Recherche fondamentale
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Impact du SADI-S et du bypass gastrique Roux en Y sur la plaque d’athérosclérose
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendues obèses ou déficientes pour un récepteur des lipides, elles subissent une chirurgie de l'estomac et de l'intestin d'environ une heure puis des prises de sang répétées, avant d'être tuées deux mois plus tard pour prélever l'aorte. Le porteur annonce une mortalité pouvant atteindre 20 % après l'opération, des douleurs pendant cinq jours, un risque de lâchage de la cicatrice et une dénutrition. Il compare deux techniques de chirurgie de l'obésité pour leur effet sur la plaque d'athérome et affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace l'animal dans ce domaine.
Objectifs
La chirurgie bariatrique, inclue plusieurs techniques comme la sleeve gastrectomie (SG), le bypass gastrique de Roux en Y (RYGB). Malgré le statut de référence qu’occupe le RYGB dans le traitement de l’obésité morbide, des échecs avoisinant les 20% sont observés, en particulier chez les patients super obèses dont la prise en charge pose problème. Dans ce contexte, le SADI-S (single-anastomosis duodeno-ileal bypass with sleeve gastrectomy), a été récemment développé. Cette intervention consiste en un bypass duodéno-iléal avec anastomose unique associée à une SG. L’anastomose digestive unique rend le SADI-S moins complexe que le RYGB (qui nécessite 2 sutures digestives). Nous avons récemment mis au point au laboratoire un modèle murin de SADI-S, dont les premiers résultats en comparaison du RYGB montrent, chez la souris Ob/Ob (naturellement obèse) une amélioration importante de l’homéostasie glucido-lipidique, associée à une perte de poids qui avoisine les 40%. Ces résultats, comparables à ceux observés chez l’homme, laissent entrevoir une réduction importante du risque cardiovasculaire, qui n’a pas à ce jour été évaluée chez l’homme après SADI-S. Les études menées chez l’homme suggèrent un effet bénéfique du RYGB sur la plaque d’athérome par mesure échographique de l’épaisseur intima-média carotidienne et par coronarographie , mais les mécanismes mis en jeu restent encore peu connus, et aucune étude n’a évalué les effets du SADI-S sur l’athérosclérose. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du SADI-S, en comparaison du RYGB, sur le développement et/ou la régression de la plaque d’athérosclérose chez la souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus d’un tel projet s’inscrivent dans la réflexion, d’actualité, autour des chirurgies métaboliques et de leur indication chez des patients obèses présentant des comorbidités variées. Si le SADI-S, intervention émergente dont la réalisation en pratique clinique est en plein essor, semble s’accompagner d’effets métaboliques marqués, les mécanismes mis en jeu et les conséquences sur le long terme restent peu connus. Une étude clinique nationale française est actuellement en cours pour comparer ses effets avec ceux du RYGB (NCT03610256). Notre étude sur modèle animal, en améliorant la connaissance des effets du SADI-S et du RYGB en particulier sur la plaque d’athérome, pourrait en particulier permettre de mieux cibler les indications opératoires de ces types de chirurgies selon le profile métabolique du patient.
Procédures
Chaque souris de chaque groupe sera opérée d’une chirurgie (soit une chirurgie de type RYGB, soit une chirurgie de type SADI-S ou une chirurgie de type Sham) d’une durée moyenne d’environ 65 minutes. Pour ces deux groupes expérimentaux, un prélèvement de sang par une coupure minime à l’extrémité de la queue sera réalisé à différents temps (30 microlitres) : avant la mise sous régime, à une semaine et à deux semaines après la mise sous régime puis tous les mois jusqu’à la chirurgie et tous les mois après la chirurgie, afin de déterminer la cholestérolémie et la glycémie. Les souris seront randomisées dans 2 groupes expérimentaux (groupe "sham" ou laparotomie; ou groupe type chirurgie bariatrique) en fonction de leur poids et de leur cholestérolémie. Après une semaine de récupération, les animaux seront mis en condition pour la chirurgie bariatrique.
Impact sur les animaux
En tant que protocole sévère, les effets indésirables attendus sont : - Une mortalité entre 0 et 20% après chirurgie; - Des douleurs pendant les 5 premiers jours qui nécessitent une antalgie appropriée; - Un risque de désunion cicatricielle post-opératoire qui nécessite une surveillance biquotidienne initiale - Une dénutrition qui nécessite une supplémentation ferrique et vitaminique quotidienne
Devenir
A l'issue de la chirurgie (procédure 1) toutes souris seront gardées 2 mois en vie et seront euthanasiées pour le prélèvement de l'aorte afin de mesurer la plaque d’athérome.
Remplacement
Les conséquences physiologiques du SADI-S et du Gastrique Bypass en Y impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Il n’existe pas à l’heure de méthodes ex vivo / in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de la chirurgie bariatrique.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
La procédure 1 est classée sévère. Un protocole péri-opératoire a été mis en place afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale par Isoflurane. Les animaux reçoivent avant la chirurgie puis pendant une durée de 3 jours de la buprénorphine et de l’amoxicilline. Des injections de metoclopramide seront réalisées avant la chirurgie et jusqu’à J5. Les souris seront nourries avec une nourriture sous forme de gel riche en graisse (Geldiet highfat, 10% Saindoux, 10% sucre liquide, 57% eau, Safe) de J1 à J5, puis le régime riche en graisse sous forme solide sera réintroduit à partir de J3. Les souris seront supplémentées en fer et en vitamines ad libitum dans l’eau de boisson jusqu’à la fin du protocole afin de prévenir l’anémie et les carences nutritionnelles. Les souris seront placées en couveuse à 30°C pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les différentes voies et les transporteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines. Outre l’existence de nombreux modèles de souris génétiquement modifiés, ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie (anticorps, test ELISA, dosage colorimétrique) et/ou de biologie moléculaire (Primers, Sh-RNA,...) qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Nous avons au laboratoire une lignée de souris déficientes en LDLr et nous commanderons des souris Ob/Ob. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 2 et 5 mois). A ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.
Sensibilisation au 5-Fluorouracil et anti-PD-L1 chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
420 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses colorectales puis jusqu'à dix-huit injections dans l'abdomen sur deux semaines, pour tester si la nortriptyline ou le blocage de l'interleukine-23 rend la tumeur plus sensible à une chimiothérapie et à une immunothérapie. Le porteur précise que les souris sont maintenues sans traitement antidouleur pour ne pas fausser la réponse inflammatoire, tout signe de souffrance entraînant leur mise à mort. Il présente une régression complète de la tumeur comme un résultat probable et affirme que l'effet sur le microenvironnement tumoral ne peut être modélisé in vitro.
Objectifs
Ce projet vise à démontrer le rôle de l’accumulation de lipides et de son inhibition par la nortriptyline ou par le blocage de l’IL-23 dans la sensibilisation à la chimiothérapie 5-Fluorouracil et à l’immunothérapie anti-PD-L1 dans le cancer colorectal.
Bénéfices attendus
L’agent anti-cancéreux 5-FU perd de son efficacité avec l’accumulation induite de gouttelettes lipidiques intracellulaires et pourrait limiter également l’action favorable de l’immunothérapie anti-PD-L1 par l’induction de ces gouttelettes lipidiques limitant l’action du système immunitaire anti-tumoral. La prévention de l’accumulation des gouttelettes lipidiques par l’inhibition de la capture de lipides extracellulaires à l’aide de la nortriptyline ou l’anti-IL23 améliorerait l’efficacité du traitement 5-FU et de l’immunothérapie anti-PD-L1 conduisant probablement à une régression tumorale complète avec un traitement combinant ces trois molécules.
Procédures
Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales tous les 3 jours pendant 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les injections IP répétées (avec au maximum 18 injections sur deux semaines) peuvent entraîner un stress chez les souris vigiles au moment de la contention. La transplantation en sous-cutanée des cellules se fera sur souris anesthésiée à l’isoflurane. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids (deux fois par semaine) sera effectuée.
Devenir
Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront traitées pendant deux semaines et maintenues en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elles seront ensuite mises à mort.
Remplacement
L'utilisation de ce modèle murin de cancer est nécessaire car l’effet du blocage de la capture de lipides extracellulaires pourrait moduler l’activité de l’ensemble du microenvironnement tumoral et notamment celle du système immunitaire qui ne peut être modélisée in vitro. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.
Raffinement
Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 420 souris mâles seront utilisées.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 ou Balb-C a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. Des souris mâles âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.
Réalisation d’une preuve de concept sur la résorption et la tolérance d’un renfort de suture à base d’alginate sur une lobectomie pulmonaire partielle chez le modèle porcin (EU 1/3)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
11 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Âgés de trois à quatre mois, ils subissent l'ouverture de la cage thoracique et une résection partielle du poumon agrafée avec un renfort de suture à base d'alginate, puis un suivi par scanner sous anesthésie pendant six à neuf mois avant d'être tués pour analyse de l'organe. L'objectif n'est pas thérapeutique mais commercial, il s'agit d'une preuve de concept en vue du marquage CE d'un dispositif hémostatique présenté comme un produit fabriqué en France. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de tester le dispositif dans un environnement avec organes et fluides corporels qu'aucun essai in vitro ne reproduit.
Objectifs
Le pansement idéal n’existe pas. Cependant, il doit présenter quelques caractéristiques, parmi lesquelles : 1/maintenir la plaie en milieu humide et chaud, 2/être modifié selon les stades de cicatrisation, 3/ être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, 4/absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, 5/ ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, 6/ ne pas être toxique et être hypoallergénique, 7/ protéger des chocs, 8/ être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, 9/ être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanées mais très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies par rupture de petits vaisseaux dits « capillaires » qui induit un saignement continu et étendu, le chirurgien utilise des hémostatiques chirurgicaux résorbables comme traitement. Ces dispositifs médicaux sont des produits de synthèse ayant des temps de résorption longs. Nous souhaitons testé est un produit naturel dont le temps de résorption devrait être plus court que ses concurrents. Son enrichissement (calcium, zinc et magnésium) permet des échanges ioniques avec la plaie et favorise l'activation des réactions en cascade de la coagulation. Le dispositif médical est un renfort de la suture dans l’utilisation d’un système d’agrafage de type GIA® et dont la résorption sera suivie à différents temps par imagerie scanner. L’objectif de cette procédure est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale, de suivre sa résorption et son impact au niveau du tissu lésé ainsi que des zones proches à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de dispositif médical hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements liés au renfort de suture par agrafage en cours de chirurgie. De plus, nous disposerions d’un produit fabriqué en France, ce qui n’est pas le cas des autres dispositifs (Etats-Unis, Japon). La biocompatibilité de ce dispositif médical a été testée en in vitro.
Bénéfices attendus
Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit (sous format de pansement) pour le renfort d’un système d’agrafage sur la résection d’un tissu (lobectomie pulmonaire partielle) mais aussi de suivre la résorption du produit et les adhérences possibles dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) en tant que renfort de suture.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie pour permettre l’accès au poumon tout en préservant les autres organes dans les cavités respectives. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès à l’organe, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutané). L’animal n’aura qu’une seule intervention chirurgicale. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Quelques minutes au total Retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie après entrainement médical: 5 minutes. A différents temps post-opératoires, l’animal aura une imagerie pour évaluer le taux de résorption: transport anesthésie acquisition environs 2h à chaque fois. Pour l’hébergement à long terme, les animaux seront hébergés dans des conditions proches des élevages, sans contraintes particulières. Les animaux seront pesés régulièrement. Cet acte ne dure que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Lors de l’ouverture de la cage thoracique, il y aura une rupture du vide pleural qui se situe entre le poumon et la plèvre recouvrant la cage thoracique. Ce vide est essentiel pour permettre au poumon de se gonfler et dégonfler. Si le vide est rompu, le poumon ne peut pas se gonfler correctement lors de l’inspiration et place l’individu en détresse respiratoire. Pour éviter cette complication, l’incision sera refermée plan par plan et hermétiquement. Ensuite, à l’aide d’un cathéter et d’une seringue, l’excédent d’air sera aspiré de la cage thoracique en même temps que la remise progressive du poumon sous ventilation. La procédure sera potentiellement douloureuse pour l’animal en post-opératoire, et la procédure analgésique systématique sera adaptée à chaque animal selon le suivi de l'état clinique. Au bout de 3 semaines, les animaux déclarés aptes au transport partiront pour une autre structure qui assurera l’hébergement de longue durée. A différents temps post-opératoire, l’animal sera transféré vers un centre d’imagerie pour passer au scanner. Le transport entre les différentes structures va générer du stress dû à l’arrivée dans un nouvel environnement. De plus, les différentes contention pour réaliser les pesées et les gestes techniques pour faire l’anesthésie de la chirurgie et de l’imagerie ainsi que la mise à mort peuvent générer un stress.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort soit parce qu’ils auront atteint un point limite ou qu’ils ont atteint le temps d’observation (J+6 mois, J+7,5 mois, J+9 mois). Une étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée donc cela nécessite le prélèvement de l’organe.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu lésé et de suivre sa résorption à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements lors de résection de tissu en cours de chirurgie. Il est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduits in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.
Réduction
Nous utiliserons 11 animaux au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes. Il y a 2 animaux supplémentaires prévus pour compléter un groupe si nécessaire. Ce nombre a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Étant donné que c’est une preuve de concept, nous n’avons pas besoin de plus 3 animaux par lot pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et nécessite une intervention chirurgicale pour l’arrêter, nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé et raffiné la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux mise à mort, issus de procédures antérieures.
Raffinement
Initialement l’intervention était prévue en thoracoscopie c’est-à-dire sous coelioscopie, ce qui ne nécessite que 3 incisions (une pour la caméra et 2 pour les instruments). La forme de la cage thoracique est trop étroite pour travailler avec les pinces et le système d’agrafage sans provoquer d’autres lésions sur les tissus environnants. C’est pourquoi, il a été opté pour une chirurgie ouverte avec une voie d’abord au niveau du 9ème espace intercostal, dont l’incision suivra la forme des côtes. L’animal sera injecté avec un analgésique d'action longue (anti-douleur) pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un hypnotique couplé à un analgésique. L’animal est placé sous masque avec un anesthésique gazeux et sur une table chauffante pour maintenir la température corporelle. L’extrémité du lobe pulmonaire sera saisie à l’aide d’une pince atraumatique. Les mors du système d’agrafage équipés du renfort seront placés de part et d’autre du lobe, puis le dispositif sera mis en place. Cette résection n’empêche pas le poumon de fonctionner correctement par la suite. La plaie sera protégée à l’aide d’un pansement. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous-surveillance jusqu’à son réveil complet. L’animal avec les couvertures polaires sera remis dans l’enclos et recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans l’enclos des légumes frais, plus appétents, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. L’état général de l’animal et de la cicatrice seront suivis quotidiennement pendant 1 semaine, puis toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. Les animaux seront hébergés collectivement mais s’il est seul, il aura un contact visuel et/ou olfactif avec d’autres congénères et bénéficiera d’un renforcement de l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement pour détecter rapidement toutes complications. Ces dernières seront reportées auprès du vétérinaire de la structure qui mettra en place le traitement adapté. La surveillance sera renforcée le temps nécessaire. Pour obtenir la complète collaboration des animaux sur un hébergement à long terme, des techniques de renforcement positif seront mises en place.
Choix des espèces
Toute étude en vue du marquage CE d’un dispositif médical existant sous plusieurs formats doit être réalisée sur le format de taille maximale, correspondant ici à un dispositif de 8 cm. Il n’existe que 2 espèces animales sur lesquelles nous pouvons trouver un poumon capable d’accepter un dispositif de cette taille, le porc et le mouton. Les études initiales pour le dispositif actuellement commercialisé ayant été réalisées sur le porc, nous avons donc retenu cette espèce pour ce projet. Le modèle lapin utilisé dans le cadre d’autres projets semblables ne peut être utilisé pour ce projet car la taille du poumon ne permet pas de faire la résection nécessaire, sous peine d'handicaper gravement l'animal en post-opératoire. Les animaux seront réceptionnés à 29 kg environ pour atteindre 35-37 kg (jour de chirurgie). L’utilisation d’animaux de 35 kg environ permet de bénéficier d’une taille d’organe représentative de ce que nous avons en chirurgie humaine. Il s'agit de jeunes animaux de trois à quatre mois.
Comparaison de deux systèmes d’imageurs scintigraphiques chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'un traceur radioactif, par voie intrapéritonéale à l'état vigile et par voie intraveineuse sous anesthésie, suivies de séances d'imagerie jusqu'à huit fois par animal. L'objet du projet n'est pas thérapeutique mais consiste à comparer deux appareils d'imagerie, dont un prototype de TEP haute résolution dédié à la souris. Le porteur affirme qu'un tel appareil doit être testé sur l'"organisme entier" et que la modélisation mathématique ne peut remplacer la "vérité terrain" sur le cerveau.
Objectifs
Le projet vise à comparer 2 systèmes d’imagerie : le système d’imagerie actuellement utilisé au sein du département d’imagerie préclinique dédié rats et souris versus un prototype d’imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons), Haute résolution dédié exclusivement à la souris. Le prototype est en développement et des études in vitro ont été réalisées. Les résultats sont très encourageants, il est donc nécessaire de le tester sur l’animal vivant (organisme entier) pour objectiver l’impact du gain en résolution et en sensibilité des images. En effet, l’optimisation de la qualité des images est un enjeu majeur dans la compréhension des mécanismes sains et pathologiques associés au système nerveux central. Un système d’imagerie plus performant nous permettra de raffiner nos connaissances sur l'étiologie de certaines pathologies cérébrales et ainsi d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans la prise en charge de ces pathologies.
Bénéfices attendus
Ce projet qui consiste en la validation d’un nouveau système d’imagerie haute résolution chez la souris nous permettra d’obtenir des résolutions optimales dans le cadre de nos activités de recherche relative à l’exploration cérébrale. En effet, nos thématiques de recherche ciblent en majeur partie des études portant sur le système nerveux central des rongeurs. Actuellement, nous travaillons sur des modèles rats et souris avec un système d’imagerie dont la résolution est autour du millimètre, il est donc plus aisé de travailler sur des modèles rats de par la taille. Cependant, une grande partie des modèles animaux de pathologie du système nerveux central sont des modèles souris. L’optimisation de la résolution mais aussi de la sensibilité et de la qualité des images fournies par nos systèmes d’imagerie est un enjeu majeur dans la compréhension des mécanismes impliqués dans les différentes pathologies du système nerveux central. En effet, un système d’imagerie plus performant nous permettrait de raffiner nos connaissances sur l'étiologie de certaines pathologies cérébrales. Nous espérons que ce système nous apportera des informations complémentaires pour mieux comprendre le métabolisme cérébral basal (animal sain), les mécanismes pathologiques impliqués dans la neuroinflammation et appréhender la sensibilité de ce nouveau système en terme de quantification des images. Ceci, nous permettra de raffiner nos connaissances sur ces pathologies cérébrales et, potentiellement, d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans la prise en charge des pathologies du système nerveux central.
Procédures
Etape 1: Injection intrapéritonéale en vigile: 8 fois en tout, 2 min/souris – injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse: 6 fois – Imagerie 30 min sous anesthésie gazeuse, 8 fois/animal Etape 2: Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse: suivi d’une imagerie de 60 min, 8 fois/animal Etape 3: Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse suivi d’une imagerie de 60 min, 3 fois/animal injection intrapéritoneale, vigile, 1 fois/par animal.
Impact sur les animaux
La contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute un stress supplémentaire. Une douleur au point d’injection du traceur radioactif ou des traitements pharmacologiques en intrapéritonéal peut être ressentie quelques heures. Un hématome associé avec une douleur au niveau de la queue à la pose ou au retrait du cathéter peut apparaitre.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue du projet et les cerveaux seront prélevés pour des analyses immunohistochimie et métabolomiques.
Remplacement
Les études réalisées in vitro sont très encourageants. A ce stade, il est impératif d’étudier ce nouveau système d’imagerie sur l’organisme vivant entier. Ce type d’étude ne peut être substitué par une modélisation mathématique car l’objectif final est d’obtenir la vérité terrain sur le cerveau qui intègre l’environnement vasculaire cérébral et ainsi la distribution systémique du radiotraceur au sein du système nerveux central.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux, les animaux seront imagés plusieurs fois. A partir des images individuelles acquises pour chaque radiotraceur, les images seront générées afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques appropriées pour ce projet pour comparer les différents groupes. Le nombre d’animaux dans cette étude est dictée par des études antérieures menées au sein de notre laboratoire qui ont montré qu’un effectif de n=12 par groupe et par imageur est nécessaire pour répondre à nos objectifs. Nous prévoyons d’inclure un effectif de 15 animaux/groupe de chaque sexe (afin d’assurer un minimum de 12 animaux à exploiter).
Raffinement
Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle d’expérimentation pour diminuer leur stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les souris seront observées une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance accrue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal chaque jour d’expérimentation jusqu’au réveil complet.
Choix des espèces
L’objectif étant de caractériser un système d’imagerie haute résolution, la souris est l’espèce adaptée pour cette étude. De plus, la taille du cerveau de la souris est compatible avec la sensibilité et la résolution spatiale des 2 imageurs qui seront utilisés. Nous utiliserons des souris adultes afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole.
Evaluation des effets de composés pharmacologiques sur un modèle de diabète de type 1 chez le rat ou la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 216
1 080 rongeurs, 864 souris et 216 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète de type 1 est induit par injection de streptozocine, puis les animaux reçoivent des candidats médicaments, parfois par pompe osmotique implantée, et subissent des tests de glycémie avec prises de sang répétées. Le porteur indique que les administrations et la contention peuvent provoquer stress et douleur. Il présente ces molécules comme sélectionnées après des tests in vitro et destinées à d'éventuels essais cliniques, et prévoit la mort de tous les animaux en fin de procédure.
Objectifs
Le glucose est décrit comme étant le principal carburant de l’organisme, et son taux plasmatique est régulé par l’insuline, une hormone secrétée par les cellules bêta du pancréas. Le diabète correspond à une élévation prolongée de la concentration de glucose, appelé aussi hyperglycémie, dans le sang. On distingue principalement 2 types de diabète : le diabète de type 1 (DT1) et le diabète de type 2 (DT2). Le DT1 est due à la détérioration des cellules bêta du pancréas entraînant une carence en insuline, tandis que le DT 2 est causé par une baisse de la production d’insuline ou l’apparition d’une résistance à l’insuline produite. Le DT 1 est une maladie auto-immune, en effet, il fait suite au dysfonctionnement des cellules immunitaires (lymphocytes T), qui se mettent à identifier les cellules bêta du pancréas comme des cellules étrangères et à les éliminer. Le DT1 représente environ 10 pour cent des cas de diabètes, dont la moitié se déclare avant l’âge de 20 ans. Il a une incidence d’environ 15 cas pour 100 000 enfants de moins de 15 ans. L’insulinothérapie est le traitement de référence du DT1, qui consiste à des injections sous-cutanées d’insuline plusieurs fois par jour. Un traitement bien suivi permet le plus souvent de réguler la glycémie, néanmoins, c’est un traitement lourd et chronique, nécessitant en même temps une mesure de la glycémie par le patient plusieurs fois par jour. A noter que c’est un traitement qui permet une prise en charge, et non une guérison, et donc à prendre à vie. Par ailleurs, le nombre de personnes atteintes de DT1 ne cesse d’augmenter au rythme de 3 à 4 % par an. Ainsi, la recherche continue, soit à décrypter les mécanismes de la maladie pour mieux la prévenir, soit en améliorant les traitements. Ce projet a donc pour objectif de tester des nouveaux candidats médicaments pour le traitement du DT1 chez le rat ou chez la souris.
Bénéfices attendus
Depuis une vingtaine d’année, le nombre de personnes atteintes de DT1 ne cesse d’augmenter tous les ans, tandis que le traitement de référence reste l’insulinothérapie, un traitement lourd et à vie. Ce projet vise à rechercher et sélectionner les candidats médicaments efficaces pour traiter le DT1 chez l’animal, afin d’obtenir une preuve d’efficacité pour d’éventuels essais cliniques chez l’homme par la suite.
Procédures
Les interventions que vont avoir les animaux sont : - Une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à tester, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. Tout type d’administration sur animal vigil, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute. L’administration à l’aide d’une pompe osmotique dure moins d’un quart d’heure. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour, pendant 1 à 48 semaines). - Une administration intrapéritonéale de streptozocine si le modèle animal requiert l’induction du diabète de type 1. Ce traitement durera 5 jours au maximum avec une administration par jour, réalisé par des personnels tutorés, et dure moins d’une minute. - Un test de supplémentation au glucose ou en insuline (comme réalisé chez l’homme). Ce test consiste à une administration de glucose ou d’insuline, puis à des prélèvements sanguins permettant le dosage de glucose et ou d’insuline dans le sang. Le test est réalisé une seule fois pour chaque animal, et les prélèvements sont réalisés au maximum 5 fois chez la souris et 7 fois chez le rat, dans les 2 heures qui suivent la supplémentation. Chaque prélèvement sanguin par des personnels tutorés dure environ une minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induit par l’administration du composé à tester, qui nécessitera une contention, et l’implantation de pompe osmotique si besoin - Stress potentiellement dû à l’isolation pour les prélèvements d’urine en cage à métabolisme (moins de 24 heures) ou dû aux prélèvements sanguins.
Devenir
Tous les animaux vont avoir un diabète de type 1 et ou vont recevoir un traitement contre cette maladie. Ainsi, au vu des traitements réalisés sur les animaux, ils seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
Les composés testés dans ce projet sont ceux ayant montré au préalable des effets positifs dans des tests in vitro (screening).
Réduction
Tout d’abord, seuls les composés ayant montré des effets positifs lors des sélections in vitro seront étudiés dans ce projet, limitant le nombre d’animaux à utiliser. Ensuite, selon la littérature et notre expérience, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Et en prenant en compte les exclusions ou pertes potentielles tout au long de l’étude (environ 20 pour cent), 12 animaux par groupe seront étudiés. En considérant que pour l’étude d’un composé pharmacologique, 6 groupes seront nécessaires, et que l’analyse des résultats sera réalisée en 4 mois, 3 sélections sont prévues par an sur 5 ans. Ainsi, le nombre estimé d’animaux est de : 6 groupes d'animaux x 12 animaux par groupe x 3 sélections par an x 5 ans. Soit un total de 1080 animaux, rats et souris confondus. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les animaux sont hébergés à au moins 2 par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de frisure de papier pour leur permettre de nicher et de bûchettes de peuplier pour ronger. - Un suivi quotidien de tous les animaux sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Une anesthésie, anesthésie et un traitement antibiotique prophylactique sont réalisées si la procédure d’implantation de pompes osmotiques est réalisée.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine du diabète. Les rats et les souris sont bien décrites sur le plan physiologique et comportemental, et pour lesquels il existe de nombreux modèles répondants à l’approche thérapeutique envisagé (diabète de type 1). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. L’étude du diabète nécessite l’apparition des caractéristiques qui sont stables et établies au-delà du stade juvénile.
Étude du remodelage veino-lymphatique chez la souris pour comprendre la physiopathologie de l’hypertension intracrânienne idiopathique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
714 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'étude de leur dure-mère et de leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Selon les groupes, elles subissent une ligature des deux veines jugulaires, une injection de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien ou la pose d'un cathéter intracrânien laissé 12 à 14 jours, avec un isolement pendant toute cette durée. Le protocole prévoit aussi un régime gras pour rendre les souris obèses, 31 jours d'isolement en cage d'activité et des tests comportementaux étalés sur deux jours et demi, que le porteur ne nomme pas. Le but est de reproduire chez la souris l'hypertension intracrânienne idiopathique, une maladie qui touche spécifiquement les femmes jeunes en surpoids. Le porteur juge le recours à ces souris "indispensable", alors que le même projet prévoit une IRM du réseau veino-lymphatique chez des patients et des témoins humains.
Objectifs
Les vaisseaux lymphatiques récemment mis en évidence dans les méninges du système nerveux central semblent impliqués dans un grand nombre de pathologies neurologiques. Ces vaisseaux lymphatiques sont absents du tissu cérébral et uniquement présents dans l’enveloppe la plus externe au cerveau : la dure mère. Au sein même de cette enveloppe, ils sont plus spécifiquement localisés le long des sinus veineux duraux. Des travaux récents ont montré que cette proximité anatomique veino-lymphatique jouait un rôle clé dans l’immunité du système nerveux central. Nos hypothèses sont les suivantes : 1) Une altération du réseau veineux cérébral influera le réseau lymphatique, et inversement, 2) La dérégulation du complexe veino-lymphatique chez l’Homme pourrait être impliquée dans une pathologie rare dont les mécanismes sont encore inconnus : l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I). Cette pathologie touche spécifiquement la femme jeune en surpoids et associe une rétention de fluide dans le système nerveux central à des sténoses, c’est-à-dire des rétrécissements, des sinus veineux duraux. Nos objectifs sont de caractériser les mécanismes de cette pathologie, et d’explorer la neuro-inflammation qui pourrait être impliquée dans l’altération des fonctions cognitives observées chez ces patientes. Dans cette étude, nous allons combiner une analyse par imagerie par résonnance magnétique (IRM) du réseau veino-lymphatique dural chez l’Homme (patients avec HTIC-I et contrôles), et une étude expérimentale sur des modèles animaux d’HTIC-I. Notre programme d’étude chez la souris est le suivant : 1) Modéliser chez la souris l’HTIC-I 2) Étudier comment une altération du flux veineux pourrait affecter le réseau lymphatique 3) Étudier comment une manipulation du réseau lymphatique (amplification et altération) pourrait induire, amplifier ou diminuer les caractéristiques de l’HTIC-I 4) Analyser les conséquences sur le comportement et la cognition de l’altération des réseaux lymphatique et veineux 5) Analyser les conséquences sur l’inflammation du cerveau et des méninges d’une altération des réseaux lymphatique et veineux 6) Étudier comment le genre féminin et l’obésité participent à la physiopathologie de la maladie. Nous utiliserons sur 5 ans un total de *714* souris non transgéniques.
Bénéfices attendus
D'un point de vue médical, l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I) est une maladie mystérieuse aux frontières de la neurologie, de l'ophtalmologie et de la neurochirurgie. Cette maladie affecte les femmes jeunes en âge de procréer et peut conduire à une altération majeure du champ visuel ou à la cécité. Les traitements existants soulagent les symptômes, mais ne ciblent pas la cause de la maladie, ils sont invasifs, ont une efficacité limitée et sont associés à des risques et effets secondaires non négligeables. Des thérapies alternatives, plus efficaces et moins invasives, ciblant directement la cause biologique de la maladie semblent nécessaires. Cependant, un prérequis nécessaire de ce développement est de comprendre la physiopathologie et les mécanismes biologiques impliqués. A long terme, l'objectif de cette étude est d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles avec un potentiel réaliste pour améliorer le pronostic de cette maladie. D'un point de vue scientifique, l'HTIC-I est un modèle de maladie cérébrale paradigmatique qui semble parfaitement illustrer une dysfonction primitive du complexe veno- duro-lymphatique. Tandis que le rôle et l'anatomie des lymphatiques ont été bien étudiés chez l'animal, leur caractérisation chez l'humain et leur rôle dans les pathologies neurologiques est très méconnu. L'exploration du complexe veno-lymphatique et de sa plasticité pourrait conduire à des avancées significatives en neurosciences.
Procédures
Les procédures suivantes seront réalisées après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, et hydratation. Les souris sont ensuite anesthésiées par anesthésie gazeuse. Les interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Un protocole de prise en charge de la douleur sera suivi en post opératoire. On identifie les procédures suivantes qui seront réalisés selon le plan expérimental en fonction des groupes d’animaux : 1. Chirurgie de ligature bilatérale des veines jugulaires (Durée : 1 heure, préparation 30 min). 2. Mesure de pression intracrânienne : La mesure de la pression intracrânienne est une procédure sans réveil (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 3. Manipulation du réseau lymphatique par injection de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 4. Mise en place d'un cathéter intracrânien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 5. Mise en place du cathéter intracrânien et injection de traceurs de fluorescence différente à 30 minutes d’intervalle (préparation : 30 min, durée : 1h30), procédure sans réveil. **6. IRM cérébrale avant et après chirurgie de ligature jugulaire (préparation : 30 minutes, durée de la procédure : 40 minutes)**. Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consiste en : 1. Des tests comportementaux répartis sur deux jours et demi. 2. Un régime riche en graisse pour rendre l’animal obèse pendant toute la durée de l’experimentation soit entre 4 et 10 semaines. 3. Isolement pour cathéter intracrânien laissé en place pendant 12 à 14 jours. 4. Injection par le cathéter intracrânine une fois par jour pendant 6 jours. **5. Étude d’activité dans des cages d’activité locomotrice nécessitant l’isolement de l’animal pendant 31 jours. 6. Étude d’activité dans des cages comportant une roue d’activité nécessitant l’isolement de l’animal sur 4 périodes de 3 jours**
Impact sur les animaux
Dans cette expérimentation, les nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être divisés en effets indésirables liés aux chirurgies réalisés sous anesthésie générale et incluent les accidents survenant lors de l’anesthésie (accident opératoire, hémorragie, mauvaise tolérance de l’anesthésie pouvant conduire au décès de l’animal ou à l’interruption de la chirurgie), les effets indésirables post opératoires (douleur, infection de la cicatrice ou du site opératoire, stress, inactivité mobilité réduite, comportement anormal). Les procédures réalisées sans anesthésie sont de sévérité moindre mais peuvent entrainer un inconfort, ou un stress de l’animal qu’il conviendra de détecter et de prendre en compte. Le phénotype obèse peut engendrer des difficultés pour l’animal à se déplacer. L’isolement de l’animal porteur d’un cathéter intracrânien peut occasionner une souffrance de l’animal et des troubles du comportement qu’il conviendra de détecter et de prendre en charge précocement et préventivement par un enrichissement du milieu.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études histologiques et biochimiques de la dure mère et du cerveau des animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, l’étude des mécanismes physiopathologiques ne peut être modélisée autrement que par des modèles vivants. Le recours à ces animaux est indispensable afin de pouvoir analyser les réactions physiologiques à l’atteinte d’une fonction.
Réduction
Trois lots d’animaux seront nécessaires en raison de traitements différents des échantillons en post mortem (n= 660). A ceci s’ajoutent les animaux des procédures 9 et 10 *et 11 (n=54)* dont l’analyse est clinique par IRM ou tests comportementaux. Afin de réduire les contraintes pour les animaux, les études histologiques seront couplées aux études cliniques (comportement et mesure de PIC). Un calcul de puissance a été réalisé pour évaluer le nombre d’animaux par groupe, ainsi un nombre de 10 animaux pour chaque condition expérimentale pour analyse histologique a été calculé afin d’obtenir des données reproductibles et solides nécessaires pour réaliser des analyses robustes. Tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 15 animaux par groupe a été estimé pour un groupe avec analyse post mortem en immuno histochimie. Pour le groupe avec analyse en cytométrie de flux, un nombre minimal de 18 souris par groupe est nécessaire sur le plan technique en raison de la faible cellularité de la dure mère. Tenant compte du risque de perte d’animaux pendant la chirurgie, le nombre de 20 animaux par groupe a été estimé pour ce groupe. Ce nombre de 18 souris par groupe a été validé également par le calcul de puissance réalisé pour évaluer la taille de l’échantillon. Un nombre minimal de 3 animaux est nécessaire pour les analyses en imagerie post mortem 3D, les données étant qualitatives et ne nécessitant pas d’analyse statistique. Par conséquent, tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 5 animaux par groupe nous semble pertinent. Pour la procédure 9 (IRM), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 6 animaux par lot a été validé. Pour la procédure 10 (tests comportementaux en cage individuelle), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 12 animaux par lot a été validé. Pour analyser les résultats de l’étude, nous utiliserons les tests diagnostiques dédiés aux échantillons et à leur distribution. Ainsi, un total de *714* souris sera nécessaire en tout pour répondre à l’ensemble des objectifs.
Raffinement
A réception des animaux une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification de type « Nestlet ». Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau . Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie, pH de l’eau) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement. Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine après une chirurgie. Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, à J1-J2 et J8 post chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgique. Une grille de surveillance sera remplie tous les jours les premières 48 heures puis tous les deux jours après une chirurgie, et utilisée pour la surveillance de la douleur et la détections de points limites. La grille sera cotée de 0 (aucune souffrance) à 15 (Souffrance maximale) et guidera l’administration d’antalgique et le rythme de surveillance des animaux. Les critères de surveillance seront : l’apparence de l’animal, le comportement naturel, la perte de poids, le comportement provoqué, le site de la chirurgie. Ce suivi permettra de vérifier l’état général des animauxet de détecter un état de stress ou de douleur nécessitant un traitement, ou la mise en place d’une procédure d’euthanasie. Un protocole d’antalgie adapté sera mis au point, pour traiter ou prévenir une douleur induite par une procédure. L’animal bénéficiera avant tout geste chirurgical d’une association d’antalgique par opiacés et d’anti-inflammatoire. Le protocole d’antalgie sera adapté à la grille de surveillance. L’indication d’antalgiques, le rythme de surveillance, et l’identification des points limites conduisant à l’euthanasie de l’animal seront définis en fonction du score.Une anesthésie sera réalisée pour tout geste susceptible d’entrainer une souffrance physique ou morale de l’animal. Les animaux isolés seront surveillés spécifiquement et auront accès à un enrichissement supplémentaire.
Choix des espèces
Notre objectif est d'identifier les mécanismes du remodelage veino-lymphatique et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. Concernant l’espèce, les modèles de chirurgie et de manipulation du réseau lymphatique ont été préalablement développées chez la souris avec de bons résultats. L’expérience de notre équipe et les données existantes dans la littérature sont majoritairement basées sur la souris. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal adulte après développement du réseau lymphatique chez la souris c’est-à-dire après 8 semaines post-natal. Les injections intracrâniennes et la mesure de pression intracrânienne devront être effectuées sur des animaux jeunes adultes (âgés de 2 mois à un an), un âge auquel la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise.
Etude du rôle de la protéine auxiliaire β3 des canaux sodium dépendant du potentiel (NaVβ3) dans la réponse aux variations de pression et de flux
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour savoir si une protéine des canaux sodium intervient dans la réponse des artères à la pression et au flux sanguin, 840 souris, dont des souris privées des gènes Scn3b ou Ldlr, vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 540 d'entre elles et modéré pour 300. La ligature de deux artères mésentériques, abdomen ouvert, concerne 300 souris, 108 reçoivent une minipompe d'angiotensine II pendant 14 ou 28 jours pour provoquer une hypertension, et 108 un régime riche en cholestérol pendant 16 semaines. Les 432 souris du volet hypertension passent chaque jour en contention pour une mesure de pression que le porteur qualifie de "non invasive et indolore", tout en signalant le stress de l'isolement et de la contention. Toutes sont tuées à l'issue pour l'étude de leurs vaisseaux. Le porteur écrit que "420 animaux au maximum seront nécessaires à ce projet", qui en déclare 840.
Objectifs
Les canaux sodium dépendant du potentiel (canaux NaV) sont des déterminants moléculaires majeurs de l'excitabilité cellulaire et sont impliqués dans la genèse et la propagation des potentiels d’action et le couplage excitation-contraction au niveau cardiaque. Ils sont composés de deux sous-unités, une sous-unités α formant le pore et une sous-unité β, auxiliaire, impliquée dans la régulation de l’activité du canal. Ils sont aussi exprimés dans des cellules dites non excitables comme les cellules vasculaires où leur rôle n’a pas encore été bien caractérisé. Récemment, nous avons montré que la dilatation-flux dépendante des artères de résistance de souris était potentialisée lors d’un traitement avec le bloqueur des canaux NaV, la tétrodotoxine. Ces résultats suggèrent que les canaux NaV vasculaires seraient impliqués dans la perception et la transduction du flux vasculaire. Nos travaux in vitro ont pu mettre évidence que la sous-unité auxiliaire des canaux NaV, NaVβ3, voit son expression augmentée dans la cellule endothéliale en réponse à un flux laminaire physiologique et non lors d’un flux oscillatoire perturbé pathologique, propice à un environnement inflammatoire et au développement de plaques d’athérome. Dans l’objectif de valider le rôle fonctionnel de NaVβ3 dans la mécanotransduction et la vasculoprotection, nous souhaiterons utiliser le modèle KO pour Scn3b (qui code pour la protéine NaVβ3) chez la souris et explorer si une délétion de NaVβ3 entraîne une modification dans la réponse à une augmentation de pression ou à une variation de flux et de dépôt de plaques d’athérome induite par le flux.Nous souhaitons inclure non pas que des mâles dans nos procédures mais également des femelles .
Bénéfices attendus
Si NaVβ3 a un impact sur la physiopathologie de l’HTA ou de l’athérosclérose, alors il pourra être alors identifié comme une cible thérapeutique comme les canaux NaV le sont déjà dans certaines formes d’épilepsie et d’arythmie.
Procédures
Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. Pour le modèle d’hypertension artériel, 432 animaux subiront une chirurgie lègère sous anesthésie générale en présence d’analgésique qui consistera soit en une implantation de minipompe osmotique avec de l’angiotensine II pour 108 animaux, soit des animaux subissant la même chirurgie mais sans implantation de pompe pour les 108 autres animaux (sham). Dans cette procédure, l’hypertension artérielle est induite chez les animaux par une infusion en chronique d’une dose d’Angiotensine II diluée dans du NaCl pendant 14 ou 28 jours. L’intervention chirurgicale dure en moyenne 10 minutes et chaque souris ne la subit qu’une fois. L’ensemble des 432 animaux auront une mesure de la pression artérielle par pléthysmographie. C’est une technique non invasive et indolore qui est réalisée sur des souris vigiles et qui permet la mesure de la pression artérielle systolique et diastolique. Les mesures sont débutées 2 semaines avant le début de l’induction de l’hypertension. La première semaine est une semaine de socialisation et d’habituation au système. Ensuite les séries de mesure seront analysées et permettront d’obtenir une pression basale 7 jours avant la chirurgie puis 14 ou 28 jours après la chirurgie. La prise de pression est répétée chaque jour et dure 15 minutes par groupe de 6 souris. Ainsi une souris aura 7 jours d’habituation au système puis 7 jours de prise de pression avant chirurgie puis 14 ou 28 jours de prise de pression. Pour le modèle de ligature d’artères mésentériques, l’ensemble des 300 animaux subiront une chirurgie modérée, réalisée sous anesthésie générale et en présence d’analgésique. Les animaux sont placés sur le dos, l’abdomen est ouvert et deux artères sont ligaturées (bas flux). L’artère intermédiaire adapte son flux et l’augmentera (haut flux). Après chaque chirurgie, les souris sont surveillées à l’aide de la grille d’évaluation et si besoin une nouvelle injection d’antalgique sera réalisée. Enfin, Pour la mise en place du modèle d’athérosclérose, l’ensemble des 108 animaux subiront un régime avec une nourriture riche en cholesterol indiqué dans la formation des plaques d’athérome sous forme de granulés ad libitum pendant 16 semaines. Cette procédure est non invasive et indolore pour l’animal.
Impact sur les animaux
Une chirurgie légère ou modérée n’entraine que très peu de douleur car ces procédures sont accompagnés d’une analgésie pré et post opération. Les animaux sont surveillés au réveil , dans les premières heures suivant l’opération puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée grâce à la grille de score des points limites . Les modèles d’hypertension artérielle et d’athérosclérose ayant pour but de créer un modèle pathologique non sévère, les animaux seront également surveillés mais d’après notre expérience, peu ou pas de signes de mal être sont associés et seront dans tous les cas évalués. Enfin, la prise de pression artérielle par pléthysmographie engendrant un stress lié à l’isolement et à la contention des souris, une habituation 15 jours avant le début de la procédure sera réalisée.
Devenir
Mise à mort des animaux de toutes les procédures en vue de l’exploration des vaisseaux : Réactivité vasculaire et histomorphologie et étude transcrits et protéines .
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de Scn3b dans la physiopathologie vasculaire. En effet, la physiologie et physiopathologie du vaisseau met en jeu les systèmes immunitaire et nerveux. Les modèles cellulaires ne permettent en physiologie vasculaire que d’évaluer le mode d’action au niveau moléculaire et cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe voire à l’organisme. De plus, il n’existe pas de modélisation mathématique dans ce domaine.
Réduction
Nous avons reduit au minimum le nombre d'animaux pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Nous avons estimé que 420 animaux au maximum seront nécessaires à ce projet.
Raffinement
Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (au minimum 2, au maximum 4), enrichies par des jouets (rouleau de sopalin, maison). Les animaux sont surveillés au quotidien par le personnel de l'animalerie. Le poids des animaux est suivi en fonction de leur croissance et des procédures opératoires. Pendant tout le protocole, la douleur générée par les gestes chirurgicaux et/ou le stress sera evaluée et prise en charge etla mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, une partie de ce projet utilisera des souris génétiquement modifiées pour Scn3b et Ldlr (KO). La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle bien décrit, bien documenté et utilisé dans le monde entier. Ainsi, les résultats peuvent être comparés d’un laboratoire à un autre. Enfin, les modèles d’HTA et d’athérosclérose chez la souris sont proches de la pathologie développée chez l’homme (augmentation de la pression artérielle, hypertrophie cardiaque, remodelage structurel et fonctionnel des artères pour l’HTA, dépôt de plaque d’athérome pour l’athérosclérose). Enfin, au laboratoire, nous avons un excellent recul sur ces modèles. Les souris C57BL/6J mâles seront âgés de 3 à 5 mois puisque nous avons déterminé au laboratoire que l’étude des artères doit se faire sur des animaux adultes et matures, d’âge moyen de 3 à 5 mois.
Effets d’une carence gestationnelle en vitamine A sur la transmission dopaminergique mésocorticolimbique dans le contrôle de la prise de décision
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Après douze semaines de conditionnement opérant sous restriction alimentaire, 120 souris subissent une chirurgie stéréotaxique et 60 reçoivent des injections intrapéritonéales d'amphétamine. Au total, 936 souris vont être utilisées pour étudier les effets d'une carence en vitamine A pendant la gestation : la déclaration en classe 480 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 456 sans réveil, dont 270 reproductrices tuées au sevrage des petits. Le porteur range pourtant lui-même l'amphétamine et la chirurgie stéréotaxique en "classe modérée", une classe absente de tous les chiffres déclarés. Toutes les souris sont tuées à la fin de leur procédure pour prélever des régions du cerveau. Les tests du comportement "de type anxieux" imposés à 120 souris, que le porteur dit générateurs d'un stress aigu, ne sont pas nommés.
Objectifs
La carence en vitamine A au cours de la période périnatale, causée par un régime appauvri en vitamine A, reste un enjeu majeur de santé publique dans les pays en voie de développement. En effet, l’acide rétinoïque (AR), métabolite actif de la vitamine A est indispensable au développement cérébral du foetus et du nouveau-né mais joue également un rôle très important dans les fonctions cérébrales à l’âge adulte. En se fixant sur ses récepteurs nucléaires les RARs (Retinoic Acid Receptors) et les RXRs (Retinoid X Receptors) qui jouent le rôle de facteur de transcription, l’AR régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans les processus de plasticité cérébrale. Ainsi, de faibles apports en vitamine A pendant la période périnatale conduiraient à une hypoactivité de la voie de signalisation de l’AR et des modifications d’expression de certains gènes comme le récepteur dopaminergique D2 (D2R) avec des conséquences néfastes sur les fonctions cérébrales associées (fonctions exécutives, planification motrice). Nous faisons l’hypothèse qu’un déséquilibre d’apports alimentaires en vitamine A durant la période périnatale altère le développement de la transmission dopaminergique et pourrait participer à l’étiologie de pathologies neurodèveloppementales qui impliquent des déficits des fonctions exécutives et motrices.
Bénéfices attendus
cette étude vise à proposer de nouvelles stratégies pour la prise en charge des maladies psychiatriques dont l’arsenal thérapeutique reste insuffisant. Ce projet va permettre de tester l’effet potentiellement protecteurs de molécules d’intérêts et donc de proposer de nouvelles stratégies curatives dans le contexte des maladies psychiatriques. Il va aussi permettre d’explorer les mécanismes par lesquels ces métabolites influencent la fonction cérébrale et le comportement. Cela permettra donc d’accroitre les connaissances dans un champ de recherche nouveau et prometteur.
Procédures
270 souris reproductrices seront euthanasiées au sevrage des animaux et 120 souris descendantes seront euthanasiés pour réaliser des enregistrements électrophysiologiques (390 sans réveil). 540 souris descendantes seront soumises à un conditionnement opérant (classe légère). Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Sur les 540 souris descendantes ayant été soumises au conditionnement opérant , 60 seront soumises à des injections intrapéritonéales d'amphétamine (classe modérée) et 120 seront soumises à des chirurgies stéréotaxiques (classe modérée). Afin d’évaluer le comportement de type anxieux, 120 souris descendantes seront soumises à des tests comportementaux qui peuvent engendrer un stress aigü (classe légère). Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. 240 souris descendantes (dont 120 soumises au conditionnement opérant) seront perfusées pour réaliser des analyses immunohistochimiques (classe légère). Cette intervention dure 15 min par souris (480 classe legère).
Impact sur les animaux
De part sa nature et son objectif les tests comportementaux évaluant le comportement de type anxieux que nous allons utiliser entraine un stress aigü chez la souris. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. Les souris seront de toute façon suivies comme suit : les animaux en cours de protocole sont surveillés chaque jour par l’expérimentateur et 2 fois par semaine par les animaliers. Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Pour cela, les animaux seront pesés chaque jour et la quantité de nourriture ajustée en fonction. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération.
Devenir
En fin de procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires. En fin de procédure 2, tous les animaux seront euthanasiés pour collecter des tissus fixés afin de réaliser de l'immunomarquage sur les tranches de cerveau. En fin de procédure 3 tous les animaux seront euthanasiés et le cerveau sera prélevé (comme tissu frais) afin de réaliser des enregistrements électrophysiologiques. En fin de procédure 4, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires. En fin de procédure 5 et 6 , tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques d’une carence gestationnelle en vitamine A . Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la cognition reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. L’objectif à long terme du projet étant de tester les effets comportementaux d’une supplémentation nutritionnelle en vitamine A dans le contexte des maladies neurodéveloppementales. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié
Raffinement
Concernant le raffinement différentes approches seront mises en œuvre. Les animaux seront hébergés en cages collectives avec un environnement enrichi (bâton à ronger, igloo, sizzle nest). Les animaux seront observés quotidiennement et pesés au moins 1 fois par semaine. Les animaux seront inspectés et si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin et coton), les animaux recevront une injection sous-cutanée d'analgésique si nécessaire et seront surveillés deux fois par jour. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Si l’animal apparaît malade ou avoir des douleurs (voir définition des points limites dans les procédures expérimentales), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera mis à mort dans les 24h. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Par ailleurs pour les procédures induisant de la douleur comme la perfusion intracardiaque nous utiliserons des associations d’anesthésiques et analgésiques afin de limiter la douleur chez l’animal. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Enfin, les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalable soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en oeuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre des études sur l'impact des carences gestationnelles de nutriments sur la prise de décision , de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet.
Exposition périnatale au THC et au CBD et neurodéveloppement : Enquête sur le rôle du système endocannabinoïde
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes reçoivent pendant vingt-trois jours des injections de THC ou de CBD, et leur descendance passe des tests comportementaux de reconnaissance d'objet, de mémoire spatiale et d'apprentissage lié aux goûts et aux odeurs, une partie subissant en plus une chirurgie du cerveau avec photométrie par fibre optique. Le porteur indique que la moitié des petits sont tués au sevrage et le reste après les procédures. Il affirme que la compréhension des effets d'une exposition périnatale au cannabis sur le neurodéveloppement passe par la souris, faute de modèle in vitro reproduisant cette complexité.
Objectifs
Le cannabis est la drogue illicite la plus couramment utilisée par les femmes enceintes. Le tetrahydrocannabinol (THC), principal composant psychoactif du cannabis, ainsi que le cannabidiol (CBD), le composé non psychotrope le plus abondant du cannabis, traversent le placenta et peuvent interagir avec les systèmes endocriniens. Par conséquent, d'un point de vue scientifique, la compréhension du rôle dynamique des récepteurs cannabinoid-1 (CB1) dans les processus précoces de développement du cerveau est une question importante dans le domaine intéressant et évolutif de la recherche sur l'exposition in-utero aux drogues psychotropes et aux substances d’abus. Le projet pourrait permettre d'identifier une relation encore inconnue entre l'exposition au THC ou au CBD le développement neuronale. En plus, l’étude de l'implication du récepteur CB1 au niveau mitochondrial permettra établir un lien entre l'apparition présumée d'anomalies fonctionnelles comportementales et la perturbation bioénergétiques. Enfin ce projet permettra l'établissement de nouvelles et meilleures cibles thérapeutiques pour les maladies qui sont impliquées dans les processus énergétiques du cerveau. Ce projet vise à disséquer la contribution d'une perturbation du système endocannabinoide avec injection des drogues (THC et CBD) au stade précoce du développement dans les mitochondries de différentes cellules cérébrales dans le traitement cognitif, fournissant des informations importantes qui peuvent être utilisées dans le développement de stratégies thérapeutiques pour traiter ces troubles cognitifs.
Bénéfices attendus
Dans l'ensemble, ce projet établit une approche globale qui fournira des preuves solides reliant l'exposition neurodéveloppementale aux cannabinoïdes (THC et CBD dans notre cas) et l'implication différente des CB1R cellulaires et subcellulaires dans l'apparition présumée d'anomalies fonctionnelles comportementales et bioénergétiques. Cela pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour l'intoxication prénatale au cannabis et ses conséquences.
Procédures
Les souris gestantes receveront des injection par voie sous-cutanée (durée totale de l'injection 1 minute, 1 fois par jour, durée totale de 23 jours) et gardé en vie jusqu’au sevrage du progénie. Ensuite, la moitié des animaux sera mis à mort. Une partie des souris issues de mères traité subiront des procédures comportementales (reconnaissance d'objet (dureé 3 jours, 1 fois), mémoire spatial (dureé 10 jours, 1 fois), apprentissage liée aux gouts et aux odeurs (durée totale de 10 jours, 1 fois)) à l'adolescence (semaine 5) ou à l’âge adulte (semaine 14). Ensuite les animaux seront mis à mort. Une partie des souris issues de mères traité subiront une procédure chirurgicale et photométrie par fibre (duré de 1 heure, 1 fois) et ensuite, 3 semaine après chirurgie, seront testées dans leur cage avec un protocole de détection à travers de la fibre optique (durée totale 30 minutes, 1 fois). A la fin de cette procédure, les souris seront mis a mort.
Impact sur les animaux
Les procédures de l’injection sous-cutanées peuvent provoquer du stress lié à l’injection, qu’en tous cas à des impacts légers sur l’état générale de l’animal, son comportement moteur et alimentaire sans présence de douleur chronique. Aussi les tests comportementaux peuvent induire du stress chez les animaux qui sont faible par rapport à leur état général. Néanmoins il peut y avoir des nuisances que peuvent générer des points limites bien décrit dans les procédures, surtout liée à la procédure chirurgicale et la récupération après chirurgie.
Devenir
Toutes les souris issue de la procédure d'injection sub-cutaneé seront gardé en vie jusqu’au sevrage des portées. Apres seront mise à mort. Les 1080 animaux qui subiront les procédures comportamentales seront mise à mort. Les 420 animaux qui subiront la procédure de photometrie par fibre seront mis a mort pour des analyses hystologiques.
Remplacement
A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux et neuromusculaires conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. Pour comprendre les mécanismes complexes du neurodéveloppement et la façon dont l'exposition périnatale au THC et au CBD peut induire une altération à long terme des fonctions cognitives, qui dépendent du comportement actif du rongeur, nous ne pouvons pas utiliser des méthodes alternatives plus simples (cultures cellulaires in vitro, modèles informatiques in silico), car elles fournissent des informations trop limitées et ne peuvent pas reproduire toute la complexité d'un organisme vivant.
Réduction
Nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour avoir des conclusions solides en utilisant des méthodes statistiques courantes (12-14 animaux par groupe). Il est important de noter que ce nombre inclut les pertes malheureuses (taux d'échec de 15%) lors des procédures neurochirurgicales. 12-14 c'est le nombre minimal d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine, au regard du faible nombre d'individu par groupes expérimentaux, les analyses statistiques basées sur des tests non paramétriques (Wilcoxon, Mann- Whitney, Kruskal-Wallis, Friedman) seront privilégiées. Les nombres prévus permettent de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience nous montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant manipulation ou individuelle après manipulation (pour les procedures de injection sub-cutaneé et de comportement), avec un milieu enrichi (matériel de nidification), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général et comportemental des animaux comme expliqué dans les procédures.
Choix des espèces
A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur CB1), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont équipées pour être destinées à l’étude des rongeurs. Les souris utilisées pour les expériences comportementales, des injections virales intracérébrales et photométrie en vivo seront âgées de 5 à 14 semaines. Les protocoles que nous avons établis seront développés à l'âge adolescente/adulte des souris en évitant les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le terrain. De plus, comme nous n’attendons pas des différences entre les résultats de la progéniture femelle et mâle, nous utiliserons donc des souris mâles et femelles prouvant une vulnérabilité indépendante du sexe.
Contribution du génome silencieux a l’induction des réponses immunitaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans les coussinets des pattes des injections de cellules dendritiques activées, puis une seconde injection dans le flanc, pour mesurer une réponse immunitaire contre des peptides issus du génome silencieux. Le porteur indique que les injections dans les coussinets peuvent provoquer une douleur de plusieurs jours empêchant l'animal de marcher, de boire et de manger normalement. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les flux de cellules entre organes et juge cette étape "indispensable" pour tester le pouvoir immunisant des peptides.
Objectifs
Le système immunitaire dispose de plusieurs possibilités pour identifier et cibler les cellules tumorales. Parmi les cellules du système immunitaire, les lymphocytes T constituent un mécanisme clef pour cibler les cellules tumorales, mais c’est aussi un des mécanismes responsables des dommages dans les maladies auto-immunes. Cette reconnaissance de ses propres cellules (tumorales ou pas) s’effectue par le biais de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). En effet, ces molécules, exprimées par la plupart des cellules, ont la capacité de capturer et d’exposer des peptides (fragments de protéines), reflétant la composition protéique de la cellule à un moment donné. Dans une situation normale, lorsqu’il s’agit de protéines du « soi », présentes normalement dans la cellule, le système immunitaire les ignore. En revanche, lorsqu’il s’agit de peptides dérivés de virus ou des bactéries (« non-soi »), le système immunitaire est activé, et est alors capable d’éliminer les cellules qui expriment ces peptides du non-soi. L’activation des lymphocytes T est faite par les cellules dendritiques. Ces cellules forment un réseau de cellules « sentinelles » capables de détecter des menaces. Après reconnaissance des menaces pour l’organisme, qu’il s’agisse de pathogènes ou de cellules tumorales, ces cellules peuvent capturer des peptides dérivés de pathogènes ; elles migrent ensuite dans les organes lymphoïdes secondaires où elles initient la réponse immunitaire en présentant ces peptides aux lymphocytes T. Une question majeure restant ouverte est celle de la nature des peptides exprimés par les cellules du « soi » visibles par le système immunitaire pendant les réponses auto-immunitaires ou dans le cadre de la tumeur. L’identification de ces peptides permettrait le développement des thérapies ciblés. Ce que nous voulons tester dans ce projet, c’est l’hypothèse selon laquelle les cellules du « soi » pourraient être vues par le système immunitaire par le biais de peptides dérivés de rétroéléments endogènes, éléments de la partie silencieuse du génome ayant la capacité de se répliquer et de se déplacer au sein du génome entier. L’expression de ces éléments est normalement inhibée, mais dans certaines situations, notamment dans des cellules cancéreuses, ils peuvent être réactivés.
Bénéfices attendus
Il est essentiel de noter que la très grande majorité des cancers développent des mécanismes très efficaces qui inhibent la réponse immunitaire. Les dernières années ont vu l’entrée en clinique des inhibiteurs de checkpoint, molécules utilisées dans le traitement de plusieurs cancers chez l’homme dans le cadre d’une approche appelée immunothérapie. Le développement de ces molécules constitue une avancée majeure dans le traitement de cancers chez l’homme. En effet, elles démontrent une efficacité chez des patients résistants à d’autres types de traitement. Cependant, les inhibiteurs de checkpoint ne fonctionnent que chez 20 à 25% des patients qui sont traités de cette manière. La compréhension des mécanismes expliquant cette efficacité variable fait actuellement l’objet d’efforts considérables de la communauté scientifique. Tout comme l’identification de molécules avec lesquelles les inhibiteurs de checkpoint pourraient être combinés pour augmenter leur efficacité. D’autre part, les traitements pour les maladies auto-immunes sont en général très peu spécifiques et impliquent la suppression plus ou moins généralisée du système immunitaire, ce qui entraîne plusieurs effets indésirables. Tant dans le cas des réponses immunitaires contre le cancer que dans celui des réponses auto-immunes, une question majeure restant ouverte est celle de la nature des peptides exprimés par les cellules du soi (tumoraux ou pas) visibles par le système immunitaire. L’identification de ces peptides permettra le développement des thérapies ciblés, soit contre les cellules cancéreuses, soit pour éviter les réponses auto-immunitaires. Ce projet permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer l’efficacité des thérapeutiques contre ces deux types de maladies.
Procédures
Pour ce projet, nous injecterons des cellules dendritiques, préalablement activées par une molécule dérivée de la paroi des certaines bactéries : le LipoPolySaccharide ou LPS (qui augmente la capacité des cellules dendritiques à activer les lymphocytes T) et incubées en présence des peptides candidats, dans la plante de pied de souris afin d’étudier leur capacité d’induction des réponses immunitaires in vivo. Les cellules dendritiques activées seront injectées dans chacun des coussinets des pattes arrière (1 ou 2 fois au cours de l’expérience) chez des souris anesthésiées (durée de l’anesthésie : 5 minutes). Les antigènes de soi, comme les peptides que nous allons tester dans ce projet, induisent des réponses immunitaires très faibles. Ces réponses ne sont pas détectables dans le sang de la souris, cependant, les cellules spécifiques seront concentrées dans les ganglions des pattes. Pour obtenir ces ganglions, certaines souris seront mises à mort 7-10 jours après ces injections. Les autres souris seront gardées et injectées 15-20 jours après la première injection avec une solution de peptides ou avec des cellules dendritiques activées par du LPS dans le flanc de la souris vigile (durée du geste inférieure à 10 secondes). 2-3 jours après la deuxième injection, les souris seront mises à mort pour évaluer l’ampleur de la réponse immunitaire contre les peptides après une deuxième immunisation.
Impact sur les animaux
Les injections dans les coussinets plantaires de la souris peuvent induire la douleur pour un temps limité après l’injection. Nous n’attendons pas une induction de l’inflammation dans les coussinets après l’injection des cellules dendritiques activées. Néanmoins, il est possible que les souris aient un peu de douleur pendant quelques jours dans les coussinets, ce qui pourrait les empêcher de marcher et de boire et manger normalement. Les injections dans le flanc de la souris peuvent induire un stress lié à la manipulation et une légère douleur pendant l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro et in silico où on a constaté l’expression et la présentation des peptides dérivés de rétroélements endogènes dans des molécules MHC de cellules dendritiques lors de leur activation par LPS. Cependant, le fonctionnement du système immunitaire repose sur des interactions tridimensionnelles et des flux de cellules finement régulés entre organes. De plus, la réponse immunitaire anti-tumorale ainsi que les réponses auto-immunitaires, entraînent la réaction de différentes sous-populations cellulaires qui interagissent entre elles dans des localisations tissulaires spécifiques. C’est pourquoi ces phénomènes ne peuvent être encore aujourd’hui reproduits in vitro. Cette étape est indispensable pour tester la capacité des peptides trouvés à induire des réponses immunitaires aussi bien antitumorales qu’auto-immunes.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 4 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. D’après notre expertise, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Un minimum de 2 expériences indépendantes sur des groupes de 4 animaux est réalisé afin d'assurer la robustesse des résultats.
Raffinement
Les injections de cellules dendritiques dans les coussinets de la souris seront réalisées par du personnel entrainé sous anesthésie gazeuse afin de minimiser le stress causé à l’animal. Le volume injecté correspond à un volume réduit (par rapport au volume maximal de recommandations internationales ) afin de diminuer l’inconfort causé à l’animal. Les injections dans les coussinets plantaires de la souris peuvent induire la douleur pour un temps limité après l’injection. Nous examinerons les pattes et la démarche de la souris pour évaluer une possible gêne à la locomotion. En cas de douleur, celle-ci sera prise en charge par des anesthésiques locaux et des aliments gélifiés seront mis à disposition en cas de difficulté de locomotion. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte des points-limite, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin nous a permis d’identifier des peptides derivés de rétroélements endogènes par séquençage à haut débit. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance et que les résultats ne soient pas affectés par des modifications dues à un âge trop avancé des animaux. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.
Effet de l’inactivation du GPR18 sur le vieillissement cardiovasculaire et métabolique au cours du diabète et de l’obésité
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
114 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre elles tuées sans réveil. Génotypées par prélèvement du bout de la queue à sept jours, elles reçoivent un régime gras et sucré induisant obésité et diabète, des mesures de glycémie répétées et, en fin d'étude, une chirurgie de la carotide sous anesthésie. Le porteur indique que la pose d'un cathéter dans la carotide empêche tout réveil, l'animal ne pouvant en être privé sans se vider de son sang, d'où une mise à mort sous anesthésie. Il affirme que l'étude d'un régime mimant le syndrome métabolique impose le passage par un modèle in vivo.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la cause la plus fréquente de décès en Europe et dans le monde. Elles sont associées au vieillissement, à l’obésité, au diabète, et à l’inflammation chronique, accélérant ainsi le vieillissement cardiovasculaire et contribuant à la mortalité et à la morbidité chez les patients âgés. Les résolvines, dérivés des acides gras polyinsaturés oméga-3 considérés comme bénéfiques dans la prévention des maladies cardiovasculaires, sont des substances lipidiques induisant une résolution de l’inflammation. Les résolvines agissent via des récepteurs spécialisés. La résolvine D2 et son récepteur GPR18 sont encore très peu étudiés dans le domaine de la résolution de l’inflammation et des conséquences sur les maladies cardiovasculaires. Notre hypothèse est que la résolvine D2 et son récepteur GPR18 pourraient contribuer à limiter l’inflammation et le vieillissement cardiovasculaire. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer si l’absence du récepteur GPR18 produit l’effet inverse à savoir prolonge et/ou accentue ces phénomènes. Nous souhaitons identifier les mécanismes impliqués. Pour cela, nous utiliserons un modèle de vieillissement cardiovasculaire et métabolique induit par un régime riche en graisse et en fructose (sucre) qui provoquera une inflammation, une obésité, un diabète et altèrera les fonctions cardiovasculaires. Ce régime sera administré à des souris sauvages ayant GPR18 ou des souris dépourvues de ce récepteur. Une exploration des fonctions cardiovasculaires sera faite dans les deux groupes.
Bénéfices attendus
La réussite de cette étude permettra de montrer qu'un échec dans la résolution de l'inflammation induit par des changements métaboliques provoque une accélération des maladies cardiovasculaires. A plus long terme, nos travaux pourront soutenir l'emploi de supplémentation en résolvine pour prévenir ou améliorer l'état vasculaire des patients en situation de syndrome métabolique et réduire le vieillissement artériel lié à l'âge.
Procédures
A 7 jours de vie, 1 mm de l'extrémité de la queue (non ossifiée) est prélevé pour le génotypage et les souriceaux sont tatoués. Ceci dure environ 5 min. Les souris vigiles subiront une très légère piqûre au bout de la queue pour prélever une goutte de sang (5 µl) (comme chez les diabétiques) 1 fois par mois pendant 3 mois (en tout moin de 1 min), puis à la 30 ème semaine et 31 ème semaine 7 fois (à T0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min) donc en cumulé, 1min sur 2h). Dans tout le protocole, le temps de piqure pour prélever 5 µl de sang représentera 3 min. A l'age de 8 semaine, une contention de 7 min de la souris sera réalisée. En point finale, l'anesthésie pour la chirurgie et l'examen durera 1h en tout. A la fin de l'expérience, 1 ml de sang sera prélevé sur animal anesthésié qui sera mis à mort sans réveil préalable. L'animal subira la totalité de la procédure sur 16 semaines.
Impact sur les animaux
Le régime riche en graisse et en fructose induit un syndrome métabolique avec une prise de poids important pouvant générer un inconfort de la souris. Les mesures de glycémie via une goutte de sang à la queue seront répétées toutes les 4 semaines, une infection ou un comportement de grattage, léchage exagéré peut apparaitre.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après les 2 procédures car les animaux auront un cathéter dans la carotide à la fin des 2 procédures. Il n’est pas possible d’enlever ce cathéter sans que l’animal ne se vide de son sang. Donc la mise à mort de l'animale se fera sur animal inconscient par injection sous anesthésie gazeuse.
Remplacement
Le profil des cellules impliquées dans l’inflammation et des cellules de la paroi artérielle, l'étude des mécanismes d'action de la résolvines D2 et de son récepteur GPR18 se font déjà in vitro au laboratoire. Nous avons également mis au point l'étude de la contraction et dilatation des artères isolées par une methode ex-vivo. Cependant, pour étudier l'effet d'un régime qui induit un changement de métabolisme et qui mime le syndrome métabolique, sur le système cardiovasculaire et les paramètres métaboliques comme la glycémie, de la tolérance au glucose et de la résistance à l’insuline, nous sommes obligés de passer par un modèle in vivo. Le remplacement dans ce cas n'est pas possible.
Réduction
Nous faisons toutes les mesures sur un même animal. Des calculs statistiques permettent de prédire le nombre minimal d'animaux à utiliser pour avoir des résultats significatifs et limiter le nombre d’animaux.
Raffinement
Une anesthésie sera pratiquée pendant la chirurgie et l’examen cardiovasculaire. Du gel ophtalmique est déposés sur les yeux pour éviter le dessèchement. La mise en place de points limites est adaptée à chaque étapes de la procédure : perte de poids maximale de 20% par rapport à la dernière pesée, l’animal sera sorti de l’étude et remis sous régime normal. Si des signes de stress trop importants sont observés pendant la contension de la souris (pression trop élevée), elle sera remise dans sa cage d’origine. Pour la zone une piqûre à la queue : la zone sera surveillée activement tous les jours pendant les 4 jours suivants. Si une infection ou un comportement de grattage, léchage exagéré apparait, la plaie sera désinfectée avec de la bétadine. Un spray peut être appliqué pour aider à la cicatrisation et à la diminution de la démangeaison. Un anti-douleur local en badigeon sera également administré pour diminuer la douleur. Si une fausse route survient cela peut percer l’œsophage, l’animal sera mis à mort. Pour l'examen cardiovasculaire final, les points limités déterminés sont : -les signes de réveil (changements rapides de pression artérielle ou de fréquence cardiaque donnée par échographie suite au pincement des pattes et souffle dans les vibrisses), le % de l'anesthésiant sera modifié pendant le temps nécessaire. - la diminution de la température corporelle en dessous de 36°C, la température de la platine sera remontée. - Fréquence cardiaque anormale sous anesthesiant (différente de 350-400 battements par minute), le % d’anesthesiant sera adapté. Si aucun des ajustements ci-dessus n’améliore ni l’état hémodynamique ni le bien-être de l’animal, celui-ci sera mis à mort.
Choix des espèces
Les souris sauvages sous régime riche en graisses et en fructose développent une obésité, une insulino résistance et une rigidité artérielle proche de celle de l’homme. Il est plus facile de réaliser une invalidation génique chez les souris. Des souris adultes mâles et femelles de 18 semaines seront utilisées pour la réalisation de ce projet, âge adulte où l'appareil vasculaire a atteint sa pleine maturité.
Formation aux gestes techniques et chirurgicaux pour les études portant sur l’AVC.
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 2000
4 000 rongeurs, 2 000 souris et 2 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de la tête reproduisant un accident vasculaire cérébral, occlusion d'une artère, ischémie-reperfusion ou hémorragie, suivie d'une IRM, de tests comportementaux puis d'une ouverture terminale du thorax pour prélever le cerveau. Ces interventions ne visent pas à produire des connaissances mais à entraîner des chirurgiens aux gestes des modèles d'AVC. Le porteur affirme que les techniques d'apprentissage de substitution ne permettent pas d'acquérir ces gestes et attend de cette formation une meilleure reproductibilité réduisant le nombre d'animaux des projets futurs.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (
Bénéfices attendus
Cette stratégie d'apprentissage a pour but d'améliorer les résultats des projets précliniques sur les AVC. Le nombre d'animaux utilisés dans les projets scientifiques ultérieurs sera réduit du fait de la meilleure reproductibilité des gestes des expérimentateurs. La prise en charge des animaux sera également améliorée (soins pré, per et post-opératoire), ce qui participera à l'amélioration du bien-être des animaux.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin que le personnel puisse s’entraîner sur les différents modèles. Le modèle d’ischémie par injection de murine alpha-thrombine ou par application de FeCl3, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) durera 1.5 heure. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire. Une moyenne de 20 minutes est à prévoir pour l’entraînement à cette pose. Le modèle d’ischémie-reperfusion durera 1 heure. 1 heure plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire le monofilament et ainsi permettre une reperfusion. Cet acte chirurgical durera 30 minutes. Les deux modèles d’hémorragie dureront 1 heure. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Nous comptons un total de 10 minutes pour la prise du neuroscore, 25 à 30 minutes pour la réalisation du test de force d’agrippement. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 20 minutes minutes pour les différents prélèvements.
Impact sur les animaux
Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Ce projet à titre d'apprentissage sera soumis à une attention et un encadrement strict pour garantir le bien-être des animaux pendant cette phase d'entraînement. Le stress de l'experimentateur qui manipule l'animal (préhension de l'animal dans sa cage) et la douleur occasionnée lors des procédures (gestes chirurgicaux) sont pris en charge par une couverture analgésiante, anesthésiante, du contrôle de la température des animaux et d'un encadrement supplémentaire. Un environnement contrôlé par des conditions d'hébergements réglementaires et une surveillance strict pallient également aux nuisances attendus sur les animaux.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques d'apprentissage de chirurgies actuelles de substitution ne permettent pas d'acquérir les gestes techniques. Nous avons sélectionné les modèles expérimentaux les plus utilisés dans la thématique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend ces espèces (souris et rat) particulièrement intéressantes dans le cadre des études portant sur l'AVC.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction tout en aquérant un certain niveau d'expertise technique. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure a été calculé par l'expérience de plus de vingt ans de formation aux gestes chirurgicaux des personnels dans l'établissement. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre de 50 animaux par modèle pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les animaux seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et demi-sphère de cellulose et bûchettes de bois pour les rats), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection. Le choix de la technique de sutures se porte sur la méthode des points séparés, limitant ainsi le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, la concentration d’isoflurane et le débit de N2O sont ramenés à zéro, et le débit d’O2 est élevé à 1 L/min pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 1 heure avant d’être remis en cage par 5 pour les souris, par 2 pour les rats. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Le rat (Rattus norvegicus) reprend les caractéristiques de la pertinence de l'utilisation de la souris citées ci-dessus. Sa morphologie suscite son intérêt pour l'imagerie grâce à plus grande taille et à sa palette comportementale plus grande que la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend ces espèces particulièrement intéressantes pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS, de 25g pour les C57BL6J et d’environ 300g pour les Wistar ou Sprague-Dawley âgés de 8 semaines. Nous effectuerons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de ce projet avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.