Recherche fondamentale

Sensibilisées à des allergènes, exposées deux fois par semaine pendant six semaines par inhalation, prélevées chaque semaine, 5 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les modèles reproduisent l'asthme allergique, l'allergie alimentaire et la réaction anaphylactique, cette dernière pouvant faire chuter la température corporelle. Une trachéotomie terminale sous anesthésie clôt le protocole, sans réveil possible. Toutes les souris sont ensuite tuées pour prélever sang et organes.

Objectifs

Les maladies allergiques, qu’elles soient respiratoires (comme l’asthme allergique) ou alimentaires, sont en constante augmentation dans le monde, aussi bien dans les pays développés que dans les pays en développement. En France, on estime qu’environ un tiers de la population est concerné par au moins une forme d’allergie. Certaines de ces pathologies peuvent être graves, voire mettre en jeu le pronostic vital, comme certaines formes sévères d’asthme ou les réactions allergiques aiguës liées à l’ingestion de fruits à coque. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de prévenir efficacement les allergies ou d’en contrôler durablement les symptômes. Les mastocytes, qui sont des cellules du système immunitaire, jouent un rôle central dans les réactions allergiques. Leur activation, notamment via les immunoglobulines E (IgE), déclenche les phénomènes inflammatoires responsables des symptômes. Dans ce contexte, ce projet propose d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques reposant sur l’utilisation d’anticorps humanisés ciblant les IgE. Ces stratégies seront étudiées dans différents modèles d’allergies majeures, incluant l’asthme allergique, l’allergie alimentaire et les réactions anaphylactiques. L’objectif est d’améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans les allergies et d’identifier de potentielles pistes de traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies allergiques, en particulier dans l’asthme allergique, les allergies alimentaires et les réactions anaphylactiques. Ces pathologies, fréquentes et parfois graves, représentent un enjeu important de santé publique. Le projet proposé permettra de mieux caractériser le rôle de certains acteurs clés du système immunitaire dans le déclenchement et l’amplification des réactions allergiques. Cette meilleure compréhension est indispensable pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À plus long terme, les connaissances acquises dans le cadre de ce projet pourraient contribuer au développement d’approches thérapeutiques innovantes, visant à prévenir ou à mieux contrôler les réactions allergiques, et ainsi à réduire leur impact sur la qualité de vie et la santé des patients.

Procédures

Chaque injection se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que les inhalations (2x par semaine pendant 6 semaines) et les injections intra-dermiques (1x dans le modèle de PCA) se feront sous anesthésie gazeuse, (induction/perte de conscience : 2min ; inhalation 20 sec). Des prélèvements sanguins seront réalisés en sub-mandibulaire sur animal sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine, avec alternance des joues de prélèvement (induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec). Une trachéotomie sera réalisée sous anesthésie générale, après vérification de la profondeur de la narcose et suppression de tout réflexe (10-15min), par du personnel diplomé en « chirurgie de l’animal de laboratoire », en fin de procédure expérimentale et sans réveil possible (procédure sans réveil).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés aux procédures expérimentales et aux modèles d’allergie utilisés. Les administrations de traitements par injection peuvent entraîner une douleur aiguë de courte durée liée à la piqûre (quelques secondes) ainsi qu’un inconfort transitoire au point d’injection. Des nuisances spécifiques sont attendues en fonction des modèles d’allergie étudiés. Dans le modèle d’asthme allergique, l’exposition aux allergènes par voie respiratoire peut induire une gêne respiratoire transitoire. Dans le modèle d’allergie alimentaire, le gavage peut entraîner un stress de courte durée lié à la contention et à l’administration (environ 20 secondes). Ce modèle peut également provoquer des troubles digestifs (diarrhées, inconfort abdominal). L’induction d’une réaction anaphylactique peut entraîner une baisse transitoire de la température corporelle. Dans le modèle d’anaphylaxie cutanée, une inflammation locale (gonflement de l’oreille) est attendue, pouvant être associée à une sensibilité ou une douleur locale, difficilement quantifiable en l’absence de signes comportementaux marqués. Afin de limiter la douleur et le stress, plusieurs mesures seront mises en place. Les procédures potentiellement les plus invasives ou stressantes (notamment certains prélèvements sanguins et expositions par inhalation) seront réalisées sous anesthésie lorsque cela est compatible avec les objectifs scientifiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière permettant de détecter précocement tout signe de souffrance, et des critères d’arrêt seront appliqués si nécessaire.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser des prélèvements de sang et d’organes pour analyser les cellules et les tissus, notamment grâce à des techniques permettant d’identifier les différents types de cellules et d’observer leur organisation au sein des tissus (comme la cytométrie en flux ou l’histologie).

Remplacement

Bien que des expériences in vitro avec des cellules humaines ou d’animaux sont réalisées au laboratoire, celles-ci expériences in vitro ou méthodes alternitives ne permettent pas de reproduire la réponse systémique d’un organisme complet. Les maladies allergiques sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (épithélium, organes lymphoïdes secondaires, système vasculaire…). C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux est primordiale afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les différents modèles allergiques.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux contrôle versus 4 animaux allergiques de même âge et sexe pour chaque expérience. Pour certaines procédures, chaque souris sera son propre contrôle (une oreille traité vs. une oreille contrôle). Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, un des tests statistiques suivants sera utilisé :1-way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et les conditions d'hébergement (enrichissement des cages avec des carrés de ouates, igloos...) seront également surveillées. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cage de 500cm² en portoir ventilé dans un environnement contrôlé. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Bien que des signes de douleur ne semblent pas apparaître dans nos modèles d’allergie, tout animal, présentant une douleur évidente (isolement, baisse importante de l’activité, perte de poids > 10%, pilo-érection et/ou grimace) sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 7 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Tuées à l'issue même quand la tumeur régresse, 200 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules cancéreuses humaines sous anesthésie, puis des lymphocytes humains modifiés, avec un suivi par imagerie. Le projet teste des cellules CAR contre des cancers du sang et des tumeurs solides, sur la base de résultats obtenus en culture. Le porteur justifie la mise à mort de toutes les souris, y compris celles en rémission, par le risque d'une reprise de la tumeur et de la souffrance associée.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Malgré son efficacité dans le traitement de cancers sanguins comme la leucémie, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Ce projet vise donc à étudier l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient contribuer à améliorer les immunothérapies dans le traitement du cancer. Le projet se déroule dans 2 EU différents.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du sein et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d’accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue (EU1). Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions (EU1). Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Des imageries par bioluminescence nécessiteront des injections de luciférine qui se feront en IP sur animal vigile (EU2). Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse. À la fin de l’expérimentation, les animaux seront mis à mort après anesthésie générale à l’isoflurane (EU2).

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peut occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisances comme une nécrose pourrait apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 1500 mm3 pour les tumeurs sous cutanées). L’apparition de gêne respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une parésie des membres arrière peuvent être observées (pour la tumeur Raji).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle ainsi que son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons utiliser un modèle murin afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=10 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une puissance statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées trois fois par semaine pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur. De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

Rendues transgéniques pour ne plus produire une protéine des parois artérielles, puis nourries au régime gras, des souris développent des plaques dans leurs artères: 1 882 animaux vont être utilisés dans des procédures classées modérées, tous tués. Le génotypage passe par un prélèvement d'oreille sur près de mille souriceaux, et 893 animaux transgéniques peuvent voir leur mobilité se réduire aux stades avancés. Le porteur veut établir le rôle de cette protéine dans l'athérosclérose, première cause de maladies cardiovasculaires. Les souris d'élevage sont tuées à neuf mois, les autres après sept à huit mois de régime gras, délai qu'il juge "suffisant pour conclure".

Objectifs

L'athérosclérose est la principale cause de maladies cardiovasculaires. Elle se caractérise par l’accumulation de lipides dans la paroi des artères ce qui engendre la modification de la composition du tissu sous-jacent à ces dépôts et par conséquent la fragilisation des vaisseaux sanguins. Notre équipe de recherche s’intéresse à la protéine X. Cette protéine est présente dans de nombreux tissus sains et notamment dans la paroi des artères. L’absence de cette protéine X chez l’homme est associée à une fragilité et un dysfonctionnement des vaisseaux sanguins (ecchymoses spontanées, complications hémorragiques avec saignements gastro-intestinaux et hémorragies post-partum ainsi que anévrismes aortiques thoraco-abdominaux) et les mêmes conclusions ont été établies dans notre modèle de souris transgéniques déficientes en protéine X. Notre objectif est de démontrer le rôle prépondérant de la protéine X dans le développement de l’athérosclérose. Pour cela, nous accouplerons des souris déficientes en protéine X avec des souris transgéniques développant des plaques graisseuses dans la paroi des artères quand elles sont nourries avec un régime riche en graisse. Chez ces souris doublement transgéniques, nous analyserons la vitesse de formation des plaques graisseuses et la composition de la paroi des artères malades. Nous étudierons également comment la protéine X évolue (diminue ou augmente) dans la paroi des artères de souris transgéniques développant des plaques graisseuses quand elles sont nourries avec un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre l’évolution de la présence de la protéine X dans le développement de l’athérosclérose ; de comprendre son rôle sur celle-ci (rôle positif ou négatif) ; et à terme, d'envisager cette protéine comme un marqueur pour permettre le dépistage précoce de l’athérosclérose et peut-être de cibler cette protéine pour le traitement des patients.

Procédures

Pour le génotypage, un prélèvement sur souris vigile d'un bout d'oreille (

Impact sur les animaux

240 animaux au total seront nourris avec un régime riche en gras à partir de 8 semaines post-naissance, ce qui entraînera une augmentation de la masse corporelle et pourra provoquer un inconfort digestif ou une stéatose hépatique (foie gras) pouvant conduire à une jaunisse. Cependant aucun symptôme évident (troubles majeurs de l’alimentation, comportement…) associé au développement de la pathologie n’a été rapporté chez ces souris aux stades étudiés. Des difficultés d'agrippement pourraient être observées sur une partie des souris transgéniques (893 animaux au total) conduisant à une mobilité légèrement réduite à des stades avancés (>8 mois). De manière générale, les animaux subiront différentes contentions pouvant générer un stress léger de quelques minutes.

Devenir

Tous les animaux d'élevage seront mis à mort à 9 mois. Une reproduction au-delà de ce point de cinétique pourrait impacter le bien-être des animaux et pourrait conduire à une baisse de la fertilité. Pour l'analyse du rôle de la protéine X dans l’athérosclérose, les animaux seront mis à mort au maximum à 8 semaines + 24 semaines de régime riche en graisses soit entre 7 et 8 mois, temps nécessaire et suffisant pour conclure sur le rôle de la protéine X.

Remplacement

Des travaux préalables ont été réalisés dans notre équipe et notamment des analyses sur des aortes de souris déjà prélevées. Toutefois, le développement de la lésion d’athérosclérose implique la participation de nombreux tissus environnants (vaisseaux sanguins, système immunitaire) et de l’organisme dans son ensemble. Il nous est impossible de reproduire les conditions d’initiation et de développement de la pathologie dans des modèles cellulaires. Ainsi, le recours aux modèles de souris génétiquement modifiées est nécessaire pour comprendre le rôle de la protéine X dans l’athérosclérose.

Réduction

Pour l'élevage des souris transgéniques, nous avons réduit le nombre de souris générées au minimum pour réaliser l’ensemble de notre projet. Pour l'analyse du rôle de la protéine X dans l’athérosclérose, nous avons choisi nos effectifs d’après la littérature, nos connaissances des modèles transgéniques utilisés et le type d’analyses à réaliser sur les tissus collectés. Ainsi, le nombre d’individus utilisés est minimal et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en réduisant la souffrance subie par les animaux.

Raffinement

Aucune des souris transgéniques utilisées ne présente de défauts de reproduction ou de vieillissement, ni de sensibilité à des pathogènes communs. Cependant, les souris déficientes en protéine X sont hyperlaxes et présentent des difficultés légères à l'agrippement, même si leur locomotion n'est pas altérée. Pour s'assurer du bien-être des souris, elles seront surveillées de leur naissance à leur mort quotidiennement et seront mises en reproduction de 6 semaines à 9 mois, âge maximal de leur mise à mort. Une surveillance des souris sera réalisée quotidiennement et les animaux seront pesés 1 fois par semaine au cours du développement de l’athérosclérose et notamment dès le début de la mise en place du régime riche en lipides. La qualité de l’alimentation sera également vérifiée (aspect, fraicheur) toutes les semaines et l’alimentation sera changé si besoin. Le même soin sera apporté aux changements des litières pour éviter les dépôts de gras dans la cage. Dans tous les cas, l’alimentation sera changée au minimum systématiquement toutes les 2 semaines pour s’assurer de sa qualité et éviter tout problème d’appétence ou trouble digestif pour les animaux. Le projet a été établi de manière à réduire au minimum les gestes invasifs réalisés sur les animaux. Ainsi, pour les souris transgéniques dont le génotype est certain (parents de même génotype), il sera vérifié après la mise à mort en fin de procédure, évitant ainsi le prélèvement d’une biopsie. Nous testerons également sur 2 lots de souris, une nouvelle technique de prélèvement des aortes sur animaux fraichement mis à mort pour vérifier que la qualité des échantillons est toujours optimale pour nos marquages tissulaires. Si les marquages sont toujours de qualité, nous réaliserons le prélèvement des tissus aortiques après la mise à mort pour toutes les autres souris concernées de la DAP, ce qui participera au raffinement de nos procédures. Lors de la mise à mort par injection, les souris seront préalablement endormies et la solution sera diluée pour que celle-ci ne soit pas irritante (et donc douloureuse) pendant l’injection. Enfin, certains animaux subiront une diète de 20 semaines maximum (au lieu de 24), pour tenir compte d’un éventuel développement plus précoce de la pathologie. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris au maximum (suivant le poids des souris) par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, bâton, et maison en carton).

Choix des espèces

Notre objectif est de comprendre le rôle de la protéine X dans le développement de l’athérosclérose. Le modèle murin est un modèle de choix pour les études des maladies cardiovasculaires. En effet, la proximité génétique et physiologique de la souris avec l’homme permet de reproduire de nombreux aspects de la pathologie humaine, tant sur le plan moléculaire que cellulaire. Le modèle de souris transgénique utilisé est un modèle d’athérosclérose connu et documenté. Il est considéré comme la référence pour l’étude du développement de la pathologie. La cinétique de la pathologie a été largement étudiée et nous savons donc que les stades de développement des plaques chez la souris imitent de manière étroite la progression de l'athérosclérose humaine. Pour l'élevage, les souris seront mises en reproduction à 6 semaines post-naissance jusqu'à 9 mois max. Les souris ne sont pas utilisées au-delà des 9 mois pour éviter une baisse de fertilité potentielle et tout mal-être potentiel. Les souris seront soumises à une diète riche en graisse à partir de 8 semaines après la naissance et seront suivies jusqu'à leur mise à mort (maximum 8 + 24 semaines = 32 semaines). Les souris génétiquement modifiées utilisées n'ont pas de problème de reproduction, ni de vieillissement, mais montrent des difficultés légères lors de tests d'agrippements et de suspension. Pour éviter leur mal être induit par une période de reproduction avancée, elles ne seront mises en reproduction qu'à partir de 6 semaines jusqu'à 9 mois post-naissance. Nous travaillerons sur des souris adultes, donc matures sexuellement pour standardiser notre modèle et cette maturité est atteinte chez le mâle et la femelle entre 5 et 7 semaines.

Le protocole dépend du mode d'administration, de la fréquence et de la durée demandés par le donneur d'ordre: 600 rats, 120 porcs et 50 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des formulations de médicaments contre le diabète et l'obésité. Les porcs portent un cathéter à demeure jusqu'à quatre mois, subissent des jeûnes et des anesthésies répétées, les chiens et les rats des prélèvements de sang à la jugulaire. Le porteur décrit un effet possible trop marqué des molécules, avec hypoglycémie et perte de poids. Les rats sont tués en fin d'étude, les porcs réutilisés puis tués quand leur poids gêne les manipulations, une partie des chiens réutilisée et le reste proposé à l'adoption.

Objectifs

L’obésité et le diabète constituent deux enjeux majeurs de santé publique à l’échelle mondiale. Selon l’Organisation mondiale de la santé, la prévalence de l’obésité a presque triplé depuis 1975 : plus d’un milliard de personnes vivent désormais avec une obésité, dont une proportion croissante d’enfants et d’adolescents. Cette progression s’accompagne d’une augmentation rapide du diabète de type 2, fortement associé au surpoids et à la sédentarité. D’après l’International Diabetes Federation, environ 537 millions d’adultes vivaient avec un diabète en 2021, et ce chiffre pourrait dépasser 640 millions d’ici 2030. En Europe, la prévalence du diabète avoisine 8 à 10 % chez l’adulte, avec un poids économique considérable pour les systèmes de santé en raison des complications associées. Les traitements de ces maladies reposent en grande partie sur l’utilisation de différents types de molécules actives agissant sur la glycémie ou le métabolisme. Cependant, l’efficacité d’un médicament ne dépend pas uniquement de la molécule active qu’il contient, mais aussi de la manière dont elle est formulée et présenté. La forme pharmaceutique, c’est-à-dire la manière dont un médicament est présenté (comprimé, gélule), joue un rôle essentiel dans son efficacité. Elle influence la vitesse à laquelle le principe actif est libéré dans l’organisme, son absorption et donc l’intensité et la durée de son action. Les excipients, souvent perçus comme de simples composants « inactifs », sont également déterminants : ils assurent la stabilité du médicament, facilitent sa dissolution et son absorption. Ainsi, le choix de la forme pharmaceutique et des excipients ne relève pas seulement de la fabrication, mais constitue un levier majeur pour optimiser l’efficacité des traitements. Le but du projet est de tester de nouveau excipient qui ont vocation à améliorer l’efficacité de molécules pour mettre à disposition des thérapeutes un large panel de médicaments à action rapide ou lente pour le traitement ces pathologies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : 1- Santé : Pour les patients, de nouveaux traitements plus efficaces, mieux tolérés et plus simples d’utilisation pourraient améliorer significativement leur qualité de vie. Des formes d’administration moins contraignantes, des effets secondaires réduits et une meilleure efficacité sur le poids ou la glycémie favoriseraient l’adhésion au traitement et l’autonomie des personnes malades. 2- Economique : ces innovations pourraient générer des économies pour les systèmes de santé en réduisant les hospitalisations, les complications coûteuses et les traitements lourds associés aux formes avancées de la maladie.

Procédures

Les porcs seront anesthésiés pour la mise en place du cathéters. Les injections d'anesthésiques se feront dans le muscle et seront très bref, quelques secondes. Les animaux seront ensuite maintenus anesthésiés grâce à une anesthésie gazeuse. Ils resteront anesthésiés (gazeuse) le temps de la pose du cathéter soit environ 45min. Les cathéters restent à demeure et sont remplacés s'il deviennent non fonctionnel au cour du projet. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles par l'intermédiaire des cathéters. Si les cathéters sont non fonctionnel et qu'il n'est pas possible dans reposer un pour le prochain prélèvement, celui-ci sera réalisé à la jugulaire sur animal anesthésié. La pose de cathéters chez les chien sera réalisée sur animal vigile, les cathéters seront implantés à une veine au niveau de la patte. La durée de l'intervention est de 5 min. Un cathéter est posé avant chaque session de prélèvement. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles par l'intermédiaire des cathéters pour les temps court. Pour les temps long ou si le cathéter est non fonctionnel, les prélèvements sont réalisés sur animal vigile à la jugulaire. Nous réaliserons 4 à 5 prélèvements de ce type pour une durée n'excédant pas 1 min par prélèvement. Pour les rats, les prélèvements seront réalisés sur animal aneshésié (anesthésie gazeuse), les prélèvements sont réalisés à la jugulaire, la durée est 5min pour l'anesthésie plus le prélèvement. Le nombre de prélèvements sanguins nécessaire par session sera le suivant : Porc entre 15 à 18 prélèvements, chien entre 10 à 15 prélèvements et rats entre 10 à 15 prélèvements.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues peuvent être dus à un effet trop important des molécules testées. Il peut s’agir d’hypoglycémie, perte d’appétit, perte de poids survenant quelques jours après l’administration. Les élements suivants provoqueront du stress et un inconfort chez les animaux : 1- Toutes les anesthésies générales nécessaires aux prises de sang, aux administrations d'éléments d'essais ou aux poses de cathéter pour les porcs. 2- Les administrations d'élement d'essai sur animaux vigiles. Exemple administration orale chez le chien ou sous-cutané chez le rat. 3- L’isolement dû à la mise en place d’un cathéter, permanant chez le porc (maximum 4 mois) et transitoire chez le chien (max 4h). 4- Les mises a jeun nécessaire pour les administrations d'élements d'essais ou pour les anesthésies. La mise à jeun solide sera de 20H maximum pour les porcs et les chiens et de 6H pour les rats. La mise à jeun hydrique sera elle de 3H maximum pour les porcs, les chiens et les rats. 5-Pour les cohortes de porcs et de chiens la répétition des études peut engendrer des effets cumlatifs. Ces effets correspondent à l’ensemble des conséquences physiologiques (altération des paramètres sanguins), clinique (inflammation des sites de prélèvement) et comportementales (stress chronique) résultant de la répétition des procédures expérimentales.

Devenir

Pour les porcs, a l'issue de leur procédure et après une période de repos suffisante, les animaux peuvent être inclus dans une nouvelle session. Les animaux seront euthanasiés lorsque leur poids (85kg) ne permet plus un hébergement adapté ni des manipulations en toute sécurité. Pour les chiens, a l'issue de leur procédure et après une période de repos suffisante, les animaux peuvent être inclus dans une nouvelle session. Les animaux sont à terme réformés et entre dans un processus d'adoption ou peuvent être inclus dans d'autres projets. Pour les rats, la procédure présente des contraintes importantes (volume prélevé, anesthésies et prélèvements répétés), incompatible avec une reutilisation. Par conséquent ils seront euthanasiés en fin d'étude.

Remplacement

Les études in vitro sont utiles pour obtenir des premières informations sur le métabolisme ou la stabilité d’une molécule, mais elles ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant. La pharmacocinétique dépend en effet de nombreux processus intégrés : absorption digestive, distribution dans les tissus, passage des barrières biologiques, métabolisme hépatique et élimination rénale, qui interagissent entre eux et varient dans le temps. Ces phénomènes reposent sur des fonctions physiologiques complètes et complexes, impossibles à modéliser totalement in vitro. Ainsi, l’expérimentation animale reste aujourd’hui indispensable pour évaluer de façon fiable le devenir d’un médicament dans l’organisme avant son administration chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons des cohortes pour les pharmacocinétiques avec des porcs et des chiens. Ces cohortes permettront de réaliser plusieurs sessions jusqu’à ce que les animaux soient réformés. Chaque animal sera ainsi son propre témoin. Pour les rats le nombre d’animaux sera réduit au maximum afin d’avoir des données exploitatables. En général, les études font intervenir 6 groupes composés de 5 animaux chacun. 1 groupe par formulation. Aucun calcul statistique n’a été réalisé pour déterminer le nombre d’animaux. Celui-ci a été défini sur la base de l’expérience antérieure, de la variabilité attendue des paramètres étudiés et des objectifs de l’étude.

Raffinement

Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, ceci afin de permettre des manipulations avec un minimum de contraintes et de stress. Après administration des molécules testées, les animaux seront observés quotiennement et un examen clinique avec pesée sera réalisé une fois par semaine. Cathéter veineux percutané (porc) : Afin d’éviter la douleur et le stress lié aux prises de sang répétées, un cathéter per cutané sera placé au niveau de la jugulaire, 5 jour minimum avant la première pharmacocinétique. Ce cathéter sera laissé à demeure même entre les sessions. Cathtéter à la veine de la patte : Afin d’éviter de prélèver à la jugulaire, un cathéter sera posé avant la première prise de sang de la session. Ce cathéter sera laissé à demeure pour les premiers temps de la session (pas plus de 4H). Les chiens sont isolés tant qu’ils ont le cathéter. Hébergement individuel en raison du maintien permanent du cathéter : Les boxes sont ajourés, permettant au cochon de se voir,et se sentir. En outre, ils seront promenés tous les jours (fréquence qui pourra être augmenté si nécessaire) par un soigneur qu’il leur distibuera des récompenses. Afin d’atténuer le stress durant l’administration des éléments d’essai (chien et porc), les animaux seront habitués durant la période d’acclimatation à être manipulés et ils seront conditionnés à se coucher et à rester calmes quand le technicien doit réaliser les administrations (notament sous cutanée). Des anesthésiques locaux seront appliqués avant de réaliser les injections sous cutanée. Si cela est compatible avec l’étude, de la nourriture pourra être distribuée à J0 afin de faciliter les administrations. Des traitements locaux seront appliqués lors des sessions pour traiter les hématomes. Si nécessaire, suivi de la glycémie régulièr avec la mise en pace d’un arbre décisionnel. Pour les cohortes, la sucession des procédures est susceptible d’entraîner des effets cumulatifs liés aux prélèvements sanguins (volume et site prélevé) et aux manipulations répétées. Ces effets sont maîtrisés par un suivi clinique, comportemental et physiologique régulier (examen clinique, pesée, numération de formule, paramètres sanguins…), associé à des périodes de repos et aux respects des seuils limites de prélèvement. Tout signe d’altération du bien-être animal conduira à l’exclusion de l’animal et à sa réforme le cas échéant. Des points limites ont été définis.

Choix des espèces

Le rat sera pincipalement utilisé en phase précoce car il permet d’explorer rapidement l’absorption, la distribution et l’élimination d’une molécule, tout en nécessitant de faibles quantités de produit. Son métabolisme est bien caractérisé et il existe de nombreuses données historiques facilitant l’interprétation des résultats. Il est particulièrement utile pour comparer différentes formulations ou voies d’administration et orienter les choix de développement. Le chien présente une forte similarité avec l’humain en termes de physiologie digestive. De plus ce modèle présente une résistance au jeun plus importante que le porc ce qui permet de limiter le risque d’hypoglycémie lors des sessions de pharmacocinétique le necéssitant. Le porc présente une forte similarité avec l’humain en termes de physiologie digestive, d’épaisseur cutanée, de composition du tissu adipeux et de métabolisme. Il est donc particulièrement adapté pour prédire l’absorption orale et la diffusion après injection sous-cutanée. Les animaux utilisés en étude sont de jeunes adultes. Les Chiens en étude de pharmacocinétique sont de jeunes adultes finissant leur croissance pondérale. Ils présentent à ce stade un juste équilibre entre réponse physiologique et acclimatation en étude. Les Porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux qui arrivent à maturité sexuelle, leur croissance n’est pas terminée mais leur taille permet un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids (50kg à l’arrivée en étude) est proche d’un poids humain et permet de travailler avec des doses humaines. Les Rongeurs sont quant à eux intégrés en étude à 10 semaines, ce qui permet d’avoir des animaux avec un volume de sang circulant compatible avec le nombre de prèlèvement.

Une ablation des ovaires ou des testicules, puis quinze jours plus tard une injection de cellules cancéreuses au cœur de l'hypophyse: 345 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à trente-cinq jours. S'y ajoutent quatre prises de sang et, pour certains, des implants hormonaux sous la peau. Le projet cherche à comprendre comment le sexe et les hormones stéroïdes influencent le développement des tumeurs de l'hypophyse. Le porteur en attend des traitements plus personnalisés selon le sexe et le statut hormonal des patients, perspective laissée au conditionnel.

Objectifs

Le projet a pour but d'explorer comment le sexe et les hormones stéroïdes sexuelles influencent le développement, la progression, le comportement invasif ; et les caractéristiques cliniques, histopathologiques et moléculaires des tumeurs hypophysaires.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet visant à approfondir les connaissances fondamentales sur les différences liées au sexe et le rôle des hormones stéroïdes sexuelles dans le développement et l'agressivité des tumeurs hypophysaires. Les stéroïdes sexuels pourraient favoriser l'invasivité tumorale par des mécanismes impliquant la prolifération cellulaire et les interactions avec le microenvironnement tumoral. En mettant l'accent sur le sexe comme variable biologique-clé en biologie tumorale, ce projet pourrait améliorer les traitements actuels et mener à des innovations thérapeutiques, offrant ainsi des solutions plus personnalisées aux patients en fonction de leur sexe et de leur statut hormonal. De nouvelles thérapies ciblées pourraient être développées pour moduler la synthèse et l'action des stéroïdes sexuels, notamment pour traiter les adénomes hypophysaires résistants aux traitements conventionnels chez l'homme et la femme.

Procédures

Procédures chirurgicales : Injection stéréotaxique de cellules tumorales hypophysaires dans l'hypophyse sous anesthésie générale gazeuse et sous analgésiques (durée 30 min). Chez certains rats femelles, l’injection de cellules cancéreuses sera précédée 15 jours avant du retrait des ovaires (sous anethésie générale gazeuse et sous analgésiques; durée 20 min). Chez certains rats mâles, l’injection de cellules hypophysaires sera précédée 15 jours avant du retrait des testicules (sous anesthésie générale gazeuse et sous analgésique, durée 15 min). Prélèvements sanguins: 4 prises de sang à J1, J14 , J28 et J35 post-chirurgie pour le suivi hormonal (10 min par prélèvement). Chez certains rats ,traitements pharmacologiques par insertion sous cutanée sous anésthésie d'implants à libération continue d'un anti-aromatase ou d'un antagoniste de srécepteurs des oestrogènes.

Impact sur les animaux

Le nuisances attendues sont : - douleurs modérés et stress liés au retrait des testicules/ovaires - douleurs et stress lié à l'intervention chirurgicale d'implantation tumorale - léger stress lié aux prélèvements sanguins, à la prise régulière de mesures du poids.

Devenir

Les animaux seront gardés vivants après l’ovariectomie des femelles et l’orchidectomie des mâles et seront soumis 15 jours après à une injection stéréotaxique de cellules hypophysaires pour induire une tumeur. Tous les animaux seront euthanasiés à 35 jours post-injection stéréotaxique des cellules hypophysaires ; le cerveau et les tumeurs hypophysaires seront prélevés pour faire des analyses biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Les modèles animaux permettant d’étudier la progression tumorale chez l'être humain sont utiles à la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénicité tumorale et l’identification de possibles cibles thérapeutiques et/ou diagnostiques. Seule l’expérimentation utilisant un modèle in vivo mimant le plus fidèlement possible le microenvironnement tumoral permettra de répondre à nos questions. Le modèle in vivo permet notamment d’évaluer les interactions avec le système immunitaire ainsi que les régulations endocrines, ce qui est actuellement impossible avec des modèles in vitro ou in silico. Actuellement, il n’existe pas de modèle alternatif n’utilisant pas d’animaux qui permettrait de mimer fidèlement la pathologie telle qu’elle est observée chez l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés à été réduit au strict minimum afin d'avoir un nombre suffisant d’animaux pour réaliser une analyse statistique fiable. Ce nombre a été calculé à partir de données déjà publiées par notre laboratoire sur ce même modèle.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages que pourraient ressentir les animaux. Ils seront maintenus par trois dans chaque cage avec de l’enrichissement du milieu par copaux de bois et tunnel en carton. Dans le cadre de leur habituation à l’expérimentateur et afin d’améliorer leur bien-être, les rats reçoivent 3 jours d’affilé des chatouillis pour mimer leurs comportements sociaux de jeu. Ces chatouillis seront répétés juste avant d’opérer les animaux. Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaitre tout signe de souffrance. La chirurgie est réalisée sous anesthésie gazeuse. Afin d’éviter toute hypothermie durant la chirurgie, l'animal est placé sur un tapis chauffant afin de maintenir sa température corporelle à 37°C. Pour minimiser les douleurs et stress potentiels de l’animal, des analgésiques sont administrés. Les rats sont pesés avant et quotidiennement après toute procédure pour évaluer la perte de poids. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.

Choix des espèces

Actuellement, le rat est la seule espèce animale chez laquelle a été développé un modèle de tumeur hypophysaire reproduisant le microenvironnement tumoral des tumeurs hypophysaires humaines. Les animaux seront utilisés à 10-12 semaines, âge auquel ils sont sexuellement matures.

Soumises à une occlusion provoquant un accident vasculaire cérébral, sous anesthésie, 1 888 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. À l'accident vasculaire s'ajoutent une hyperglycémie induite, trois à huit injections et des prélèvements de sang. Le porteur indique que le modèle peut provoquer douleurs, prostration et difficultés à se déplacer, et que la baisse des plaquettes expose à des saignements. L'étude porte sur les hémorragies intracrâniennes de l'AVC aggravé par un excès de sucre dans le sang, situation qu'il dit rencontrer chez environ 40 % des patients.

Objectifs

En France, l’accident vasculaire cérébral reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Le traitement actuel repose sur la dissolution du caillot par un médicament et/ou son retrait mécanique, quand cela est possible dans les premières heures. Cependant, malgré ces traitements, certains patients s’aggravent rapidement. Un facteur de risque important est l’excès de sucre dans le sang, observée chez environ 40 % des patients. Elle peut provoquer des saignements intracrâniens, aggraver les lésions cérébrales et stimuler des cellules sanguines impliquées dans l’inflammation. Les objectifs du projet sont, d’une part, de mieux comprendre la physiopathologie des saignements intracrâniens chez les patients présentant un accident vasculaire cérébral associé à un excés de sucre dans le sang et, d’autre part, d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements visant à protéger le cerveau contre ces complications hémorragiques.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet donnera des résultats concernant la physiopatholgie de la survenue des saignements intracrâniens et l'efficacité thérapeutique de différents candidats médicaments pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux présentant des saignements. Il permettra ainsi d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints d’un accident vasculaire cérébral ischémique et ainsi une amélioration de la fonction neurologique et de l’état de santé chez ces patients.

Procédures

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de souris d’accident vasculaire cérébral ischémique, procédure réalisée systématiquement sous anesthésie et analgésie. L’intervention chirurgicale dure environ 30 minutes. Chaque animal recevra entre trois et huit injections (traitements, diabète anesthésie profonde et analgésie) ainsi que deux prélèvement sanguins (réalisé à J-1 et J1). L’injection dure en moyenne 10 secondes, tandis que le prélèvement sanguin ne dépasse pas 2 minutes. Toutes les souris feront l’objet d’une évaluation neurologique qui dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les modèles d’accidents vasculaires cérébraux peuvent provoquer des douleurs anisi que prostration et difficultés à se déplacer. L’injection de médicament et d’analgesie peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée L’hyperglycémie aiguë peut également entraîner une déshydratation chez l’animal. La diminution des globules blanc peut induire un risque infectieux. La diminution des plaquettes peut induire un risque de saignement. Les tests comportementaux induisent un stress de l’anxiété ou un stress modéré de courte durée

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de l’efficacité d’un traitement thérapeutique à la phase aiguë d’un accident vasculaire cérébral associé à une hyperglycémie aiguë. L'effet biologique des molécules utilisées sur leur cible a été démontré in vitro. La démonstration de leur effet bénéfique thérapeutique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Les modèles de souris d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'occlusion de l’artère cérébrale chez l'homme.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une étude statistique préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse nous permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Nous avons conçu nos groupes de manière optimisée en nous basant sur des études antérieures, garantissant ainsi l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. De plus, le modèle d’accident vasculaire cérébral hémorragique que nous utilisons est bien maîtrisés par notre équipe, ce qui nous permet de mener nos recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, nous appliquerons des méthodes statistiques adaptées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant notre engagement à réduire l’usage des animaux

Raffinement

Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de materiel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 24h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie, nous surveillerons attentivement leur état de santé grâce à une grille d’évaluation précise, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une mise à mort sera réalisée selon les réglementations en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du cerveau de deux à deux heures et demie sous anesthésie, des périodes d'isolement, des enregistrements de sommeil de vingt-quatre heures et des tests de mémoire spatiale. Le modèle vise à voir si l'activation d'un type de neurones de l'hippocampe améliore la mémoire dans une forme de maladie d'Alzheimer reproduite chez la souris. Les bénéfices, repérer plus tôt les dysfonctionnements cérébraux et ouvrir des pistes thérapeutiques, sont renvoyés au long terme.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer entraîne une détérioration progressive de la mémoire et d’autres fonctions du cerveau. Avant même l’apparition de lésions importantes, le fonctionnement des réseaux de neurones peut déjà être perturbé. Mieux comprendre ces changements précoces est important, car ils pourraient expliquer une partie des troubles de la mémoire observés au début de la maladie. Ce projet cherche à comprendre le rôle d’un type particulier de cellules du cerveau qui participent au bon contrôle de l’activité nerveuse. Ces cellules sont connues pour être importantes dans l’organisation de l’activité cérébrale et dans certaines fonctions cognitives, notamment la mémoire. Des travaux antérieurs suggèrent que leur fonctionnement est altéré dans la maladie d’Alzheimer, ce qui pourrait contribuer aux troubles observés. L’objectif du projet est donc de déterminer si l’activation ciblée de ces cellules peut améliorer le fonctionnement global du cerveau et les performances de mémoire dans un modèle murin de la maladie. En parallèle, le projet cherchera à identifier des modifications de l’activité cérébrale associées aux premiers stades de la maladie, afin de mieux comprendre comment apparaissent les dysfonctionnements. Plus largement, ce travail permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes précoces de la maladie d’Alzheimer. À plus long terme, il pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour repérer plus tôt certaines anomalies du fonctionnement cérébral et, à terme, orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes précoces impliqués dans les troubles de la mémoire au cours de la maladie d’Alzheimer. Il pourrait aider à identifier certaines modifications de l’activité cérébrale associées aux premiers stades de la maladie. À plus long terme, ces travaux pourront contribuer à faire émerger de nouvelles pistes pour repérer plus tôt certains dysfonctionnements cérébraux et, à terme, orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale à l’âge de 5 à 8 mois d’une durée d’environ 2h à 2h30. Ils seront isolés le temps du réveil de la chirurgie (maximum 12h), entre les phases d’acquisition et de rétention des tâches mnésiques (3h de délai, pendant lequel l’activité cérébrale est enregistrée) et la tâche d’association place-objet (5 min de délai). De la même manière, des enregistrements de sommeil de 24 ± 1h seront répétés 2 fois entre les sessions de comportement. Enfin les souris sont soumises à des tests comportementaux afin d’évaluer leur mémoire spatiale (3x10 mins sur 2 jours par animal pour le test de localisation d’objet et 20 minutes pour le test d’association place/objet).

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale peut provoquer un stress transitoire lié à son caractère aversif. L’intervention chirurgicale peut entraîner une douleur modérée ainsi qu’une altération temporaire de l’état général dans les jours qui suivent. Des difficultés de cicatrisation ou, plus rarement, une infection au niveau de la plaie peuvent également survenir. Enfin, les périodes d’hébergement individuel nécessaires à certaines étapes de l’étude peuvent être une source de stress pour les animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort pour réaliser des prélèvements de tissus et effectuer des observations anatomiques et histologiques nécessaires à la validation scientifique de ce projet.

Remplacement

Ce projet vise à établir un lien causal entre le remodelage des neurones PV, l’amélioration des performances mnésiques et le rétablissement de dynamiques électriques cérébrales globales chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Une telle démonstration causale, couplant manipulation neuronale spécifique, enregistrements et évaluation comportementale, n’est pas réalisable chez l’humain, en particulier aux stades précoces. Les modèles murins génétiques permettent au contraire de sélectionner des animaux à un âge défini (ici 5 à 8 mois), correspondant chez le modèle utilisé à un stade avec troubles de la mémoire spatiale en l’absence de dépôts amyloïdes détectables selon nos critères. Enfin, l’étude de dynamiques cérébrales globales associées à des comportements complexes requiert un cerveau intact et ne peut pas être menée in vitro ; elle doit donc être réalisée chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum compatible avec les objectifs scientifiques du projet. Le protocole repose sur un suivi des mêmes animaux à différentes étapes de l’étude, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en augmentant la robustesse des comparaisons. Tous les animaux inclus contribuent à plusieurs volets du projet, avec l’enregistrement de l’activité cérébrale, l’évaluation de la mémoire et les analyses finales sur les tissus. Cette organisation permet d’éviter la constitution de cohortes supplémentaires. Le nombre d’animaux prévu tient également compte d’un risque limité d’exclusion, par exemple en cas de qualité insuffisante des enregistrements, de ciblage insuffisant de l’intervention ou de complication après la chirurgie. L’effectif retenu vise donc à obtenir un nombre suffisant de données exploitables sans avoir à recommencer une expérimentation complémentaire.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long du projet. L’intervention est réalisée sous anesthésie générale, avec une prise en charge adaptée de la douleur avant, pendant et après la chirurgie. Les animaux bénéficient d’une surveillance rapprochée après l’intervention, avec une attention particulière portée à leur état général, à la cicatrisation et à la reprise de l’alimentation. Les conditions de maintien sont également adaptées pour limiter le stress : période d’acclimatation avant le début des expériences, familiarisation progressive à la manipulation, au transport et au dispositif d’enregistrement, hébergement en groupe en dehors des phases où un isolement temporaire est nécessaire, et présence de matériel permettant le nid et l’enrichissement du milieu de vie. Des points limites précoces ont été définis afin qu’un animal en difficulté puisse être pris en charge rapidement ou retiré de l’étude si nécessaire.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle de référence pour l’étude des maladies neurodégénératives et du fonctionnement de la mémoire. Son cerveau présente une organisation générale compatible avec l’étude des circuits impliqués dans la mémoire, ce qui permet d’explorer des mécanismes difficilement accessibles chez l’humain. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte, à un stade correspondant à l’apparition de troubles de la mémoire dans le modèle utilisé. Ce choix est important pour analyser les changements précoces du fonctionnement cérébral, avant l’installation de lésions plus avancées, et pour étudier des mécanismes susceptibles de jouer un rôle au début de la maladie.

1 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, jusqu'à vingt injections directement dans la tumeur, des prélèvements de sang derrière l'œil et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le projet teste des ARN thérapeutiques contre le cancer colorectal, dont l'activité a déjà été observée sur cellules en culture. Le porteur écrit que le recours à l'animal devient "indispensable" pour juger l'effet dans un "organisme entier", avant une utilisation espérée chez l'humain.

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but d'évaluer le potentiel antitumoral d’ARN thérapeutiques sur des modèles précliniques de cancer. Malgré de nombreuses avancées, en particulier avec l’arrivée des thérapies ciblées puis des immunothérapies, les thérapeutiques anticancéreuses actuellement disponibles restent limitées et des résistances émergent le plus souvent, nécessitant un changement de stratégie thérapeutiques. Il est donc essentiel de développer des nouveaux traitements, dont les mécanismes d’actions seraient différents des traitements actuellement utilisés, afin d’élargir le spectre des options thérapeutiques ais également de pouvoir adapter le traitement au patient et aux caractéristiques biologiques et moléculaires tumorales. Les arylsulfonamides sont une classe de drogue dont l’intérêt pour le traitement des cancers a été évalué. Nous avons récemment développé une approche thérapeutique via des ARN thérapeutiques, et avons fait la preuve de concept in vitro de leur activité antitumorale. Nous souhaitons donc avec ce projet valider nos observations in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l'utilisation d'ARN thérapeutiques pour le traitement des cancers, en particulier le cancer colorectal. A plus long terme, ce projet pourrait aboutir au développement en clinique de ces mêmes ARN thérapeutiques.

Procédures

Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : Durée 10 minutes - 1 fois par animal / Injection intrapéritonéale de luciferine pour bioluminescence : Durée 1 minute - 5 à 6 fois par animal - Anesthésie gazeuse durant l'imagerie : Durée 30 minute - 5 à 6 fois par animal / Prélèvements sanguins retroorbitaires - Durée 2 minutes - 3 fois par animal / Injection de traitements par voie IV - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / MODIFICATION - Injection de traitements par voie intratumorale - Durée 2 minutes - 5 A 20 FOIS PAR ANIMAL / Injection de traitements par voie intrapéritonéale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal

Impact sur les animaux

La greffe de lignées cellulaires tumorales, suivi de la croissance des tumeurs, engendreront une altération de l'état général des animaux avec perte de poids, fatigue, et anémie principalement. Le traitement par indisulam pourrait engendrer certaines toxicités, même si la littérature décrit des toxicités systémiques limitées chez l'homme et la souris (rares anémies). Nous n'avons pas encore évalué la toxicité potentielle des ARN thérapeutiques, mais celle-ci sera évaluée grâce aux expériences de mise au point. LES INJECTION REPETEES INTRATUMORALES POURRAIENT ENGENDRER UN SURCROIT DE STRESS ET D'INCONFORT POUR LES ANIMAUX.

Devenir

Des tests sur des cellules tumorales cultivées au laboratoire nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles animaux est indispensable mieux comprendre leur effet dans un organisme entier, nottament concernant la toxicité. Cette étape est primordiale puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme. Afin d'évaluer l'effet de nos traitements sur les tumeurs, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie et mise à mort systématique de l'ensemble des animaux du projet. L'étude biologique des tumeurs au laboratoire, ainsi que celles des tissus des autres organes est indidspensable pour évaluer les effets antitumoraux mais également la toxicité des traitements testés.

Remplacement

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules normales en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action du traitement dans un organisme entier proche de l'homme, incluant des paramètres comme le développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques etc. qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux, nous utiliserons les mêmes animaux pour évaluer à la fois la prise et la croissance tumorale, la dose des traitements et leur toxicité. Nous utiliserons également les mêmes souris pour nos contrôles positifs et négatifs dès que ce sera possible. Cette association nous permet de réduire le nombre de souris contrôles utilisées. Le nombre d’animaux par lot sera également réduit au maximum afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. L'environnement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature pour ce type d'éxpérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiée immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale des xénogreffes de cellules humaines. L'utilisation d'un modèle syngénique nous permettra de valdier nos observations dans un système immunocompétent ce qui est essentiel pour envisager un dévellopement chez l'homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans littérature pour ce type d'expérimentation, les animaux utilisés seront de 8 à 12 semaines.

Une irradiation du crâne puis un gavage quotidien pendant quinze jours: 1 472 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Le protocole vise la neuroinflammation déclenchée par la radiothérapie, en particulier chez les personnes dont un défaut génétique empêche de réparer l'ADN abîmé par les rayons. Aux doses les plus fortes, le porteur indique une perte de poids, une baisse d'activité et des troubles de la cognition, le gavage ajoutant un inconfort qualifié de modéré. Il revendique par ailleurs l'intérêt de son modèle de souris déficientes en réparation de l'ADN pour étudier cette hypersensibilité aux rayons.

Objectifs

Le cerveau est particulièrement sensible aux radiations. Lorsqu’il est exposé à des rayonnements, par exemple lors du traitement d’un cancer, cela peut endommager les cellules et entrainer des problèmes cognitifs durables comme des troubles de la mémoire ou de la concentration. Or certaines personnes sont encore plus vulnérables car elles possèdent un défaut génétique : elles manquent d'une protéine qui répare normalement les dommages que peut subir l'ADN exposé aux rayonnements. Ces patients risquent alors des complications bien plus graves. Quand les radiations endommagent le cerveau, cela déclenche une inflammation au niveau de cet organe (dite neuroinflammation). Cette dernière est entretenue par les cellules de nettoyage du cerveau, appelées microglies. Elles persistent et continuent à produire des substances inflammatoires qui aggravent les dégâts. Nous cherchons à comprendre comment arrêter ou réduire cette inflammation pour prévenir les dommages cognitifs. Pour cela, nous étudierons donc : 1- D'où provient cette neuroinflammation induite par les rayonnements ? Nous rechercherons les fragments d'ADN anormaux qui s'accumulent après l'irradiation et activent le système immunitaire du cerveau. 2- Par quels mécanismes cette neuroinflammation est-elle déclenchée ? Nous identifierons les protéines impliquées dans la transmission du signal d'alarme déclenchant l’inflammation. 3- Comment la contrôler ? Nous testerons des molécules pour arrêter cette cascade inflammatoire et réduire l'activation des microglies. Nous espérons ainsi mieux comprendre le lien entre dommages radiologiques et inflammation du cerveau pour développer des traitements protégeant les cellules des neurones après une exposition à des rayonnements.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre de quelle façon les radiations déclenchent l'inflammation du cerveau, en particulier chez les personnes génétiquement prédisposées. Cela élargira notre compréhension de la toxicité des rayonnements sur les cellules. Par ailleurs, nous identifierons les acteurs moléculaires responsables du contrôle de l’inflammation dans le cerveau exposé à des rayonnements. Et enfin, nous confirmerons l’intérêt de notre modèle, de défaut génétique de réparation de l’ADN, pour l’étude de l'hypersensibilité aux rayonnements ionisants. L'objectif final est d'améliorer la prise en charge des patients traités par radiothérapie, en développant des médicaments capables de bloquer l'inflammation du cerveau et de prévenir le déclin cognitif, sans toutefois réduire l'efficacité du traitement anti-cancéreux. De plus, l’identification de patients, à haut risque de complications en fonction de leur profil génétique, permettra d’adapter les protocoles de radiothérapie en personnalisant les doses selon le risque individuel. Ainsi ce travail contribuera à ajuster les normes de radioprotection afin de mieux protéger les populations sensibles. Ce projet est donc à l’intersection de la recherche fondamentale et de la clinique, afin d'une part de comprendre les mécanismes biologiques, et d'autre part de développer des stratégies thérapeutiques concrètes pour prévenir les effets secondaires graves de la radiothérapie.

Procédures

L'étude comprend deux types d’interventions effectuées sur des souris. La première correspond à une irradiation unique (sous anesthésie), ciblée sur la tête, durant 5 minutes maximum. La seconde ajoute l’administration quotidienne d’un médicament anti-inflammatoire par voie orale (soit mélangé dans la nourriture, soit administré directement par la bouche). Le temps d’administration des médicaments ne prend qu’une minute par animal durant les 15 jours de traitement. Les animaux sont euthanasiés et leurs cerveaux collectés

Impact sur les animaux

Ce projet implique plusieurs manipulations pouvant entrainer des effets sur le bien-être des souris. Aux doses les plus fortes, une perte de poids et d’activité ainsi que des troubles du comportement et de la cognition pourraient être observés. Une neuroinflammation transitoire à persistante se mettra en place. La procédure de gavage provoque du stress ou un inconfort modéré pour les animaux. Les administrations d’analgésiques et d’anesthésique seront réalisées par voie sous-cutanée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour permettre d’effectuer des analyses histologiques ou moléculaires.

Remplacement

Notre projet étudie comment les radiations endommagent le cerveau et déclenchent une inflammation. Bien que nous utilisions des approches alternatives à l’aide de cultures cellulaires, elles ne peuvent pas à elles seules répondre à nos questions scientifiques. En effet, le cerveau est un organe extrêmement complexe avec de nombreuses structures différentes qui communiquent entre elles. Seul un cerveau intact et fonctionnel peut permettre de comprendre comment les radiations affectent simultanément toutes les structures du cerveau, d’observer la progression de l'inflammation dans le temps et de tester l’administration de molécules afin de limiter cette inflammation.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser, nous avons sélectionné avec rigueur les conditions testées afin d’éviter les groupes inutiles. De plus, une phase pilote est prévue au début du projet afin de valider les procédures avant de mener les expériences complètes. Pour déterminer le nombre d'animaux requis par condition expérimentale, nous avons utilisé une approche statistique validée. Pour chaque échantillon biologique collecté, des analyses multiples (expression de gènes/protéines, histologie) seront mises en œuvre afin de limiter la répétition des expériences in vivo. Enfin, pour l’étude mécanistique des voies de signalisation impliquées, la priorité sera donnée à des expériences sur cellules en culture.

Raffinement

Nous avons mis en place plusieurs mesures pour minimiser l’inconfort et la souffrance des animaux pendant toute la durée du projet. Avant et après les procédures expérimentales, les cages des souris sont enrichies avec des éléments stimulants (tunnels en carton, coton, nourriture supplémentaire) pour améliorer leur bien-être quotidien. Une surveillance régulière du comportement des souris permettra de détecter rapidement tout problème. Pendant l’irradiation, les souris sont placées sous anesthésie générale afin de réduire le stress lié à la contention. La baisse de température corporelle dans l’appareil, sera compensée par un système de chauffage jusqu’au réveil de l’animal. Après irradiation et durant les traitements médicamenteux, une grille d'évaluation standardisée permettra de vérifier régulièrement l'état de l'animal (comportement, appétit, activité) et des critères limites ont été définis afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ce projet car son cerveau possède une organisation structurelle comparable à celle du cerveau humain. De plus, les processus inflammatoires et les mécanismes de réparation de l'ADN fonctionnent de façon similaire chez la souris et chez l'humain. Ainsi, les découvertes faites dans ce projet pourront être extrapolées à la compréhension de la physiologie humaine; Les animaux inclus dans cette étude seront de jeunes adultes de 6 semaines, afin d’étudier l’inflammation induite par les rayonnements sur un cerveau complètement développé, tout en évitant les effets du vieillissement.