Recherche fondamentale
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Contraintes énergétiques du manchot royal pendant la reproduction: aspects comportementaux et éco-physiologiques
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
94 manchots royaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, avant d'être relâchés dans leur colonie. Sous anesthésie, chaque oiseau reçoit par chirurgie des sondes de température et des électrodes implantées, une biopsie de muscle pectoral et des prélèvements de sang, plus des loggers externes, pour étudier la plongée en apnée et le sommeil en mer. Le porteur indique qu'un individu équipé peut retarder son départ en mer et provoquer l'abandon de l'oeuf par son partenaire, et suit la survie et la reproduction à long terme grâce à une puce implantée. Il justifie l'étude d'une espèce protégée par des applications possibles "One Health", tout en rangeant la plupart des bénéfices dans la connaissance fondamentale.
Objectifs
L’étude des adaptations à des conditions extrêmes permet de découvrir des mécanismes fondamentaux impossibles à observer en se confinant aux modèles classiques. Notre approche est d’équiper l’animal sauvage de ‘bio-logger’ de mesure, évoluant librement in natura. Cette approche fondamentale en écophysiologie perdure à long-terme dans le cadre d’un programme de recherche mené au milieu de l’océan Indien, avec le modèle manchot royal (MR), spécialiste de la plongée en apnée et de l’épargne énergétique. Néanmoins, le réchauffement si rapide à ces latitudes australes impacte les MR des colonies étudiées, où leurs proies se concentrent plus loin au large et plus profondément. Une de nos hypothèses est que les MR de grandes tailles seraient plus adaptés à prolonger leur apnée en profondeur, un avantage décisif dans le contexte actuel pour la chasse et leur succès reproducteur. D’où la question (Q1) de l’effet de la taille sur l’efficacité énergétique des plongées ou du voyage en mer, des données maintenant accessible grâce à la mesure de la fréquence cardiaque via l’enregistrement en continu de leur électrocardiogramme. Le sommeil est un besoin essentiel pour l’animal (observé aussi chez les méduses), dont la fonction primaire serait une façon risquée (inconscience, donc risque de prédation) d’épargner l’énergie, avec chez les endothermes une association possible avec la thermorégulation. Rien n’est encore connu de la façon dont les endothermes dorment en haute mer et notre objectif est de tester cette hypothèse chez le manchot royal, aussi bien pendant son jeûne à terre que pendant son long voyage en mer. La question est de découvrir dans un premier temps (Q2) : ‘Comment ces manchots dorment (fréquence-durée-moment-qualité) à terre ou en mer et existe-t-il un lien avec leur thermorégulation ?’ Ceci grâce notamment à l’enregistrement de leur électro-encéphalogramme. Enfin, sachant que les stocks d’oxygène embarqués ont un rôle déterminant dans la capacité d’apnée, on se posera aussi la question (Q3) : Quelles sont les causes de la variabilité des capacités de transport et de stockage de l’oxygène chez le manchot royal ? Ceci grâce à un prélèvement unique de sang et de muscle pectoral. Nous profitons des périodes d’incubation à terre pour capturer-instrumenter sous anesthésie et relâcher dans la colonie ces individus, qui pourront récupérer de la chirurgie avant de partir en mer au retour de leur conjoint.
Bénéfices attendus
Trouver des applications biomédicales est une des justifications de l’expérimentation animale, surtout si cela concerne des individus d’espèces sensibles, vivants dans des espaces protégées, tels les manchots royaux des îles subantarctiques. C’est quelquefois le cas de nos recherches, avec par ex. la découverte ‘non-intentionnelle’ d’un antibiotique stomacal testé sur l’œil humain. Par ailleurs, envisager la santé humaine dans le paradigme ‘Une seule santé (One Health)’ devient évident et urgent : mieux comprendre les contraintes auxquelles sont confrontées les espèces ou des écosystèmes entiers, afin de réduire ces nuisances liées à l’homme, sera bénéfique pour leur santé, dont celle des humains. D’où le soutien de nos tutelles scientifiques pour nos approches fondamentales ou appliquées, sur le modèle manchot royal. Concernant l’hypothèse d’un lien positif taille/aptitude à l’apnée, via l’épargne énergétique (Q1) ou les pigments respiratoires (Q3), les bénéfices attendus de ces expérimentations sont plutôt dans le domaine de la connaissance fondamentale. Car si ce lien existe, cela ne veut pas dire que les MR vont pouvoir s’adapter assez vite. Il faudrait pour cela vérifier en parallèle l’héritabilité de ces traits et un effet positif sur le succès reproducteur des grands individus. C’est pourquoi des investigations dans le cadre d’un doctorat sont en cours via l’utilisation d’un Data-set de suivi à long-terme sur 30 années consécutives. Par ailleurs, le fait de mesurer la fréquence cardiaque instantanée pour quantifier la dépense d’énergie des manchots intéresse particulièrement un collègue spécialiste de l’arythmie cardiaque chez l’homme. Son objectif est de mieux comprendre ces aspects adaptatifs chez des espèces à locomotion verticale (le MR à terre) ou dans des contextes d’anoxie ou d’asphyxie (le MR en mer). Concernant les questionnements sur le sommeil (Q2), cette approche pourrait nous faire comprendre certains paradoxes de la phase de ‘repos’ de surface pendant la nuit en mer (phases courtes d’échappement de la thermorégulation). Mais surtout nous faisons le pari, avec l’un de nos collaborateurs et spécialiste internationalement reconnu dans ce domaine, qu’étudier cette fonction in natura, surtout dans le contexte si particulier du MR en haute mer, peut nous faire faire un grand pas en avant dans la compréhension des mécanismes ayant façonné cette fonction vitale, encore si imparfaitement étudiée dans sa diversité.
Procédures
La majorité des individus (entre 34/58 et 70/94) vont subir : (1) une capture (juste avant ou au début d’un jeûne d’incubation), précédée de 30min d’une sédation ; (2) un transport cagoulé (de 3min jusqu’à la salle d’intervention) ; (3) une anesthésie associée à une analgésie (de 25 à 100 min) permettant de pratiquer (4) différentes mesures et prélèvements (sang+ plumes) et marque colorée+ puce RFID à vie ; (5) la pose de 2 loggers fixés au plumage du dos; (6) la tunnélisation de sondes de température et électro-physiologiques (fréquence cardiaque, frisson thermique, sommeil) ; et (7) un réveil sur le lieu même de la capture. C’est pendant leur voyage en mer que les données de comportement et de physiologie sont enregistrées et elles ne seront récupérées qu’à leur retour dans la colonie, 20 j (en été) ou 40j (en hiver) plus tard. Tous ces individus seront recapturés 2-3 jours après avoir repris l’incubation, puis anesthésiés (25min max) pour décrocher les loggers et les sondes, puis remis au réveil sur leur œuf dans la colonie. Un sous-groupe de 24 individus subissant le cycle capture-pose équipement-voyage en mer et recapture-déséquipement est à part car : (i) la capture1 aura lieu au départ en mer et la pose d’un logger externe seul ne justifie pas d’anesthésie, alors que (ii) c’est seulement à la recapture au retour de mer qu’une anesthésie générale sera pratiquée (30min), pour réaliser une biopsie.
Impact sur les animaux
Les nuisances concernent potentiellement deux points : un effet handicap en mer et un effet post-procédure à plus long terme. Concernant les handicaps pendant le voyage où l’individu est équipé, nous avons pu rencontrer exceptionnellement dans le passé un problème de retard au ‘vrai départ en mer’, l’individu restant au voisinage de la colonie 5-7jours au lieu de moins de 24h après l’échange avec son conjoint, entrainant un échec reproducteur par abandon de l’œuf du conjoint (attendant trop longtemps le retour de l’individu équipé). Dans tous les cas, le fait de travailler sur des modèles animaux faisant partie d’une espèce protégée, et sur le territoire d’une réserve nationale, implique de mettre en place un suivi systématique du devenir de ces individus à moyen ou long-terme (survie), ainsi que leur succès reproducteur sur une période dépassant celle de l’expérimentation. De ce fait tous les individus anesthésiés sont équipés d’office d’une puce RFID interne à vie, ce qui peut permettre de les suivre à plus long-terme (plusieurs années) et mesurer des effets indésirables non perceptibles pendant la procédure.
Devenir
Cent pour cent des individus seront replacés en liberté en fin des procédures, leur succès reproducteur étant suivi jusqu’à la mue de leur poussin grâce à sa marque colorée.
Remplacement
Le principe général de cette étude est d’utiliser un modèle d’espèce sauvage évoluant dans son environnement naturel et dans un contexte extrême d’un point de vue énergétique : la plongée en grande profondeur en apnée et en eau froide chez des organismes à sang chaud. Il est en l’occurrence impossible de trouver une méthode de remplacement adaptée.
Réduction
Sur la base des connaissances précédemment acquises, le nombre d’individus étudiés a été déterminé au plus juste pour obtenir des résultats exploitables et statistiquement fiables.
Raffinement
1/ Anesthésie, médication et chirurgie. Un raffinement a été apporté à toutes les étapes de manipulation des oiseaux pour une réduction des risques de stress ou de la douleur de la capture au relâcher définitif ; d’infection en cours de chirurgie et les jours suivants, cela selon 3 protocoles d’anesthésie et de médication bien spécifiques. Les gestes de ‘tunnélisation’ sont maitrisés depuis >15 ans pour les mesures de la fréquence cardiaque et du frisson thermique. Dans le cas de l’implantation d’électrodes sur la tête (étude du sommeil), l’approche utilisée ici est le résultat d’une collaboration avec des spécialistes du sommeil chez les oiseaux. En été antarctique 2019, des collègues ont déployé avec succès 28 manchots à jugulaire partant pendant 2j en mer, ce qui nous permet de proposer ici des protocoles adaptés et raffinés. Notons enfin que des gestes ont été simplifiées pour ne pas cumuler sur l’individu un temps de chirurgie prolongé et limiter le nombre d’incisions.
Choix des espèces
Cette étude a pour objet de révéler des adaptations physiologiques encore inconnues en utilisant un modèle particulièrement adapté à sa niche écologique particulière : la plongée en apnée en eau froide chez les endothermes marins. Par ailleurs, l’approche qui nous semble la seule valide est d’étudier ces adaptations en équipant les individus pour un suivi in natura grâce au bio-logging. Cela suppose d’utiliser une espèce assez grande pour limiter le risque d’un handicap lié à cet équipement ; et d’avoir une très grande expérience de ce qu’il est possible de réaliser au niveau expérimental sans compromettre la qualité des résultats et risquer des nuisances pour les individus concernés. Seul le manchot empereur serait une espèce assez étudiée et aussi adaptée (voir plus), mais ce serait un non-sens étant donné le très faible effectif de la seule colonie d’étude accessible, en Terre Adélie. Il est de ce fait interdit d’utiliser ce modèle pour toute intervention de chirurgie expérimentale. Pour les trois procédures, le choix du stade de développement est celui des reproducteurs, donc adultes. Ce sont les seuls accessibles, dans la colonie de reproduction, pour pouvoir effectuer une séquence de capture-équipement, relâcher-voyage en mer-recapture-déséquipement et relâcher final.
Rôle de l’inflammation sur les réponses anti-tumorales dans un modèle de chimère chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle de l'inflammation dans les réponses immunitaires contre les tumeurs. Chaque animal est irradié, reçoit une greffe de moelle osseuse puis des cellules tumorales, et une partie ingère un irritant intestinal par cycles de cinq jours. Le porteur indique que l'irradiation peut faire souffrir en cas de mauvaise reconstitution, que l'irritant colique provoque une perte de poids et une souffrance, et que tous les animaux sont tués pour prélever organes et tumeur. Il affirme que la complexité du micro-environnement tumoral "oblige" à recourir à l'expérimentation animale, les bénéfices restant formulés au conditionnel.
Objectifs
Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires (aussi appelé exhaustion). Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’une exhaustion des globules blancs au cours du vieillissement. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer le rôle de ces protéines sur l'exhaustion des réponses immunitaires dans le cadre du cancer.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de préciser le rôle de ces protéines inflammatoires sur les acteurs de la réponses anti-tumorale, notamment sur leur fonction. In fine, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.
Procédures
Irradiation (4 minutes par souris), une injection intraveineuse rétro-orbitaire de cellules de moelle osseuse sous anesthésie générale (15 sec/souris). Pour certaines souris, une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par échographie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).
Impact sur les animaux
L'irradiation peut occasionner une souffrance en cas de mauvaise reconstitution des cellules de la moelle osseuse. L'injection intraveineuse, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les organes et la tumeur pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.
Remplacement
La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale au niveau du tube digestif en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux. Chaque animal chimère permet d'analyser les cellules de deux génotypes différents au sein d'un même animal.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Tous les gestes invasifs réalisés sur les animaux seront faits sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet (pesée et surveillance deux fois par semaine après l'irradiation, mesure de la croissance tumorale trois fois par semaine après l'injection de cellules tumorales, suivi régulier par échographie pour certains animaux).
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certaines voies de signalisation dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.
Effets d’inactivations ciblées des gènes foxl2b sur le sexe de la truite
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
1 204 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour inactiver le gène foxl2 et étudier son rôle dans la différenciation sexuelle. Le protocole produit des oeufs microinjectés, génotype les alevins par prélèvement d'un fragment de nageoire, puis croise les individus pour obtenir des lignées mutantes analysées après mise à mort. Le porteur indique attendre peu de souffrance, l'inactivation d'un gène gonadique provoquant surtout une inversion sexuelle, et tue tous les animaux pour prélever leurs gonades. Il présente cette recherche fondamentale comme pouvant ouvrir des applications de "contrôle sexuel" en aquaculture des salmonidés.
Objectifs
La duplication ancestrale et complète du génome des salmonidés a profondément façonné́ la structure et le contenu en gènes des génomes des salmonidés. L’évolution de la fonction des gènes issus de cette duplication est importante à la fois d’un point de vue fondamental et finalisé. Ce projet a pour but d’explorer dans quelle mesure ces gènes dupliqués peuvent être redondants au niveau de leur fonction en utilisant, comme un cas d’étude, une approche d'inactivation ciblée d’un gène dupliqué et conservé en deux copies chez la truite arc-en-ciel, le gène foxl2. Ce gène est un gène conservé qui est impliqué́ dans le développement ovarien et la différenciation du sexe chez les vertébrés. Le projet génèrera des lignées de truite arc-en-ciel chez lesquelles les deux copies du gène foxl2 seront inactivés soit individuellement, soit simultanément, et ce de façon à comprendre quels sont les rôles respectifs de chaque copie dans la différentiation et le développement de l’ovaire.
Bénéfices attendus
Les connaissances générées par ce projet nous permettront de mieux comprendre l’évolution des gènes dupliqués chez la truite arc-en-ciel. Ces résultats sont particulièrement importants d’un point de vue de la connaissance de l’évolution des gènes pour mieux comprendre le rôle des gènes en copies dupliquées chez les salmonidés. Sur le plan plus finalisé, une meilleure connaissance du devenir de ces gènes en double copie chez les salmonidés peut avoir de nombreux résultats pratiques à moyen et long terme. Par exemple, cette information peut être cruciale pour des programmes de sélection qui cibleraient une seule copie de ces gènes dupliqués. De plus, comme foxl2 est un gène clé pour la différenciation ovarienne chez les vertébrés, sa caractérisation fonctionnelle précise chez les salmonidés pourrait ouvrir de nouvelles opportunités pour un meilleur contrôle sexuel chez les salmonidés.
Procédures
Trois femelles et deux mâles seront utilisés pour la production d’œufs (3 fois 5 minutes) qui seront microinjectés pour générer 3 lignées de poissons. Ces animaux seront génotypés pour à partir d’un fragment de nageoire (une fois 1-2 minutes sur chaque individu) pour sélectioner des lots de 20 géniteurs présentant des mutations perte de fonction. Ces géniteurs seront marqués individuellement (une fois 2 minutes par individu). Différents croisements seront ensuite réalisés à partir de ces animaux pour produire des lignées non mosaiques puis homozygotes qui seront analysées aprés euthanasie sur la base de leur phenotype sexuel (macroscopique, histologique et moléculaire) et génotype (pour la mutation et pour leur sexe genotypique).
Impact sur les animaux
Le gène foxl2 est connu pour son rôle dans la différenciation et le développement ovarien. C’est un gène gonadique dont l’inactivation est peu susceptible d'induire de la souffrance, de l’angoisse ou du stress dans les lignées mutantes que nous souhaitons construire chez la truite arc-en-ciel. A notre connaissance, toutes les inactivations de foxl2 effectuées jusqu’à maintenant montrent que foxl2 est un gène clé́ pour la différenciation des cellules de la granulosa et pour le maintien des ovaires avec un phénotype d’inversion sexuelle partielle ou complète des gonades. C’est par exemple le cas chez le tilapia du Nil qui est la seule espèce de poisson où ce gène a été́ inactivé, et ou le phénotype rapporté chez les femelles mutantes homozygotes est une inversion sexuelle complète. Aucune différence dans l'histologie gonadique n'a été́ trouvée entre les animaux contrôles, les animaux mutés à l’état hétérozygote (pas d’inversion du sexe) et les mutants homozygotes (complètement inversés). Nous nous ne nous attendons donc pas sur la base des analyses de la littérature à ce que ces mutations chez la truite conduisent à une souffrance physiologique ou un stress. Nous serons néanmoins attentifs à des éventuels phénotypes dommageables par une observation régulière des poissons issus de ces lignées mutées, en recherchant notamment des critères phénotypiques comme l'apparition d'un gonflement abdominal, ou comportementaux (nage, alimentation, position dans le bac) afin de réajuster notre protocole éthique si un phénotype dommageable ou de stress était observé.
Devenir
Aprés chaque procédure tous les animaux utilisés seront euthanasiés et les animaux euthanasiés des lignées finales non mosaiques seront eux utilisées pour des prélèvements d'organes nécessaires aux analyses (gonades pour analyses histologiques et moléculaires).
Remplacement
L’objectif de ce projet est d'explorer l'effet de ces différentes mutations foxl2 sur le phénotype sexuel adulte. La gonade étant un organe complexe et aucune alternative in vitro ou in silico pour ce type de recherche n'est actuellement disponible.
Réduction
Les effectifs de poissons expérimentaux (femelles pour la production d’œufs, embryons injectés et alevins génotypés) seront réduits au maximum et nous favoriserons le génotypage précoce des individus potentiellement porteurs de mutations, à un stade embryonnaire non autonome (alevins avant la première prise alimentaire). Ce génotypage précoce permettra de ne conserver que 10 à 20 individus par lignée porteuse de mutation(s) à l'âge adulte.
Raffinement
Les procédures de raffinement seront basées sur l'utilisation appropriée des anesthésiques pendant toute la procédure d'échantillonnage (par exemple, une anesthésie non létale avec de la tricaïne avant tout échantillonnage ou manipulation des poissons). Les animaux seront enlevés dans les conditions optimales de l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité et alimentation). Tous les prélèvements se feront selon des procédures établies et approuvées par la structure bien-être. Nous nous ne nous attendons donc pas sur la base des analyses de la littérature à ce que ces mutations chez la truite conduisent à une souffrance physiologique ou un stress. Nous serons néamoins attentifs à des éventuels phénotypes dommageables par une observation régulière des poissons issus de ces lignées mutées, en recherchant notament des critères phénotypiques comme l'apparition d'un gonflement abdominal, ou comportementaux (nage, alimentation, position dans le bac) afin de réajuster notre protocole éthique si un phénotype dommageable ou de stress était observé.
Choix des espèces
Notre étude portant sur le devenir des gènes issus de la duplication specifique du génome des Salmonidés, la truite est donc une des espèces sur laquelle nous pouvons développer ce projet. Cette espèce est une espèce robuste dont l'élevage et la reproduction sont bien maitrisés en pisciculture (et dans nos installations expérimentales). L'espèce est grégaire et supporte des densités d'élevage importantes. C’est une des espèces de salmonidés les plus élevés avec le Saumon Atlantique. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). La production des oeufs se fera à partir de femelles sexuellement matures et ovulantes. Les génotypages se feront au stade oeillé ou alevin. Ils seront réalisés le plus tôt possible pour limiter le nombre de prélèvements sur des animaux au stade autonome.
Impact des pesticides sur le neurodéveloppement et leur rôle dans l’apparition de troubles du spectre autistique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le lien entre pesticides et troubles du spectre autistique. Les femelles gestantes reçoivent un cocktail de trois pesticides à faible dose et subissent une chirurgie pour insérer des marqueurs fluorescents dans le cerveau des embryons, et la descendance passe des tests comportementaux nommés, vocalisations, interaction sociale et tests moteurs. Le porteur indique attendre chez les petits des retards de développement, des défauts d'interaction sociale et des stéréotypies, qu'il juge sans souffrance, et tue la descendance pour prélever les cerveaux. Il affirme que l'expérimentation animale est "indispensable", aucun modèle alternatif ne reproduisant selon lui la complexité du développement cérébral.
Objectifs
Une altération durant le développement du cerveau peut mener à l’émergence de troubles du neurodéveloppement parmi lesquels figurent les Troubles du Spectre Autistique (TSA) dont la grande variété des symptômes suggère une origine multifactorielle. Chez les individus atteints de TSA, des anomalies du développement du cerveau, et en particulier d’une partie appelée « cortex cérébral », ont été mises en évidence. L’objectif de notre projet de recherche est de déterminer l’influence de facteurs environnementaux, tels qu’une exposition chronique à des résidus de pesticides, sur le développement de ce cortex cérébral, dans un contexte de prédisposition génétique. Il consiste donc plus particulièrement à traiter des animaux susceptibles de développer un TSA avec un cocktail de pesticides à faible dose (dose réglementaire autorisée dans l’eau du robinet en Europe). Nous déterminerons ainsi l’impact de ces pesticides dans l’évolution de cette maladie. Notre étude permettra de mieux comprendre l’action de pesticides ingérés quotidiennement à faible dose sur le développement cérébral de souriceaux sains ou prédisposés à développer un TSA, et d’identifier les cibles pour lutter précocement contre les potentielles malformations cérébrales induites par les pesticides.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de caractériser l’impact d’une exposition à faible dose de pesticides sur le développement du cerveau pendant la gestation et la lactation sur des individus génétiquement prédisposés à développer un TSA (gpTSA). Cette étude aura un impact significatif car elle permettra d’identifier les stades du développement et les cibles cellulaires particulièrement sensibles aux facteurs environnementaux tout en caractérisant les défauts induits par ces polluants à l’échelle cellulaire ainsi que leur impact sur le comportement. De plus, elle offrira de nouvelles perspectives sur la précocité et l’étendue des effets délétères des polluants environnementaux sur le développement cérébral des individus sains ou gpTSA. Ces travaux permettront d’alerter sur l’impact délétère de l’ingestion chronique des polluants environnementaux même à des doses résiduelles tout en fournissant des pistes diagnostiques et/ou thérapeutiques pour lutter contre la survenue ou l’aggravation des symptômes associés aux TSA.
Procédures
Traitement des femelles/ femelles gestantes/ progénitures à une faible dose de 3 pesticides, 2 mois avant la mise en reproduction et jusqu'à la fin de l’expérimentation (environ 6mois). La première portée des femelles servira exclusivement à tests comportementaux : enregistrement des vocalisations à 3 jours et 7 jours (3x3min/souris), test d’interaction sociale à 21 et 60 jours (15 min), tests moteurs à 21 et 60 jours (10 min/souris). Durant la seconde gestation, il y aura une procédure chirurgicale sur la femelle gestante (environ 35 min) qui permettra d’insérer des marqueurs fluorescents dans le cerveaux des embryons. La progéniture sera utilisée pour : soit i) Tests comportementaux (vocalisations, interaction sociale, tests moteurs) de J3 à J60, soit ii) Imagerie à travers le crâne sur animal anesthésié (environ 30 min), soit iii) directement mise à mort pour prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
En ce qui concerne le traitement aux pesticides, d'après de précédentes études conduites chez la souris, même à long terme (10 mois), aucune souffrance, perte de poids, stress, ou comportement anormal n'a été relevé chez les animaux sauvages traités. Cependant en débutant les traitements dès la gestation, nous nous attendons à avoir un retard de développement (yeux, oreilles, motricité), des défauts d'interaction sociale ou encore des comportements répétés associés à l’autisme (stéréotypies), sans que cela n'induise de souffrance. Concernant la chirurgie sur femelle gestante, pour éviter la souffrance, l'animal bénéficie d'une anesthésique générale et d’une couverture analgésique (anti-douleur). Une grille de suivi est mise en place évaluant : la complexité du nid, la présence de sang dans la cage, la posture, la mobilité et l'état du pelage. Ces critères sont évalués quotidiennement durant les trois jours suivant l'acte chirurgical. En fonction du score obtenu durant cette évaluation, l'état de souffrance de l'animal est défini, ce qui va permettre de statuer sur la conservation de la femelle jusqu'à la date initialement prévue ou sur l’obligation d’abréger sa souffrance immédiatement.
Devenir
Mise à mort de la progéniture pour prélèvement des cerveaux afin d’explorer l’impact des pesticides au niveau cellulaire (morphologie, nombres, anomalies diverses). Les géniteurs seront également mis à mort dès lors qu'ils ne pourront être réutilisés pour reproduction (âge trop avancé, chirugie ou fin du projet).
Remplacement
L'expérimentation animale est indispensable dans ce travail car aucun modèle alternatif ne nous permet actuellement de reproduire la complexité du développement cérébrale des mammifères. De plus l'étude sur l'animal est indispensable afin de pouvoir associer des défauts au niveau cellulaire à des déficits comportementaux tels que des défauts d'interaction sociale.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d'animaux pour ce projet en ne générant que les animaux au type génétique d’intérêt pour la mise sous traitement. Nous avons également décidé de ne pas réaliser de chirurgie sur la première portée des femelles et de garder la progéniture pour des analyses de comportement afin d'éviter que la perte associée à la primiparité (première portée) des femelles ne se mêle à la perte associée à la chirurgie. Ainsi les femelles ne sont pas utilisées que pour une seule et unique portée (car une femelle ayant subi la chirurgie ne pourra servir qu’une seule fois pour nos expériences), cela réduit le nombre de femelles à utiliser mais également la perte estimée au sein de la portée en comparaison à la combinaison primiparité + chirurgie. Le nombre d’animaux à utiliser a été déterminer grâce à des calculs statistiques permettant de définir le nombre d’individus par groupe nécessaire à la mise en évidence de différences significatives entre les groupes non-traités et traités aux pesticides et les différents types génétiques. De plus la moitié des cerveaux collectés sera envoyé à nos collaborateurs de manière à réduire le nombre d’animaux générés pour l’ensemble du projet de recherche incluant la collaboration.
Raffinement
Le bien-être animal est au cœur de nos préoccupations, c'est pourquoi tout au long du projet, les souris seront quotidiennement et étroitement surveillées par un personnel qualifié. Chacune des procédures chirurgicales sera réalisée sous couverture anesthésique et analgésique. Une grille de suivi permettra de mesurer l’état de bien-être général des animaux suite à un acte chirurgical en se basant sur des indicateurs physiques et comportementaux permettant de mettre des limites strictes à la douleur potentiellement endurée par celles-ci. Le comportement sera réalisé par un seul manipulateur qui aura habitué les animaux à sa présence pour éviter toute forme de stress dû à la présence de l’expérimentateur. Avant chaque test de comportement, une étape d'habituation à la manipulation et à l'environnement sera effectuée afin de réduire le stress des animaux durant l’expérience. La manipulation des animaux sera faite dans le calme et avec douceur. La séparation mère/souriceaux sera réduite au maximum avec des temps de présence de la mère entre chaque expérience nécessitant une séparation.
Choix des espèces
La souris présente une grande similarité avec l'Homme. En effet, 98% de son génome trouve son équivalent dans le génome humain ce qui permet, dans la majorité des cas de pouvoir mimer une pathologie humaine via des modèles génétiquement modifiés. De plus c'est une espèce de petite taille et sa courte durée de gestation et l'importance de ses portées en fait un modèle mammifère idéal pour les projets de recherche. Les différentes étapes du développement cérébral chez la souris étant maintenant bien décrites, ce modèle est pertinent pour la recherche neurodéveloppementale. La taille des embryons de souris est suffisante pour l'injection des marqueurs fluorescents qui nous permettent de suivre le développement du cerveaux ainsi que pour toutes les analyses qui vont en découler. De plus, il existe chez la souris de nombreux tests comportementaux spécifiques et bien décrits permettant de dissocier un comportement "normal" d'un comportement lié à un trouble du spectre de l'autisme (interaction sociale, comportement répété). L'injection des marqueurs fluorescents dans les embryons aura lieu au jour 13 de gestation afin de pouvoir marquer l'ensemble des cellules d’intérêt afin de suivre leur développement dans le cerveau. Le temps le plus précoce d'analyse est le stade embryonnaire E18 (jour 18 de gestation) qui correspond à la migration des cellules d’intérêt vers leur lieu de prédilection, ensuite il y a le stade J3 (3e jour post-natal) qui correspond au pic de prolifération des cellules d’intérêt, J7 qui correspond à la fin de leur prolifération et à la migration d’une population de neurones qui nous intéresse, J21 qui correspond à la période de maturation des différents types cellulaires d’intérêt et la quasi-finalité de la mise en place des interfaces entre les vaisseaux et les populations cellulaires d’intérêt. Nous analyserons également le stade J60 afin de déterminer si les dommages précoces induits par les pesticides sont maintenu ou spontanément rétabli après la maturation du cerveaux.
Les maladies infectieuses comme menaces de populations d’oiseaux longévifs en France: surveillance et mécanismes de transmission d’agents infectieux
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 200 oiseaux sauvages, fous de Bassan et vautours fauves, vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avant d'être relâchés sur le lieu de capture. Chaque individu subit une prise de sang, deux écouvillonnages cloacaux et deux buccaux, et pour une partie la pose d'une balise GPS externe, pour étudier l'exposition à l'influenza aviaire et la transmission d'agents infectieux. Le porteur indique attendre très peu d'effets indésirables, la manipulation ne durant que quelques minutes. Il affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer" ces espèces, choisies parce qu'elles ont été fortement touchées par l'influenza aviaire en 2022.
Objectifs
Les objectifs du projets sont d'acquérir des données sur les processus de transmission d'agents pathogènes dans les populations d'oiseaux sauvages et leurs implications pour ces populations. En particulier, dans le contexte de l'émergence récente de l'influenza aviaire hautement pathogène dans les populations de nombreuses espèces d'oiseaux de la faune sauvages, il s'agit d'acquérir des données sur les proprotions d'individus exposés aux virus et les modalités de transmission des virus. Les acquisitions de données et d'échantillons seront insérée dans des suivis démographiques déjà pré-existants de deux espèces emblématique, le fou de Bassan _Morus bassanus_ et le vautour fauve _Gyps fulvus_.
Bénéfices attendus
Est attendue un meilleure connaissance de l'exposition d'espèces d'oiseaux sauvages aux virus de l'influenza avaire hautement pathogène, ainsi qu'à d'autres agents infectieux, ainsi que du rôle de certains individus dans la transmission des agents infectieux. Les résultats ont vocation à être publié dans articles scientifiques et pourront être utilisés pour des décisions concernant la protection de la biodiversité. Le projet apportera spécifiquement des informations sur l'expositon des fous de bassan et des vautours fauves des populations françaises aux virus de l'influenza aviaire hautement pathogène. Les données seront acquise dans le cadre de suivis intégrés des populations concernées, c'est-à-dire des suivis incluant aussi l'acquisition de données fines sur la démographique et l'écologie du déplacement des populations.
Procédures
Les animaux font l'objet de prélèvements sur animaux vigiles (1 prise de sang, 2 écouvillonnages cloacaux et 2 écouvillonnages buccaux) et pour une part d'entre eux la pose d'un GPS (balise externe) afin d'acquérir des données sur leurs déplacement. Ces interventions dure quelques minutes de manipulation, l'individu étant ensuite relâché en nature au point de capture.
Impact sur les animaux
Très peu d'effets idésirables ou nuisance attendus sur les oiseaux, car la manipulation ne va consister qu'en la réalisation d'une prise de sang de 1 ml et la réalisation d'écouvillonnages cloacaux et buccaux.
Devenir
Tous les individus seront relâchés libres dans leur population en milieu naturel, sur le lieu de capture, quelques minutes après la réalisation des prélèvements. Les individus n'auront pas été affectés par des effets indésirable et des mesures de biosécurités sont prises pour ne pas risquer de dissémination d'agents infectieux.
Remplacement
Les objectifs étant de déterminer l'exposition de populations des espèces considérées, le fou de bassan et le vautour fauve, aux virus de l'influenza aviaire, il n'est pas possible de remplacer les espèces considérées. En revanche, les résultats obtenus avec ces espèces emblématiques pourront avoir des implications pour d'autres espèces.
Réduction
Les tailles d'échantillons considérées ont été déterminées afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en s'assurant d'obtenir des données informatives. Les données qui pourront être collectées plusieurs années de suite permettront d'optimiser l'utilisation des informations, notamment celles concernant le statut sérologique des individus.
Raffinement
Les techniques de capture et de prélèvements ont fait l'objet d'un raffinement afin de provoquer le moins d'effet négatifs sur les oiseaux.
Choix des espèces
Les espèces choisies l'ont été car elles ont été fortement affectées par l'émergence de l'influenza aviaire hautement pathogène en 2022 et qu'elles ont des traits d'histoire de vie les rendant particulièrement susceptibles à des maladies infectieuses affectant la survie des adultes. Il est aussi tout particulièrement important d'obtenir des informations sur les modes de transmission des virus de l'influenza aviaire au sein et entre colonies de ces espèces sociales qui se reproduisent en colonies. Les individus capturés pour faire l'objet de prélèvements seront majoritairement des adultes. Des prélèvements sur des jeunes au nid pourront être effectués lorsque les conditions le permettront (bonne accessibilité, dérangement limité).
Effets de l’exposition précoce à un toxique issu de particules d’usure de pneu couplée à une hausse de température durant les premiers stades de vie d’un poisson lacustre patrimonial sténotherme froid, l’omble chevalier
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 664 ombles chevaliers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les effets d'un toxique issu des particules d'usure de pneu et d'une hausse de température. Les poissons sont exposés dès les premiers stades de vie à la molécule 6PPD-quinone par balnéation, puis filmés par groupes de cinq pour mesurer leur activité et leur vitesse de nage. Le porteur indique attendre une mortalité d'environ 10 % liée à la température et une hausse supplémentaire liée au toxique, et tue tous les individus, ces stades précoces étant jugés les plus sensibles. Il affirme que le modèle poisson n'est "pas remplaçable ni substituable" pour cette question.
Objectifs
Les lacs péri-alpins tiennent une place particulière en raison de leur réserve en eau douce, et des nombreux services écosystémiques rendus. Néanmoins, ces derniers constituent également une zone importante de stockage des micro-plastiques, dont la majorité serait des résidus de pneus dus à un intense trafic routier. Une étude a mis en évidence une forte contamination du lac Léman aux micro-plastiques dont 60% sont des particules de pneus (TWP pour tire wear particles). La connaissance des impacts de ces micro-plastiques sur la faune aquatique reste encore parcellaire, en particulier sur les poissons. Quelques études ont porté sur les produits issus de la dégradation de la gomme des pneus et de ses additifs, dont beaucoup sont toxiques pour les poissons. En effet, les 2/3 des TWP et autres débris déposés sur la route peuvent ruisseler avec la pluie. La molécule 6PPD-quinone (6PPD-Q), dont la source principale dans les milieux aquatiques provient du lessivage des particules de pneus à partir des routes, est connue pour sa forte toxicité pour les organismes piscicoles et sa présence en quantité non négligeable (jusqu’au mg/L) dans l’eau de ruissellement de chaussée. Elle a récemment été identifiée comme responsable du « syndrome de mortalité par ruissellement urbain » chez le saumon coho adulte et semble particulièrement toxique pour les salmonidés. Le mode d'action précis de la 6PPD-Q est toutefois encore inconnu sur les stade embryo-larvaire, même s’il semble être lié à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique. Les effets de la 6 PPD-Q sur les premiers stades de vie de ces salmonidés sont encore indéterminés à notre connaissance. Les effets sont connus chez les larves de zebra fish, ou cette molécule n’entraine pas d’augmentation de la mortalité mais à des effets neurotoxiques et entraine de nombreuses malformations cardiaques. A ce titre, nous nous proposons d’explorer les effets de cette molécule sur les premiers stades de vie de l’omble chevalier qui est un salmonidé vivant dans les lacs péri-alpins. De plus, l’omble chevalier est un bon candidat pour ce projet car il possède un temps de vie embryolarvaire long (4-5 mois), connu et maitrisé par le laboratoire. De plus, l’étude de l'impact d'une molécule toxique est classiquement analysée au stade juvénile, stade qui permet plus facilement de mettre en évidence des effets sur la mortalité, le développement, effets tératogènes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise donc à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination à la 6PPD-Q durant premiers stades de vie de l’Omble Chevalier, salmonidé vivant dans les lacs peri-alpins dans un contexte de réchauffement climatique.
Procédures
Les animaux feront l’objet de prise vidéos pour l’observation de leur comportement lors des stades d’alimentation exogéne (750 DPF) et juvénile (840 DPF). Ainsi, les animaux seront testés par groupe de 5, ils seront acclimatés durant 2h dans le système expérimental et seront filmés à l’aide d’une webcam connectée à un ordinateur placé hors de la salle de test (afin de ne pas déranger les poissons durant le test) durant 10 minutes. Ces tests permettent d’évaluer différents comportements, tels que l’activité, la vitesse de nage, grâce à un logiciel de suivi vidéo. Ainsi, la prise de vidéo ne devrait impliquer qu’un léger stress du au changement de bac.
Impact sur les animaux
Compte tenu du peu de connaissance de l’impact de la 6PPD-Q sur les poissons non modèle aux stades embryolarvaires, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses de 6PPD-Q testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) pour les concentrations testées dans ce projet. De plus, pour les animaux incubés à 8,5°C nous pouvons nous attendre, au vue de la littérature, à une hausse de la mortalité de 10%.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis.
Remplacement
Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné le peu de connaissance sur les premiers stades de vie de poisson et en particulier sur les salmonidés qui semble particulièrement sensible à la 6PPDQ. Ainsi, le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il n’est pas remplaçable ni substituable.
Réduction
mixtes (GLM). L’effectif de 60 individus par temps de prélèvement est un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses, mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 1 440 individus seront utilisés et mis à mort (60 individus prélevés par temps de prélèvement * 2 conditions thermiques) * 6 conditionnements (témoin eau 0ng/l, témoin éthanol 1.5ng/l stade 200 DPF puis eau claire, 1.5ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le développement embryo-larvaire, 3ng/l stade 200 DPF puis eau claire ; 3ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le stade embryo-larvaire) * 2 stades de développement (740 DPF et 820 DPF) = 1 440 individus. Au total pour l’expérimentation, nous aurons besoins de 1 440 individus pour les mesures morphologiques et comportementales. Nous pouvons prévoir une mortalité maximum au cours de l’expérimentation d’environ 10% dû à la hausse de température durant le développement embryo-larvaire . Ainsi, 1584 (1440+1440*0,1) individus seront utilisés pour l’effet température. Si nous nous basons sur la seule étude de toxicité de la 6 PPD-Q réalisée au stade larvaire sur les larves de zébra fish à nos concentrations nous pouvons nous attendre à avoir de faible hausse de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) , les expérimentations sur l’omble chevalier adultes à nos doses ne montrent pas de mortalité , nous pouvons nous attendre à une hausse de 5% en raison de son affinité présumé pour les salmonidés. Ainsi, 1664 (1584+1584*0,05) individus seront utilisés au cours de l’étude
Raffinement
L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours à partir du commencement du nourrissage soit à 700 DPF pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous-alimentation). De plus, dans chaque bassin, des galets seront installées pour permettre aux alevins de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière, les stades embryo-larvaire vivant dans des gravières à 50m de fond. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience à partir de 700 DPF.
Choix des espèces
L'omble chevalier est une espèce sentinelle du changement climatique des lacs alpins qui sont concernés par une forte pollution aux particules de pneu (responsable de 60% de molécules plastiques présente dans le lac léman). Ainsi, cette espéce est à la fois exposé aux particules plastiques et à la hausse des températures dans nos lacs alpins et péri-alpins. De plus, les stades embryonaires choisis pour cette étude sont connus pour être plus sensibles aux polluants.
Utilisation d’une lignée de souris transgénique AARE-LUC pour identifier les inducteurs et les tissus cibles de la voie eIF2α-ATF4
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 035 souris transgéniques vont être utilisées, dans des procédures déclarées sévères pour 780 d'entre elles et sans réveil pour 255, alors que la partie sur les effets attendus ne décrit que des interventions légères, piqûre d'aiguille, jeûne de 16 h et isolement de courte durée. Les animaux reçoivent de la luciférine puis sont anesthésiés pour une imagerie de bioluminescence, avec des prélèvements sanguins submandibulaires, afin de visualiser l'activation d'une voie de signalisation selon le régime nutritionnel ou un traitement. Une partie est tuée pour prélever les organes et une autre réutilisée dans d'autres expériences, le porteur gardant vivantes les souris dont le transgène est fonctionnel. Il indique tester d'abord l'effet des inducteurs sur cellules en culture, mais justifie le recours à la souris par l'étude au niveau de "l'animal entier".
Objectifs
Afin de pouvoir étudier le rôle joué par la voie de signalisation eIF2α/ATF4 au niveau de l’animal entier, nous avons généré une lignée de souris transgénique qui exprime le gène rapporteur luciférase sous le contrôle de séquences de fixation du facteur de transcription ATF4. Cette lignée de souris a été breveté et constitue un outil de choix pour visualiser le stress nutritionnel ou pharmacologique au niveau de l'animal entier. Notre objectif avec cet outil murin transgénique est de mieux caractériser les conditions d’activation de cette voie de signalisation dans l’espace et dans le temps en fonction du régime nutritionnel ou du traitement pharmacologique.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre chez les mammifères les effets de la consommation d’un régime déséquilibré en acides aminés ou d’un traitement avec un inducteur pharmacologique. Dans ce but, les souris transgéniques bioluminescentes sont un outil de choix pour situer dans l’espace (identification des tissus et cellules cibles) et dans le temps (chronologie d’activation en fonction des sites) l’activation de la voie eIF2α-ATF4 dans des conditions de carences nutritionnelles en acides aminés ou lors d’un traitement pharmacologique par la mesure de la bioluminescence au niveau du corps entier de l’animal vigile, de l’expression (immuno-histochimie) et/ou de l’activité de l’enzyme codée par le gène rapporteur luciférase dans les tissus cibles.
Procédures
Des prises de sang pourront aussi être réalisées sur animal vigile au niveau de la veine submandibulaire (1 min par souris) à l'aide de microlancettes spécifiques. Elles seront réalisées avant et après le protocole nutritionnel en alternant le côté du prélèvement. Pour visualiser l’activité luciférase en utilisant un appareil d’imagerie bioluminescente (10 min par souris), les animaux seront injectés avec de la luciférine (10 sec par souris), anesthésiés sans effets indésirables (15 min par souris). Pendant toute la durée d'adaptation au régime contrôle (7 jours) et d'expérimentation (96h maximum), les souris seront hébergées individuellement avec un accès libre à l’eau et à la nourriture.
Impact sur les animaux
Les 2 lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Les expériences réalisées ne vont pas engendrer d’effets indésirables sévères : piqûre d’aiguille, transport des souris, anesthésie gazeuse, jeûne de 16h maximum et isolement de courte durée.
Devenir
Les animaux dont le transgène n’est pas fonctionnel seront mis à mort (105 souris). Les autres animaux dont le transgène est fonctionnel sont gardés en vie (930 souris). Pour tester la réponse à différents inducteurs nutritionnels déséquilibrés en acides aminés, une partie des animaux sera mise à mort avant la fin de la procédure (100 souris) pour prélever les organes et tissus afin d’identifier précisément où la voie eIF2α/ATF4 est activée. Les autres animaux pourront être réutilisés dans d’autres expériences (680 souris). Pour tester la réponse à différents inducteurs pharmacologiques, une partie des animaux sera mise à mort avant la fin de la procédure (50 souris) pour prélever les organes et tissus afin d’identifier précisément où la voie eIF2α/ATF4 est activée. Les autres animaux pourront être réutilisés dans d’autres expériences (100 souris).
Remplacement
De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro sur des lignées de cellules en culture permettent d'abord de tester l'efficacité de carence en un acide aminé ou d’inducteurs pharmacologiques sur l’activation de la voie eIF2α-ATF4. Ces expériences permettent dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal de l’induction de la bioluminescence, il s'avère indispensable de répéter les expériences. Etant donné que les procédures sont légères, une même souris pourra être réutilisée pour tester l’effet de plusieurs régimes après une période de récupération d’une semaine.
Raffinement
Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition (tube plastique rouge et/ou bille métallique). Par ailleurs, l'utilisation d’un transgène exprimant la luciférase nous permettra de suivre l’activation de la voie eIF2α-ATF4 à l'aide d'une méthode non invasive (bioluminescence).
Choix des espèces
Les deux lignées homozygotes de souris transgéniques bioluminescentes (fond génétique C57 Bl/6), ont été générées par notre équipe. Les croisements pour amplifier ces deux lignées seront réalisés avec des souris âgées de 4 à 6 mois, âge où le taux de fécondité est optimum. Pour toutes les procédures, les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 2 à 24 mois. L'âge pourra dépendre de l'objectif de l'expérience réalisée.
Caractérisation de la fonction pancréatique de modèles murins du Syndrome de Wolfram
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, comme modèles du syndrome de Wolfram. Chaque animal subit un jeûne de 16 h, des injections intrapéritonéales et des incisions caudales répétées sur neuf mois, pour caractériser un diabète et tester cinq composés. Le porteur indique que le modèle Wolfram-like développe progressivement cécité, surdité et troubles vestibulaires, et que les animaux sont tués pour prélever leurs organes. Il affirme que ces modèles murins sont "indispensables", seul "recours mammifère autre que l'humain" à reproduire ces symptômes, alors que les retombées thérapeutiques restent une "preuve de concept" à venir.
Objectifs
Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. De même, le syndrome de Wolfram-like est caractérisé par un diabète sucré de type 1, une surdité neurosensorielle et une atrophie optique bilatérale. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de ces maladies n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de caractériser l'apparition du diabète dans deux modèles murins de ces maladies et déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur ce diabète.
Bénéfices attendus
Les stratégies thérapeutiques dans les syndromes de Wolfram et Wolfram-like sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, dans un premier temps, de caractériser le diabète des modèles murins de référence pour le syndrome de Wolfram et Wolfram-like. Il permettra ensuite d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur ces deux modèles.
Procédures
Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : contrôle alimentaire (durée 16h) -identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - incision caudale sur animal vigile (anesthésie locale via créme anesthésiante). Chaque animal sera identifié une fois. Les animaux subiront 1 contrôle alimentaire (durée 16h), 2 injections en intrapéritonéal (1 min) à au moins 3 jours d’intervalle, 2 incisions caudales (première fois coupure puis retrait de la croute) à 1 mois. Ces interventions seront répétées à 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins, pour un total de 5 contrôles alimentaires, 10 injections en intrapéritonéal et 10 incisions caudales sur une période de 9 mois.
Impact sur les animaux
Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Le contrôle alimentaire sur un durée de 16h peut également engendrer un stress. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels (cécité, surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.
Remplacement
L'utilisation de modèles murins des syndromes de Wolfram et Wolfram-like pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.
Réduction
Nous avons basé la taille de notre lot sur les données bibliographiques de souris développant un diabète, non induit par un régime spécifique. Nous avons estimé que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires et suffisants pour générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle. De plus, des analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe et ce nombre sera révisé au besoin. De même, les animaux utilisés pour la réalisation des tests métaboliques seront ensuite euthanasiés et leurs organes collectés afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet. Ces tissus seront utilisés pour lors de nombreuses analyses, morphologiques, histologiques, afin de disposer du plus large éventail de données possibles à l’issue d’une procédure expérimentale et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Des points limites ont été établis afin de surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le projet . Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.
Choix des espèces
La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations métaboliques dans un schéma physiologique global d'évolution de la pathologie et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. Les tests métaboliques seront réalisés sur les animaux à 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins.
Suivi en télémétrie de la dévalaison de l’anguille argentée en lagune
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
160 anguilles européennes vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être relâchées dans le milieu naturel. Chaque individu est capturé, anesthésié, puis équipé par chirurgie d'un émetteur acoustique et d'une marque RFID implantés sous la peau avec un à trois points de suture, pour suivre en télémétrie la migration de dévalaison en lagune. Le porteur indique que le stress de la capture et du marquage peut retarder la migration, et écarte les individus déjà blessés ou en mauvais état sanitaire. Il affirme qu'il est "indispensable" d'étudier des anguilles sauvages capturées dans le milieu, l'espèce étant présentée comme menacée d'extinction.
Objectifs
Ce projet a pour objectif (i) de mieux connaître la dynamique de dévalaison à l'intérieur d'un système lagunaire, (ii) d'étudier la diversité des comportements migratoires et (iii) d'évaluer le succès de deux projets de restauration de la continuité hydrobiologique.
Bénéfices attendus
L'analyse des détections enregistrées par les stations d'écoute fixes et mobiles permettront de : i) S'assurer du bon déroulé de l'opération de marquage et de la survie des individus, -ii) Etudier le comportement des individus relâchés après l'opération de marquage : sont-ils immédiatement mobiles ou non ? - iii) Etudier comportements migratoires des individus : est-ce qu'ils dévalent tous ou certains remontent-ils au contraire le cours d'eau ? -iv) Connaître à quel moment les individus prennent la direction de la mer -v) Evaluer combien d'individus parmi ceux qui ont été détectés partis des bassins amont parviennent jusqu'aux portes de la mer - vi) Estimer la durée nécessaire pour les individus de parcourir la distance entre l'embouchure des bassins et les portes de la mer -vii) Evaluer si les voies de connexion restaurées sont utilisées par les anguilles pour rejoindre la mer -ix) Mieux connaître la diversité des comportements de dévalaison. Les résultats obtenus pourront éventuellement permettre de formuler des préconisations pour la gestion des ouvrages de connexion, afin d'optimiser le retour en mer des anguilles.
Procédures
Capture dans un vereux (nasse) : relève toutes les 24h approximativement. Facultatif : Si trop de captures, mise en couve jusqu'à 3 jours maximum. Stabulation dans un bac obscur et aéré : de 5 min à 4h Bain anesthésiant: 5 à 15 min Injection analgésique : 2 s Marquage avec une fermeture de la plaie à l'aide de 1 à 3 points de suture : 2 à 5 min Phase de réveil sous surveillance : de 10 à 30 min Stabulation avant relâcher : de 5 min à 2h
Impact sur les animaux
Le stress de la capture et du marquage est susceptible de retarder la migration des individus.
Devenir
L’ensemble des animaux sera remis en liberté à la suite de leur marquage, ce qui est primordial pour répondre à l’objectif de l’étude.
Remplacement
L’étude portant sur le comportement de poissons en milieu naturel, l’expérimentation doit être réalisée avec des individus capturés dans le milieu, et ne peut donc s’affranchir de l’emploi de poissons sauvages.
Réduction
Le milieu étudié présentant des densités d'anguilles élevées, il est nécessaire de suivre un maximum d'individus afin de pouvoir obtenir des résultats robustes et représentatifs de l'ensemble des deux sous-populations ciblées. De plus, au niveau des embouchures des bassins ciblés, des individus peuvent se faire éventuellement prédater par des silures. Et entre l'embouchure des bassins ciblés et les portes de la mer, les anguilles peuvent être prélevées par les pêcheurs professionnels ou la prédation aviaire. Par conséquent, un nombre suffisamment élevé d'individus doivent être marqués pour optimiser les probabilités d'avoir suffisamment d'individus qui parviennent jusqu'aux sorties de l'hydrosystème du Vaccarès. Dans le cadre de cette étude pilote, un total de 40 individus par bassin et par saison de dévalaison (octobre à mai), soit un total de 80 pour une année de suivi, et 160 si deux années de suivi sont réalisées, seront marqués. Le choix de ce nombre est un compromis entre avoir suffisamment d'individus pour obtenir des résultats robustes (n>>30 par bassin et par saison de suivi) et avoir suffisamment de moyens financiers pour y parvenir (coût des marques acoustiques relativement élevées >400€). Si les retours d'expérience sont favorables, un déploiement à plus grande échelle sera éventuellement envisagé.
Raffinement
Un individu qui présente des marques externes de blessures prononcées (souvent d'origine de prédateurs aviaires) ou d'autres signes d'état sanitaire dégradé (kystes, parasites, opacité des yeux, etc.) ne sera pas utilisé dans le cadre de cette procédure. Le marquage des individus s'effectue sous anesthésie et analgésie pour limiter au maximum la douleur. Un individu qui présente un comportement anormal lors de son anesthésie: des signaux d'hyperventilation ou de tremblements sera immédiatement placé dans le bac de réveil et ne sera donc pas traité. Les bacs de stabulation seront noirs, de manière à favoriser l'obscurité et diminuer le stress des individus pendant les phases de stabulation (avant leur traitement et pendant la phase de réveil). La densité des individus par bac sera limitée à 40kg/L. Et les bacs seront brassés par des aérateurs pour favoriser le brassage et l'oxygénation de l'eau. Les bacs seront placés à l'ombre pour éviter que l'eau se réchauffe excessivement. Une fois un individu marqué, il pourra être détecté en continu à plusieurs points de passage, aux points de sorties des bassins ciblées ainsi qu'aux portes de la mer, de manière continue. Ces suivis télémétriques (RFID et acoustique) constituent un moyen de raffiner le suivi en capture-marquage-recapture, puisqu'il permet de suivre à distance le déplacement d'individus marqués (de recapturer leur signalement) sans avoir à les manipuler à nouveau.
Choix des espèces
L’anguille européenne est une espèce migratrice amphihaline catadrome qui présente un cycle de vie unique, et qui est actuellement menacée d'extinction. Afin de mieux comprendre ses déplacements et en particulier de mettre en place des dispositions pour optimiser son retour en mer, il est indispensable d’étudier des individus de cette espèce. Dans le cadre de cette étude, uniquement des anguilles femelles argentées de plus de 50 cm, ayant un poids suffisamment important (>400g) pour supporter l’implantation de transpondeurs sans affecter leurs constantes vitales, seront utilisées. L'implantation de transpondeurs correspond à un lestage total de 5.1g dans l'air, avec une marque RFID de 23 mm de long qui pèse 0.6 g et un émetteur acoustique de 9mm de diamètre qui pèse 4.5g dans l'air (et 2.7g dans l'eau). L’impact des implants est négligeable lorsque leur masse est inférieure à 2.5% de celle du poisson, ce qui se vérifie ici.
Rôle des récepteurs Toll-like dans l’inflammation, l’autoimmunité et le syndrome métabolique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Environ 1 200 sont tuées dès le génotypage pour ne pas porter le bon profil génétique, tandis que les 1 200 autres subissent un régime gras de cinq à six mois provoquant obésité et stéatose hépatique, des prélèvements sanguins et des tests de tolérance au glucose. L'objectif est d'étudier le rôle d'un récepteur Toll dans l'obésité et l'auto-immunité. Le porteur affirme que les souris partagent "99 % des gènes" avec l'humain et écarte les organoïdes, jugés incapables de reproduire l'atteinte de plusieurs organes.
Objectifs
L'obésité est une épidémie mondiale qui touche aussi bien les pays riches que les pays pauvres et constitue l'un des principaux problèmes de santé publique du XXIe siècle. Un lien entre l'obésité, le syndrome métabolique et les maladies auto-immunes et l'inflammation chronique associée a été suggéré, mais les mécanismes sousjacents sont encore inconnus. Toutes ces maladies ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies, continuent à augmenter, menacent de réduire l'espérance de vie et infligent un fardeau aux patients et à la société dans son ensemble. Les récepteurs de type Toll (TLR) des mammifères détectent des composants microbiens conservés, partagés par de nombreux micro-organismes, ainsi que des composants endogènes provenant de cellules mourantes ou blessées, et jouent un rôle essentiel dans le pilotage de l'immunité innée et adaptative. Récemment, les récepteurs de type Toll sont apparus comme un lien critique entre l'inflammation et la contribution à l'obésité et aux maladies auto-immunes, tant chez la souris que chez l'homme. En particulier, le récepteur 7 de type Toll, qui détecte l'acide ribonucléique simple brin, contribue au développement de l'obésité et des maladies auto-immunes, comme le lupus érythémateux systémique et le syndrome de Sjögren. Ainsi, cibler les récepteurs Toll-like pourrait être une nouvelle approche thérapeutique dans la prévention ou le traitement de l'obésité et des maladies auto-immunes et inflammatoires. L'objectif du présent projet est de mieux comprendre comment l'augmentation de la signalisation du récepteur 7 de type Toll dans certains types de cellules contribue à l'obésité et à l'auto-immunité et d'émettre l'hypothèse que la réduction de la fonction du récepteur 7 de type Toll pourrait prévenir le développement de l'obésité et de l'auto-immunité et leurs effets néfastes. Plus précisément, nous cherchons à explorer la contribution du récepteur 7 de type Toll par les cellules dendritiques, les cellules B et les cellules épithéliales thymiques dans le développement de l'obésité et de l'auto-immunité en utilisant des modèles de souris transgéniques.
Bénéfices attendus
L'obésité est liée à un risque plus élevé de troubles auto-immuns et inflammatoires. Au cours des dernières décennies, l'obésité et les troubles auto-immuns ont connu une augmentation parallèle significative dans les pays occidentaux/industrialisés. Il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies pour la prévention et le traitement de ces maladies. Le modèle murin d'obésité induite par le régime alimentaire est devenu l'un des outils les plus importants pour comprendre l'interaction entre les régimes alimentaires occidentaux riches en graisses et le développement de l'obésité, tandis que les modèles murins de lupus ont permis de faire d'importantes découvertes sur l'implication du récepteur 7 de type Toll dans les maladies auto-immunes. Le récepteur 7 de type Toll joue un rôle important dans le développement de maladies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique et le syndrome de Sjögren ainsi que l'obésité. Afin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles pour l'obésité, des études animales plus mécanistes sont nécessaires pour délimiter les mécanismes moléculaires et cellulaires exacts qui sous-tendent l'auto-réactivité dans l'obésité, ainsi que la diaphonie adipeuseimmunitaire dans l'organisme. Nos études feront progresser notre compréhension de la contribution du récepteur 7 de type Toll par différents types de cellules dans l'obésité et l'auto-immunité et pourraient déboucher sur de nouvelles pistes pour la prévention et le traitement de ces troubles qui réduisent l'espérance de vie et ont d'énormes conséquences socio-économiques.
Procédures
Les animaux pré-sevrés seront soumis à un prélèvement de tissus pour le marquage et le génotypage (2400 souris). Les animaux avec le génotype approprié (1200 souris) seront soumis à un régime riche en graisses ou à un régime standard à partir de l'âge de 1,5-2 mois et pour une période de 5-6 mois. Des prélèvements sanguins (durée : 4 minutes maximal) seront effectués sous anesthésie gazeuse une fois à l'âge de 3,4-4 mois et une fois à l'âge de 5-5,5 mois. Un test de tolérance au glucose sera effectué à l'âge de 6-7 mois et un test de tolérance à l'insuline sera effectué à l'âge de 7-7,5 mois, au cours duquel des prélèvements de sang seront effectués à 5 moments différents. La durée du test de tolérance au glucose et du test de tolérance à l'insuline est de 90 minutes, tandis que le prélèvement de sang durant ces procédures dure 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un prélèvement de tissus pour le génotypage et l'identification, ainsi qu'à une prise de sang. Ces procédures durent moins d'une minute et peuvent entraîner une gêne et un stress mineurs pour les animaux, comme une douleur ou un stress temporaire pendant la procédure, un risque d'infection ou de saignement si elle n'est pas effectuée correctement. Pour l'obésité induite par le régime alimentaire, les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime riche en graisses pendant une période de 4 à 6 mois. Le régime riche en graisses chez la souris peut entraîner une prise de poids importante, l'obésité, des troubles métaboliques, une stéatose hépatique et une inflammation de faible intensité. Il peut également avoir un impact potentiel sur les facteurs comportementaux et psychologiques et provoquer des troubles gastro-intestinaux en raison de l'altération du microbiote intestinal. En outre, la manipulation ou l'immobilisation des souris peut provoquer du stress et de l'anxiété, ce qui peut entraîner des changements physiologiques et comportementaux, tels qu'une augmentation du rythme cardiaque, des niveaux élevés d'hormones de stress et une modification des schémas d'exploration ou d'activité. Enfin, l'anesthésie chez les souris peut entraîner des nuisances potentielles ou des effets indésirables tels que la dépression respiratoire, la baisse de la température corporelle et des altérations de la fonction cardiovasculaire.
Devenir
Après le génotypage, les animaux avec le mauvais génotype seront mises à mort (~1200 souris), tandis que les animaux avec le bon génotype (~1200 souris) seront placés dans un régime riche en graisses ou un régime standard pendant une période de 5-6 mois et seront ensuite mises à mort pour une analyse plus approfondie. Si, au cours des procédures, les souris atteignent le point limite (score de gravité supérieur à 10), elles seront mises à mort.
Remplacement
L'obésité et les maladies auto-immunes sont des maladies chroniques complexes, qui impliquent des décennies de changements physiopathologiques et d'adaptation. Le modèle d'obésité induite par le régime alimentaire chez la souris entraîne des modifications de plusieurs organes par rapport aux souris témoins. De plus, les maladies auto-immunes sont souvent systémiques et affectent plus d'un organe, comme dans le cas du lupus érythémateux systémique ou du syndrome de Sjögren. Ce projet propose d'étudier ces processus dans des modèles murins de récepteurs Toll (TLR) de l'obésité induite par le régime alimentaire et d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents ; ceci nécessite l'évaluation des changements physiologiques et immunologiques d'un organisme vivant. D'autres alternatives ont été envisagées, notamment la culture de tissus ou les organoïdes ex vivo (par exemple, le tissu adipeux sur une puce), mais l'objectif principal de ce projet est d'étudier les changements dans divers organes (tissu adipeux, foie, rein, pancréas, thymus) pendant une longue période et l'interaction entre l'obésité et les troubles auto-immuns, ce qui n'est pas possible avec les alternatives susmentionnées.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d'animaux par expérience, nous suivons des protocoles actualisés et standardisés pour le modèle de souris obèse induit par le régime alimentaire et pour mesurer la résistance ou la sensibilité à l'insuline. Les calculs pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour les procédures ont été instruits par des études rapportées dans la littérature et notre expérience antérieure sur des souris transgéniques dans le cadre du syndrome métabolique et de l'auto-immunité. Le nombre d'animaux à utiliser permettra de générer des données scientifiquement robustes. Chaque souris sera soumise à de multiples tests (jusqu'à une sévérité modérée) au lieu d'utiliser des animaux différents pour chaque test, et des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus de tous les animaux afin de garantir que le maximum d'informations soit recueilli sur chaque animal. Afin de limiter la variabilité entre les différents génotypes de souris, nous utiliserons et comparerons toujours des souris de même origine génétique et appariées en âge et en sexe. En outre, et chaque fois que cela sera possible, nous comparerons des souris transgéniques avec des souris sauvages de la même portée, afin d'éliminer l'hétérogénéité due à la variabilité du microbiote.
Raffinement
Les souris seront manipulées de manière appropriée et elles interagiront fréquemment, ce qui réduira le niveau de stress pendant les procédures. Le prélèvement de sang dans le plexus rétro-orbitaire sera effectué sous anesthésie à l'aide d'une station d'anesthésie à gaz, tandis que le prélèvement de sang dans la queue sera effectué après l'application d'un anesthésique local sur la queue. En outre, afin de préserver le bien-être des animaux au cours de la procédure, les souris seront contrôlées fréquemment à l'aide d'une feuille de score appropriée pour le bien-être des animaux, afin de s'assurer qu'aucun animal ne dépasse un niveau de détresse strictement déterminé par le score. Des interventions humaines ou des points d'arrêt seront immédiatement mis en œuvre si l'on constate qu'un animal présente des effets indésirables inattendus.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies parce qu'elles sont très similaires aux humains, puisque les deux sont des mammifères et que 99% des gènes des souris sont similaires aux gènes des humains. En étudiant la physiologie des souris, nous pouvons obtenir des informations sur la façon dont les êtres humains développent des maladies. En particulier pour les maladies chroniques comme l'obésité et l'auto-immunité, les souris sont idéales car elles vivent peu (~2 ans). De plus, les souris génétiquement modifiées rendent cette espèce idéale pour l'étude des molécules individuelles du système immunitaire. Dans notre projet, nous étudions un récepteur de type Toll, qui est conservé au cours de l'évolution entre les humains et les souris, dans le développement de l'obésité et de l'auto-immunité, en utilisant des souris génétiquement modifiées. Ces souris sont donc le modèle le plus approprié pour atteindre les objectifs de cette étude. Pour les souris issues d'un accouplement hétérozygote, la collecte de tissus pour le génotypage et le marquage des souris sera effectuée à l'âge de 7-10 jours. En effet, les souris doivent être regroupées dans des cages en fonction de leur génotype au moment de leur sevrage (21 jours), et le génotypage doit donc être effectué avant cet âge. Les souris seront utilisées à l'âge de 2 à 8 mois afin d'étudier la progression de la prise de poids et de l'auto-immunité avec le temps, puisqu'il s'agit de troubles chroniques.
Étude du métabolisme et de l’activité locomotrice dans un modèle de souris résistant à l’obésité.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
66 souris vont être utilisées, chacune passant 48 heures isolée dans une cage de calorimétrie et subissant trois séances de rotarod, de grip test et de marche en équilibre sur une planche à trous, ainsi qu'un open field de 30 minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les prises de sang se font sous anesthésie, et une partie des souris reçoit pendant six mois un régime enrichi en sucres et en lipides, que le porteur dit capable de conduire "à la longue à une obésité". L'équipe a créé une lignée privée d'un gène dont les souris résistent à la prise de poids, et veut comprendre cette résistance en les comparant à des souris témoins. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tissus. Le porteur retient des groupes de 12 souris pour deux génotypes et deux régimes, soit 48 souris, et écrit pourtant que "l'étude de 66 animaux sur 3 ans est nécessaire".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier la locomotion et le métabolisme chez des souris qui semblent résistantes à la prise de poids. En effet, nous avons développé un modèle de souris avec une perte d’expression d’un gène spécifique, et à notre surprise ces animaux sont résistants à la prise de poids. Des analyses complémentaires montrent une masse musculaire normale mais une non-accumulation de la masse graisseuse dans ces animaux à l’âge d’un an. Nous souhaitons donc explorer plus en avant ce phénotype, notamment via des analyses longitudinales de la composition corporelle, du métabolisme, de l’activité locomotrice et de la calorimétrie de ces animaux, complété par des analyses sanguines, et ceci à la fois en diète normale ou enrichie en lipides. Nous espérons que cette approche nous permettra de mieux comprendre la résistance à la prise de poids dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de l’activité locomotrice et du métabolisme.
Procédures
1 – Les prélèvements sanguins requièrent moins d'une minute. 2 – L’analyse de la masse corporelle se fera par qNMR, qui est une analyse non-invasive d’une durée de 1 minute. 3 - L’analyse du métabolisme se fera par des tests de Calorimétrie indirecte, qui se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles pendant 48 heures. 4 – L’analyse de la locomotion des animaux se fera par une batterie de tests non invasifs réalisés sur une durée de 3 à 4 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Nous souhaitons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice chez des souris résistantes à la prise de poids, et ceci via des tests classiques et non invasifs. Nous souhaitons aussi analyser les paramètres biochimiques de ces souris et ceci via un prélèvement d’une faible quantité de sang. Ces analyses peuvent induire des contraintes décrites ci-dessous : -Une partie de l’étude du métabolisme se fait chez des animaux avec une diète enrichie en sucres et en lipides, ce type de régime peut conduire à la longue à une obésité avec ces problèmes associés (difficulté à se déplacer, etc.). Nous allons donc restreindre ce régime enrichi en sucres et en lipides à une période de 6 mois. - Toujours à propose de l’étude du métabolisme, celle-ci nécessite des tests se déroulant dans des cages d’hébergement individuelles, conduisant donc à un isolement des animaux pendant 48 heures. Toutefois ce test est de courte durée et une fois terminé, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement). - Concernant les prélèvements sanguins, ceux-ci peuvent entrainer un stress et/ou éventuellement à une légère douleur. Les animaux seront donc anesthésiés quelques minutes avant le prélèvement sanguin.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus pour des analyses histopathologiques et moléculaires.
Remplacement
Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris d’une maladie humaine génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de la locomotion et du métabolisme. Enfin, nous espérons que l’analyse de ce modèle murin permettra de mieux comprendre la faiblesse musculaire et la perte de poids de noter maladie d’intérêt.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et compte tenu de notre projet d’analyser deux conditions (souris contrôle ou souris sans notre gène d’intérêt) sous deux types de nourriture (normale ou enrichie en lipide), nous estimons que l’étude de 66 animaux sur 3 ans est nécessaire.
Raffinement
Afin de limiter la prise de poids des animaux, le régime enrichi sera limité à 6 mois. De plus, les prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle se feront sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après le prélèvement sanguin (changement du comportement : akinésie, prostration, paralysie, non réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure de prélèvement seront arrêtés si ces points limites sont atteints. Enfin, les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Néanmoins, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Toutefois, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience sera stoppée.
Choix des espèces
Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude du métabolisme. Nous allons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice par des tests non invasifs sur 66 souris adultes, et ceci sur une période de 6 mois pour l'étude du métabolisme, à 15 mois pour l'étude de la locomotion, Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la perte de force et de la prise de poids des animaux.
Développement de traitements innovants antalgiques pour le traitement de la douleur.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 210
210 rats et 24 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une douleur inflammatoire de la patte par des stimulations thermiques ou mécaniques répétées, ou une douleur post-opératoire par incision et sutures, avec un risque d'automutilation de la plaie. L'objectif est de tester des nanomédicaments à base d'enképhalines contre la douleur, une partie des animaux étant tuée pour doser les substances dans le sang. Le porteur affirme que la complexité de la douleur rend le recours à l'animal "incontournable" et présente le rat comme l'espèce "de référence".
Objectifs
La morphine et les opioïdes synthétiques apparentés sont les analgésiques les plus largement utilisés mais leur utilisation est associée à des effets secondaires graves, tels que la dépression respiratoire, l'accoutumance et la dépendance. Dans ce contexte, les enképhalines, qui sont des opioïdes existant naturellement dans le corps humain, sont une option intéressante car elles jouent le rôle d’une morphine endogène, inhibitrice de la douleur mais sans effets secondaires. Cependant, l'utilisation des enképhalines a toujours été limitée car elles sont rapidement dégradées après leur injection dans la circulation sanguine. Ainsi, la conception de systèmes d'administration les protégeant de la dégradation et leur permettant d'atteindre leur cible pour délivrer leur action est un objectif ambitieux. Notre équipe a développé une nouvelle approche de nanomédecine permettant la protection des enképhalines. La preuve de concept a été faite sur un modèle classique de douleur inflammatoire chez le rat et l’étude a montré que les nanomédicaments contenant les enképhalines ont protégé la substance active qui s’est accumulé au site de la douleur et a montré une action analgésique périphérique. Cette étude préliminaire est très encourageante et une des voies d’amélioration de l’activité analgésique des enképhalines repose sur l’augmentation de leur stabilité par l’utilisation de médicaments qui empêche leur dégradation (appelés inhibiteurs d’enképhalinases) et ainsi prolonger encore leur durée de vie et donc leur action anti-douleur. Notre objectif est de tester cette piste d’amélioration en développant de nouveaux médicaments à base d’inhibiteurs des enképhalinases pour booster la concentration en enképhalines et traiter efficacement et durablement la douleur.
Bénéfices attendus
La douleur représente un important défi sanitaire mondial en raison de l'absence relative de traitement efficace, en particulier pour soulager la douleur neuropathique. Actuellement, les médicaments les plus puissants et les plus fréquemment utilisés pour soulager la douleur sont la morphine et les opioïdes de synthèse. Toutefois, leur utilisation chronique est associée à de graves inconvénients, tels que la dépression respiratoire, la tolérance et la dépendance. Chaque jour, plus de 130 personnes aux États-Unis meurent après une surdose d'opioïdes. Il existe donc un besoin important de médicaments antidouleur efficaces dépourvus d’effets secondaires. L’objectif de ce projet est le développement de nouveaux traitements innovants de la douleur. Les enképhalines qui sont des opioïdes naturellement existants dans le corps humain représentent un moyen prometteur d'atténuer la sensation de douleur, sans les effets secondaires de la morphine. Cependant, leur dégradation rapide une fois administrés limite leur utilisation clinique. Ainsi, la conception de nanosystèmes d'administration de médicaments protégeant les enképhalines de la dégradation et leur permettant d'atteindre les récepteurs opioïdes situés dans le système nerveux périphérique (effet local et non central) est un objectif majeur. Cette nouvelle approche permettrait de lutter contre la crise des opioïdes qui a englouti l'Amérique, et d’autres pays dans une moindre mesure, dans une vague d'addiction et de décès par overdose.
Procédures
Pour le modèle de douleur inflammatoire au niveau de la patte, le rat subira 2 injections, d’une durée de quelques secondes, sous anesthésie générale. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise une douzaine de fois (toutes les 30 minutes environ) à un stimulus thermique ou mécanique, qui va déclencher le retrait spontané de la patte, l’animal n’étant pas contraint. La procédure durera au maximum 24h. Pour le modèle de douleur post-opératoire, le rat ou la souris subira une incision qui sera refermée avec 2 points de suture sous anesthésie générale (durée de l’intervention : 5 minutes). Pour la pharmacocinétique, chaque rat sera soumis à une injection et à 4 ou 5 prélèvements de sang sur 24 ou 48 h. Ces gestes seront réalisés sous anesthésie à l’isoflurane et dureront moins d’une minute. Pour la biodistribution, chaque souris sera soumise à une injection unique de traitement et sera suivi en imagerie à différents temps sur une période de 24h. Les injections et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale et dureront moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Le modèle d’inflammation de la patte induira une douleur locale modérée pendant 3 à 8 h avec une réduction de la motricité mais sans autres manifestations comportementales notables. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise à un stimulus thermique, qui va déclencher le retrait de la patte. La douleur reste modérée car les animaux ont la possibilité d'échapper à la stimulation en retirant leur patte, l’animal n’étant pas contraint. Le modèle de douleur post-opératoire, équivalent à la suture d’une plaie superficielle aux urgences de l’hôpital sous anesthésie locale, induira une douleur locale pendant 2 à 3 jours avec un pic de douleur à 24h. Une éventuelle infection au site d’incision ou une désunion de la cicatrice seront à surveiller ainsi que des comportements d’automutilation au niveau de la plaie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures, soit parce que l’étude est terminée et qu’ils ne pourront pas être ré-utulisés dans une autre procédure, soit pour réaliser des prélèvements sanguins pour doser les substances actives dans le plasma.
Remplacement
La douleur est un phénomène très complexe. C’est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à une lésion tissulaire. Le stimulus générant la douleur va activer les terminaisons nerveuses de neurones spécialisés dans la perception de la douleur. Ce signal se propage ensuite le long des fibres nerveuses jusqu’à la moelle épinière et le cerveau. Il existe dans le cerveau et la moelle un puissant système de contrôle de la douleur qui fait notamment intervenir des endorphines et régule le transfert des informations douloureuses en provenance de la périphérie. Cette complexité est actuellement impossible à modéliser in vitro ou in silico et le recours à l’animal est incontournable pour évaluer nos nanomédicaments sur la douleur. Le rat constitue un bon modèle d’étude de la douleur car il possède une organisation nerveuse comparable à celle de l’homme. Les modèles de douleur inflammatoire sont validés par la communauté internationale (International Association for the Study of Pain, IASP)
Réduction
Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui permet de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Un plan d’expérience a été construit afin de réduire au maximum le nombre d’animaux. Les animaux seront répartis dans les groupes expérimentaux de manière aléatoire. L’attribution des traitements se fera en simple aveugle pour éviter les biais expérimentaux. Si les traitements innovants testés ne présentent pas l’effet analgésique escompté l’étude s’arrêtera là. Pour l’étude de pharmacocinétique, afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs prélèvements sanguins seront réalisés sur le même animal dans la limite du volume maximal prélevable en 24h. L’étude de biodistribution se fera en imagerie par fluorescence ce qui permettra un suivi longitudinal des animaux et de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
La semaine précédent la mise en place du modèle, les rats seront manipulés tous les jours et habitués aux gestes de la procédure afin de minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les injections, lesprélèvements et la chirurgie se feront sous anesthésie générale associée quand cela est possible à une anesthésie locale (quand pas d’interférence entre le traitement et l’anesthésique). Notre modèle de douleur inflammatoire et post-opératoire induit une douleur modérée dans la patte qui est raisonablement bien supportée par l’animal. Dans les tests utilisés pour évaluer la sensibilité nociceptive, l’animal n’est pas contraint pendant les mesures et l’intensité de la stimulation est progressivement augmentée jusqu’à une valeur minimale seuil pour déclencher la réaction nociceptive et donc le retrait de la patte. La stimulation n’est jamais poursuivie au-delà. Pour des raisons scientifiques évidentes, les anti-douleurs et les anti-inflammatoires ne peuvent pas être utilisés. Toutefois, une grille de score permettra de suivre l’état général des animaux et de définir des points limites qui seront strictement appliqués. Les animaux seront stabulés en groupes sociaux, dans un environnement enrichi afin de favoriser un comportement naturel.
Choix des espèces
Cette étude sera effectuée sur des rats car c’est l’espèce de référence dans la littérature pour les études sur la douleur. Les rats sont calmes, faciles à manipuler et s’acclimatent progressivement à l’expérimentateur. L’étude de biodistribution sera menée sur des souris afin de pouvoir réaliser une étude longitudinale en imagerie de fluorescence, les rats étant trop grands pour être imagés en entier dans l’appareil d’imagerie. Nous utiliserons des rats et des souris adultes car la population cible est adulte.