Recherche fondamentale

2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Les souriceaux sont soumis à des variations d'oxygène pour reproduire la rétinopathie du prématuré, certains recevant une injection dans l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que les mères supportent mal le retour à un air normal et développent une détresse respiratoire, ce qui conduit à les tuer dès la sortie du caisson et à confier les petits à des mères adoptantes. Il justifie l'usage de la souris par l'impossibilité de reproduire la maladie sur des cellules isolées.

Objectifs

La rétinopathie du prématuré (ROP) est un trouble oculaire potentiellement cécitant qui affecte les prématurés. Elle survient lorsque les vaisseaux sanguins de la rétine, la couche de tissu nerveux à l'arrière de l'œil responsable de la vision, se développent anormalement. Chez les prématurés, les vaisseaux sanguins de la rétine ne sont pas complètement formés à la naissance et, par conséquent, ils peuvent être perturbés par des facteurs tels que l'oxygénothérapie et d'autres traitements médicaux. Dans certains cas, des vaisseaux sanguins anormaux peuvent se développer dans la rétine, provoquant des cicatrices et pouvant entraîner un décollement de la rétine et la cécité. La ROP est une maladie grave qui peut entraîner des problèmes de vision à vie ou la cécité si elle n'est pas traitée. Cependant, une détection et un traitement précoces peuvent aider à prévenir la perte de vision dans la plupart des cas. Notre objectif est de révéler et comprendre le mécanisme de l'hypoxie intermittente chronique (CIH) et son influence sur la rétinopathie induite sur des souriceaux par l'oxygène (OIR) (modèle animal normalement utilisé pour la rétinopathie du prématuré), comprenant l'angiogenèse rétinienne, la néovascularisation rétinienne et l'inflammation rétinienne. L'hyperoxie fait référence à un état d'augmentation des niveaux d'oxygène ou à une concentration d'oxygène supérieure à la normale. L'hypoxie se caractérise par des niveaux d'oxygène réduits ou une concentration d'oxygène inférieure à la normale. La concentration normale d’oxygène dans l’air ambiant (normoxie) est de 20.9%. La rétinopathie est toute lésion de la rétine des yeux pouvant entraîner une déficience visuelle. La rétinopathie fait souvent référence à une maladie vasculaire rétinienne ou à des lésions de la rétine causées par un flux sanguin anormal. L'angiogenèse est le processus physiologique de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux sanguins préexistants. La néovascularisation fait référence à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, en particulier à une croissance anormale ou excessive des vaisseaux.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de l’hypoxie intermittente et son interaction dans un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène, ainsi que de connaître les expressions géniques qui entrent en jeu. Cela permettra de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques chez l’Homme pour réguler l’inflammation dans l’œil et soigner la rétinopathie du prématuré.

Procédures

Dans ce projet il n’y a pas de chirurgie. Les animaux seront soumis à des variations de concentrations d’oxygène (hyperoxie pendant 5 jours et hypoxie intermittente pendant 4 ou 10 jours). Pour le protocole d’hyperoxie, la concentration en oxygène est maintenue à 75% (la montée se fait en 15-20 minutes). Lors du protocole d’hypoxie, la concentration en oxygène passe de 20,9 % à 7 % en 45 secondes. Elle se maintient à 7 % pendant 30 secondes puis revient à 20,9 % en 15 secondes. Ensuite, la concentration en oxygène se maintient à 20,9 % pendant 45 secondes. C'est un cycle d'hypoxie intermittente, répété 10 heures par jour de 10h00 à 20h00. Certains recevront des injections intravitréennes (qui dure entre 2 et 3 minutes) sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une stabulation dans un environnement non adapté (hyperoxie ou hypoxie). Le modèle d’hyperoxie peut induire chez les femelles une difficulté de réadaptation en normoxie qui se traduit par une détresse respiratoire. En revanche l’hyperoxie n’a pas d’impact sur les souriceaux. Certains souriceaux subiront une injection intraoculaire. Dans de rare cas, cela peut induire une inflammation.

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem sur les souriceaux, cela implique donc leur euthanasie. Les mères ne peuvent pas entrer dans une nouvelle procédure après leur passage dans le caisson d’hypoxie/hyperoxie et seront donc également euthanasiées.

Remplacement

Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’oeil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.

Réduction

Pour cette étude nous utiliserons un total de 2400 souris. Nous devons induire plusieurs expériences (5 expériences/groupe expérimental) en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables selon nos précédentes expériences (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 6 animaux défini par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet, selon nos expériences antérieures.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par portée dans des cages ventilées. Les cages comportent plusieurs cotons et une petite maisonnette pour pouvoir faire leur nid. Les animaux sont hébergés avec alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Lors des expériences de d’hyperoxie et d’hypoxie, les animaux sont stabulés dans des cages ayant les mêmes dimensions qu’en stabulation normale, avec les mêmes enrichissements. Suite à l’hyperoxie, le retour en condition de normoxie est mal supporté par les mères et peut induire une détresse respiratoire, afin d’éviter cela nous euthanasions les mères dès le retour en normoxie. Les souriceaux bénéficieront d’une mère adoptante swiss à la sortie du caisson. En effet, les souris Swiss sont connues pour être de bonnes mères adoptantes. Certains souriceaux subiront une injection intravitréenne sous anesthésie générale et anesthésie locale. L’animal est placé sur tapis chauffant durant pour prévenir le risque d’hypothermie.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la rétinopathie, l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence rétinienne sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développé le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène et l’hypoxie intermittente. Pour le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène, les animaux seront utilisés dès 8 jours de vie. En effet, chez la souris la vascularisation rétinienne se développe à la naissance jusqu’à 21 jours. Les variations d’oxygénation déclenchent une néovascularisation que pendant la vasculogenèse rétinienne qui a lieu les 3 premières semaines de vie de la souris. L’hyperoxygénation entre 8 et 13 jours de vie entraine une perte des vaisseaux (phase de vaso-oblitération). Au retour en normoxie à 13 jours l’hypoxie relative mène à une angiogenèse compensation et pathologique ce qui correspond à la phase de néovascularisation.

303 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Chacune subit six interventions, dont des injections, un prélèvement dans l'orbite de l'œil et une blessure hémorragique de trente minutes sous anesthésie, par coupure de la queue ou section d'une veine caudale. Le porteur détaille des effets possibles allant de l'anémie et la perte de poids jusqu'à l'automutilation et une réaction hyperalgésique, et prévoit une mise à mort sans réveil. Ce modèle de souris à déficit induit en facteur X, présenté comme "unique au monde", sert à mesurer la dose corrigeant un trouble hémorragique rare.

Objectifs

Le déficit en facteur X (FX) de la coagulation sanguine est un désordre hémorragique héréditaire rare avec une incidence estimée à 1-2 par million, bien qu’une fréquence plus élevée ait été observée dans des populations où le mariage consanguin est un événement courant. Le FX joue un rôle crucial au sein de la cascade de la coagulation sanguine. Le déficit en FX est associé à une tendance aux saignements et des symptômes sévères de la maladie sont principalement observés chez des patients ayant moins de 10% d’activité coagulante en FX. Au-delà de son rôle crucial au sein de la coagulation sanguine, plusieurs travaux ont montré que la protéine pouvait également moduler la progression d’autres pathologies comme les maladies fibro-prolifératives ou certains cancers. Le FX a également été montré comme jouant un rôle au cours de l’inflammation ou d’infections virales. La marque la plus évidente que le FX est impliqué dans des processus non hémostatiques est la létalité embryonnaire partielle de 50% in utero observée chez des souris avec une anomalie sévère pour le FX. Les souris déficientes survivantes meurent dans les 30 jours après leur naissance. La construction d’un modèle de souris avec un déficit total en FX mais viable à l’âge adulte nous est apparue comme une stratégie puissante et originale pour aborder in vivo les fonctions biologiques diverses de la protéine. Nous avons obtenu une souche de souris unique au monde avec un déficit inductible du FX quand la souris est adulte. L'objectif du projet est de caractériser ce modèle unique en déterminant la dose de FX nécessaire dans la circulation sanguine pour rétablir une hémostase normale dans les souris pour lesquelles on a induit un déficit en FX. Pour cela nous allons utiliser différents modèles de saignements mis au point dans notre laboratoire et publiés pour d’autres modèles hémorragiques. L’ensemble de ces modèles miment soit des saignements de la vie courante, ou des saignement plus accidentels, ou des saignements sévères comme lors d’actes chirurgicaux.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans un objectif de tester et développer de nouvelles molécules thérapeutiques dans le domaine des maladies hémorragiques mais aussi d’autres pathologies comme les maladies fibro-prolifératives ou certains cancers, l’inflammation ou certaines infections virales dans lesquelles il a été montré que le FX pouvait jouer un rôle. En effet, la compréhension et la caractérisation du modèle de déficit acquis en FX est une option incontournable à cet objectif. Pour cela, il s’agit dans ce projet d’évaluer l’efficacité hémostatique du FX et par conséquent son importance physiologique dans des modèles hémorragiques différents en termes de sévérité et de lits vasculaires visés. Le résultat attendu sera donc la caractérisation in vivo du rôle du FX dans l’hémostase.

Procédures

Les souris seront soumises à 6 interventions chacune : - 3 injections intrapéritonéales espacées d'au moins 2 jours. Chaque injection va durer 5 secondes, au total 15 secondes - 1 prélèvement sanguin rétro-orbital. Ce prélèvement va durer 10 secondes -1 injection rétro-orbitale qui va durer 5 secondes - 1 blessure induisant un saignement qui va durer 30 minutes (coupure extrémité de la queue ou transsection d'une veine ou d'une artère caudale, ou incision de la veine Saphène)

Impact sur les animaux

Les 3 injections répétées espacées de 2 jours en intrapéritonéal d’ARN double brin peuvent entrainer par ordre croissant de sévérité les apparences ou signaux suivants chez les souris manque toilettage, moins mobile, isolé mais attentif, anémie (apparence blanchâtre aux extrémités), perte de poids

Devenir

Tous les animaux sont encore sous anesthésie à la fin de chacune des procédures où ils subissent un test de saignement qui dure 30 minutes. Les animaux en fin des procédures exploratoires seront mis à mort avant leur réveil pour prélever les tissus qui seront analysés par la suite. Les animaux qui ne répondent pas aux critères hémostatiques nécessaires notamment avec une formulation sanguine non rétablie ou qui ont des taux de facteur X qui ne sont pas inférieurs à 1% seront mis à mort sous anesthésie pour prélever les tissus qui seront analysés par la suite.

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, autant des molécules procoagulantes que leurs inhibiteurs mais aussi des phospholipides membranaires. Actuellement les tests disponibles in vitro, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.

Réduction

Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse statistique optimale après un calcul de puissance. Nous avons estimé le nombre d’animaux nécessaire de 303 au maximum.

Raffinement

Nous avons aussi attaché une grande importance au raffinement : les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bienêtre des animaux avec un enrichissement du milieu. Toutes les interventions sur les animaux sont faîtes en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. La durée des interventions est réduite au strict nécessaire. La surveillance sera rapprochée et des points limites spécifiques sont prévus. La principale intervention sur les souris aura lieue sous anesthésie générale et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement réévaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet.

Choix des espèces

Ce projet fait appel à un modèle murin unique qui reproduit une pathologie hémorragique rare, le déficit en FX. C'est un nouveau modèle qui a déjà montré sa pertinence en tant que modèle d'une pathologie humaine car il produit des souris viables qui atteignent l'âge adulte et dont le déficit est induit par une approche déjà validée dans la littérature et qui peut ainsi servir comme un modèle préclinique valide pour des tests de nouvelles thérapies anti-hémorragiques chez les patients avec un déficit en FX qui ne bénéficient pas à l'heure actuelle de produits spécifiques dédiés à leur pathologie. Les souris adultes seront utilisées à partir de 8-10 semaines d’âge lorsqu'elles auront atteint un poids de 18-25 gr. La durée de suivi des procédures (3-4 semaines) est alors compatible avec une fin de procédure à un âge compris entre 12 et 14 semaines. A ce stade, leur poids est tout à fait compatible avec la réalisation des expériences de saignement pour tester l'efficacité de la thérapie notamment dans la procédure de saignement de la veine saphène qui est alors clairement visible.

282 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par occlusion d'une artère du cerveau sous anesthésie, puis un candidat neuroprotecteur leur est injecté, avant prélèvement du sang et du cerveau. Le porteur emploie des souris âgées de 18 à 20 mois pour se rapprocher de la population humaine touchée et rappelle qu'aucun traitement neuroprotecteur n'a démontré d'efficacité chez l'humain. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne peut reproduire un AVC, justifiant le recours à l'animal vivant.

Objectifs

Compte tenu de leur incidence et de leur sévérité, les accidents vasculaires cérébraux (AVC) restent un enjeu thérapeutique majeur. L’AVC est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, la 2ème cause de démence et la deuxième cause de mortalité. L’âge est le principal facteur de risque non modifiable. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il est dû à à l’occlusion d’une artère cérébrale. L’occlusion de l’artère entraine une destruction rapide d’une zone du cerveau (infarctus cerebral) à cause du défaut d’apport d’oxygène et de glucose et des déficits neurologiques et moteurs. Le seul traitement utilisé après un AVC ischémique repose actuellement sur la recanalisation de l’artère occluse (chimique par thrombolyse et / ou mécanique par thrombectomie). L'efficacité de cette approche reste, cependant, limitée (moins de 10% des patients peuvent en bénéficier à cause de l’étroitesse de la fenêtre thérapeutique et du risque hémorragique). Même après recanalisation, 50% des patients traités gardent des sequelles. La neuroprotection est une approche complémentaire dont l’objectif est de réduire les dommages cérébraux. A ce jour, aucun traitement visant à protéger le tissu cérébral (neuroprotection) n’a démontré d’efficacité chez l’Homme. Il y a un besoin urgent de trouver des thérapies efficaces Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel neuroprotecteur d'un traitement dans un contexte d’accident vasculaire cérébral chez la souris et d’étudier son mécanisme d’action. Nous évaluerons l’impact de ce traitement sur la réduction de la lésion cérébrale, de la perte des cellules neurales et des troubles neurologiques et moteurs. Nous utiliserons un modèle expérimental d’ischémie cérébrale in vivo chez la souris (modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne avec reperfusion). Ce modèle permet de reproduire la plupart des signes cliniques observés chez les patients après AVC et d’évaluer in vivo les effets d’un traitement sur le volume de l’infarctus cérébral et sur la récupération fonctionnelle.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances précliniques qui pourront être à la base d’une proposition de nouvelles stratégies neuroprotectrices susceptibles de réduire le dommage ischémique cérébral et corriger les déficits neurologiques et moteurs après la survenue d’un accident vasculaire cérébral (AVC).

Procédures

Les souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale au niveau du cou qui dure moins de 20 min pour induire une ischémie cérébrale . Une substance susceptible de réduire les effets délétaires de l'ischémie ou son solvant sont injectés aux souris à 1,6 et 24 heures après la chirurgie.

Impact sur les animaux

La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale . La chirurgie en soi n’induit pas de douleur ou de souffrance. Une perte de poids d’environ 10% peut survenir dans les 48h qui suivent la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés pour récupérer le sang et le cerveau afin de faire des analyses.

Remplacement

Ces études nécessitent des expériences in vivo utilisant des animaux. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres modèles n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Le projet a pour but d’étudier l’effet d’un traitement après ischémie cérébrale, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier (système nerveux, système vasculaire et la connexion entre les organes). Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants. Les AVC ont des impacts au niveau de différentes structures du cerveau ainsi que des conséquences physiologiques sur l’ensemble de l’organisme. Le modèle expérimental d’ischémie cérébrale in vivo permet de reproduire une grande partie des signes cliniques observés chez l’homme après AVC et d’évaluer in vivo les effets sur le cerveau et sur la récupération fonctionnelle (score neurologique, coordination motrice). Actuellement, Il n’existe aucun modèle in silico ou in vitro permettant de mimer les impacts d’un AVC ou d’étudier les effets d’un traitement. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas d’étudier l’efficacité d’un traitement visant à limiter la taille des lésions cérébrales et les déficits sensori-moteurs. La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répandus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris transgéniques sur un même fond génétique. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable.

Réduction

Le nombre minimal et suffisant d’animaux à utiliser a été déterminé en tenant compte de la sensibilité des techniques utilisées et de la variabilité attendue du modèle sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature. Le nombre d’animaux par série expérimentale a été estimé au plus juste et est réduit au minimum, de façon à mettre en évidence des différences statistiques avec un risque d’erreur moins que 5%, sur la base de notre expérience de ce modèle et de nos études antérieures. Nous avons optimisé les techniques de façons à évaluer le maximum de paramètres sur les mêmes groupes d’animaux (tests de comportement, taille de l’infarctus, et études immunohistochimiques au niveau du cerveau sont évalués sur les mêmes lots d’animaux).

Raffinement

Les conditions de travail pour l’utilisation des souris ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations.Une attention particulière est portée pendant la chirurgie en particulier la température corporelle est mintenue grâce à une couverture chauffante. Les souris sont pesées avant et quotidiennement après ischémie pour évaluer la perte de poids. Tout sera mis en œuvre pour réduire le stress, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées tout le long de l’étude jusqu’à la mise à mort de l’animal. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont bien établis et maitrisés. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. De plus, Le modèle murin permet l’utilisation de lignées de souris transgéniques. Nous utiliserons des souris sauvages et des souris transgéniques, dont les récepteurs de la progestérone ont été sélectivement invalidés dans le système nerveux. Nous disposons de ces souris, nous les avons déjà caractérisées et utilisées dans nos études précédentes. Des souris âgées de 18-20 mois seront utilisées dans cette étude car l’ischémie cérébrale est fréquente chez l’individu âgé et ses conséquences sont plus invalidantes. L’âge est le principal facteur de risque non modifiable de la survenue des AVC ischémiques. Les souris jeunes ont une neuroprotetion endogène plus importante que les souris âgées.