Recherche fondamentale

150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une craniotomie pour implanter une canule, puis jusqu'à quatre injections de molécules inflammatoires sur les méninges pour mimer une crise de migraine, et restent isolés en cage individuelle pendant deux semaines. Le projet compare l'intégration de la douleur méningée entre mâles et femelles selon le cycle hormonal, les retombées thérapeutiques restant à long terme. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer cette étude in vivo.

Objectifs

La migraine est une pathologie à forte prévalence féminine, qui est caractérisée par des céphalées associées à d’autres symptômes telles que la photophobie, la phonophobie ou encore l’allodynie (douleur déclenchée par une stimulation non douloureuse). Pendant la phase de céphalée, la douleur est générée au niveau des méninges puisqu’il n’existe pas de récepteurs à la douleur dans le cerveau. L’hypothèse actuelle est que cette douleur est la conséquence d’une inflammation provoquée par des molécules (histamine, bradykinine, sérotonine, prostaglandines…) libérées par les fibres nerveuses au niveau des méninges. L’objectif du projet sera de comparer l’intégration de la sensibilité méningée au niveau du système nerveux central chez les mâles et chez les femelles selon le cycle hormonal, dans un modèle animal de migraine. Ce modèle consiste à mimer l'inflammation qui a lieu au niveau des méninges pendant les crises de migraine et qui provoque la douleur ressentie. Nous réaliserons des enregistrements électrophysiologiques d’une population neuronale localisée dans une région cérébrale impliquée dans l’intégration de l’information douloureuse, et comparerons les effets de l’inflammation méningée sur la physiologie de ces neurones chez les mâles et les femelles, et chez les femelles à différents cycle hormonaux.

Bénéfices attendus

Même si la migraine touche plus les femmes que les hommes et est fortement corrélées aux cycles hormonaux, la plupart des études précliniques ont été réalisées chez les mâles. Ainsi, à moyen terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiologiques d’intégration de la douleur méningée au niveau du système nerveux central chez les mâles et les femelles selon le cycle hormonal. A plus long terme, mieux comprendre cette pathologie pourra nous aider à développer de nouveaux traitements qui pourraient mieux soulager les patients en tenant compte des différences hommes/femmes et cycle menstruel.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale qui consiste en une craniotomie pour pouvoir implanter une canule pour appliquer à la surface des méninges une inflammation, mimant ce qui se passe pendant les crises de migraines. Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. Chaque chirurgie dure environ 30 à 45 min. Injection des molécules sur les méninges afin de mimer les crises de migraine: 4 injections (au maximum) tous les 2 jours ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min.

Impact sur les animaux

Nous réalisons une procédure chirurgicale avec l’implantation de la canule. La douleur est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie pendant 2 h après l’injection, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Un autre effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour la mise en place de la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 2 semaines.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles. Enfin, nous réduirons le nombre d'animaux en ne faisant pas de groupe contrôle de 2 injections d'aCSF et en utilisant le groupe contrôle de 4 injections d'aCSF à la place.

Raffinement

Les rats bénéficieront d’un enrichissement environnemental avec des rouleaux qui seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue)...mettrait fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Opérées au cerveau, elles reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant 20 jours, subissent un test comportemental, puis sont tuées pour l'électrophysiologie. Le projet étudie l'effet du cannabis sur la mémoire à l'adolescence, les souris étant utilisées à 28 jours pour mimer cette période. Le porteur affirme que ces circuits neuronaux ne peuvent être étudiés ni par simulation numérique ni chez des invertébrés.

Objectifs

Le noyau accumbens (NAc) est une région du cerveau impliquée dans la récompense et l'une des principales cibles des drogues illicites. L'hippocampe, une région du cerveau impliquée dans la formation de la mémoire, envoie des informations au NAc. Certaines drogues illicites, comme le cannabis, modifient les connexions neuronales entre l'hippocampe et le NAc, entraînant des troubles de l'apprentissage, mais on ne sait pas comment ces connexions sont régulées et modifiées après la consommation de cannabis. Il est important de noter que la consommation de cannabis commence généralement à l'adolescence, une période où le cerveau subit de nombreux changements. Il est donc important de comprendre comment la consommation de cannabis pendant l'adolescence influe sur la mémoire. Ce projet étudiera ces questions en se concentrant sur un candidat potentiel pour la régulation de ces connexions neuronales : les récepteurs CB1 astrogliaux. Le récepteur CB1 est le principal récepteur cérébral des effets du cannabis et on sait qu'il est exprimé dans les astrocytes, les principales cellules du cerveau. Notre nouvelle hypothèse est que l'activation des récepteurs CB1 dans les astrocytes pendant la consommation de cannabis entraîne des changements dans les connexions hippocampe-NAc et des déficits de la mémoire. En outre, nous étudierons ces effets sur des souris adolescentes, de sorte que notre étude fournira des informations sur les effets néfastes de la consommation de cannabis sur la mémoire des adolescents.

Bénéfices attendus

La consommation de cannabis à l'adolescence est en constante augmentation, mais ses effets nocifs à cet âge ne sont pas bien compris. Il est bien connu que la consommation de cannabis entraîne des déficits de la mémoire, mais les mécanismes neurobiologiques sous-jacents sont inconnus. Le récepteur CB1 étant la cible endogène des molécules psychoactives du cannabis, comprendre comment les récepteurs CB1 des astrocytes (les principales cellules du cerveau) régulent les connexions hippocampe-NAc (impliquées dans la mémoire) fera progresser nos connaissances sur ces processus. Par conséquent, ce projet nous aidera à mieux comprendre les mécanismes par lesquels le cannabis modifie ce circuit neuronal, altérant ainsi la mémoire et, de cette manière, visant à découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des effets nocifs de la consommation de cannabis.

Procédures

Tous les animaux seront opérés (durée de l'opération 90 min + 4 jours de suivi postopératoire). Une fois rétablis, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (15 sec) par jour pendant une période de 20 jours consécutifs. Le test comportemental sera réalisé pendant 4 jours consécutifs (1h/jour maximum).

Impact sur les animaux

L'opération ne présente pas de risques majeurs et la douleur associée sera contrôlée par une anesthésie et des analgésiques adéquats. Si ces mesures sont prises correctement, il n'y a pas de signes de douleur après l'opération ou pendant la convalescence. Le taux d'apparition de signes d'infection de la plaie après ce type d'opération est très faible. Les traitements médicamenteux et les injections IP sont bien contrôlés en laboratoire et ne provoquent pas d'inconfort pour l'animal. De plus, les produits utilisés (et leurs doses) sont bien tolérés par les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour être utilisés en électrophysiologie.

Remplacement

A ce jour, notre connaissance de l'organisation des circuits neuronaux chez les mammifères, y compris l'homme, ainsi que leur plasticité, ne nous permet pas de concevoir et de réaliser des simulations numériques fiables pour étudier les changements qui se produisent. En outre, l'utilisation d'invertébrés, dont le système nerveux est complètement différent, serait inappropriée. Dans ce contexte, le recours à des expériences sur les mammifères reste nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne doit pas dépasser 15 animaux, c'estàdire le nombre minimum d'échantillons permettant l'application des tests statistiques classiques dans le domaine et également décrits dans la littérature scientifique sur le sujet. Les chiffres attendus garantissent une bonne interprétation des résultats. Toutefois, si l'expérience montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Les animaux sont logés dans des cages collectives avant et après la manipulation. Les souris sont hébergées avec du matériel de nidification en coton dans des conditions optimales de température, d'humidité et de lumière. Les souris sont observées quotidiennement par du personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs formés conformément à la réglementation en vigueur, afin que des mesures d'analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. L'établissement des points limites est basé sur une évaluation de l'état général et du comportement des animaux, comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, tant préopératoires que postopératoires, comprennent également l'utilisation d'analgésiques pour la gestion de la douleur et doivent être effectuées par des expérimentateurs formés à à la chirurgie des rongeurs, conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

À ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères, y compris l'homme, et surtout leur plasticité, ne permet pas de concevoir et de mettre en oeuvre des simulations numériques fiables permettant d'étudier les changements qui se produisent. De plus, l'utilisation d'invertébrés dont le système nerveux est complètement différent serait inappropriée. Dans ce contexte, l'expérimentation animale reste nécessaire. La souris est le modèle idéal pour ces trois raisons 1) Possibilité d'étudier des mutants pour une protéine donnée (dans ce cas le récepteur CB1), 2) Reproductibilité et comparabilité avec d'autres résultats obtenus dans le laboratoire et la communauté scientifique au sens large. 3) Les installations sont équipées pour les études sur les rongeurs. Les animaux seront utilisés à l’âge de 28 jours, car nous avons l'intention d'étudier les effets du cannabis pendant l'adolescence. En outre, une fois que toutes les procédures expérimentales in vivo (chirurgie, traitement pharmacologique et tests comportementaux) seront terminés, les animaux seront sacrifiés et utilisés pour l'électrophysiologie in vitro. En raison de la difficulté d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur des souris adultes, le protocole que nous avons établi permettra d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques après que toutes les procédures auront été achevées sur des souris raisonnablement jeunes.

696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie sous anesthésie pour modifier l'expression d'un gène dans le cerveau de leurs embryons, les mères étant tuées après le sevrage et les petits à l'âge adulte pour prélever le cerveau. Le projet cherche à comprendre la survie anormale de neurones transitoires dans certaines épilepsies, les retombées thérapeutiques restant hypothétiques. Le porteur affirme que la complexité du cerveau ne peut être reproduite dans aucun modèle in vitro.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux impliquent un dysfonctionnement cérébral résultant d'une altération de l'assemblage du cerveau au cours du développement embryonnaire. Ils comprennent l'autisme, le trouble déficitaire de l'attention/hyperactivité, la déficience intellectuelle, l'infirmité motrice cérébrale et diverses formes d'épilepsie. On estime que jusqu'à quinze pourcents des enfants des pays développés peuvent souffrir de troubles neurodéveloppementaux, dont certains symptômes durent toute la vie. Il est donc extrêmement important de comprendre les déficits impliqués dans ces troubles pour trouver des stratégies thérapeutiques permettant de guérir ces patients. Divers mécanismes peuvent être impliqués dans le développement anormal du cerveau, notamment la génération de neurones, leur migration vers leur destination finale et leurs connexions adéquates. En outre, une forme de mort cellulaire programmée apparaît comme un nouveau mécanisme, encore peu étudié, du bon développement du cerveau. Ainsi, certains n'apparaissent que de manière transitoire au cours du développement du cerveau, où ils participent à la construction des circuits neuronaux, et sont programmés pour mourir à la fin de la maturation cérébrale. Une survie aberrante de ces neurones a été constatée chez des patients atteints de troubles neurodéveloppementaux associés à l'épilepsie. De plus, nos travaux récents révèlent que le fait de forcer certains de ces neurones à survivre après la naissance perturbe le câblage du cerveau, ce qui entraîne une activité cérébrale aberrante et des crises d'épilepsie. Notre projet vise à étudier comment la survie aberrante des neurones transitoires chez la souris et l'homme conduit à une activité cérébrale altérée dans les troubles du développement neurologique. Au cours de ce projet, nous identifierons certains mécanismes clés de la "mort cellulaire programmée" au cours du développement du cerveau et évaluerons son rôle dans certains troubles du développement neurologique associés à l'épilepsie, ouvrant ainsi la voie à l'identification de nouvelles cibles ou stratégies d'intervention thérapeutique dans ces troubles.

Bénéfices attendus

La survie anormale des neurones transitoires est une caractéristique des troubles du développement cortical associés notamment à des formes d’épilepsies focales sévères. Comprendre les déterminants cellulaires qui contrôlent le destin de ces cellules permettra de mieux comprendre leur survie anormale dans la pathologie et de concevoir des stratégies visant à y remédier. Une meilleure connaissance de l’intégration de de ces cellules dans les réseaux corticaux et de leur impact sur l’activité corticale permettra à la fois de mieux comprendre comment leur survie anormale promeut l’émergence d’activités pathologiques, et ainsi révèlera de nouvelles cibles à visée thérapeutique dans les affections neurologiques impliquant une survie anormale des neurones transitoires.

Procédures

Un groupe de souris gestantes sera soumis à une courte chirurgie sous anesthésie et analgésie (45 min) pour induire l’expression d’un gène spécifique dans le cerveau de leurs embryons. Une fois les petits nés un antibiotique leur sera administré via la lactation (antibiotique placé en continu dans l’eau de boisson de la mère) afin de permettre l’expression de ce gène. Les mères seront euthanasiées après le sevrage des petits et les petits seront euthanasiés à l’âge adulte par une procédure adaptée. Un autre groupe de souris gestantes sera aussi soumis à une courte chirurgie (45 min) sous anesthésie et analgésie pour induire l’expression d’un virus non pathogène dans le cerveau de leurs embryons. Une fois ces embryons adultes, ils seront eux-mêmes soumis à une chirurgie d’une heure sous anesthésie et analgésie pour induire l’expression d’un second virus non pathogène dans leur cerveau. Les mères seront euthanasiées après le sevrage des petits et les petits seront euthanasiés à l’âge adulte par une procédure adaptée.

Impact sur les animaux

La contention peut provoquer un stress chez l’animal. Les étapes d’anesthésie peuvent provoquer une détresse respiratoire, et une perte de chaleur de l’animal. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer une souffrance et risque d'infection de la cicatrice. Les administrations d'antidouleur/anesthésiques peuvent entrainer une douleur et un stress de courte durée associée à la piqure de l’aiguille.

Devenir

Les animaux seront mis en oeuvre dans des expériences in vitro ou des marrquages histologiques, nécessitant un prélèvement du cerveau. Ils seront donc nécessairement euthanasiés en fin d'experimentation et ne pourront être réutilisés.

Remplacement

Les études menées dans ce projet portent sur le développement du cerveau et les connections entre neurones dans le cerveau adulte. Ainsi, les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées sur des cerveaux intacts, prélevés sur des souris au stade embryonnaire ou adulte, et ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement/adulte. En effet, nous disposons d’outils génétiques puissants chez la souris nous permettant de spécifiquement cibler les neurones d’intérêt ce qui en fait un modèle de choix. De plus, la complexité anatomique du cerveau et des réseaux neuronaux qui s’y établissent ne peuvent être mimés dans aucun modèle in vitro.

Réduction

Les expériences de chirurgie antérieures de nos collaborateurs sur ce type d’étude et de modèle animal indique qu’un échantillon de 6 animaux par condition pour une expérience donnée est suffisant pour mettre en évidence une différence mesurable et significative entre les conditions. A l’aide de ces calculs, nous estimons devoir utiliser 696 animaux dans le cadre de ce projet. Les effectifs ont été confirmés par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans un environnement avec enrichissement (sizzle, cabane en plastique) avec eau et nourriture à volonté. Les animaux seront regroupés en groupe sociaux avant la gestation (pour la mère) et après le sevrage (pour ses petits). Entre ces deux temps, la mère disposera d’une cage seule afin de minimiser le stress lors de la gestation et d’une cage seule avec ses petits avant le sevrage. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Après les chirurgies, les souris seront laissées seules pour une période de convalescence de 24 heures avant d’être remises en groupes sociaux. Après les chirurgies, une litière utilisée spécifique pour les animaux opérés permet de diminuer les risques d'infection de la cicatrice. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, anesthésiée et un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place, en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites, des mesures appropriées seront mises en place.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix afin d’étudier le développement du cerveau ainsi que les connexions neuronales chez l’adulte, à la fois car c’est un modèle présentant un développement très bien caractérisé et stéréotypé mais surtout en raison des similarités du développement du système nerveux entre la souris et l’Homme. De plus, l’organisation de notre structure d’intérêt du cerveau est très similaire chez la souris et l’homme (organisation en couches, morphologie…). Les femelles gestantes sont des adultes. L'expérimentation est menée sur des souris du stade embryonnaire (E11.5-E12.5) jusqu’à l’âge adulte. En effet, les chirurgies concernant l’injection de gène/virus chez l’embryon doit se faire chez l’embryon lors de la neurogenèse de nos neurones d’intérêts et l’analyse de la survie neuronale et des circuits neuronaux doit se faire chez l’adulte car nous nous intéressons aux propriétés du cerveau de la souris adulte.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des périodes d'hypergravité en centrifugeuse, qui provoquent stress, baisse d'activité et perte de poids les premiers jours, puis soumises à une série de tests comportementaux, boîte noir et blanc, reconnaissance d'objet, labyrinthe en Y et piscine de nage. Elles sont ensuite mises à mort pour prélever le cerveau. Le porteur relie le projet aux troubles cognitifs des astronautes et affirme que l'effet de la gravité sur un organisme entier ne peut être modélisé in vitro ou in silico.

Objectifs

Lors des voyages spatiaux, les astronautes sont soumis à des modifications de gravité qui compromettent leurs performances cognitives, et qui représentent encore l’un des principaux écueils concernant les vols de longue durée. Ce projet consiste à comprendre les mécanismes cérébraux, en particulier hippocampiques, induisant ces perturbations provoquées par des changements de gravité. En effet, si le système vestibulaire est le système sensoriel initialement impliqué dans le mal de l’espace, l’hippocampe, structure centrale auquel il est étroitement connecté, représente une cible potentielle de choix. Notre hypothèse est qu’une partie des troubles cognitifs des astronautes seraient liés à des modifications de la plasticité fonctionnelle des réseaux neuronaux hippocampiques, propriété reconnue comme support biologique des processus mnésiques.

Bénéfices attendus

Les données qui seront recueillies grâce à ce projet apporteront des informations essentielles sur le rôle de la gravité dans le fonctionnement de l’hippocampe et des structures associées. En effet, on sait que le système vestibulaire, qui est l’organe sensoriel sensible à la gravité est indirectement connecté à l’hippocampe et participe ainsi non seulement à l’orientation dans l’espace mais aussi à la mémoire spatiale et aux autres fonctions contrôlées par l’hippocampe. Comprendre comment la gravité modifie le fonctionnement et la plasticité de l’hippocampe, et indirectement comment elle affecte les fonctions cognitives servira de base pour trouver des contre-mesures pour aider les astronautes à éviter la désorientation et l’altération des fonctions cognitives qu’ils subissent lors de changements de gravité au cours des vols spatiaux. En utilisant différentes durées d’exposition à l’hypergravité, nous cherchons à évaluer à la fois les adaptations qui s’opèrent dans les premiers jours mais aussi sur le plus long terme et comment s’effectue la réadaptation à 1G post-exposition à l’hypergravité.

Procédures

Les animaux seront exposés à une période d’hypergravité . Ensuite, 96 animaux seront mis à mort dès la sortie de la centrifugeuse pour permettre des prélèvements de tissus (expositions de 24h, 48h, 15j). Les autres seront soumis à des tests comportementaux. Les animaux effectuant des tests comportementaux seront divisés en 2 lots avec des protocoles de comportement différents (exposition à 24h, 15 j ou 30 j d’hypergravité). Pour le premier lot, le premier jour après la sortie de la centrifugeuse, les souris feront un test de la boite noire et blanche (10 min par souris). Ce test vise à évaluer l’anxiété des souris. Le deuxième jours le test de reconnaissance de place d’objet sera utilisé (test qui permet d’évaluer la mémoire spatiale et de reconnaissance à long terme) (2 sessions de 10 min à 4h d’intervalle par souris). Le 3ème jour la sociabilité et la reconnaissance sociale des souris sera évaluée grâce à un dispositif comportemental (2 sessions de 10 min par souris). Le 4ème jour les souris effectueront la première session d’un test d’évitement passif, la seconde partie du test sera effectuée une semaine plus tard (entre 1 et 5 min par souris)(mémoire émotionnelle). Après ces différents tests, soit 2 semaines après la sortie de la centrifugeuse les souris seront mises à mort pour permettre des prélèvements de structures et des enregistrements électrophysiologiques. Pour le lot 2, le jour de la sortie de la centrifugeuse les animaux effectueront le test d’enfouissement de billes (évaluation de l’anxiété,20 min par souris). Le jour 2, les souris effectueront un test d’alternance spontanée dans un labyrinthe en Y (mémoire de travail, 5min par souris). Le 3ème jour les souris commenceront un protocole en piscine de Morris. Ce test, réparti sur 5 jours donnera des indications sur la mémoire spatiale et l’apprentissage (4x4 essais de 1min max par jour). Une semaine après la sortie de la centrifugeuse les souris seront mises à mort pour permettre des prélèvements de structure et des enregistrements électrophysiologiques. Ces études vont nous permettre d’évaluer si les modifications sont concomitantes au niveau comportemental (mémoire) et au niveau cérébral (propriétés électrophysiologiques de l’hippocampe).

Impact sur les animaux

La mise en hypergravité des animaux induit une sensation d’alourdissement qui provoque une augmentation du niveau du stress chez le rongeur, lié à la perturbation de perception de la gravité, et à la difficulté initiale à se déplacer. Par conséquent, et comme cela a été montré dans la littérature, les animaux vont présenter une faible activité motrice pendant une période de quelques heures avant de s’habituer au nouveau référentiel gravitataire et reprendre une activité normale. Une baisse de la température corporelle due à l’inactivité des animaux se produira lors des 3 premiers jours d’exposition. De nombreuses études ont aussi montré une diminution de la masse corporelle les premiers jours de centrifugation. Cette perte de poids est due à une hypophagie médiée par une réaction au stress vestibulaire induit par la centrifugation, au bout de 3 à 4 jours les animaux recommenceront à s’alimenter normalement et reprendront du poids.

Devenir

Les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure (soit 300 souris) pour la réalisation d'analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de l’hypergravité sur un organisme entier. En effet, la gravité exerce des effets sur l’intégralité de l’organisme (systèmes sensoriels, système musculosquelettique, viscères etc.), et les effets de ses modifications et de leurs interactions ne peuvent, à l’heure actuelle, pas être modélisés autrement que sur un organisme dans son intégralité. Par ailleurs, étant donné que nous effectuons des tests comportementaux, nous avons besoin des animaux vivants. Pour les enregistrements électrophysiologiques nous avons besoin de tranches de cerveaux d’organismes ayant été exposés à une hypergravité, qui ne sont pas encore modélisables in vitro ou in silico. Nous avons choisi le modèle souris afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur ce même modèle, car il est de petite taille et peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse. De plus, le modèle souris est un mammifère suffisamment proche de l’homme pour pouvoir transférer les données obtenues entre ces deux espèces.

Réduction

Tous les animaux utilisés pour les études comportementales seront utilisés pour les études post-mortem ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Nous avons défini le nombre d’animaux dans chaque groupe à n=12 en nous basant sur la littérature disponible sur le sujet et sur les travaux du laboratoire utilisant les mêmes méthodes. En effet, un calcul d’effectif sur le site biostatgv.sentiweb.fr nous a permis d’aboutir à ce nombre sur la base de données précédentes acquises au laboratoire. Dans une optique de réduire le nombre d’animaux nous avons décidé de n’utiliser qu’un seul groupe d’animaux témoins et non pas un groupe témoins pour chaque temps d’exposition à l’hypergravité. Aussi, les animaux serviront en plus de la récupération de leur cerveau à des prélèvements sanguins afin d’en réduire leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Une semaine de manipulation des animaux sera réalisée avant les expérimentations afin de réduire le stress lié à la manipulation. Pendant cette semaine les animaux des groupes utilisés pour l’étude comportementale seront aussi habitués à être transportés dans un tunnel en polycarbonate rouge. Le tunnel sera placé à demeure dans la cage puis la souris sera encouragée à entrer dans le tunnel qui sera soulevé afin de faire ensuite délicatement glisser la souris dans la main. Cette méthode permet de ne pas soulever les souris par la queue et enlève par conséquent un facteur important d’anxiété. Lors des tests comportementaux les souris seront placées dans la pièce expérimentale 30 minutes avant le début des tests afin de leur permettre de s’habituer à ce nouvel environnement. De la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition à l’hypergravité (il en sera de même pour les animaux témoins). Leur environnement est enrichi par des frisures de carton et un igloo en papier mâché. Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, à chaque arrêt de la centrifugeuse un responsable des animaux vérifiera quotidiennement leur état de santé et particulièrement d’éventuelles variations de poids, leur apparence physique externe (poils hérissés, blessures…) ou des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement ou réagissant de manière inhabituelle à l’expérimentateur, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et une discussion sera entreprise avec des membres de la SBEA concernant son éventuelle euthanasie (cf grille de points limites).

Choix des espèces

Les données bibliographiques les plus récentes sur ce sujet ont portés sur le modèle souris, il parait donc judicieux de poursuivre avec cette espèce pour pouvoir confronter nos résultats et apporter de nouvelles données. Nous avons également choisi le modèle souris car il est de petite taille, peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse et supporte bien une modification de la gravité jusqu’à 2G. Nous avons également choisi d’utiliser des souris C57BL6 car leur génome est connu et que des modifications de leur génome est possible et pourrait nous être utile par la suite (OGM sans otoconies par exemple). C’est aussi une souche qui est beaucoup étudiée au laboratoire et sur laquelle nous avons donc une importante base de données. Nous utilisons des souris adultes entre 3 et 5 mois car pour étudier la plasticité synaptique hippocampique, nous souhaitons que la croissance et le développement cérébral soient atteints. De plus, les astronautes sont toujours adultes, nos données seront donc plus facilement transposables à l’humain.

1 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une contention de 30 minutes en tube avec prélèvements sanguins pour tester la réponse au stress, une chirurgie d'injection d'un virus dans l'hippocampe sous anesthésie, puis un test de nage en labyrinthe aquatique, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le projet cherche à comprendre pourquoi certains individus vieillissants gardent la mémoire et d'autres non, les retombées pour la maladie d'Alzheimer restant renvoyées au long terme. Le porteur conclut qu'une approche intégrée exige l'animal vivant et qu'aucune technique de remplacement n'est possible.

Objectifs

Au cours du vieillissement, certains individus voient leur mémoire décliner beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables, en comparaison aux individus résilients qui conservent de bonnes capacités mnésiques. La compréhension des processus qui sous-tendent ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles cognitifs liés à l'âge. L’hippocampe est une structure cérébrale jouant un rôle clé dans les mécanismes de mémoire, qui reposent en partie sur la génération de nouveaux neurones tout au long de la vie, processus appelé neurogenèse adulte. Un des mécanismes permettant d’expliquer les différences inter-individuelles de mémoire au cours du vieillissement serait la capacité de ces nouveaux neurones créés à l’âge adulte à s’intégrer (individus résilients) ou pas (individus vulnérables) dans le réseau de l’hippocampe. Il est important de noter que les astrocytes, aussi appelés cellules gliales, sont des partenaires actifs des neurones, notamment au cours des processus de mémoire. En effet, les astrocytes sont capables de détecter l’activité neuronale et d’y répondre en libérant des messagers chimiques. Nous proposons d’identifier si la libération de ces messagers est importante pour l’intégration des nouveaux neurones dans le réseau de l’hippocampe et donc le maintien des capacités mnésiques au cours du vieillissement. Enfin, le stress est connu pour avoir un fort impact sur le vieillissement des individus, et la réponse au stress est un facteur prédictif de vieillissement cognitif. De plus, la neurogenèse et l’état des astrocytes peuvent tous deux être affectés par un événement stressant (aigu ou chronique). Dès lors, il est important de connaître la réponse au stress des animaux pour pouvoir établir une corrélation avec l’état fonctionnel des astrocytes associés aux nouveaux neurones de l’hippocampe et le vieillissement cognitif des individus (résilients/vulnérables).

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences inter-individuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d'Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 6 : • Test de réponse au stress : Les animaux seront placés 30min dans un tube de contention de façon à induire un stress et 3 prélèvements sanguins seront réalisés, à 3 temps différents (1600 animaux seront concernés). • Injections intra-cérébrales de virus : Les animaux seront sous anesthésie gaseuse durant toute la chirurgie (≈1h/animal) qui consiste en une injection de virus dans l’hippocampe, structure cérébrale impliquée dans la mémoire (1600 animaux). • Injections sous-cutanées d’un marqueur de prolifération cellulaire (400 animaux). • Labyrinthe aquatique : Au cours de ce test, les rats nagent dans une piscine et doivent apprendre à localiser une plateforme immergée en s’aidant des indices disposés dans la pièce. Ils passeront au maximum 6min dans l’eau par jour (4 essais consécutifs de 90s maximum), pendant 6 à 15 jours (1400 animaux). • Euthanasie par injection intra-péritonéale d’un mélange d’anesthésique/euthanasiant suivie d’une perfusion intra-cardiaque de fixateur sur cœur arrêté pour l’étude immunohistochimique (400 animaux). • Anesthésie profonde par injection intra-péritonéale d’un mélange d’analgésique/anesthésique suivie d’une perfusion intra-cardiaque de liquide cérébro-spinal artificiel pour l’étude électrophysiologique (1200 animaux).

Impact sur les animaux

Comme lors de tout projet incluant des contentions, des injections et des gestes chirurgicaux, il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adpatées. En effet, même si cela est relativement rare, il se peut que les sites d’injection (intra-péritonéale, sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales s’infectent. De même dans les 2 jours suivant la chirurgie, il est possible que les animaux perdent du poids (~10/20g pour un rat de 400g au moment de la chirurgie) ou présentent des signes de douleur. C’est pourquoi les animaux seront suivis quotidiennement au cours des 3 jours suivant ces actes afin de s’assurer de leur bien être. Au cours de ce suivi, l’expérimentateur en charge du projet remplit une fiche de suivi du bien-être animal avec une grille de score. Enfin, au sujet de l’isolement, certes les animaux seront hébergés en cage individuelle mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.

Devenir

Toutes les parties du projet nécessitent le prélèvement du cerveau des animaux afin de réaliser des analyses à l’échelle cellulaire. Les animaux seront de ce fait mis à mort à l’issue de chaque expérience pour réaliser ce prélèvement.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact du vieillissement sur l’interaction entre astrocytes et nouveaux neurones de l'hippocampe, et ce en fonction du vieillissement des capacités de mémoire. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents de l’équipe, en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales, des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus de l’étude), ainsi que du nombre minimum d’animaux nécessaires à l’observation de différences inter-individuelles au niveau comportemental (test d’apprentissage spatial) qui constituent l’objet de notre étude. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux générés en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les objectifs sont atteints plus précocément que prévu

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en cages collectives enrichies (nids de fibres de peupliers compressées) afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité, réactivité, aspect du pelage) et manipulés hebdomadairement jusqu’à leur euthanasie. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. 10 à 30 min avant la chirurgie, un antalgique sera administré à l’animal afin de prévenir la douleur per-opératoire. Après chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement et quotidiennement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire (comportement, plaie, pesée). Si besoin, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. Nous utilisons des grilles d’évaluation permettant de scorer (0 à 15) de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies mensuellement par l’expérimentateur jusqu’à l’euthanasie des animaux. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera mis à mort par inhalation de gaz carbonique.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la neurogenèse adulte est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’homme. Enfin, cette étude vient compléter les investigations déjà menées sur cette espèce par notre équipe, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante pour contrôler les résultats. Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections intra-cérébrales. Ensuite, les différentes études seront réalisées 1 à 15 mois après les chirurgies. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : un groupe début de vie adulte (rats de 4 mois), deux groupes milieu de vie (rats de 8 et 12 mois) et un groupe fin de vie (rats de 18 mois). Ces âges ont été choisis car ils permettent une étude longitudinale de l’interaction entre astrocytes et néo-neurones en comparant les animaux âgés à des animaux plus jeunes.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-trachéale de particules virales sous anesthésie pour induire des tumeurs pulmonaires, sont transférées entre deux établissements, puis suivies pour la détérioration liée au développement tumoral avant la mise à mort et le prélèvement des poumons. Cette version du projet ajoute un groupe de souris témoins pour renforcer les données. Le porteur étudie le rôle d'une protéine à bromodomaine dans le cancer du poumon et juge le modèle animal nécessaire, les cultures cellulaires restant selon lui trop éloignées de la physiologie.

Objectifs

La transformation maligne des cellules pourrait être considérée comme une série d'événements de reprogrammation cellulaire conduite par des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation en amont. La plasticité et la dynamique de la chromatine sont des déterminants critiques dans le contrôle de la reprogrammation cellulaire. Une augmentation de la dynamique de la chromatine pourrait donc constituer une étape essentielle dans la conduite de l'oncogenèse et dans la génération de l'hétérogénéité des cellules tumorales, ce qui est indispensable pour la sélection des propriétés agressives, y compris la capacité des cellules à se disséminer et à acquérir une résistance aux traitements. L'apport et le dosage d'histones sont les régulateurs les plus connus de la dynamique de la chromatine. En facilitant la reprogrammation cellulaire, le sous-dosage des histones devrait également être crucial dans la transformation cellulaire et les métastases tumorales. L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle d'un facteur à bromodomaine, dans la transformation tumorale et plus particulièrement dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Cette modifcation du projet concerne l'addition d'un groupe de souris contrôles pour renforcer nos données.

Bénéfices attendus

Le gène étudié au cours des 15 dernières années a été largement décrit comme étant surexprimé dans tous les tissus cancéreux humains étudiés et présentant un facteur de mauvais pronostic. Après analyse des articles scientifiques sur ce gènee et le cancer, il s'avère que toutes les études ont été réalisées in vitro avec des modèles de lignées cellulaires de différents cancers ou in vivo en utilisant des modèles de xénogreffes. Ceci rend difficile de conclure sur le degré d’implication de ce gène dans l’initiation et la progression tumorales in vivo d’où la nécessité de développer des modèle (s) animaux de cancer impliquant directement cette protéine. Les expériences entreprises dans ce projet devraient nous permettre de démontrer si l’activité de la protéine d'intérêt est nécessaire pour la réponse du génome à des facteurs oncogéniques. Ce travail devrait permettre non seulement de découvrir un mécanisme moléculaire de base essentiel mais encore inconnu, mais constitue aussi une étape commune critique dans la transformation maligne.

Procédures

Les animaux recevront par voie intra-trachéale une injection unique et sous anesthésie de particules virales induisant la mutation désirée dans les poumons. Aucun prélèvement ni procédure chirurgicale n'est prévu durant cette période. La préparation des particules virales dure 30 minutes environ. La durée de l'anesthésie est de 5 minutes par souris. Une fois anesthéssiées, les souris recevront par voie intratrachéale une dose de particules virales. Cette étape dure 1 à 5 minutes par souris. À la fin de cette étape, les animaux seront placés pendant 10 à 15 minutes sur une plaquante chauffante dans un environnement calme afin de leur permettre de se réveiller.

Impact sur les animaux

Dans cette partie du projet, les souris recevront une injection unique de particules virales sous anesthésie générale. Elles seront hébergées dans un premier établissement utilisateur avant d'être transférées dans un second établissement où elles seront suivies et observées pour le développement tumoral. Une détérioration de l'état général des animaux lié au développement tumoral sera étudié.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort et les poumons prélevés pour analyse histologique et biochimique.

Remplacement

Bien que les propriétés fonctionnelles du facteur que nous investigons dans cette étude aient été initialement abordées par des tests in vitro et dans des modèles de cultures cellulaires, ces derniers présentent néanmoins des limites considérables. Il n’est pas possible d’appréhender l’ensemble des mécanismes que nous étudions sans l’apport du modèle animal. A ce jour et à notre connaissance il n’existe pas de modèle animal qui permet de déterminer le rôle de notre protéine dans l’initiation et la progression tumorales. Nous avons développé des modèles alternatifs en invalidant des gènes d’intérêt dans des cellules souches de souris ou dans des lignées humaines ou encore l’utilisation de modèles de xénogreffes, mais ces systèmes basés sur la culture cellulaire in vitro présente plusieurs limites. Ce modèle de culture cellulaires est en effet très loin de la physiologie animale et ne reflète pas les évènements de dynamique de la chromatine qui ont lieu in vivo.

Réduction

Après avoir discuté avec nos biostatisticiens nous nous étions fixés un nombre minimal de 4 animaux par groupe nécessaire afin de réaliser une cinétique d'infection pour suivre l'évolution des tumeurs (sur le plan histologique mais aussi et surtout au niveau moléculaire) et pouvoir l'analyser statistiquement, car les tumeurs pulmonaires sont très hétérogènes. D'autre part, d'après notre expérience, il arrive que des animaux décèdent lors de l'expérimentation. Une réduction de nos groupes expérimentaux initiaux rendrait caduque l’interprétation et l'analyse de nos données, c'est pourquoi nous comptons faire un individu supplémentaire si besoin. Enfin, contrairement à la version précédemment autorisée nous ne réaliserons des prélèvements qu’aux 2 temps les plus pertinents par rapport aux données déjà obtenues (6 et 12 semaines) et plus à 5 temps (4, 6, 8, 10 et12 semaines), ce qui nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. C’est pourquoi nous avons n=5 animaux par groupe x 2 lignées 2 temps d’analyse différents.

Raffinement

Les injections de particules virales sont faites sous anasthésie générale pour limiter la douleur et le stress. Les souris seront maintenues sous tapis chauffant pour éviter une perte de tempréature. Du gel occulaire sera appliqué pour éviter la déshydratation. Des points limites seront mis en place pour maintenir un état de douleur léger.

Choix des espèces

Afin de mieux comprendre les mécanismes de développement et d'aggessivité tumorales et pour découvrir de nouveaux moyens plus efficaces pour diagnostiquer et traiter le cancer, il est nécessaire de mener des recherches sur les animaux vivants. Les études sur les souris sont essentielles pour comprendre la complexité des processus fondamentaux qui sous-tendent le cancer dans les organismes vivants. Les souris utilisées dans cette étude viennent d'un laboratoire de recherche américain. Le modèle a été validé sur des souris agées de 6 à12 semaines afin d'induire les tumeurs. Les souris de cet âge sont suffisement adultes pour se rétablir assez rapidement des effets de l'anesthésie, du volume des particules virales utilisé anisi que des effets de l'intubation intratrachéale.

872 amphibiens vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les grenouilles vertes relâchées et les xénopes tués. Des adultes capturés dans la nature reçoivent une injection d'hormone sous anesthésie pour obtenir des pontes, puis les têtards sont soumis à des tests de comportement face à un prédateur, en cages flottantes ou en mésocosmes. Les 436 grenouilles vertes et leurs têtards sont relâchés, tandis que les 436 xénopes et leurs têtards reçoivent une surdose d'anesthésique, cette espèce classée envahissante ne pouvant être remise dans le milieu. Le porteur présente l'étude comme utile à la conservation de la grenouille verte, quasi menacée, et affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer l'observation directe des interactions.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’apporter des éléments de connaissance sur la sensibilité des populations d’amphibiens autochtones comme la grenouille verte à des changements environnementaux majeurs auxquels l’espèce est confrontée. Si les études scientifiques sur l’écologie de la grenouille verte sont nombreuses, l’impact de la présence de potentiels compétiteurs et/ou prédateurs invasifs sur la dynamique des populations de grenouille verte restent très mal documentés. L’étude se propose ici de tester l’impact de la présence des têtards de xénopes lisses Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis une vingtaine d’années dans les mares, cours d’eau et rivières. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet visera à étudier l’impact de la présence du xénope sur la croissance (durée de la période larvaire), la survie, la taille à la métamorphose et le comportement de la grenouille verte. Pour ce faire, il est nécessaire d’obtenir des pontes de grenouilles vertes et de xénopes à partir d’adultes capturés en milieu naturel puis injectés à l’aide d’une hormone. Une fois les pontes obtenues les adultes de grenouilles vertes seront relâchés et les adultes de xénopes seront mis à mort (dû à son statut d’espèce exotique envahissante) puis les têtards seront soit placés en cages flottantes dans une mare, soit en mésocosmes placés en laboratoire. Dans les deux situations, les têtards seront placés sous des conditions de compétition différentes (intra- et interspécifique) et sous une ou deux densités différentes (1 et 3 têtards.L-1). Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé.

Bénéfices attendus

Ce projet s’insère dans les problématiques de conservation et gestion de la biodiversité. Il s’inscrit dans le défi scientifique actuel visant à comprendre les mécanismes en lien avec la sensibilité des organismes à l’altération spatio-temporelle de leur habitat dont la présence des espèces exotiques envahissantes est annoncée comme l’une des principales causes de l’érosion de la biodiversité. Ce projet nous permettra de tester pour la première fois l’impact de la présence du xénope sur la croissance, la survie, la taille à la métamorphose et le comportement des grenouilles vertes. Nous émettons l’hypothèse que la présence de têtards de xénope dans le milieu de vie des grenouilles vertes pourrait induire une diminution de leur croissance et survie en affectant des fonctions écologiques vitales chez la grenouille verte. D’un point de vue comportemental, nous émettons l’hypothèse que la présence de xénope induirait des comportements anti-prédateurs. Ces résultats permettraient une meilleure compréhension de la biologie et de l’écologie de ces deux espèces et plus encore sur leur interaction. De manière plus globale, cette étude permettra d’apporter des éléments scientifiques qui viendront enrichir les discussions sur les stratégies de gestion/conservation de ces espèces à l’échelle du territoire notamment depuis que le xénope a colonisé beaucoup de zones humides du Maine-et-Loire.

Procédures

Le transport durant 30 minutes sera assuré dans une double boite réduisant les risques de chocs. Femelles et mâles seront injectés d’hormones pour induire l’ovulation et stimuler l’accouplement. Avant l’injection, les amphibiens seront anesthésiés dans un bain de sédatif (endormissement en 15 minutes, réveil en 10 minutes). Après l’accouplement et l’ovulation, les œufs seront laissés dans les bacs et les adultes seront déplacés dans un autre mésocosme avec les mêmes conditions environnementales. Une partie des têtards obtenus (n=250 têtards de grenouilles vertes et n=250 têtards de xénopes) seront répartie dans les cages flottantes dans la mare et une autre partie des têtards obtenus (n=180 têtards de grenouilles vertes et n=180 têtards de xénopes) seront répartis en mésocosmes sous conditions contrôlées. Ces têtards élevés en milieu contrôlé seront au bout de trois jours (stade 25) passés en tests de comportement. Ces tests seront au nombre de trois (avec 48h entre chaque test), deux face à un prédateur (xénope adulte et grenouille verte adulte) et un face à un contrôle (grenouille en plastique). Les tests seront filmés et dureront 30 minutes (15 minutes d’acclimatation puis 15 minutes de test). Chaque groupe expérimental passera une fois le test dans chacune des trois conditions. Une fois les tests passés, les adultes et les têtards seront replacés dans le milieu naturel pour les grenouilles vertes après avoir été pêchés de leur bac d’élevage, placés dans une double boite de transport puis rapportés sur leur site d’origine après 30 minutes de transport. Les xénopes ne pouvant pas être libérés dans la nature seront en revanche placés dans un bain de sédatif pour être anesthésiés puis une surdose d’anesthésiant sera ajoutée pour la mise à mort des xénopes adultes.

Impact sur les animaux

Il est envisageable qu’un individu soit blessé lors de la capture ou de la manipulation et par conséquent développe une maladie. L’effet indésirable le plus probable est le stress lié au transport et aux conditions d’hébergements. De plus, à leur arrivée dans le laboratoire, certains animaux pourraient ne pas s’acclimater à leur environnement.

Devenir

Les six grenouilles vertes adultes et les 180 têtards seront remis en liberté avec une acclimatation à leur milieu naturel en ouvrant les boites de transports à côté de leur mare d’origine. Les animaux seront observés le temps qu’ils sont visibles après l’ouverture des boites afin de s’assurer de leur bonne acclimatation à leur milieu. Les six xénopes adultes et les 180 têtards seront mis à mort avec une surdose d’anesthésiant après une anesthésie en balnéation car il est impossible de relâcher dans le milieu naturel cette espèce classée comme espèce exotique envahissante. Les 250 têtards de xénope placés dans les cages seront après métamorphose mis à mort avec une surdose d’anesthésiant et les 250 têtards de grenouille verte après métamorphose seront libérés dans la mare.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant d’étudier la survie, la croissance et le comportement des premiers stades de vie de la grenouille verte face à la présence d’un compétiteur et d’un prédateur, il n’est pas possible de remplacer les animaux prévus pour cette expérimentation. Il est donc nécessaire de recourir à des animaux. De plus, il est impossible de modéliser les réponses des têtards face à la compétition et face à la prédation car c’est la première fois que cette question sera posée pour ces deux espèces dans un contexte semi-contrôlé et en testant la compétition indirecte. Par conséquent, aucun modèle ne pourra permettre de prédire ce qu’il va se passer.

Réduction

Les trois couples de grenouilles vertes et les trois couples de xénopes soit trois femelles et trois mâles Pelophylax spp. et trois femelles et trois mâles Xenopus laevis seront amenés au laboratoire et injectés d’hormones permettant d’induire la ponte et de stimuler l’accouplement. Les trois couples de chaque espèce sont le minimum pour assurer la quantité d’œufs et donc la quantité de têtards nécessaire pour l’expérimentation en cages flottantes et en mésocosmes. Pour l’étude sur les têtards en mésocosmes, les trois réplicats par modalité (grenouilles vertes ; xénopes ; grenouilles vertes – xénopes) sont le minimum pour obtenir des résultats statistiques viables (modèle linéaire permettant d’étudier les interactions statistiques sur le comportement des individus testés). Par ailleurs, la densité de têtards (3 têtards.L-1), nous semble appropriée pour pouvoir observer des interactions entre les individus. Les triplicats permettent de rendre compte de la variabilité interindividuelle existante au sein des groupes tout en obtenant une moyenne au plus proche de la réalité.

Raffinement

Le transport de la zone de prélèvement en milieu naturel vers le laboratoire sera effectué dans des bacs fermés à l’abri de la lumière pour limiter le stress des animaux. Les amphibiens étant des espèces proies, il est important de leur fournir un abri. Des tuyaux en plastiques et des objets flottants seront disposés dans les bacs permettant aux amphibiens de se cacher. De plus, afin d’apporter un environnement plus complexe aux amphibiens, des pierres seront disposées dans les bacs. Avant, l’expérimentation, la qualité de l’eau (dureté et chlore) sera testée. Chaque jour, une personne habilitée et formée sera en charge de vérifier le comportement des amphibiens avant et après l’injection d’hormones (en dehors des périodes de nourrissage). La qualité d’eau, c’est-à-dire les paramètres physico-chimiques sera mesurée une fois par semaine. En cas de mauvaise qualité d’eau (au-delà des seuils précités), un changement d’eau sera effectué puis une mesure deux jours après sera reprise pour s’assurer que les amphibiens sont dans un environnement stable. Enfin, l’anesthésie en balnéation avant l’injection d’hormone permettra de limiter tout stress. Les différentes phases de réveil seront surveillées ainsi qu’un retour à l’alimentation 24h après l’injection. Pour la phase expérimentale en mésocosme, le transport de la zone d’élevage à la zone expérimentale sera effectué dans des bacs couverts permettant de placer les individus dans le noir limitant le stress des amphibiens lors du transport. Une mauvaise qualité d’eau reportera le test prévu jusqu’à ce que la qualité d’eau revienne aux seuils exigés ci-dessus. Enfin, les tests de comportement seront toujours précédés d’un temps d’acclimatation (15 minutes) au dispositif afin que les individus puissent revenir à un taux d’activité normal après le transfert des mésocosmes vers le dispositif de test. Il est prévu également un repos de 48h entre chaque test. Le bien-être sera évalué par une grilles déterminant les points limites à la continuité du projet. Infections, blessures, comportement, dépigmentation et prise alimentaire seront évalués grâce à une échelle de score donnant un score global compris entre 0 (normal – aucune action) à supérieur à 7 (mise à mort de l’amphibien avec une surdose d’anesthésique).

Choix des espèces

Les deux espèces choisies sont : la grenouille verte Pelophylax spp. et le xénope Xenopus laevis. L’objectif de cette étude est de comprendre l’impact de la présence des têtards de xénopes lisses Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis quelques années dans les mares, cours d’eau et rivières de Maine-et-Loire. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé. Aujourd’hui, il apparaît donc nécessaire de comprendre l’impact de la colonisation du xénope dans sa globalité dès les plus jeunes stades de vie.