Recherche fondamentale

Exposés au fongicide in utero puis jusqu'au sevrage par l'alimentation de leur mère, à des doses dites réglementaires, 132 ratons subissent aussi six prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche à savoir si ce pesticide, autorisé aux doses en vigueur, altère les barrières protectrices du cerveau en développement. Le porteur présente les nuisances des prélèvements comme légères, un stress court et une hypothermie transitoire. Tous les ratons sont tués en fin de protocole pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Des études récentes montrent que certains pesticides, largement utilisés actuellement en agriculture pourraient poser un problème de santé publique important. Parmi les différents composés sur le marché, certains pourraient avoir une activité sur la consommation d'oxygène par les cellules. Dans le contexte du développement cérébral précoce, les barrières protectrices du cerveau nécessitent beaucoup d’énergie pour fonctionner correctement. Ainsi, l’altération de la respiration de ces barrières, provoquée par une exposition précoce au pesticide étudié est un facteur de risque méconnu de développement de pathologies cérébrales. L'objectif de cette étude est l’étude des altérations du fonctionnement des barrières protectrices du cerveau et du cerveau lui-même, provoquées par une exposition lors de la période périnatale (depuis le développement in utero jusqu'au sevrage) à un pesticides aux doses réglementaires.

Bénéfices attendus

Ce projet produira des données nouvelles et originales qui permettront aux agences réglementaires d’affiner leur analyse de risque sur la santé environnementale des populations exposées au pesticide étudié.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins hebdomadaires réalisés sous anesthésie générale. Nombre de prélèvements sanguins et durée : 6; 3 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les anesthésies gazeuses réalisées lors de prélèvement sanguins peuvent induire une légère hypothermie transitoire. La manipulation des animaux peut induire un stress léger de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du protocole afin de collecter les tissus pour analyse.

Remplacement

Le projet envisage l'étude des barrières protectrices du cerveau en lien avec une exposition expérimentale à un pesticide. Les modèles in vitro de barrières sang-cerveau ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des intoxications périnatales. Ceci implique donc le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous avons calculé, sur la base des effet attendus, le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie, et seront hébergés dans un environnement enrichi (bûchettes de bois, tunnel en plastique et éléments de nidification). Le suivi individuel consiste en une inspection visuelle du comportement et de l’apparence au quotidien. Des points limites spécifiques ont été définis et provoqueront la mise à mort des animaux si ils sont atteints. L'exposition au pesticide est réalisé par voie orale de façon naturelle via l'alimentation et sans manipulation des animaux. Les prélevement de sang sont réalisés sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le projet sera réalisé sur des rats Sprague Dawley qui est une espèce de référence pour l'étude du neurodéveloppement. Cette lignée a des portées nombreuses. Le projet prévoit d’utiliser des ratons jusqu'au sevrage afin d’étudier l’impact d'un pesticide sur l’intégrité des barrières protectrices du cerveau au cours du développement précoce.

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles portent des tumeurs et reçoivent jusqu'à dix injections, certaines sous anesthésie, pour tester des signaux immunogènes recombinants censés renforcer l'immunité antitumorale. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ou in silico ne reconstruit un système immunitaire fonctionnel. Les applications cliniques transposables sont annoncées comme une ambition, quand la mise à mort des 1 280 individus, elle, est certaine.

Objectifs

Dans le cadre de thérapies anti-tumorales telles que les chimiothérapies, il est possible d’observer une forme particulière de mort des cellules cancéreuses appelée mort cellulaire immunogène. Il a été démontré que ce type de mort cellulaire joue un rôle déterminant dans l’efficacité à long terme des traitements anticancéreux. Elle se caractérise par l’émission coordonnée de motifs moléculaires associés aux dommages cellulaires. Le système RUSH (Retention Using Selective Hooks) constitue une plateforme expérimentale particulièrement adaptée pour étudier la contribution spécifique de ces différents signaux immunogènes à l’activation de l’immunité antitumorale. L’étude de populations tumorales mixtes, offre ainsi un système original pour disséquer la manière dont la signalisation de danger indépendante de l’autophagie coopèrent, ou agissent en parallèle, dans la détection immunitaire de la tumeur. Les essais de coculture entre cellules tumorales et cellules dendritiques basés sur le modèle RUSH pourraient en outre permettre d’explorer la manière dont les cellules dendritiques intègrent ces signaux spatialement et fonctionnellement distincts afin d’induire leur activation, leur maturation, ainsi que la présentation croisée d’antigènes tumoraux. Une hypothèse vérifiable est que la déplétion sélective de certaines cellules dendritiques, abolirait les réponses immunitaires dirigées contre les tumeurs RUSH. Une autre hypothèse est que les tumeurs composées de cellules modifiées par le système RUSH soient intrinsèquement plus sensibles à l’inhibition des points de contrôle immunitaire, et que les souris guéries de telles tumeurs développent une mémoire immunologique durable. Ce projet a pour ambition de définir des stratégies combinatoires directement transposables, fondées sur l’administration de signaux immunogènes recombinants et d’agents immunomodulateurs, afin d’améliorer durablement l’efficacité des traitements anticancéreux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider, dans des modèles précliniques, une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace contre plusieurs types de cancer. À court terme, nous espérons aque les résultats obtenus grâce à ce projet permettront d'affiner les stratégies de traitement anticancéreux. À long terme, nous prévoyons de définir des conditions thérapeutiques optimales transposables en applications cliniques.

Procédures

Les souris seront manipulées régulièrement (

Impact sur les animaux

Diverses procédures (immobilisations, injections, gavages) peuvent provoquer du stress chez l'animal et une légère douleur transitoire au point d'injection. La croissance tumorale, la chimiothérapie et l'immunothérapie peuvent entraîner une perte d'appétit modérée, qui peut à son tour entraîner une perte de poids modérée.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de collecter divers organes pour des analyses immunologiques.

Remplacement

L'utilisation d'animaux vivants est essentielle car ce projet vise à tester l'efficacité des traitements anticancéreux et à confirmer l'activation du système immunitaire, et actuellement, il est impossible de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro/ex vivo ou in silico à cause de la limite des technologies actuelles.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Les résultats seront analysés avec des outils statistiques.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (examen clinique quotidien, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, pratique et éthique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Ensuite, la souris est un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

Pour étudier les mécanismes inflammatoires d'une arthrite provoquée dans deux modèles, 898 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Réparties sur trois établissements, elles subissent jusqu'à vingt et une injections, une irradiation de quatre minutes, des prélèvements sanguins et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur affirme que l'animal entier est "indispensable" car la réponse inflammatoire résulte d'interactions complexes entre organes. La majorité est tuée pour prélever sang, organes lymphoïdes et pattes, une partie conservée pour l'élevage des lignées.

Objectifs

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs différents. La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans deux modèles de souris d’arthrite induite.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l'élévage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et 2 injections d'une durée de 10 secondes ou injections 3 fois par semaine pendant 1 semaine ou 7 semaines, soit au final: respectivement 3 ou 21 injections d’une durée de 10 secondes; 2) une irradiation d’une durée de 4 min, une injection unique d'une durée de 40 secondes, un prélèvement sanguin de 15 sec (5 au total). Les animaux anesthésiés seront soumis à 2 injections d'une durée de 10 secondes et à un acte d'imagerie (au total 6 actes d'imagerie de 15 minutes)

Impact sur les animaux

L’irradiation va induire un stress et une faible perte de poids temporaire. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins vont induire du stress. Le développement de l'arthrite va induire des douleurs au niveau des articulations, et une diminution de la mobilité. Les anesthésies gazeuses sont des actes stressants. Le transport des animaux entre les différents sites peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

La majorité des souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, organes lymphoides et pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte articulaire et inflammatoire par différentes techniques. Certains animaux de l'élevage avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.

Remplacement

Bien que nous menions en parallèle des études de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, le recours à l'animal est indispensable car la réponse inflammatoire et le développement de l’arthrite résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.Tout au long de la procédure,

Choix des espèces

La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires développées dans ces modèles induits sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris adultes seront âgées de 6 à 17 semaines pour évaluer l’efficacité thérapeutique des études.

Un AVC provoqué par chirurgie sous anesthésie d'environ 45 minutes, puis des tests de mémoire et de motricité répétés jusqu'à six fois par jour pendant douze à vingt jours: 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de comprendre comment l'inflammation se propage après un AVC et provoque des troubles cognitifs tardifs. Le porteur décrit un modèle induisant un dommage cérébral limité, sans symptômes majeurs, tout en cherchant à reproduire des déficits de mémoire. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit la vascularisation cérébrale ni les tests de comportement.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) résulte d'une interruption du flux sanguin dans une zone du cerveau, provoquant la mort cellulaire ainsi qu’une réaction inflammatoire dans cette région cérébrale. Les dommages induits chez les cellules produisent des symptômes qui se manifestent à court terme, tels que des déficits moteurs ou des difficultés à parler. Cependant, les dommages initialement induits par l’AVC dans une zone spécifique pourraient se propager dans d’autres aires cérébrales induisant ainsi de nouveaux symptômes. En fait, 70 % des survivants d'un AVC développent des troubles cognitifs tels que des déficits de mémoire, des difficultés à intégrer de nouvelles informations ou à s’adapter à de nouvelles situations. Ces symptômes se manifestent tardivement, de quelques semaines à quelques mois après l’AVC, ce qui offre la possibilité d’intervenir avec un traitement. Une bonne compréhension des mécanismes qui sous-tendent les troubles cognitifs se manifestant après l’AVC est donc nécessaire pour le développement de stratégies permettant d’éviter leur survenue. Nous émettons donc l’hypothèse que la propagation de l’inflammation de la zone initialement affectée par l’AVC aux autres régions du cerveau pourrait être à l’origine de troubles cognitifs. Dans cette étude, nous testons cette hypothèse en induisant un AVC limité à une région anatomique précise du cerveau d’un modèle de souris afin d’étudier l’évolution des conséquences à plusieurs niveaux, allant de l’expression du gène au comportement. Cette approche favorise une compréhension intégrative de comment des altérations précoces causées par l’AVC peuvent progressivement mener à des troubles tardifs à plus grande échelle, tels que la mémoire. Nous pourrons ainsi établir des liens entre les modifications observées dans le cerveau, notamment dans des régions qui ne sont pas touchées directement par la lésion, et les déficits de mémoire, afin d’identifier les mécanismes qui pourraient sous-tendre leur apparition.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser et comprendre les phénomènes après AVC au-delà de la zone initialement affectée. Cette compréhension est nécessaire afin d’établir de solides bases pour de futures recherches sur l’établissement de nouveaux traitements pour prévenir certains troubles cognitifs tardifs et pourrait avoir des répercussions positives et importantes pour la recherche préclinique. Les bénéfices attendus sont donc au profit de la santé humaine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie peu invasive pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes), et des tests comportementaux seront réalisés. Les souris seront soumises pendant 3 jours à des tests pour évaluer leur fonction motrice (duré max 5 minute par essai) et leur anxiété (durée max 5 minutes). Ensuite des autres tests seront utilisés pour évaluer la mémoire ainsi que la capacité à intégrer de nouvelles informations. Chaque test de la durée d’une minute est répété maximum six fois par jour pendant 12-20 jours selon le degré d'apprentissage des animaux. Les capacités de mémoire des souris pourraient également être étudiées avec un test plus court de reconnaissance d’objet nouveau.

Impact sur les animaux

La chirurgie d’induction de l’AVC induit un dommage cérébrale limité et ne s’accompagne typiquement pas des symptômes majeurs, rendant le modèle facilement utilisable tout en limitant la souffrance animale. Pendant la chirurgie des risques d’hypothermie et de déshydratation à cause de l’anesthésie peuvent survenir (nuisance modérée). Le seul symptôme observé post-chirurgie dans notre modèle et une légère perte de poids (usuellement inférieur à 10%) dès le lendemain de la chirurgie, et résolue dans la semaine suivante (nuisance légère). Les tests comportementaux peuvent engendrer une fatigue physique passagère (nuisance légère), ainsi qu’une légère hypothermie (nuisance légère).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après les expériences pour récupérer les cerveaux et faire une étude de l’inflammation.

Remplacement

Il n’existe pas encore, à ce jour, de modèle alternatif (tel que les cultures cellulaires) à l’induction d’AVC chez la souris suffisant pour reproduire les mécanismes complexes présents dans la pathologie humaine, impliquant notamment des structures sophistiquées comme la vascularisation cérébrale. La méthode que nous utilisons est cependant la méthode actuelle connue la moins invasive, permettant l’induction contrôlée et reproductible d’un AVC limité à une zone d’intérêt. Il n’existe pas non plus actuellement de méthode alternative permettant de remplacer les animaux dans les expériences de comportement, impliquant l’interaction complexe de différentes structures et systèmes cérébraux

Réduction

Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux : certains tests seront effectués sur la base de résultats des expériences précédentes. Les tests comportementaux choisis permettent d’étudier plusieurs aspects de la mémoire sur le même lot d’animal et sans altérer les résultats. En plus, sur les mêmes animaux nous testerons des signes d’une inflammation. Cela permet une étude longitudinale, et donc une réduction des animaux. Le nombre de souris a été déterminé à l’aide de tests statistiques.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront mises en place durant toute la durée du projet pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. La douleur est prévenue grâce à des mesures anesthésiantes et analgésiantes. Les animaux sont toujours surveillés quotidiennement par le personnel animalier, et une surveillance accrue est réalisée par l’expérimentateur pendant au moins deux jours après la chirurgie, puis une fois par semaine. Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, il sera pris en charge par l’expérimentateur et le vétérinaire responsable qui appliquerons des soins conservatoires et une surveillance prolongée. Si les critères d’arrêt des souffrances sont atteints (points limites établis), l’expérience sera arrêtée. Nous vérifions que les animaux sont en bonne santé tout au long des tests et si des souffrances sont observées, des soins conservatoires seront également appliqués avec avis du vétérinaire, ou les expériences arrêtées en cas d’atteinte des points limites. Les animaux sont habitués à l’utilisateur et aux dispositifs utilisés pendant le test pour réduire le stress. Par expérience, il est coutumier de voir après quelques jours d’apprentissage que l’animal monte directement dans votre main lorsque vous ouvrez la cage et effectue la tâche sans appréhension, ni signe d’angoisse particulier.

Choix des espèces

Le modèle envisagé a déjà été développé chez la souris. L’étude sur la souris permet de faire des corrélations entre les phénomènes à niveaux cellulaire et le comportement et donc de répondre à notre question scientifique. Nous utiliserons des souris âgées de 16-28 semaines. Cette tranche d’âge permet d’étudier les conséquences d’un AVC sur une tache de mémoire chez un animal adulte. Nous utilisons des animaux adultes puisque, pour étudier les conséquences d’un AVC, les circuits neuronaux et vasculaires doivent être complètement développés.

760 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour étudier une enzyme dans les défaillances du rein et du cœur lors d'un choc circulatoire. Chaque animal reçoit des traitements par injection ou voie orale, des prélèvements de sang et des examens d'imagerie sous anesthésie, dont des ponctions rétro-orbitaires. Interrogé sur les effets néfastes attendus, le RNT énumère les cinq libertés du bien-être animal plutôt que de décrire les atteintes concrètes. La mise à mort sert au prélèvement d'organes pour l'analyse des dommages tissulaires.

Objectifs

L’insuffisance circulatoire est une situation grave qui conduit souvent à une admission en réanimation et peut mettre la vie en danger. Elle apparaît généralement après un choc important d’origine cardiaque, hémorragique ou lié à une infection sévère et entraîne un mauvais fonctionnement du cœur, des vaisseaux sanguins et des reins. La protéine étudiée est une enzyme naturellement présente dans l’organisme qui modifie certaines molécules actives. Des travaux ont montré que cette protéine, lorsqu’elle circule en grande quantité, permet non seulement de prédire l’évolution des patients en insuffisance circulatoire, mais joue aussi un rôle direct dans l’aggravation de la défaillance des organes. Dans des modèles expérimentaux, bloquer cette protéine avec un anticorps spécifique protège le cœur. Objectif du projet : Mieux comprendre comment apparaissent les défaillances aiguës des organes, en particulier du rein, lors d’un choc circulatoire, et déterminer si cibler notre protéine d’intérêt pourrait prévenir ou limiter ces dommages.

Bénéfices attendus

Ce projet vise, à court terme, à disséquer les contributions cellulaires et systémique de notre protéine d’intérêt dans le choc circulatoire et les conséquences aigues et chroniques associés à la défaillance d’organes comme le rein et le cœur. A moyen terme, ce projet permettra de valider une biothérapie efficace contre le choc circulatoire. A moyen-long terme, les données récoltées par le projet fourniront des arguments précliniques essentiels à la mise en place d’une biothérapie visant à traiter ou même à prévenir les défaillances rénales et à améliorer la survie des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes procédures, plus ou moins invasives, susceptibles d’entraîner du stress. Des prélèvements de tissu seront réalisés à 3 semaines sur l’ensemble des souris. Des traitements seront administrés à l’ensemble des animaux, par injection ou par voie orale, avec contention si nécessaire. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’ensemble des souris sous anesthésie générale. Des examens d’imagerie ainsi que des évaluations du fonctionnement du cœur et des reins seront réalisés sous anesthésie générale chez les animaux concernés.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ces procédures expérimentales, toutes les mesures nécessaires seront mises en œuvre afin de respecter les cinq libertés fondamentales du bien-être animal. Les animaux auront en permanence accès à une alimentation équilibrée et à de l’eau ad libitum, garantissant l’absence de faim, de soif et de malnutrition. L’absence de peur et de détresse sera assurée par une manipulation réalisée par du personnel formé, une contention limitée au strict nécessaire pour les injections d’acide floique et l’utilisation systématique de l’anesthésie générale lors des procédures potentiellement stressantes ou douloureuses (prélèvements et injections rétro-orbitaires). L’absence de stress physique et/ou thermique sera garantie par le maintien des animaux dans des conditions environnementales contrôlées et adaptées à leur espèce, ainsi que par une surveillance continue pendant et après l’anesthésie. L’absence de douleur, de lésions et de maladie sera prise en compte par le recours à des protocoles anesthésiques validés (isoflurane, kétamine) et par un suivi clinique régulier permettant de détecter et traiter rapidement tout signe de souffrance (tableau de score). Enfin, la liberté d’expression des comportements normaux de l’espèce sera préservée en dehors des temps de manipulation grâce à un hébergement adapté, enrichi et conforme aux besoins comportementaux des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt

Remplacement

Nous étudions un syndrome qui implique 2 organes différents, à savoir le cœur et le rein, ainsi que les interactions biochimiques et biologiques qu'il existe entre eux. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle cellulaire, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier ce syndrome. Ainsi, les modèles in vitro et organoïdes ne peuvent mimer les phénomènes pathophysiologiques systémiques que nous étudierons et le petit animal, comme la souris, permet une analyse précise et indispensable des mécanismes mis en jeu dans cette physiopathologie.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été conçus de manière à utiliser le plus petit nombre possible d’animaux tout en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe a été soigneusement déterminé à l’aide d’un calcul statistique, afin d’obtenir des données exploitables et significatives sans recourir à un nombre excessif de spécimens. Cette approche permet de prendre en compte la variabilité des réponses des souris au traitement à l’acide folique, tout en limitant strictement l’utilisation d’animaux aux besoins indispensables de l’étude

Raffinement

Les protocoles expérimentaux se feront sous anesthésie générale afin d’éviter le plus possible une quelconque douleur chez l’animal. Un collyre analgésique sera utilisé avant chaque injection et chaque prélèvement rétro-orbitaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel de l’animalerie. Des points limites adaptés permettent de prévenir toute forme de souffrance des animaux.

Choix des espèces

Des souris mâles et femelles de 8 à 14 semaines seront utilisés dans notre étude. L'utilisation des souris jeunes adultes permet d'obtenir des résultats plus fiables et pertinents grâce à leur maturité physiologique, leur homogénéité et leur robustesse.

288 rats génétiquement modifiés vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue, pour étudier le rôle du microbiote dans une forme de rhumatisme inflammatoire. Chaque animal reçoit six administrations orales de composés bactériens puis est suivi six mois, développant diarrhée, arthrites des pattes arrière et, spontanément, une inflammation des testicules. Le modèle transgénique est présenté comme le "seul" à reproduire l'ensemble des atteintes de la maladie. Le porteur juge son usage "indispensable" pour disséquer les mécanismes, en vue d'une application chez l'humain.

Objectifs

La Spondylarthrite (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent au sein de la population adulte française. Le gène d’intérêt est fortement associé au développement de la maladie et constitue le facteur génétique principal multipliant le risque de développer cette maladie par 40. Malgré une association démontrée il y a plus de 50 ans, les raisons pour lesquelles ce gène confère cette prédisposition sont encore peu connues. L’identification des mécanismes impliqués dans l’association gène/maladie est importante car c’est une maladie fréquente, touchant 0,45% de la population adulte en France. De manière importante, il n’existe aucun traitement curatif, seulement des thérapies ralentissant la progression de l’état inflammatoire et de la maladie. Les modèles in vitro ne permettent pas d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques car ils ne récapitulent pas la complexité d’un organisme. Ainsi, l’étude du rat surexprimant le gène d’intérêt constitue le seul modèle récapitulant toutes les atteintes de la SpA.: une inflammation articulaire chronique, une inflammation intestinale et des atteintes inflammatoires de la peau et des griffes. Le développement de ces symptômes cliniques nécessite une un ensemble normal des microbes (bactéries surtout) vivant naturellement dans un organisme (par exemple dans l’intestin), ainsi ces rats élevés en condition stérile ne développent pas de SpA. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer l’influence des constituants du microbiote intestinal sur l’activation des cellules du système immunitaire du rat conduisant au développement de la SpA et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Une meilleure compréhension du rôle pathogène de ces microbes et de leurs constituants pourra conduire à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos expériences consisteront d’abord à administrer des ces microbes à des rats puis à évaluer l’activation des cellules du système immunitaire et s’ils sont capables d’induire la SpA. L’ensemble de ces approches permettra de révéler les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal et ses composants influencent l’activation des cellules immunitaires au cours de la SpA, dans l’objectif final d’identifier et tester de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

La spondylarthrite (SpA) est une maladie complexe qui résulte à la fois de facteurs héréditaires et de l’environnement. Elle provoque une inflammation anormale dans l’organisme, entraînant des douleurs importantes et un handicap, souvent chez de jeunes adultes. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir la maladie, seulement des traitements pour en atténuer les symptômes. Mieux comprendre comment le système immunitaire interagit avec les micro‑organismes vivant naturellement dans l’intestin (le microbiote) pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques. L’utilisation d’un modèle animal chez le rat est indispensable pour étudier ces mécanismes en détail et analyser des tissus touchés par la maladie, comme les articulations, qui ne peuvent pas être prélevés régulièrement chez l’être humain. De plus, les études visant à modifier le microbiote doivent d’abord être réalisées chez l’animal avant toute application chez l’Homme. De telles recherches ont déjà permis, par le passé, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, dont certaines sont aujourd’hui utilisées avec succès en pratique clinique.

Procédures

Lors de la procédure, les rats recevront 6 administrations de composés bactériens par voie orale (durée 15 secondes). Les animaux seront suivis ensuite pendant 6 mois pour le développement de la SpA. Des prélèvements de selles fraîches seront effectuées au cours de l’expérimentation à raison de 1 fois toutes les 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent les rats qui développent de manière spontanée une inflammation testiculaire en conditions stériles. À la suite de la colonisation par des bactéries les rats peuvent développer une SpA. Le premier symptôme est la survenue d’une inflammation intestinale se traduisant par une diarrhée qui sera accompagnée par des arthrites (inflammation au niveau des articulations) aux pattes arrière. Ces arthrites évoluent au cours du temps et certaines se résorbent complètement (environ 20% des cas). Les administrations par voie orale et la collection des selles présenteront un léger inconfort aux animaux le plus souvent associé à la contention de l’animal. En cas de douleur, un traitement antalgique par voie sous-cutanée sera mis en place.

Devenir

Tous les animaux issus de la procédure seront mis à mort à la fin de la procédure. Les organes et tissus seront ensuite collectés pour des analyses biologiques et histologies et ajoutés dès que possible à une biobanque limitant des ajouts futurs d’animaux

Remplacement

Les cultures cellulaires in vitro ne sont pas adaptées pour étudier l’interaction hôte–microbiote dans ce contexte, car la maladie étudiée est complexe et implique plusieurs organes (intestin et articulations). Ces modèles simplifiés risquent de ne pas reproduire les mécanismes biologiques pertinents et ne permettent pas de maintenir les conditions anaérobies nécessaires au microbiote. Il est donc nécessaire de recourir à un organisme vivant. Des tests in vitro sont néanmoins réalisés en amont pour vérifier l’absence de toxicité des substances testées.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est strictement limité tout en garantissant que les conclusions tirées d’une étude sont fiables et peuvent être considérées avec confiance afin de respecter le principe de réduction. Plusieurs tests statistiques préalables nous permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet réel, fiable et peu probable d’être dû au hasard. Des tests pour déterminer l’effet sur le développement et la sévérité de la SpA nécessitent des effectifs plus élevés (6 animaux par groupe) Ce projet s’inscrit dans une thématique importante avec des projets similaires menés dans d’autres établissements. Enfin, les analyses seront faites à la fin de chacune des expériences et permettront le cas échéant de ne pas effectuer une expérience supplémentaire si la significativité est atteinte

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement sont mises en œuvre pour garantir le bien-être des animaux tout au long du protocole. Pour l’administration par voie orale de composés du microbiote, nous utiliserons une canule en plastique adaptée à l’animal et à son poids, afin de diminuer la douleur liée à la procédure. Les changes des cages seront plus fréquents chez les animaux dont l'inflammation intestinale est présente. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel compétent, permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou d’inconfort. Ces observations sont effectuées par le personnel de zootechnie, par le vétérinaire lors des contrôles réguliers et par les expérimentateurs. L'administration d'un médicament analgésique est prévue pour limiter les douleurs liées à la SpA. En cas de présence d’arthrites causant une difficulté de la mobilité des rats, l’alimentation humidifiée avec de l’eau sera mise à disposition dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement. Des points limites ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est le rat, en raison de sa pertinence préclinique et de son adéquation expérimentale mimant la SpA. Les rats surexprimant le gène d’intérêt permettent ainsi d’évaluer l’efficacité des traitements en fonction des atteintes cliniques. Les analyses cellulaires, moléculaires, histologiques et cliniques permettent d’appréhender le bénéfice fonctionnel global, tout en respectant les principes des 3R. Ainsi, l’utilisation des rats surexprimant le gène d’intérêt est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques de la SpA. Par ailleurs, les expérimentations de modulation du microbiote doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Les animaux utilisés dans ce projet seront des rats à différents stades de développement allant de 3 semaines d’âge (correspondant au sevrage chez le rat : période de colonisation bactérienne) à l’adulte. Ce choix permet d’évaluer le rôle des composant du microbiote lors du développement de la SpA du rat.

Rendues immunodéprimées pour accepter des cellules tumorales humaines, 75 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une implantation de cellules cancéreuses de la prostate dans l'abdomen, puis un traitement de la zone opérée par une torche à plasma froid. L'objectif est d'évaluer si ce procédé réduit le risque de récidive après ablation d'une tumeur. Le porteur décrit ce modèle comme "incontournable" et a porté l'effectif de 45 à 75 animaux.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.

Procédures

Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)

Impact sur les animaux

La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque d'une durée n'exédant pas 4 semaines. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, cette DAP correspondant à une extension d'une expérimentation précedemment autorisée, les lots d'animaux déjà traités n'ont présenté aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.

Remplacement

Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés au total sur des lots de 15. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué. MODIFICATION 75 ANIMAUX AU TOTAL

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.