Recherche fondamentale

120 poussins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgés de un à dix jours, chacun est placé huit à dix jours dans une enceinte avec environ cinq cents larves de tique qui se nourrissent de leur sang, pour étudier l'effet de bactéries symbiotiques sur le cycle des tiques. Le porteur mentionne des démangeaisons possibles et prévoit de tuer les poussins après l'exposition, au motif que des larves pourraient rester sur eux et s'échapper. Il indique que cette espèce de tique refuse tout autre mode de nourrissage en laboratoire.

Objectifs

Caractériser l'effet de microorganismes symbiotiques sur le cycle de vie des tiques (survie, reproduction, longévité, temps de développement). Pour celà, nous souhaitons maitenir en élevage une espèce de tique molle, Ornithodoros maritimus (famille des Argasidae). Cette espèce de tique est naturellement présente sur le sol français (plus généralement sur tout le pourtour Méditerranéen) et est spécifique des oiseaux de mer (Goélands notamment) sur lesquels elle se nourrit. La tique O. maritimus héberge une bactérie symbiotique, non pathogène, appelée Coxiella-like endosymbiont. Cette bactérie est génétiquement proche, mais différente, de l'agent de la fièvre Q, Coxiella burnetii. C'est justement l'effet de cette Coxiella-like endosymbiont sur les tiques que nous voulons étudier dans ce projet. Nous mesurerons ici les traits d’histoire de vie des tiques (taux de croissance, survie, fécondité, taille adulte, etc) en fonction de la présence/absence de bactéries symbiotiques.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension de la biologie des tiques et de leur cycle de vie, notamment des interactions entre les tiques et leurs bactéries symbiotiques, et des mécanismes moléculaires à l’origine de cette interaction. Ce projet permettra de comprendre les tiques ont besoin de bactéries symbiotiques pour se reproduire et achever leur cycle de développement.

Procédures

Les poussins seront placés dans des mésocosmes en présence de larves de tique pour une durée de 8 à 10 jours afin que celles-ci puissent se nourrir. Les poussins en seront retirés à la fin de la procédure (les larves de tiques, une fois à réplétion au terme de ces 8 à 10 jours, se détachent spontanément des poussins et se laissent tomber sur le fond du mésocosme). Aucune autre intervention expérimentale n’est prévue sur ces animaux.

Impact sur les animaux

Les poussins seront exposés aux piqures de tique dans les mésocosmes pendant 8 à 10 jours. Chaque poussin sera exposé aux larves issues de deux pontes de tique, soit environ 500 larves (une larve mesure 0.4mm environ). Le volume de sang prélevé par les larves de tique molle est inconnu, mais nous l’estimons inférieur à 0.1 µL (ce prélèvement s'étale sur une semaine entière). L'expérience du terrain sur les oiseaux de mer (poussins de goéland) indique qu'il n'y a a priori pas de risque de spoliation sanguine avec cette quantité de larves. Des démangeaisons pourraient éventuellement se manifester bien que ça n'ait pas été reporté sur les oiseaux sauvages. Par ailleurs, nous estimons que toutes les larves ne se nourrirront pas (environ 10 à 20%) pendant la durée de l'expérience. En cas de démangeaisons ou de risque d’allergie, nous retirerons les poussins concernés des mésocosmes.

Devenir

Les poussins seront euthanasiés après l'exposition aux tiques car il y a un risque que des larves de tique restent présentes dessus et puissent s'échapper.

Remplacement

Les poussins ne seront utilisés que pour le nourrissage des stades larvaires (les stades de développement ultérieurs seront nourris sur oeufs embryonnés et non sur poussin). Cette espèce de tique refuse tout autre type de nourrissage en laboratoire.

Réduction

Le nombre de poussins utilisé en expérimentation est réduit au stricte minimum. Les nombre prévus de poussin pour la durée des expériences (5 ans) est de 120. Ce nombre élevé s'explique par (1) l'utilisation unique poussin, (2) nos protocoles expérimentaux qui nécessitent le maintient séparés de deux cohortes de tique (ces cohortes diffèrent entre elles par la présence ou l'absence de bactéries symbiotiques).

Raffinement

Pour un meilleur enrichissement, nous rajouterons une suspension avec objets brillants et colorés dans le mésocosme. Un protocole de suivi des points limites d'évaluation de la souffrance et des critères d'arrêt sera mis en place.

Choix des espèces

Dans la nature, la tique Ornithodoros maritimus ne se nourrit que sur oiseaux de mer comme les goélands. En laboratoire, cette espèce accepte de se nourrir sur poule domestique. Les larves de tique acceptent facilement de nourrir sur des poussins de 1 (en début d’expérience) à 10 jours (en fin d’expérience). Le nourrissage sur poussins plus agés ou poules est plus problématique (de nombreuses larves de tiques ne se nourrissent pas).

Greffées de cellules leucémiques humaines par voie intraveineuse ou dans le fémur, les souris reçoivent ensuite, selon les études, des molécules par injection jusqu'à deux fois par semaine ou par gavage quotidien pendant quatre semaines, avec jusqu'à douze prises de sang et trois prélèvements de moelle chacune. 3 000 souris immunodéficientes vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Beaucoup développent une leucémie qui, à un stade avancé, les amaigrit et les affaiblit. Des greffes peuvent aussi se faire sur des souriceaux nouveau-nés, pour étudier les leucémies de l'enfant. Le porteur annonce des points limites et des "critères d'arrêt précoces de souffrance" sans en préciser aucun.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvments de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries.

Devenir

Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.

Choix des espèces

Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.

16 boucs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous maintenus en vie ensuite comme reproducteurs ou inducteurs d'effet mâle. Douze d'entre eux subissent une chirurgie de stérilisation d'une vingtaine de minutes sous anesthésie, et tous des contentions hebdomadaires pour prises de sang et mesure des testicules, ainsi que des montes d'une femelle avec recueil de la semence. Le porteur décrit un stress de contention, une douleur brève aux prises de sang et un inconfort après l'opération. Il compare trois techniques de vasectomie pour promouvoir l'"effet mâle" comme alternative aux hormones dans l'élevage caprin.

Objectifs

La reproduction caprine étant saisonnée, différentes techniques sont actuellement disponibles pour maîtriser la reproduction tout au long de l’année et contribuer au progrès génétique par l'insémination. Les traitements hormonaux, couramment utilisés en insémination, soulèvent de plus en plus de questionnements vis vis à de l'environnement, du bien-être animal et de la santé humaine. Des alternatives aux hormones pour le pilotage des chaleurs, basées sur l’effet mâle (introduction soudaine d'un mâle dans un lot de femelles après une phase de séparation préalable) se développent actuellement mais présentent des freins techniques. L’effet mâle peut être utilisé pour le groupage des chaleurs avant l’insémination en introduisant des boucs équipés de tabliers dans les lots de chèvres, leur permettant ainsi de déclencher les chaleurs sans les saillir. Cependant l'utilisation de ces tabliers peut aussi poser question vis à vis du bien-être animal : les boucs ne sont pas libres d'exprimer toute la gamme de leurs comportements sexuels naturels jusqu'à la saillie, malgré des ouvertures dans la toile, la transpiration et l'urine peuvent s'accumuler et causer de l'inconfort en période de chaleur. L'effet bouc avec tabliers nécessite une rotation quotidienne des boucs (repos des mâles, maintien de la stimulation des femelles, nettoyage des tabliers), une habituation préalable de l’animal au tablier et un investissement en temps important pour les éleveurs pour cet apprentissage ainsi que pour la mise en place, le nettoyage et la vérification quotidienne des tabliers. L’utilisation de boucs vasectomisés se développe comme alternative à l'utilisation du tablier. Mais la vasectomie est encore peu pratiquée par les vétérinaires et certains boucs "vasectomisés" restent fertiles. Ainsi 14% des éleveurs caprins enquêtés dans le cadre de la thèse vétérinaire actuellement en cours signalent des persistances de fertilité chez 2 à 20% des boucs opérés chez eux, soulignant la nécessité de recommandations techniques actualisées. Ce projet a pour but de décrire pas à pas différentes techniques chirurgicales (conditions/durée/avantages/inconvénients) permettant de stériliser efficacement des boucs et donc de favoriser l'adoption de l'effet mâle comme alternative aux hormones.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’acquérir des connaissances nécessaires à la mise en place de recommandations concernant les opérations de vasectomie et les conditions de mise en œuvre. L’utilisation de boucs vasectomisés à grande échelle en élevage pourra permettre une diminution de l’utilisation d’hormones, de ne plus équiper les boucs de tabliers et de limiter la manipulation des boucs. L’effet mâle est nécessaire aux techniques de reproduction que ce soit en monte naturelle (pour assurer ses filiations) ou en insémination. Le secteur de l’insémination représente aujourd’hui 70 000 doses inséminées par an en France chez les 600 éleveurs contributeurs du schéma de sélection. Les conclusions que nous tirerons de notre projet seront transposables en recommandations de terrain et bénéficieront à la filière caprine dans son ensemble.

Procédures

Interventions sur boucs vigiles pendant les 4 mois de procédure : Chaque bouc subira au maximum 16 contentions (1 contention par semaine) d'une durée maximale de 2min30 pour prélèvement de sang et mesure de la circonférence scrotale et 32 sollicitations (2 sollicitations par semaine à 2 jours d'écart). La sollicitation consiste à ouvrir la case du bouc pour le laisser rejoindre librement une salle de collecte où se trouve une femelle qu'il peut monter. Lors de la monte, un opérateur dévie le pénis pour recueillir la semence. Les anesthésies concernent 12 animaux sur les 16 boucs du projet. Interventions sur boucs anesthésiés pendant les 4 mois de procédure : chaque bouc subira au maximum 1 injection intramusculaire et 1 injection intraveineuse pour administration d'un anesthésique, 1 intervention chirurgicale de stérilisation d'une durée de 20 minutes en moyenne.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des boucs peuvent entrainer un léger stress. Lors des prises de sang, les boucs sont susceptibles de ressentir une légère douleur liée à l’introduction de l’aiguille et de courte durée. La mise à jeun des animaux durant les 12 heures précédant la chirurgie peut causer un léger inconfort lié à la faim, cependant comme cette durée correspond à la durée d'une nuit l'inconfort induit sera très modéré. Les chirurgies, dans la mesure où elles sont pratiquées sous anesthésie et avec une couverture antalgiques, peuvent causer un inconfort léger et transitoire au réveil.

Devenir

Les boucs seront tous maintenus en vie, les boucs témoins comme producteurs de semence, les boucs vasectomisés comme boucs inducteurs d'effet mâle en élevage de chèvres.

Remplacement

L'objectif du projet est d'évaluer la réponse biologique et comportementale des boucs suite à un traitement chirurgical de vasectomie. Elle est évaluée grâce à différents indicateurs de l’activité sexuelle : la testostéronémie, la circonférence scrotale et les performances de production de semence. Il n’existe pas de méthode in vitro ou in silico permettant d'éviter ou de remplacer l'utilisation de boucs pour décrire comment l’opération de vasectomie influe sur le comportement sexuel et la non-production de semence. Un remplacement relatif (c'est-à-dire remplacer les boucs par des animaux ayant un moindre potentiel de perception de la douleur, comme certains invertébrés) n’est pas envisageable dans la mesure où la sécrétion d'hormones, les performances de production de semence et leurs variations sont propres à chaque espèce.

Réduction

L'objectif est de suivre l'activité sexuelle (testostéronémie, circonférence scrotale, comportement, production de semence) et de mesurer la disparition de la production de semence dans les 3 à 4 semaines après la chirurgie. Le présent projet a un objectif de descriptif technique et non de comparaison statistique avec de grands effectifs. Avec 16 boucs répartis en 4 lots nous pourrons décrire la cinétique de disparition des spermatozoïdes dans les éjaculats des boucs vasectomisés et nous assurer que la testostéronémie et le comportement sexuel sont maintenus comme chez les témoins.

Raffinement

Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie et couverture antalgique après prémédication sédative et analgésique. Un vétérinaire anesthésiste sera présent avec le chirurgien pendant l’intervention et mettra en œuvre les moyens de surveillance et de réanimation adaptés. L’analgésie post-opératoire sera assurée par l’administration d’anti-inflammatoires jusqu’à 48h après l’intervention. Le nombre et la fréquence des prises de sang pour le suivi hormonal a été réduit au minimum nécessaire et suffisant à l’établissement de profils interprétables. Il est recommandé de ne pas prélever plus de 10 pourcent du volume sanguin total en 1 fois. Le volume de sang prélevé 1 fois par semaine est de 5mL, ce qui est très inférieur au seuil recommandé estimé pour un bouc de 90kg (10 pourcent de la volémie, soit 630mL maximum par jour). Afin de limiter la durée de contention et le stress éventuel, les prélèvements et la mesure de volume testiculaire seront réalisés par des binômes expérimentés et familiers des animaux. Chez les caprins, les prélèvements sanguins sont réalisables facilement à la veine jugulaire sans nécessité d’anesthésie, car la contention est aisée et l’animal est coopérant. Un baume antiseptique et cicatrisant sera appliqué par massage sur les veines systématiquement après chaque prélèvement. Le suivi détaillé des animaux au cours du projet sera réalisé grâce à des fiches individuelles. Les fiches individuelles sont adossées à un arbre décisionnel qui, le cas échéant, permet d'agir de façon proportionnelle au point limite observé. Les boucs disposent de matériels d’enrichissement de milieu renouvelés régulièrement tels que des brosses, ballons et jouets en cordes ou chaines fixés aux barrières. Les animaux sont hébergés en cases individuelles pour limiter le risque de blessures entre individus ; l'isolement n'est ni olfactif, ni visuel, ni auditif.

Choix des espèces

L’objectif de l’expérimentation est spécifique de l’espèce caprine. Les animaux utilisés sont des boucs pubères (en âge de produire de la semence) de plus d'un an.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une myopathie rare, elles reçoivent dès un à trois jours de vie une injection de vecteur viral sous anesthésie par le froid, puis passent des tests de force musculaire jusqu'à douze fois et une mesure invasive de force sous anesthésie sans réveil à quatre mois, avant d'être tuées pour analyse des muscles. Le porteur indique que ces nouveau-nés peuvent souffrir d'une hypothermie non corrigée ou être rejetés par leur mère, et que la lignée développe une faiblesse musculaire progressive. Il juge "indispensable" de poursuivre chez la souris pour vérifier l'efficacité et la toxicité de la thérapie à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

La Myopathie CentroNucléaire Autosomique Dominante est une maladie rare du muscle. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine impliquée dans les processus d’entrée et de transports de vésicules dans la cellule. L'injection dans le muscle d’un virus thérapeutique exprimant une molécule ciblant la forme mutée de la protéine permet de restaurer la structure et la fonction du muscle dans un modèle murin de la maladie après administration à l’âge d’un mois. Cependant, le traitement est moins efficace chez les souris plus âgées qui présentent une atteinte musculaire plus prononcée. Par ailleurs des essais de traitement de l’ensemble des muscles via une administration par voie sanguine se sont révélés infructueux y compris chez les souris d’1 mois. L’expression d’une molécule thérapeutique dans la cellule par l’intermédiaire d’un vecteur viral de type virus adéno-associé (AAV) est dépendante de son entrée dans la cellule et de son transport jusqu’au noyau par des vésicules. Nos résultats antérieurs montrent que le vecteur est moins bien acheminé chez les souris malades et que ce phénomène s’empire avec l’évolution de la maladie. Ainsi la maladie elle-même, semble compromettre l’administration du traitement. Le but de ce projet est d’intervenir le plus précocement possible dans le développement de la maladie (en période néonatale) afin de s’affranchir de son impact potentiel sur l’acheminent du vecteur thérapeutique et de tester différentes combinaisons de constructions de vecteur viral dans une optique d’amélioration de son administration dans ce contexte pathologique.

Bénéfices attendus

L’aboutissement de ce projet constituera une étape essentielle de l’étude préclinique de notre molécule et est nécessaire au développement de futurs traitements inexistants à ce jour pour les patients atteints de Myopathie Centronucléaire. Il participera également à la compréhension et l’optimisation des voix d’administration de ce type de molécule dans un modèle pathologique présentant une altération de la transduction virale

Procédures

Toutes les souris subiront une injection en intrapéritonéale (IP) ou dans le système sanguin d’un virus vecteur « inactivé » exprimant un gène luminescent ou un shRNA thérapeutique à l’âge de 1 ou 2 jours à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille ultrafine. Une seule injection sera réalisée par souris sous anesthésie. La durée de l’injection est d’environ 15 secondes par souris. La durée totale du geste par souris est d’environ 30 minutes incluant l’anesthésie de quelques minutes, l’injection et le réveil avec ses congénères avant d’être replacé dans la cage avec la mère. Ensuite, un premier lot de souris subira une injection intrapéritonéale (IP) d’un produit permettant de visualiser le gène luminescent à l’âge de 1 mois, 2 mois et 4 mois suivi d’un examen d’imagerie dans un appareil qui permet de lire la bioluminescence. Ce lot de souris sera anesthésié par anesthésie gazeuse au moment de l’examen qui dure quelques minutes. Ces souris seront euthanasiées à l’âge de 4 mois. Résumé des interventions subies par le lot1 : Injection d’AAV IP ou Veine temporale (J1 ou J2) -> (Injection IP de luciférine +Imagerie sous anesthésie gazeuse) *3 -> Euthanasie à 4 mois. Un second lot sera soumis à des tests de force musculaire non invasifs à partir de l’âge d’1mois. Ces évaluations sont la mesure de la force par test d’agrippement sur une grille et de maintien sur la grille après retournement. Ces 2 mesures durent environ 5 minutes par animal et seront répétées toutes les semaines entre 1 et 4 mois (soit 12 fois maximum pour chaque test). Une mesure de traction sur une barre sera réalisée à 2 reprises également pour chaque souris, 3 essais/souris avec 30 secondes entre chaque essai. Une mesure directe de la force du muscle de la patte après stimulation électrique sera réalisée chez ces souris à l’âge de 4 mois sous anesthésie générale gazeuse avec analgésie en procédure sans réveil par le personnel expert. Elle dure environ 20 mn par souris. Résumé des interventions subies par le lot 2 : Injection du vecteur viral en IP ou Veine temporal (J1 ou J2) -> Mesures non invasives de forces musculaire (hebdomadaire entre 1 et 4mois soit environ 12 fois)-> Mesure de Forces invasives sous anesthésie gazeuse puis euthanasie à 4 mois.

Impact sur les animaux

La lignée de souris modèle présente un phénotype dommageable. Les hétérozygotes développent une faiblesse et une atrophie musculaire progressive dont les premiers signes apparaissent à 1 mois et s’amplifient jusqu’à environ 8 mois avec une perte de force musculaire l’ordre de 40% par rapport à des souris sauvages. Ce phénotype est comparable à celui observé dans la myopathie humaine. Ces souris hétérozygotes sont par ailleurs viables et fertiles avec une courbe de poids comparable à des souris sauvage. Les souris homozygotes meurent dans les premières 24h après la naissance mais ne seront pas produite dans ce projet. L’élevage de la lignée pour les projets fait l’objet d’une autorisation spécifique. Les différentes procédures que vont subir les animaux (tests de forces non-invasives, contention pour les injections intrapéritonéale, préhension des animaux pour les anesthésier) entrainent un stress de l’animal. Les animaux pourraient également souffrir d’hypothermie non-reversée suite à l’anesthésie par le froid ou être rejeté par leur mère. L’utilisation des vecteurs viraux de ce projet n’entraîne pas de douleurs et aucune pathologie ni effets indésirables ne sont induits chez les animaux traités avec des ARN interférence ou les AAV. Cependant une inflammation au site d’injection pourrait survenir.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

L’efficacité et l’absence de toxicité de l’approche thérapeutique par ARN interférence allèle spécifique a été démontré au préalable sur des cellules de patients en culture. La validité du modèle de souris de la maladie est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons préalablement démontré l’efficacité et l’innocuité de la stratégie thérapeutique en injection ciblée dans le muscle de souris du modèle de la maladie par l’intermédiaire du vecteur viral utilisé dans le projet. Le but de ce projet est l’optimisation de cette thérapie dans le modèle de souris en testant des modifications du vecteur viral et de son contenu afin d’améliorer l’expression de la molécule thérapeutique. Il nous apparait indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude dans ce modèle. Seule l’administration du traitement dans le système sanguin permettra de vérifier son efficacité et sa potentielle toxicité à l’échelle d’un organisme entier

Réduction

Des études précédentes sur nos différents projets nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés (entre 6 à 8 souris par groupes expérimentaux). Une première étude correspond à une étude pilote sur le sérotype et la voie d’administration systémique afin de réduire le nombre d’animaux utilisé pour la deuxième étude avec le vecteur exprimant la molécule thérapeutique. Les mâles et femelles sauvages et hétérozygotes seront analysés mais les comparaisons seront réalisées entre souris de même genre dans les 2 études. En effet des différences d’efficacité de transduction et de forces sont connues entre mâles et femelles. Ainsi cette étude pourra aussi permettre de révéler ou non des différences de phénotypes ou de réponse au traitement entre les sexes. Nous injecterons le nombre de portées nécessaire à obtenir au moins 8 souris de chaque génotype d’un même sexe pour les 2 études. Des analyses statistiques dédiées à l’analyse sur petit groupe seront utilisées pour une interprétation la plus fiable possible des résultats. Les constructions de la 2ème étude seront testées de manières successives et si une option s’avère parfaitement efficace les autres ne seront pas testées. Aussi, l’ensemble de ces projets nécessite au maximum l’utilisation de 720 souris (sauvages et hétérozygotes) dans les 2 études expérimentales pour les 5 ans du projet.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h/jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés 6 par cage maximum et l'isolement est évité au maximum. Un enrichissement de leur environnement est mis place avec aux choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’entretien des animaux ainsi que les expériences seront réalisés par un personnel titulaire des autorisations et formations nécessaires. Les animaux sont observés quotidiennement par l’animalier en charge de la lignée ou par les personnes en charge des protocoles. L’utilisation de vecteurs viraux de type virus adéno-associé n’entraine a priori pas de douleurs et donc de mise en place de traitement particulier pour y palier mais une surveillance renforcée sera exercée dans les jours suivants l’injection des souris. La procédure d’injection dure moins d’une minute par souris et est réalisée après anesthésie par le froid chez les nouveaux nés. L’imagerie est réalisée après anesthésie gazeuse et les mesures de forces de type Grip, Hanging et string test sont non invasives. Pour les mesures de forces invasives elles sont réalisées sous anesthésie et sans réveil. L’anesthésie gazeuse est réalisée en maintenant la thermorégulation en utilisant une lampe ou un tapis chauffant. Les animaux anesthesiés par le froid dont réchauffés progressivement dans une cage placée sur tapis chauffant. Les nouveaux nés ne sont replacés avec leur mère qu’une fois réchauffés et complètement réveillés (respiration normale et mouvements spontanés). Ils sont également frottés avec la litière de la cage maternelle afin de limiter le risque de rejet et remis tous en même temps dans la cage.Le comportement de la mère envers les petits est ensuite surveillé pendant 15 minutes puis fréquemment pendant les heures suivantes. Pour tous les projets, des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour l’optimisation du traitement, car la molécule testée ici est un outil génétique qui cible spécifiquement la mutation du gène portée par ce modèle. Le modèle de souris utilisé est le plus petit modèle mammifère pour cette myopathie et est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons précédemment démontré l’innocuité et l’efficacité du vecteur viral thérapeutique utilisé dans le muscle de souris de ce modèle. A ce stade il apparait donc indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude chez la souris afin d’en optimiser l’efficacité et vérifier la toxicité à l’échelle de l’organisme entier (injection dans le système sanguin). Les souris développent un phénotype musculaire progressif dont les premiers signes apparaissent à 1 mois et s’amplifient ensuite. Nos études préliminaires montrent que le défaut qui permet le bon acheminement du vecteur thérapeutique apparait entre 1 et 2 mois et s’aggrave avec la progression de la maladie. L’objectif de ce projet thérapeutique étant d’intervenir au plus tôt dans le développement de la maladie, les souris seront injectées en période néonatale entre 1 et 3 jours de vie. Nous nous limiterons à des injections entre J1 et J3 car après la veine temporale n’est plus visible du fait de l’apparition de la pigmentation de la peau et pour l’injection intra-péritonéale il s’agit de la fenêtre permettant une diffusion optimale en systémique (perméabilité maximale). Les souris sont par la suite évaluées à 1, 2, 3 et 4 mois après l’injection 1 c’est-à-dire après le début des symptômes jusqu’à ce que la maladie soit bien développée.

208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour deux gènes de l'horloge biologique, elles sont gavées cinq jours par semaine pendant trois semaines et placées dans des caissons appauvris en oxygène, en continu ou par cycles reproduisant l'apnée du sommeil, avant une mesure de pression cardiaque et la mort pour prélever les organes. Le porteur indique que l'hypoxie provoque une perte de poids et que les caissons génèrent stress, bruit et fatigue par mauvais sommeil. Il cherche à savoir si le rythme circadien protège de la sénescence pulmonaire et reconnaît que ce rythme s'étudie difficilement in vitro.

Objectifs

L’impact de la sénescence sur le fonctionnement du rythme circadien, et inversement, commence à être mis en évidence dans plusieurs travaux montrant des altérations de l’horloge circadienne avec l’âge, chez l’homme et chez la souris. La sénescence cellulaire correspond à l’arrêt de la prolifération et à la perte des fonctions initiales de la cellule. C’est un phénomène qui peut survenir après différents stress ou bien naturellement au cours des divisions successives. La sénescence cellulaire est aujourd’hui considéré comme un processus important dans de nombreuses maladies liées à l’âge. Les protéines p21 et p16, régulateurs du cycle cellulaire, sont deux des principaux marqueurs de la sénescence. D’autre part, le rythme circadien chez les mammifères est généré par des oscillations de l’expression de gènes spécifiques au niveau cellulaire (gènes circadiens). Rev-Erb alpha et Bmal -1, deux composants clés de l’horloge circadienne, sont capables d’interagir avec p21, indiquant un lien avec le cycle cellulaire, et potentiellement avec la sénescence. Des résultats obtenus dans un modèle d’apnée du sommeil chez la souris montrent une dérégulation de ces gènes circadiens, ainsi qu’une altération de l’expression de p21 dans le poumon. D’autre part, l’exposition de souris à l’hypoxie chronique (pour modéliser l’hypertension artérielle pulmonaire) induit une accumulation de cellules sénescentes dans le poumon. Nous cherchons à déterminer si le rythme circadien joue un rôle protecteur contre la sénescence, dans des conditions normales ou pathologiques. Nous utiliserons pour cela deux modèles de souris dans lesquels les gènes Rev-Erb alpha ou Bmal-1 sont non-fonctionnels. Ces souris seront exposées à l’hypoxie chronique, ou à l’hypoxie intermittente (modèle d’apnée du sommeil) afin de reproduire des conditions similaire à celles observées dans deux pathologies humaines affectant le poumon. Nous traiterons les souris avec une molécule permettant d’éliminer spécifiquement les cellules sénescentes (molécule sénolytique). Cette étude permettra finalement de comprendre : 1) comment est impacté le processus de sénescence cellulaire chez des souris génétiquement modifiées présentant un rythme circadien altéré. 2) comment l'élimination des cellules sénescentes par un traitement pharmacologique corrige les altérations induites par l’exposition au stress hypoxique et par le défaut des gènes circadiens.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront de décrire plus précisément le lien suspecté entre rythme circadien et sénescence, suggéré dans plusieurs travaux récents, ainsi que d’explorer les mécanismes d’interaction entre les deux processus. A terme, cette étude permettra d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques pour agir indirectement sur la sénescence en ciblant le rythme circadien. Comprendre les différents facteurs pouvant impacter la sénescence est important pour pouvoir envisager des traitements et/ou déterminer des facteurs de risques, dans le contexte d’une population vieillissante.

Procédures

Les animaux seront gavés 5 jours par semaine pour les traitements par la molécule sénolytique ou le placebo pendant une durée de 21 jours. Pendant cette durée, ils seront placés dans des caissons à hypoxie et hypoxie intermittente, dans lesquels est injectée de l’azote afin de réduire la concentration en oxygène soit : en continu pour l’hypoxie chronique, afin d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patient atteint de broncho-pneumopathie obstructive chronique ; de façon cyclique pour reproduire les cycles d’hypoxie/réoxygénation observés chez les patients atteints d’apnée du sommeil. A la fin de la procédure, les animaux seront profondément anesthésiés et analgésiés pour la prise de la pression ventriculaire, suite à quoi ils seront euthanasiés pour le prélèvement des organes.

Impact sur les animaux

Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie et l'hypoxie intermittente en début de procédure. Les caissons d'hypoxie intermittente peuvent créer un stress dû au bruit généré par la machine et à l'hypoxie au début de l'expérimentation, ainsi qu'une fatigue chez les souris dû à une faible qualité de sommeil. Le gavage est aussi une source de stress pour les souris.

Devenir

L'étude nécessite le prélèvement des organes (poumons, cœur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologique (quantification des marqueurs de sénescence, expression des gènes circadiens) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon) les animaux seront donc mis a mort à la fin des procédures.

Remplacement

Le rythme circadien peut difficilement être étudié in vitro. En effet une fois mise en culture, les cellules ont tendance à perdre l’expression rythmique des gènes circadiens et à se désynchroniser entre elles, ce qui est problématique pour étudier des effets à moyen et long terme. De plus, les modèles de culture cellulaire ne permettent pas de reproduire fidèlement les concentrations d’oxygène qui varient de manière complexe en fonction des organes, tissus et du métabolisme, ce qui est problématique pour étudier un modèle impliquant l’hypoxie et l’hypoxie intermittente, où les changements de la concentration d’oxygène sont récurrents. Cependant, nous utiliserons en parallèle un modèle de culture cellulaire pour étudier l’interaction entre Rev-Erb alpha et p21.

Réduction

Nous choisissons de réaliser des groupes de taille suffisante pour atteindre une puissance statistique satisfaisante, ce qui nous évitera d’avoir à recommencer l’expérience pour cette raison. Par ailleurs, les groupes ont été pensés afin de réduire le nombre d’animaux tout en ayant les contrôles nécessaires à l’analyse correcte des résultats. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même portées pour réduire au maximum la variabilité des données. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.

Raffinement

Les zootechniciens et les investigateurs du projet seront en communication concernant le bien-être et la santé des animaux qui seront surveillés quotidiennement. L'environnement des souris sera enrichi par des maisons ou tube en carton, du papier kraft et du coton. Le gavage sera effectué par un même expérimentateur afin de réduire le stress des souris. Les souris recevront une anesthésie et analgésie adaptée avant la mise à mort. Pendant la durée des procédures, des critères d’évaluation et des points limites adaptés seront utilisés afin de détecter des signes de souffrance, et de procéder si nécessaire à la mise à mort anticipée de l’animal.

Choix des espèces

Les modèles d'hypoxie intermittente et d'hypoxie chronique que nous souhaitons utiliser sont bien décrits dans la littérature, ils ont fait l'objet de plusieurs publications notamment dans le domaine des maladies vasculaires et pulmonaires. On utilisera des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et on considère que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures. Nous étudierons également des souris âgées de plus de 18 mois pour évaluer dans quelle mesure l'accumulation de cellules sénescentes altère le rythme circadien.

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie des injections d'ADN dans un muscle suivies d'une électroporation, puis sept prises de sang en un mois sur animal vigile, pour mettre au point une méthode faisant produire une protéine par les cellules musculaires. Le porteur indique que les injections et les prélèvements peuvent provoquer des douleurs et des hématomes, et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs muscles. Il présente cette mise au point comme une étape vers des biomédicaments destinés aux animaux domestiques.

Objectifs

Le présent projet vise à développer une méthode permettant de faire exprimer par un muscle une protéine d’intérêt à partir d’un plasmide contenant sa séquence codante. Le plasmide est injecté dans les cellules musculaires de souris afin d’induire une sécrétion à une dose supérieure ou égale à la dose minimale efficace. Le projet se focalisera sur des protéines de types anticorps, à longue durée de vie, puis un peptide, la kisspeptine, à plus courte durée de vie, impliqué dans le contrôle de la reproduction. L’objectif est donc double : 1/ mettre en place une méthode d’expression de protéines par les cellules musculaires et 2/ induire une expression qui soit suffisante pour être détectée dans le sang des animaux et agir sur des cibles présentes à distance des muscles. Ce projet fait suite à de nombreux tests cellulaires de vérification de la fonctionnalité des plasmides ADN utilisés. Sa réussite ouvrira la voie à des études plus approfondies et à visée thérapeutique chez des espèces domestiques.

Bénéfices attendus

Une fois abouti, le présent projet a pour vocation de mettre en place une méthode de production de biomédicament par les cellules musculaires d’un muscle de souris via l’injection d’un vecteur ADN. Celle-ci ouvrira de nombreuses perspectives thérapeutiques intéressantes et notamment, dans notre cas, pour les animaux domestiques.

Procédures

Les animaux de cette étude seront soumis à des injections intramusculaires et de l'éléctroporation sous anesthésie générale (d'une durée inférieure à 10 minutes). Afin de réaliser un suivi de l'expression des protéines exprimées suite à l'injection, 7 prélèvements de sang de quelques secondes seront réalisés sur animaux vigiles sur une période de 28 jours.

Impact sur les animaux

Les procédures employées dans notre projet emploient des injections intramusculaires, d’ADN complexé ou non à un transfectant pouvant potentiellement induire des douleurs. Des prises de sang seront également réalisées et peuvent provoquer des douleurs, ou encore des hématomes aux lieux de ponctions.

Devenir

Afin de réaliser des marquages et des études poussées sur les muscles de nos animaux, ceux ci seront euthanasiés suite à l'injection d'un mélange anesthésique à l'issu de chaque procédure

Remplacement

Une première sélection des meilleurs plasmides d’expression a été réalisée en amont sur des modèles de cultures cellulaires. L’étude de la production de nos protéines d’intérêt par un tissu musculaire et sa sécrétion dans la circulation sanguine générale n’a, à l’heure actuelle, pas de méthode de remplacement qui permet de suivre l’effet des silençage épigénétique et immunitaire.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. La première mesure de réduction a été d’utiliser des vecteurs exprimant des protéines qui sont détectables dans la circulation sanguine et pouvant être dosées. De cette façon, les animaux ne seront pas euthanasiés à chaque temps d’observation pour étudier l’expression du vecteur et celle-ci pourra être suivie au cours du temps sur un seul et même animal. C’est donc un double bénéfice au niveau scientifique et au niveau de l’utilisation d’animaux. La seconde mesure de réduction consistera à effectuer un premier tri de notre collection de vecteurs plasmidiques sur des systèmes cellulaires, ce qui a permis de réduire de façon significative le nombre de tests sur animaux.

Raffinement

Les animaux utilisés dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique, dans des cages en présence d'enrichissement. De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Une attention toute particulière sera portée au comportement et l'apparence des souris et celles ci seront pesées tous les jours pendant 3 jours après les injections intramusculaires, injections ou prises de sang puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements sanguins. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites (soulagement de la douleur en cas de dégradation d’un critère de comportement et d’apparence, euthanasie en cas d’atteinte du seuil critique de perte de poids et/ou dégradation de plus de deux critères de comportement et d’apparence). Afin de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies, des traitements anesthésiques et analgésiques seront apportés aux animaux pour réduire leur douleur au maximum.

Choix des espèces

Le projet emploie la souris qui est un modèle de petite taille possédant donc de petits muscles. Pour une mise au point comme c’est le cas dans notre projet, l’approche est ainsi facilitée. Enfin, la souris est un modèle très largement employé dans la littérature pour ce genre d’étude, les connaissances associées sont donc très nombreuses et nous permettent donc d’être plus précis sur certains aspects techniques, réduisant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. La méthode mise en place dans ce projet a pour vocation de faire produire nos protéines d’intérêt dans un système complètement fonctionnel et développé. Les animaux employés seront donc post pubères et adultes.