Recherche fondamentale

20 furets vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre moitié confiée pour adoption. Tous reçoivent un implant crânien lors d'une chirurgie de quatre à six heures, puis une cinquantaine de séances d'enregistrement cérébral sous contention, motivées par une privation d'eau. Dix furets sont tués pour analyse histologique du cerveau, les dix autres explantés lors d'une seconde chirurgie puis remis à des organismes d'adoption. Le porteur justifie l'usage du furet par son cortex plissé et une gamme auditive proche de celle de l'humain, et retient les femelles 'en raison de leur petite taille'.

Objectifs

Écouter dans des situations réalistes est un processus actif qui engage nos capacités de perception et de réflexion. Cela donne du sens à la parole, permet à la musique de nous émouvoir et aux sons de notre environnement d'avoir de l'importance. Grâce à notre écoute, nous, les humains et les autres animaux, sommes capables de naviguer à travers des paysages sonores complexes, de distinguer des sources sonores mélangées, de comprendre des messages et d'évaluer leur signification pour nos comportements. Ces compétences sont vraiment remarquables et nous dépassent souvent. Même les systèmes d'ingénierie audio les plus sophistiqués n'arrivent pas encore à égaler ces performances étonnantes. Le projet de recherche a pour objectif d'étudier une nouvelle approche de l'audition qui considère l'écoute comme un processus interactif entre nos facultés sensorielles et notre réflexion. Nous voulons intégrer la cognition (c'est-à-dire notre façon de penser et de prendre des décisions) comme une partie essentielle du traitement de l'information sonore, ce qui peut être étudié au niveau de notre activité cérébrale. En d'autres termes, nous cherchons à comprendre comment notre cerveau s'adapte rapidement lors de l'écoute, tant au niveau des neurones individuels que des groupes de neurones travaillant ensemble. Ce processus d'adaptation rapide est appelé "plasticité rapide". Il se manifeste à différents niveaux de notre système auditif, depuis l'oreille interne (cochlée) jusqu'au cortex auditif et préfrontal de notre cerveau. En résumé, ce projet de recherche explore comment notre cerveau traite les sons de manière active et flexible, en utilisant à la fois nos facultés sensorielles et cognitives. En comprenant mieux ces mécanismes, nous pourrons élargir nos connaissances sur l'écoute et développer de nouvelles avancées dans le domaine de l'audition.

Bénéfices attendus

Le projet s'appuie sur les travaux des chercheurs en charge du protocole réalisés lors de la dernière décennie sur la physiologie et la modélisation informatique de ces phénomènes. Ces efforts ont abouti à la découverte de plasticité rapide dans le cortex auditif, au niveau du neurone unique et de populations de neurones. Ils ont aussi conduit à l'élaboration d'un modèle neuromimétique de traitement auditif qui ont mené à des percées technologiques et à des applications concrètes. Ils ont enfin permis d’utiliser une technologie de neuroimagerie large-champ chez le furet. Ce projet étendra ces recherches et intégrera de nouveaux paradigmes psychophysiques puissants pour sonder l'écoute active chez l'homme. S'appuyant sur ces domaines très complémentaires et plusieurs innovations techniques (reconstruction de stimulus à partir d'enregistrements de neurones à grande échelle chez les animaux réalisant une tâche de comportement, nous espérons promouvoir une vision nouvelle de la perception auditive et de la cognition. Cela contribuera également de manière significative à des avancées significatives dans le domaine du traitement du signal pour les prothèses auditives cliniques, étant donné que de nombreuses limitations actuelles ne sont pas technologiques, mais plutôt conceptuelles.

Procédures

Tous les animaux (n=20) sont équipés d'un implant crânien lors d'une première chirurgie qui se fait sous anesthésie et analgésie (durée 4-6h). Cet implant permet ensuite de réaliser des enregistrements neuraux en électrophysiologie ou en neuroimagerie fonctionnelle par ultrasons (procédures répétées autour d'une cinquantaine de fois en moyenne par animal, entre 3 et 5 fois par semaine, durée moyenne d'enregistrement 3h). Une partie de la cohorte sera euthanasié (sous sédation et anesthésie ; n=10). L'implant crânien est retiré des animaux qui ne sont pas euthanasiés (n=10 - voir 5.8 + 5.9), lors d'une seconde chirurgie sous anesthésie et analgésie (durée 3h).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale se faisant sous anesthésie, un risque anesthésique est présent. Au long-terme, il existe aussi un risque infectieux. Par ailleurs, les enregistrements neuraux se font chez l'animal en situation de contention. La contention des animaux est nécessaire dans le cadre des enregistrements et pourra être génératrice de stress et d’inconfort pour l’animal. De plus, le comportement sera motivé par une privation hydrique qui pourra entraîner une sensation de soif de courte durée chez l’animal.

Devenir

L'euthanasie est nécessaire pour réaliser une analyse post-mortem des tissus cérébraux. Cette méthode n'est utilisée que pour les animaux dont la localisation des injections ou des enregistrements électrophysiologiques aigus par histologie post-mortem est nécessaire (n=10). Pour l'ensemble des autres animaux (n=10), nous retirons l'implant crânien à la fin de l'expérimentation quand cela est possible, afin de les confier à des organismes chargés de trouver des particuliers qui souhaitent adopter nos animaux.

Remplacement

Afin de pouvoir comprendre le traitement de l'information sensoriel dans les cortex auditifs, visuels et frontaux, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux vivants pour pouvoir enregistrer l'activité neurale, que ce soit de neurones uniques en électrophysiologie ou les flux hémodynamiques en imagerie large-champ. Ce type d'enregistrement n'est pas réalisable chez des êtres humains. Par ailleurs, le furet constitue un animal modèle nécessaire à la compréhension de la perception auditive dans un contexte de prise de décision. En effet, il est capable d'apprendre des tâches complexes et de percevoir des sons dans une gamme auditive similaire à celle de l'être humain. Son cerveau à cortex plissé permet aussi d'étudier le rôle fonctionnel des plis corticaux, ce qui n'est pas possible chez le rongeur ou primate à cortex licencéphale.

Réduction

Le type d'expérimentation que nous réalisons permet de réaliser de nombreux enregistrements dans un nombre réduit d'animaux (20 maximum). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance par exemple et qu’il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies en jouets et tunnels divers et régulièrement mis tous ensemble dans une aire de jeu. Durant les week-ends, les animaux ne doivent pas effectuer de tâche comportementale. Leur état de santé est suivi en permanence, en collaboration avec un vétérinaire. Deux réunions du comité de suivi du bien-être animal sont faîtes chaque année, avec un suivi des recommandations du comité dans la durée (durée d'expérimentation, protocole de chirurgie, méthodes d'enregistrement…). Le comportement est motivé par une privation hydrique, raison pour laquelle nous suivons au plus près le poids des animaux ainsi que les marqueurs de bien-être suivants : + Poids – avant et après le week-end ; plus souvent si nécessaire. + État général de l'animal (activité, état global : fourrure, yeux...) – tous les jours. + Observation de l'état général des animaux – hebdomadaire – grâce à une méthode de scoring durant un examen clinique. L'évaluation de l'état général de chaque animal s'appuie sur la grille d'évaluation suivante : - le furet se cache ou de tente de mordre les expérimentateurs (comportement) - le furet cesse de s'alimenter (perte de poids) - le furet cesse de se nettoyer ou gratte de manière excessive un endroit de son corps (aspect du pelage) - état d'hydratation de l'animal (test du pli cutané) - état de l'implant crânien. Le protocole de chirurgie inclut l’administration d’anti-inflammatoire et d’anti-douleur en pré- et post-opératoire et les opérations sont réalisées sous analgésie et anesthésie. Sur le plan expérimental, un effort constant nous pousse vers le raffinement des différentes étapes de nos procédures. Tout d’abord nous portons un grand soin à l’habituation préalable à la contention chez les animaux implantés. Nous développons la pose de systèmes d'enregistrements chroniques chez les animaux pour obtenir des sessions d'enregistrements plus courtes. Enfin nous explantons un grand nombre d'animaux, quand cela est possible, à la fin de l'expérimentation, afin de les replacer.

Choix des espèces

Les furets apprennent rapidement une tâche ; ils ont par ailleurs une large gamme auditive, similaire à celle de l'homme. Leur cerveau est assez grand pour utiliser des électrodes avec 200 contacts. De plus leur cortex est convolué ; ces plis corticaux ne sont pas présents chez le rongeur à l’inverse de nombreux primates. Le furet permet d’étudier un putatif rôle fonctionnel de ces plis. Les individus femelles sont préférés en raison de leur petite taille. Les animaux ont entre 6 mois et 1 an quand ils arrivent au laboratoire, âge auquel ils sont adultes ; ce stade est choisi car le développement du cerveau est alors terminé.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles subissent une chirurgie de 25 minutes avec incision de la peau et exposition répétée du muscle au froid, sur chaque patte antérieure, avant d'être tuées pour prélèvements. Le porteur étudie le rôle de la protéine PARP3 dans la régénération musculaire, à partir de résultats déjà obtenus in vitro. Il présente la validation in vivo chez la souris comme nécessaire et renvoie les molécules thérapeutiques au 'plus long terme'.

Objectifs

Le projet concerne l’étude de PARP3 (i.e Poly(ADP-ribose) polymérase 3), une protéine qui joue un rôle déterminant dans la réparation des cassures dans l’ADN. Des expériences réalisées avec des modèles cellulaires révèlent un rôle important de cette protéine dans la différenciation de cellules souches musculaires en myotubes, un évênement clé de la régénération musculaire qui permet de réparer un muscle endommagé. Les objectifs du projet sont de vérifier ce rôle in vivo chez la souris.

Bénéfices attendus

La régénération musculaire est altérée dans plusieurs pathologies musculaires comme la dystrophie musculaire. De plus chez un sujet sain, la capacité de régénération musculaire diminue au cours du vieillissement. Notre projet qui vise à comprendre comment la protéine PARP3 intervient dans la régénération musculaire, va permettre à plus long terme de concevoir des molécules thérapeutiques agissant sur PARP3 pour activer la régénération musculaire.

Procédures

Les souris anesthésiées sont soumises à une procédure chirurgicale qui implique une incision de la peau du Tibialis antérieur, une exposition répétées du muscle squelettique au froid (3X). La plaie est ensuite suturée avec une colle chirurgicale. Au total, les animaux subissent une chirurgie d’une durée de 25 minutes qui est réalisée sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

La procédure mise en oeuvre conduit à une plaie suturée sur chaque patte antérieure de l’animal qui cicatrise en moins de 24h. Une nécrose du tissu musculaire ne peut pas être écartée mais est un évênement rare.

Devenir

Les souris sont mises à mort après la chirurgie pour prélèvements.

Remplacement

Des expériences préliminaires réalisées in vitro avec des modèles cellulaires ont permis d’identifier une protéine appelée PARP3 dans la régénération musculaire. La validation de ces résultats nécessite des approches in vivo chez la souris. La procédure que nous proposons est classiquement utilisée dans le domaine.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux nécessaire à ces approches in vivo a été très précisément réfléchi. Les questions in vivo entreprises dans ce projet reposent sur des données in vitro déjà bien caractérisées. Il ne s’agit donc pas d’une étude exploratoire chez la souris mais de la validation in vivo d’un résultat existant. Le nombre d’animaux indiqué est calculé sur la base d’une validation statistique. Pour réduire le nombre d’animaux, des groupes de 6 souris seront utilisées pour chaque condition expérimentale permettant des études statistiques précises. Nous effectuerons d’abord une première série d’expériences (1 replicat) et analyserons toutes les données avant de réaliser le 2ième replicat. Celui-ci ne sera réalisé que si des résultats pertinents sont observés avec le premier replicat.

Raffinement

La procédure est réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux peuvent être maintenus en groupe et un enrichissement des cages est mis en place (papier kleenex pour nidification, bâtonnets de bois, rouleau en carton). Des points limites précoces et sur le temps de la procédure ont été définis, une grille de score a été établie avec des actions à mener permettant de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus pertinent pour ce projet en raison des similitudes décrites dans la littérature entre les pathologies musculaires de la souris et celles de l’homme. De plus, ce projet repose sur l’utilisation de souris déficientes en PARP3 générées au laboratoire. Des jeunes adultes (6-8 sem) et souris âgées (12/18 mois) sont utilisées pour évaluer l'impact du vieillissement.

300 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple-négatif humain leur sont injectées dans les tissus mammaires sous anesthésie, pour étudier le rôle du gène HLF dans l'infiltration des tumeurs par les cellules immunitaires. Le porteur annonce une douleur légère au réveil et une gêne liée à la croissance tumorale qu'il dit limitée, puis une mise à mort pour analyses post-mortem. Il affirme que seul 'un animal vivant, entier' permet d'étudier ces interactions et juge le recours à la souris 'indispensable', les applications thérapeutiques restant hypothétiques.

Objectifs

Le cancer du sein est devenu en 2020 le type de cancer le plus fréquent à l’échelle mondiale, avec plus de 2 millions de nouveaux cas diagnostiqués chez les femmes. Le cancer triple négatif (TNBC pour Triple-negative breast cancer) est l’une des formes les plus agressives et est associé à des rechutes plus précoces, plus fréquentes et à un mauvais pronostic vital. Il a été montré qu’un niveau élevé d’infiltrats lymphocytaires intra tumoraux après chimiothérapie chez les patients TNBC est corrélé à un excellent pronostic, suggérant que la surveillance immunitaire anti-tumorale joue un rôle crucial dans l’évolution des cancers TNBC. Grâce à des analyses bioinformatiques, nous avons identifié un gène dont l’expression pourrait inhiber l’attraction des cellules immunitaires dans les tumeurs et donc, potentiellement être utilisé comme cible thérapeutique dans le traitement de ce type de cancer. Nous avons supprimé ou diminué son expression et donc ses fonctions dans des lignées tumorales humaines TNBC. Des travaux réalisés in vitro nous ont confortés dans le rôle joué par notre gène d’intérêt dans l’infiltration des tumeurs par les cellules immunitaires et souhaitons maintenant déterminer son influence dans l'organisme. Pour se rapprocher du modèle humain, nous injecterons des cellules tumorales humaines TNBC parentales ou inactivées pour le gène étudié dans les lignées de souris immunodéficientes.

Bénéfices attendus

Ce projet transversal est issu d’observations cliniques indiquant que lorsque le gène HLF est surexprimé dans les cellules tumorales de patientes souffrant de cancer de type TNBC, une inhibition de la réponse immunitaire, en particulier de l’activation d'un sous-type de globules blancs est observée et corrélée à un mauvais pronostic. Des études in vitro en cours nous suggèrent que ce gène est bien impliqué dans la régulation de mécanismes moléculaires et cellulaires associés à l’attraction et la fonction de ces cellules blanches. L’étude dans l'organisme de l’infiltration des tumeurs TNBC exprimant ou non HLF est indispensable afin de confirmer le rôle joué par ce gène dans la réponse immunitaire anti-tumorale au sein du microenvironnement et en particulier dans la régulation des fonctions des cellules impliquées dans la lutte anti-tumorale. Ces connaissances fondamentales sont également essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle et de déterminer si le gène HLF pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif de mauvais pronostic. Des inhibiteurs de ce gène identifiés par criblage à haut débit sont actuellement en cours de caractérisation in vitro au laboratoire.

Procédures

Injection de cellules tumorales au niveau des tissus mammaires après anesthésie générale: une fois par animal, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances seront liées aux injections: légère douleur au réveil après injection des cellules tumorales et à la gêne physique induite par la croissance des tumeurs: limitées car la taille des tumeurs sera très limitées. Ces tumeurs n'entraînent pas d'autres nuisances.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leurs extensions éventuelles. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans le recrutement et l’activation de certaines cellules blanches dans la lutte anti-tumorale dans les cancers du sein de type triple négatif. Il est indispensable pour notre projet de tester nos hypothèses in vivo dans un modèle de souris immunodéficientes greffées par des tumeurs humaines ayant conservé sa population de cellules blanches, ou dans un modèle murin humanisé pouvant être reconstitué avec des cellules humaines, et recevant des greffes de tumeurs humaines.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance. Pour certaines expériences, une étape de sélection de lignées triple-négatif sauavges et déplétées pour le gène d'intérêt à étudier seront réalisées in vitro afin de réduire au maximum le nombre de souris. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un triatement. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire adapté leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

Nous avons développé des lignées de cancer triple-négatif humaines inactivées ou non pour le gène d'intérêt qui seront injectées chez des souris immunodéficientes. Nous avons choisi l'espèce souris car ces souris immunodéficientes permettent d'étudier les tumeurs humaines sans rejet. Ces souris présentent également l’avantage d’avoir conservé la production des globules blancs sur lesquels nous avons centré notre projet. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures.

2100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une crème inflammatoire est appliquée chaque jour pendant onze jours pour induire un psoriasis, après tonte ou épilation, avec deux prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour analyser peau, rate et ganglions. Le porteur précise qu'aucun analgésique ne sera administré car il fausserait la réponse immunitaire étudiée, alors que l'inflammation peut provoquer des plaques cutanées et, dans les cas les plus graves, une atteinte articulaire gênant les déplacements. Il décrit ces expériences comme des prestations réalisées pour des laboratoires privés et publics cherchant à valider des modèles génétiquement modifiés.

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact d’une inflammation cutanée sur le système immunitaire suite à la modification de gènes cibles. Les maladies inflammatoires de la peau telles que la dermatite atopique et le psoriasis touchent près de 3% de la population mondiale. Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui se manifeste par des plaques rouges présentant des squames. Il s'agit le plus souvent d'une maladie bénigne, mais il existe des formes sévères (environ 20% des cas), associées à une atteinte généralisée et/ou à des douleurs articulaires. Bien que la pathogenèse ne soit pas entièrement comprise, d'intenses recherches sont en cours pour explorer les mécanismes sous-jacents impliqués. L’objectif de ce projet est d’évaluer la réponse immunitaire après l’induction de psoriasis de souris contrôles ou d’animaux génétiquement modifiés. Le modèle de souris traité via une crème inflammatoire est l’un des modèles les plus largement utilisé pour étudier le psoriasis. Ainsi, nous utiliserons ce modèle et nous appliquerons localement de la crème inflammatoire sur la peau des souris au niveau du dos ou des oreilles afin d’induire une dermatite de type psoriasis pour évaluer la réponse immunitaire suite à la modification de gènes cibles.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à répondre à une inflammation cutanée.

Procédures

Pour induire une inflammation cutanée de type psoriasis, les souris seront soumises à plusieurs interventions : 1) La préparation de la peau par tonte d’une durée de 30 secondes en vigile ou par épilation d’une durée de 15 minutes par anesthésie générale gazeuse en fonction de la demande du partenaire. La préparation de la peau se fait qu’une seule fois au début de l’expérimentation. 2) L’application quotidienne de crème inflammatoire d’une durée de 3 minutes par anesthésie générale gazeuse, et ce, sur une période de 11 jours maximum. 3) Deux collectes de sang d’une durée de 30 secondes sur souris vigiles par voie submandibulaire à l’aide d’une lancette pour recueil du sérum. 4) Des pesées un jour sur deux d’une durée de 30 secondes, et ce, sur une période de 11 jours maximum. 5) A la fin de l’expérimentation les souris sont mises à mort pour l’analyse de la peau, la rate et les ganglions.

Impact sur les animaux

L’induction de psoriasis par application quotidienne de crème inflammatoire cause une inflammation localisée sur la peau des souris. Cette inflammation se reflète par des érythèmes (léger à très marqué) ainsi que des plaques cutanées, et ce, sur une durée de 11 jours maximum. Dans les cas les plus grave, une atteinte articulaire peut être observée pouvant causer des difficultés à se déplacer pour se nourrir et s’hydrater. Ces signes cliniques ne pourront être soulagés par la prise d’analgésique car nous étudions la réponse immunitaire et toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Lors de l’expérimentation les animaux sont suivis quotidiennement et une grille de score et des points limites sont préalablement établis afin de réagir rapidement face aux premiers signes de souffrance chez la souris. L’ajout de Gel Diet / pâtée SAFE Energy et d’hydrogel pourront améliorer les conditions de vie des animaux. Les manipulations des souris pour la tonte, le recueil de sang ou pour l’application quotidienne de la crème inflammatoire peuvent générer du stress chez la souris mais sont indolores. Nous veillerons dans chacun de nos actes au respect du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire ou pour l’histologie.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.

2 766 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des gavages, des injections sous anesthésie, jusqu'à une trentaine de prélèvements sanguins et une irradiation, pour étudier le rôle d'une protéine, TET2, dans le développement de lymphomes B. Le porteur indique qu'un tiers des souris dont ce gène est inactivé développe une maladie proche d'une leucémie, qu'il décrit comme asymptomatique. Il reconnaît mener des approches in vitro en parallèle mais conclut que le recours à l'animal reste "indispensable" pour tenir compte du micro-environnement et du système immunitaire.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de déterminer le rôle de la déficience en une protéine impliquée dans les hémopathies malignes chez l'Homme (TET2) dans la production de lymphocytes à l'origine des anticoprs et en particulier dans les lymphomes de type B. Nous avons montré, avec d'autres, que la déficience en Tet2 murine affecte la maturation terminale des lymphocytes B, en altérant leur différenciation . Ce blocage de la différenciation est associé à plusieurs caractéristiques des lymphomes B, en particulier ceux présentant des mutations inactivatrices de TET2. Le but de ce projet est donc de mieux comprendre le rôle de TET2 dans la maturation lymphoïde B, lors de la réponse immunitaire adaptative, ainsi que les mécanismes à l'origine du développemment des lymphomes B chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mieux comprendre le rôle de TET2 dans la maturation lymphoïde B lors de la réponse immunitaire adaptative ainsi que les mécanismes à l'origine du développement des lymphomes B chez l'Homme. Il pourra y avoir des applications sur la prise en charge des patients porteurs de ces tumeurs, par une meilleure compréhension de la maladie et l'identification éventuelle de cibles thérapeutiques

Procédures

Gavages : nombre= 3, durée = 30 secondes. Injections (une à trois) :durée 5 minutes sous anesthésie générale. Prélèvements de sang :1 à 30 : durée 5 minute sous anesthésie générale. Irradiation (non léthale) à dose moyenne: durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les interventions sur les animaux (gavages, injections, irradiations et prélèvements de sang) induiront des nuisances temporaires et transitoires de type douleur légère. L’inactivation de Tet2 n’entraîne pas de conséquence notable avant 6-9 mois. Lorsque Tet2 est absent dans les cellules souches, une fraction (1/3) des souris développe alors une maladie de type leucémie myélomonocytaire chronique asymptomatique. Quand Tet2 est inactivé spécifiquement au cours de la différenciation lymphoïde B, la même fraction des souris montre une accumulation de lymphocytes B1a, sans aucun symptôme associé.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédure pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Nous utilisons en parallèle des approches in vitro, qui permettent de reproduire une partie de la maturation lymphoïde B. il s'agit de stimulation des lymphocytes B naïfs triés à partir de suspension cellulaires de rate, par diverses molécules pour mimer la maturation T-indépendante, CD40L + IL4 pour mimer la maturation T-dépendante des lymphocytes B. nous avons aussi développé une approche plus complexe, qui s'approche un peu plus des conditions in vivo, sur des cellules certains gènes en présence d'une cytokine. ces approches permettent d'obtenir beaucoup de cellules pour certaines analyses biochimiques, donc de réduire les analyses in vivo, qui restent néanmoins indispensables. L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est en effet indispensable car il est important de pouvoir prendre en compte l’ensemble des interaction des cellules mutées (et tumorales) avec l’organisme, du micro-environnement au système immunitaire complet. Ces aspects ne peuvent pas être reproduit in vitro.

Réduction

Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés et nous privilégierons toute étude in vitro sur modèles cellulaires établis, ou sur cellules primaires de patients, nous permettant de valider nos hypothèses de travail. Le nombre d'aimaux nécessaire et suffisant a été déterminé par calcul de puissance. Les résultats seront analysées par des méthodes statistiques.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour examen clinique, et dès l'apparition d'un signe de contrainte ou de douleur, les animaux recevront un traitement ou des mesures palliatives. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un aliment adapté leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’animal vertébré le plus adapté et utilisé dans la recherche translationnelle sur les cancers et les tests de toxicité, aussi bien qu'en recherche fondamentale. Cela se traduit par un accès à une quantité importante de publications scientifiques et de techniques détaillées essentielles à nos études. Des animaux adultes seront utilisés au vu des pathologies concernées.