Recherche fondamentale

3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis des chimiothérapies, immunothérapies et molécules par voie orale ou intrapéritonéale, la tumeur au flanc pouvant gêner leurs déplacements et déclencher la mise à mort au-delà d'un volume limite. L'objectif est de tester des molécules censées lever la résistance à la chimio-immunothérapie dans des cancers du côlon, du poumon et du pancréas, les bénéfices pour les patients restant hypothétiques. Le porteur affirme que l'efficacité des combinaisons en oncologie doit être évaluée sur des "organismes vivants" et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association immunothérapie (anti-PD-1) et chimiothérapies utilisées en clinique en association avec des inhibiteurs de certaines voies de résistance aux traitements, dans trois modèles de cancers chez la souris, un pour le côlon, un pour le poumon et un pour le pancréas.

Bénéfices attendus

Les cancers du côlon et du poumon font partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Actuellement, leur traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, d’immunothérapies ou une combinaison des deux. Bien qu’ayant montré des effets bénéfiques chez certains patients, ces traitements restent inefficaces pour un grand nombre d’entre eux. Il serait donc intéressant de trouver des molécules capables de lever la résistance à la chimio-immunothérapie. La découverte de tels agents permettrait de rendre la chimio-immunothérapie efficace pour un plus grand nombre de patients. Nous proposons ici de tester des inhibiteurs de deux voies majeures connues pour réguler la réponse immunitaire et l’évolution du cancer. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association immunothérapie et chimiothérapies utilisées en clinique en association avec des inhibiteurs de certaines voies de résistance dans trois modèles de cancers chez la souris, un pour le côlon, un pour le poumon et un pour le pancréas. Dans ce projet, nous évaluerons : - l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale chez des souris standards. Ceci permettra d’évaluer l’efficacité d’une combinaison chimio-immunothérapie + composés testés par rapport à une chimio-immunothérapie seule. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur état d’activation chez les souris traitées par la chimio-immunothérapie seule ou en association avec les composés testés, par rapport aux souris non traitées (immunomonitoring, Nanostring). - la nécessité du système immunitaire, en réalisant les mêmes expériences chez des souris génétiquement modifiées, comme par exemple la souris de type Balb/nude (dépourvue de lymphocytes T et ayant un système immunitaire affaibli). L’importance de certains régulateurs de l’inflammation ou de l’autophagie sera également évaluée. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, la chimiothérapie et/ou la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.

Procédures

- Injection de cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée 5 minutes - Nombre de souris : 3500 souris. - Traitements par chimiothérapie: - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 1960 souris. - Traitements par immunothérapie: - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée 1 minute Nombre de souris : 1540 souris . - Traitements par trametinib par voie orale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une administration par jour pendant 10 jours par animal - Durée 1 minute Nombre de souris : 630 souris. - Traitements par anakinra par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée 1 minute Nombre de souris : 630 souris.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Lorsque le volume tumoral est trop important, ou que la tumeur parait gêner le déplacement de la souris celle-ci sera mise à mort. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. Donc surveillance régulière du poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage. Si un point limite est atteint, la souris sera mise à mort. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies, immunothérapies et thérapies spécifiques utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. Surveillance régulière de l’état général et des points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Les souris utilisées pour les expériences de croissances tumorales seront mises à mort lorsque la taille des tumeurs sera trop importante. Les souris utilisées pour les expériences d’analyse du système immunitaire seront mises à mort afin de prélever la tumeur.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné. Si aucun effet bénéfique de certains composés seuls ou en association avec la chimio-immunothérapie sur la réponse anti-tumorale (croissance et infiltrats immunitaires) n’est observé au début du projet, alors ces composés ne seront pas testés sur les souris immunodéficientes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe. L’utilisation d’un arbre décisionnel selon les points limites adaptés (poids, posture, expression de la douleur, absence de toilettage, léthargie, immobilité, tumeurs, …) et leur comptabilisation dans une grille de scores permettra de stopper la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

220 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une craniectomie pour l'implantation de cellules de glioblastome dans le cerveau, puis des séances répétées d'imagerie cérébrale sous anesthésie, avant la mise à mort vingt jours après la greffe. L'objectif est d'étudier le rôle de la sécrétion des cellules tumorales dans le développement du gliome et d'identifier des cibles thérapeutiques. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne démontre la pertinence in vivo et qu'une étude préclinique chez l'animal est requise.

Objectifs

Le gliome est un cancer du cerveau agressif au pronostic sombre et aux options thérapeutiques limitées. Le gliome est la forme maligne la plus courante de tumeur cérébrale primaire avec le taux de mortalité le plus élevé. Le glioblastome est considéré comme la forme de gliome la plus agressive, invasive et mortelle, et il représente 50% de tous les cas de gliome. Le glioblastome est considéré comme presque incurable et la survie des patients après le diagnostic est de 15 à 18 mois malgré des paradigmes de traitement agressifs tels que la résection chirurgicale combinée, la radiothérapie et la chimiothérapie. Ces tumeurs malignes très agressives sont extrêmement invasives et prolifératives. Combinés, ces facteurs contribuent à la résistance thérapeutique et à des taux de récidive de près de 100%. Pour mieux étudier la progression naturelle de cette maladie dévastatrice et pour une meilleure évaluation des nouveaux schémas thérapeutiques, des moyens de caractériser de manière non invasive et longitudinale les tumeurs dans les modèles précliniques sont très recherchés. Les modèles précliniques de gliome sont d'une valeur inestimable pour comprendre la progression du glioblastome chez les patients, pour évaluer des stratégies thérapeutiques prometteuses. Le glioblastome se caractérise notamment par une communication intense entre les cellules tumorales et leur microenvironnement, principalement par la sécrétion de protéines et d'autres facteurs par les cellules du glioblastome. Comme pour d'autres tumeurs solides, l'une des principales caractéristiques du glioblastome est l'intensité des interactions réciproques avec son microenvironnement - en particulier les neurones. Par conséquent, les mécanismes cellulaires qui contrôlent la sécrétion des cellules du glioblastome sont particulièrement importants dans le cancer et dans le fonctionnement des cellules cérébrales.

Bénéfices attendus

La greffe des cellules de glioblastomes modifiées génétiquement permettra de connaître le rôle de la sécrétion dans le développement tumoral. La co-injection de modificateurs de l'expression des gènes permettra de déterminer des potentielles nouvelles cibles thérapeutiques envisageables chez l’homme. Ces molécules pourraient le cas échéant être utilisés comme adjuvants d’une résection chirurgicale de tumeurs chez l’homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale visant à implanter des cellules tumorales dans le cerveau et la visualisation de la croissance tumorale par imagerie cérébrale sous anesthésie gazeuse d'une heure. Cette greffe sera réalisée en une seule fois par animal. cette procédure prend 1h maximum par rat. Pour les chacune des 4 séances d'imagerie, chaque rat subira une anesthésie gazeuses de 40 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des expérimentations sont liés aux anesthésies répétées, aux douleurs associées aux injections, au stress au réveil des anesthésies, aux douleurs liés au craniectomies et à un effet général altéré suite à la présence d'une tumeur cérébrale.

Devenir

La procédure vise à l'implantation des cellules tumorales dans le cerveau, et à réaliser un suivi longitudinal tous les 5 jours par imagerie cérébrale. Elle termine 20 jours après par la mise à mort des animaux.

Remplacement

Ce projet vise à obtenir une preuve de concept in vivo. Les expériences in vitro, y compris de co-culture glioblastome-neurones indiquent un rôle de la sécrétion dans l’état souche des cellules cancéreuses. Aucune méthode in vitro ne permet de démontrer la pertinence in vivo pour établir le rôle de la sécrétion dans le développement tumoral dans un environnement pertinent pour la pathologie humaine. De plus, l’utilisation potentielle d’oligos anti-sens pour contrôler la sécrétion dans le cadre du glioblastome chez l’homme nécessite une étude pré-clinique chez l’animal.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une évaluation statistique appropriée et prend en compte les échecs dus à une mortalité en cours de procédure. Le suivi longitudinal par imagerie de type Doppler permet de restreindre le nombre d’animaux utilisés mais nous procéderons à une analyse finale par histologie ainsi que par le suivi de marqueurs moléculaires. Pour ces raisons, des groupes de 25 rats par condition (8 au total) seront nécessaire. La procédure n'ayant pas été encore utilisée par l'équipe, une phase de mise au point et formation au geste avec 20 rats injectés avec des cellules de glioblastome contrôle sera nécessaire. Le projet utilisera un total de 220 rats.

Raffinement

Les rats, non isolés, ont dans leur cage un environnement enrichi. Les soins sont toujours effectués par les mêmes expérimentateurs et animaliers afin de réduire le stress des animaux. Les signes de douleur éventuels amèneront aux traitements appropriés avec des analgésiques. Nous avons défini des points limites.

Choix des espèces

Nous utiliserons un modèle des rats Fischer 344, un modèle pertinent pour l'implantation de cellules de gliomes. L’utilisation de ces modèles va nous aider à mieux appréhender la croissance tumorale et surtout avoir un modèle animale très proche des procédures effectuées chez les patients. Les cellules utilisées nous permettent de contrôler la croissance tumorale par imagerie cérébrale. Nous utiliserons des jeunes rats adultes de 6 à 8 semaines, ~200g, pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences s’étaleront sur 3 semaines donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

1440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées ou une injection intraveineuse de lymphocytes, cette dernière pouvant provoquer une détresse respiratoire ou neurologique, avant d'être tuées pour prélever leur tissu adipeux brun. L'objet du projet est d'étudier le rôle de sous-populations de macrophages dans la production de chaleur par ce tissu. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal et qu'"aucune autre espèce" que la souris ne peut être utilisée.

Objectifs

Chez les mammifères deux types de tissu adipeux ont été identifiés : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun. Ces deux tissus ont des fonctions très distinctes. En effet, le tissu adipeux blanc emmagasine de l’énergie sous la forme de triglycérides. Le tissu adipeux brun est impliqué dans la génération de chaleur, un processus appelé la thermogenèse adaptative. La thermogenèse adaptative est assurée par l’intermédiaire d'une protéine mitochondriale qui permet la génération de chaleur dans les adipocytes bruns. Cette protéine mitochondriale est exprimée de manière très spécifique par les adipocytes bruns. La chaleur ainsi générée est ensuite localement libérée et diffuse dans l’organisme par la circulation sanguine. Des recherches précédentes ont démontrées un rôle essentiel du système immunitaire dans la thermogenèse adaptive. La présence de plusieurs sous-populations de macrophage ont été mises en évidence dans le tissu adipeux brun. Cependant, le rôle des différentes sous-populations de macrophages reste à déterminer. Ainsi, nous souhaitons développer des modèles génétiques permettant de cibler spécifiquement et de réduire les sous-populations de macrophages dans le tissu adipeux brun. Nous analyserons la conséquence de ces réductions de populations de macrophages sur la physiologie du tissu adipeux brun et sur la thermogenèse adaptative. Un intérêt tout particulier sera porté sur l’impact des adipocytes bruns sur le développement de la réponse immune innée et adaptative.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l'interaction entre les adipocytes thermogéniques et les cellules immunes. Nous espérons déterminer les fonctions des différentes populations de macrophages du tissu adipeux brun. En effet, ceci pourrait identifier des nouvelles cibles permettant de contrôler l'activité du tissu adipeux brun.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux seront l’une des suivantes : des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 4 jours suivies ou non de 3 autres injections la semaine suivante, ou une anesthésie suivi d'une injection intraveineuse. De plus, un prélèvement de sang sera effectué juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Des animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales répétées pendant deux semaines consecutives et une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Dautres souris seront soumises à une injection intraveineuse de lymphocytes, ce qui pourrait induire des signes de détresse circulatoire (atteinte de la fonction respiratoire ou neurologique).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le tissu adipeux brun dans le but de l'analyser.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires au lieu de cellules isolées à partir des animaux. Cependant, pour comprendre les fonctions des macrophages du tissu adipeux brun, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux brun.

Réduction

Pour les élevages nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. De plus, nous utiliserons les souris mâles et femelles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Dans le cas d’injections intrapéritonéales répétées, nous effectuerons une rotation des sites d’injection et surveillerons quotidiennement l’aspect des sites d’injections. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins une fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les macrophages du tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant l’expansion du tissu et la déplétion spécifique des différentes populations de macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée.

Seules dans leur cage pendant dix semaines, des souris mâles et femelles ont un accès intermittent au choix entre une bouteille d'alcool et une bouteille d'eau. D'après des études antérieures, la consommation augmente après deux à trois semaines, et le porteur prévient que les souris peuvent se déshydrater et que l'isolement "peut induire un stress". Au bout de ces dix semaines, chacune passe sous anesthésie trois séquences d'IRM, fonctionnelle, anatomique et de diffusion, soit 56 minutes, pour mesurer selon le sexe les effets de l'alcool sur la communication entre régions du cerveau. Les 120 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sont ensuite mises à mort pour des prélèvements d'organes.

Objectifs

Le trouble de consommation de l’alcool induit des modifications cérébrales complexes, se caractérisant par plusieurs stades associés à des adaptations spécifiques. En effet, une exposition prolongée et répétée à l’alcool peut être à l’origine d'altérations dans la communication entre les différentes régions du cerveau. Par ailleurs, des différences dans la vulnérabilité à la dépendance et à la toxicité de l'alcool entre les sexes ont déjà été mises en évidence à la fois chez l'Homme et dans des modèles de rongeurs. Ainsi l'objectif de cette étude est d'identifier par IRM dans quelle mesure les altérations de la communication cérébrale dépendent du sexe lors d'une consommation excessive et à long terme d'alcool. C'est pourquoi, après une consommation chronique de 10 semaines, des souris mâles et femelles sous exposition volontaire à l'alcool seront caractérisées par IRM multimodale afin de detecter les modification de la communication cérébrale. Ce projet tend donc à répondre aux questions suivantes ; quelles modifications cérébrales sont induites par la consommation d'alcool à long terme, quelles sont les différences d'altérations entre les sexes, et comment ces modifications peuvent être liées ou même prédire un comportement addictif ?

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude devraient contribuer à mieux comprendre les conséquences au niveau de la connectivité cérébrale dans l'addiction à l'alcool à long terme;, et l'influence du sexe dans les modifications observées. Ce projet devrait apporter une vue globale de la réorganisation du connectome chez les souris exposées à l’alcool, tout en permettant de cibler les aires cérébrales présentant des altérations spécifiques, et pouvant servir de cibles pour de futurs études translationnelles.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) un protocole volontaire d'accès intermittant au choix entre 2 bouteilles : alcool versus eau ; pendant 10 semaines 2) un examen IRM sous anesthésie incluant : un séquence d'IRM fonctionnel (16min), une séquence d'IRM anatomique (10min) et une séquence d'IRM de diffusion (30min). Par ailleurs, les souris seront hébergées individuellement pour toute la durée du protocole c'est-à-dire 10 semaines.

Impact sur les animaux

Le protocole de préférence de consommation de la solution d'alcool par rapport à l'eau par les souris est basée sur une action volontaire et non forcée. Des études précédentes chez la souris ont montré que le protocole induit une augmentation de la consommation après 2-3 semaines d’exposition. Cette consommation se stabilisent par la suite mais sa chronicité pendant 10 semaines reproduit le passage vers l’addiction à l’alcool, comme observées chez l’homme. Le protocole ne teste pas l’état de sevrage des souris car l’exposition à l’alcool n’est pas arrêté de manière prolongé, limitant ainsi les possibles nuisances. Les souris peuvent cependant présenter un état de déshydratation suite à la consommation excessive d’alcool. Ce protocole exige par ailleurs que les souris soient isolées ce qui peut induire un stress chez les animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements d’organes d’intérêts.

Remplacement

Le modèle animal est, pour le moment, le seul modèle qui permet d’étudier dans son ensemble les phénomènes complexes mis en oeuvre dans l'addiction à l'alcool au niveau cérébrales à l'échelle du connectome. En effet ces atteintes sont multifactorielles, nécessitant un grand nombre d’acteurs, et toutes les conditions ne sont pas reproductibles fidèlement dans un modèle de culture cellulaire.

Réduction

Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaires afin d’assurer l’efficacité des tests et obtenir des résultats fiables en fonction des expériences réalisées. Le nombre d’animaux pour l’analyse des résultats a été calculé à l’aide de tests statistiques, amenant à 30 souris par groupe nécessaires pour analyser les résultats d'expérience IRM, conduisant à un total de 120 animaux

Raffinement

Le stress potentiellement engendré par la pratique expérimentale sera limité au maximum. Dans les cages d'hébergement, l'environnement sera enrichi par des carrés de coton pour l’édification du nid, des morceaux de bois pour que les animaux usent leurs dents, et des tubes pour fournir un abri. Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d'une anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM. Il sera alors placé dans une cage mise sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.

Choix des espèces

Pour ce projet nous utiliserons des souris mâles et femelles. Cette souche de souris est la plus utilisée dans l'étude du comportement lié à l'alcool. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, étant l'équivalent de l'âge adulte chez l'Homme. A cet âge, les souris ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleure reproductibilité des résultats.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène Tshz3 présentée comme un modèle d'autisme, elles reçoivent une injection quotidienne pendant dix jours et passent trois tests comportementaux censés mesurer des stéréotypies, dont le RNT ne précise pas le protocole. L'objectif est de tester si un médicament utilisé dans la maladie d'Alzheimer réduit ces comportements répétitifs. Le porteur affirme que les troubles du spectre autistique "ne peuvent être étudiés qu'in vivo" et que des souris génétiquement modifiées sont "indispensables".

Objectifs

Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) sont diagnostiqués sur la base de troubles du comportement, notamment des déficits de la communication et des interactions sociales, ainsi que des comportements répétitifs (stéréotypies) avec des champs d’intérêts restreints. Les causes des TSA sont encore mal connues, mais plusieurs recherches ont établi que de mutations dans certains gènes sont impliquées. Plusieurs de ces gènes participent, d’ailleurs, au développement et au fonctionnement du cerveau. Nos travaux apportent un faisceau d’arguments convergents, à partir d’études menées chez l’homme et sur des modèles de souris, en faveur de l’existence d’un lien direct entre des mutations d’un gène et les TSA. En particulier, nos souris avec des mutations de ce gène montrent des comportements répétitifs (stéréotypies) qui miment ceux typiques des TSA. Notre hypothèse, basée aussi sur nos travaux précédents, est que ces comportements répétitifs soient dus à une réduction des niveaux d’une substance chimique sécrétée par les neurones d’une zone du cerveau nommée striatum, comme dans d’autres cas de comportements stéréotypés. A l’heure actuelle il n’existe pas des traitements médicamenteux généralisés pour les TSA, cependant certains des symptômes peuvent être pris en charge spécifiquement. Dans ce contexte, nous proposons d’utiliser nos souris afin tester si leurs comportements répétitifs peuvent être améliorés par un traitement qui vise à augmenter les niveaux de cette substance dans le cerveau. Dans ce cadre, nos objectifs principaux sont : 1. Effectuer des tests comportementaux permettant de mettre en évidence des stéréotypies et des comportements de type persévérant chez les souris mutantes, par rapport à leurs contrôles. 2. Tester si un traitement pharmacologique qui augmente les niveaux de cette substance est capable d’améliorer ces déficits comportementaux. Cela pourrait fournir des indications thérapeutiques pour le traitement des comportements stéréotypés, associés ou pas aux TSA.

Bénéfices attendus

Cette demande s’inscrit dans la suite de travaux précédents du demandeur et des autres responsables du projet. Nous avons identifié un gène dont la mutation est impliquée dans les troubles du spectre de l’autisme (TSA). Dan ce contexte, ce projet a pour objectif de tester des traitements pharmacologiques permettant de corriger des comportements stéréotypés chez la souris modèle des TSA dus à la mutation de ce gène.

Procédures

Ce projet comprend 2 types d’intervention : un traitement qui consiste en une injection une fois par jour sur une période de 10 jours ; 3 tests comportementaux (qui ne comportement pas de souffrances pour les animaux) pour détecter des comportements stéréotypés typiques des TSA : chaque test dure entre 15 et 20 min et sera effectué au 3ème et au 10ème jour de traitement.

Impact sur les animaux

Nuisances attendues : injections quotidiennes sur 10 jours, qui peuvent entrainer de la douleur au point de piqure ; tests de comportement répétés qui peuvent engendrer du stress ou de la fatigue.

Devenir

A la fin de la procédure, les souris ne seront pas utilisés pour d’autres expériences dans le cadre de ce projet ou d’autres projets de recherche. Par conséquent, toutes les 40 souris seront mises à mort.

Remplacement

Les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des neurones du contexte physiologique. De plus, l’utilisation de souris vivantes est nécessaire pour tester l’efficacité du traitement pharmacologique visant à améliorer les stéréotypies.

Réduction

Nous nous efforçons d’utiliser le moins d’animaux possible (optimisation des conditions d’élevage, des croisements etc.), tout en veillant à ce que le nombre d’animaux utilisé soit représentatif. Cela a été estimé sur la base d’expériences antérieures, et grâce à des outils statistiques permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires. Cela nous a fourni un nombre total de sujets = 18 (9 par groupe). Afin d’héberger les souris par groupes homogènes de 5 et compenser à une possible augmentation des écarts types due au traitement et à l’utilisation des deux sexes, nous avons choisi d’utiliser 10 animaux par groupe : 10 mâles mutantes et 10 mâles contrôle, ainsi que 10 femelles mutantes et 10 femelles contrôle, pour un total de 40 souris.

Raffinement

Les souris sont élevées en groupes sociaux de 5 animaux, dans des environnements enrichis par la présence d’objets (igloos en carton, « Nestlets » déchiquetables en fibre, briques en bois), au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques (température, humidité) et sanitaires sont strictement contrôlés. Les animaux sont examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur/mal être et veiller à ne pas dépasser des points limites. Etant donné l’absence de procédures chirurgicales ou d’autres sources de douleur dans ce projet, nous n’utiliserons pas d’anesthésiques ou d’analgésiques.

Choix des espèces

Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) ne peuvent être étudiés qu’in vivo, car ils sont définis par des comportements caractéristiques (déficits dans les interactions sociales et mouvements répétitifs ou stéréotypés) qui nécessitent d’animaux vivants pour être mis en évidence. La possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est indispensable pour reproduire les symptômes des TSA dus à la délétion d’un gène. Nous utiliserons donc ces souris pour des expériences visant à mettre en évidence des comportements stéréotypés, afin de tester l’effet d’un traitement pharmacologique, utilisé en clinique pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. Notre hypothèse est que ce traitement peut restaurer la fonction d’une région du cerveau impliquée dans les TSA, le striatum, et ainsi améliorer les comportements stéréotypés qui caractérisent ces souris. L’âge des souris utilisées sera de 6 à 8 semaines au début de la procédure : cela a l’avantage d’avoir des animaux capables d’effectuer les tâches comportementales prévues dans la procédure expérimentale, tout en minimisant la durée de leur stabulation.

2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie provoquant un infarctus par ligature définitive d'une artère coronaire, un quart d'entre elles ayant en plus la rate retirée, avec des injections de vésicules extracellulaires et des échographies sous anesthésie. L'objectif est de comprendre le rôle de ces vésicules dans la réparation du cœur après infarctus, les applications thérapeutiques restant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que ces phénomènes complexes ne peuvent être recréés in vitro et que le modèle murin est "absolument nécessaire et indispensable".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires et l’infarctus du myocarde en particulier sont l'une des premières causes de mortalité dans le monde. La compréhension des mécanismes impliqués dans cette maladie est nécessaire pour le développement de thérapies visant à améliorer la survie après infarctus et constitue ainsi un enjeu médical et sociétal majeur. La mort du tissu cardiaque infarci déclenche une réponse inflammatoire qui est essentielle pour la réparation cardiaque. Cette réponse inflammatoire repose sur la communication efficace entre les cellules inflammatoires et les cellules cardiaques. Lors d’un infarctus, les cellules cardiaques libèrent des fragments de leur membrane, les vésicules extracellulaires (VE). Ces VE exercent leur activité biologique par le transfert de leur contenu (protéines et acides nucléiques) vers des cellules cibles, ce qui en fait de véritables messagers intercellulaires. La composition de ces VE cardiaques ainsi que leur rôle dans la réponse inflammatoire et la réparation cardiaque est inconnu. Le but de notre projet est de définir les mécanismes moléculaires qui contrôlent cette communication intercellulaire par les VE cardiaques, leur rôle dans la réparation cardiaque après infarctus du myocarde. Divers modèles de souris génétiquement modifiées nous permettront d’analyser spécifiquement le rôle de ces VE. Les animaux subiront un infarctus du myocarde. L’analyse consistera à caracteriser la composition des VE cardiaques ainsi que leur rôle dans la réponse inflammatoire, la fonction et le remodelage du coeur après infarctus.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de définir les mécanismes de communication cellulaire qui controllent la réparation cardiaque lors de l’infarctus du myocarde. La caractérisation de ces mécanismes clés est essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à favoriser la réparation du coeur infarci et ainsi favoriser la survie.

Procédures

Chaque animal va subir une procédure chirurgicale de 20 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde expérimental est réalisé par ligature permanente de l’artère coronaire antérieure gauche. Un tiers de ces animaux seront injectés avec des VE purifiées (injection intracardiaque ou intraveineuse) afin d'évaluer le rôle des VE dans la réparation cardiaque. Un quart des animaux de ce projet sera préalablement splénectomisé. La splénectomie est une procedure chirurgicale de 10 minutes. Pour chacune de ces procédures, trois injections sous-cutanées d’analgésiques (50 µL, durée inférieure à 5 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents jours après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Per-opératoire Inconfort au point d'injection. Douleur post-opératoire adequatement soulagée par des analgésiques. Post-opératoire L'etat de santé des souris sera suivi quotidiennement pour les 5 premiers jours puis de manière hebdomadaire par la suite. Toute dégradation de l'etat de santé (ex: douleur refractaire au tratiement antalgique, infections, insuffisance cardiaque) sera minutieusement evalué en rapport à une grille de points limites. Les traitements adéquats seront mis en place tant que les limites ne sont pas atteintes. Dès qu'une de ces limites est atteinte, les animaux concernés seront mis à mort immédiatement.

Devenir

Toutes les procédures de ce projet sont terminales et par consequent, les souris sont mises à mort.

Remplacement

Pour respecter le principe des 3R, nous avons évalué nos hypothèses in vitro avec des cultures de cellules cardiaques et de macrophages autant que possible avant de l’étudier dans un modèle murin. Cependant, ces modèles murins sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes, que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer. Nous voulons, in vivo, comprendre les différentes interactions cellulaires, mais également tissulaires qui sont mises en jeu au cours des phénomènes de réparation tissulaire consécutifs à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la complétion de ce projet a été calculé au plus juste ajusté par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Le nombre d'animaux est ainsi calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait pour détecter un changement de 20% de la fraction d'éjection ventriculaire gauche par échocardiographie. Ces tests déterminent un nombre de 15 souris par groupe. Pour deux groupes, en supposant quelques problèmes de traitement des tissus et la mortalité inhérente à la procédure, nous estimons une taille de groupe de 15 animaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses échocardiographiques, anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et cellules cardiaques.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux seront élevés en cages enrichies avec maisonnettes, batônnets en bois et coton et avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Après la procédure chirurgicale, les animaux sont placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie antalgique sera systématiquement poursuivie en post-opératoire pendant 48 heures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs confirmés pendant les 5 premiers jours post-opératoires, puis par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Pour l’infarctus du myocarde et l’échographie, les animaux sont placés sur une plaque chauffante thermorégulée dès l’induction de l’anesthésie.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettront de comprendre le rôle des VE cardiaques dans le remodelage cardiaque après infarctus du myocarde. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 10 à 15 semaines, chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la variabilité est accrue dans le remodelage et la survie fortement réduite à la suite d’un infarctus du myocarde.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent des injections intraveineuses et intracrâniennes de molécules, puis passent chaque mois pendant dix-huit mois une batterie de tests locomoteurs (rotarod, grip test, marche sur planche à trous, open field) et une mesure de force musculaire sous anesthésie. L'objectif est de tester la correction de la faiblesse musculaire, aucun traitement n'existant pour cette maladie. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de disposer d'un modèle animal car aucun système cellulaire ne reproduit les troubles de la locomotion à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la correction des altérations locomotrices et de la force musculaire chez des souris modèles d’une maladie humaine musculaire, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA, ou maladie de Charcot), pour laquelle il n’existe pas de traitement. Cette pathologie est due à une anomalie de l’ADN qui entraine une perte des neurone moteurs, aboutissant in fine à un affaiblissement des muscles squelettiques. Ayant précédemment identifié le mécanisme de cette mort neuronale, nous souhaitons désormais développer une approche thérapeutique pour cette maladie. Plus précisément, nous souhaitons injecter en intraveineux différentes molécules thérapeutiques, que nous avons précédemment validées en modèle cellulaire, dans des souris adultes modèle de cette maladie, et ceci afin d’étudier la correction du phénotype neuromusculaire de ces animaux. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de la locomotion et une mesure de la force musculaire de ces animaux chaque mois sur une période d’environ un an. Nous espérons que cette approche nous permettra d’ouvrir une piste thérapeutique pour cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour développer une approche thérapeutique pour la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la correction de la neurodégénérescence, de la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier cette maladie. Enfin, l’analyse de la correction de la faiblesse musculaire dans ce modèle murin a un véritable intérêt pré-clinique pour développer et tester des pistes thérapeutiques pour cette maladie neurodégénérative.

Procédures

1 – Les injections en intrapéritonéale, notamment d’agents anesthésiques, requièrent moins d'une minute. 2 - Les injections en sous cutané, notamment d’agents analgésiques, requièrent moins d'une minute. 3 – Une injection intraveineuse de virus adéno associé (AAV) requiert entre 30 secondes et 1 minute par animal. 4 - Une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique requiert entre 5 et 7 minutes par animal. 5 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 18 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 10 à 15 jours selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 6 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 10 à 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 18 mois. En conclusion, chaque animal recevra à l’âge de deux mois une injection intraveineuse rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse (entre 30 secondes et une minute), puis trois semaines plus tard une injection sous cutanée d’un analgésique et une injection intrapéritonéale d’anesthésiques suivie d’une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique (d’une durée de 5 à 7 minutes). Un mois après cette injection intra-crâniale, le phénotype de cet animal sera suivi par une batterie de tests locomoteurs non invasifs (rotarod, grip test, bar test puis rotarod) répartis sur 10 à 15 jours, puis deux semaines après le dernier test, nous effectuerons une mesure de leur force musculaire sous anesthésie gazeuse en 4 à 8 minutes. Ces tests locomoteurs et mesure de force seront répétées environ chaque mois sur une période de 18 mois.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier une maladie neurodégénérative et neuromusculaire touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal ; nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices et/ou d’une faiblesse musculaire chez ces souris. Il est à noter que les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie. Concernant le nombre d’animaux étudié, des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique. Ainsi, compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et une molécule contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de cette maladie.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir les doses de molécules thérapeutiques à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique et compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et un contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de diminuer le stress et la douleur liées à la mesure de la force musculaire par stimulation électrique et aux injections intraveineuses et intracérébrales ; ces procédures expérimentales se font toutes sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement (akinésie, prostration, paralysie), réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.

Choix des espèces

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. Enfin, nous allons étudier des approches thérapeutiques sur le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet la maladie que nous étudions touche les adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois. Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la maladie étudiée.