Recherche fondamentale

614 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie rétro-orbitale sous anesthésie, puis une chimiothérapie ou un placebo, avant d'être tuées pour prélever moelle osseuse, rate et thymus. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de rechute et de chimiorésistance des leucémies aiguës lymphoblastiques T, dont les bénéfices pour les patients restent renvoyés au long terme. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'évaluer ces mécanismes dans des modèles vivants et que les cellules leucémiques ne survivent pas assez longtemps in vitro.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes agressives au pronostic réservé, notamment en cas de rechute. Elles représentent 15 à 30% des leucémies aiguës de l'enfant et de l'adulte. Les polychimiothérapies récentes ont permis d'améliorer le pronostic des leucémies aiguës, cependant 20 à 30% des patients atteints de LAL-T présentent une rechute le plus souvent réfractaire aux thérapeutiques conventionnelles et conduisent au décès des patients dans 60% des cas. Le statut mutationnel de certains gènes semble être un facteur important de ces rechutes résistantes aux thérapies. Les cellules souches leucémiques jouent également un rôle essentiel dans la progression et la rechute des leucémies. Par leur propriété d'auto-renouvellement et de quiescence, les LSC sont capables d'échapper à la chimiothérapie de 1è ligne et de régénérer le contingent leucémique, faisant le lit de la rechute. L'étude de ce compartiment cellulaire s'inscrit donc dans la continuité de ce projet, et fait l'objet ici de cet amendement. Identifier les mécanismes à l'origine de la rechute et l'acquisition d'une chimiorésistance est essentiel pour améliorer le pronostic de ces patients. Pour mener à bien ces objectifs il est dès lors indispensable d'évaluer leur impact dans des modèles vivants, seuls garants d'une reproductibilité dans ce contexte de pathologie maligne ou le micro environnement joue un rôle décisif. Dans cette perpsective, la souris immunodéprimée constitue le modèle animal le plus adapté. Par ailleurs, les cellules leucémiques de patients sont fragiles et ne peuvent être maintenues suffisamment longtemps in vitro pour y mener des tests thérapeutiques. Il est en revanche largement décrit dans la littérature scientifique que la souris est un bon modèle d'expansion des cellules leucémiques humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'étendre nos connaissances sur les mécanismes à l'origine de la rechute de LAL-T et comprendre les altérations moléculaires responsables de l'acquisition d'une chimiorésistance. A terme, ce projet contribuera à la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer les chances de guérison des patients atteints de LAL-T.

Procédures

1/ Injection de cellules leucémiques ou pré-leucémiques par voie rétro-orbitale après anesthésie générale (temps estimé < 10min par souris). Surveillance clinique et/ou biologique au moins bi-hebdomadaire et adaptée à l'état clinique des souris. 2/ Traitement des souris immunodéprimées après prise de greffe par de la chimiothérapie conventionnelle classiquement utilisée dans le cadre du traitement des leucémies aiguës humaines et comparaison avec un groupe recevant un placebo (La durée et fréquence du traitement dépendra de la molécule utilisée : quotidien à hebdomadaire pendant une durée inférieure à 6 semaines).

Impact sur les animaux

Le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Un nombre de 64 souris supplémentaires seront nécessaires pour l'amendement de ce projet, sans extension de sa durée (soit 2 années restantes). Nous serons particulièrement attentifs au bien être des animaux. Afin de réduire au maximum le risque de souffrance, les souris seont traitées dès que le taux d'infiltration sanguin leucémique sera compris entre 2 et 20% (évaluation en cytométrie en flux de façon hebdomataire via un prélèvement mandibulaire). Un tel taux d'infiltration est habituellement atteint entre 4 et 12 semaines post-greffe. Durant les protocoles expérimentaux, un suivi quotidien la première semaine, puis bi-hebdomadaire des animaux sera mis en place afin de surveiller les signes évocateurs d'une douleur. Afin de préserver le bien-être animal, nous détecterons les points limites qui conduiront à leur mise à mort (CF Points limites adaptés détaillés dans les procédures expérimentales). Concernant l'amendement, le temps de prise de greffe attendu dans les souris syngéniques est similaire au modèle de xénogreffe faisant l'objet du projet initial. En revanche, les souris utilisées pour cet amendement sont moins immunodéprimées que les souris initiales et la greffe étant syngénique, le risque potentiel pour l'animal est moins élevé pour les procédures relatives à cet amendement. Par ailleurs, aucune prédisposition à une toxicité particulière de ce modèle pré leucémique pour l'animal n'est attendue dans des conditions d'hébergement. Nous serons particulièrement attentifs au bien-être des animaux et appliqueront les mêmes règles de surveillance et d'éthique que précédemment, avec une surveillance interne quotidienne du personnel de l'animalerie.

Devenir

Mise à mort de l'animal à l'issue de chaque procédure pour récupération des tissus biologiques (moelle osseuse, rate, thymus)

Remplacement

Les expérimentations ayant pour objectifs de déterminer les mécanismes de résistance à la chimiothérapie ne peuvent pas être réalisées in vitro du fait de la forte mortalité des cellules leucémiques et doivent nécessairement être conduits in vivo dans des leucémies xénogreffées et amplifiées chez l'animal. Par ailleurs le modèle des lignées cellulaires n'est pas un reflet exact de la biologie des leucémies aiguës et ne peut donc pas être considéré comme un équivalent moléculaire fiable dans ce contexte. Pour la même raison, dans cet amendement, l'étude de la transformation leucémique de cellules immatures transduites avec un oncogène humain (ici TLX3) ne peut être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé (par test paramétrique) la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Concernant l'amendement, un nombre de 64 souris RAG2-/-gc-/- supplémentaires seront nécessaires à ce projet, sans extension de sa durée (2 années restantes). Ce nombre a été calculé en prenant en compte une probabilité proche de 100% de prise de greffe (modèle syngénique), afin d'élaborer un nombre suffisant de tumeurs et 1è et 3è génération (8 souris d'une première génération puis 4 souris de seconde génération (par première génération) puis 2 souris de 3è génération (par seconde génération)).

Raffinement

Nous serons particulièrement attentifs au bienêtre des animaux. Les souris immunodéprimées seront élevées dans un environnement répondant à un statut sanitaire de type EOPS ou SOPF et ne présenteront donc pas de phénotype dommageable dans ces conditions. Les cages sont ventilées et enrichies à l'aide de cotons, bout de bois et tunnels, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera mis en place par un personnel qualifié de l'animalerie. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques se fera sous anesthésie gazeuse par isoflurane (induction 4,5%, entretien 2,5-3%, durée totale d'environ 2 minutes). Le suivi de la leucémie sera réalisé à partir de la 3ème semaine suivant l'injection des cellules leucémiques humaines par des prélèvements sanguins (

Choix des espèces

Les modèles de xénogreffe de leucémies chez la souris sont connus et bien décrits dans la littérature scientifique, ce qui permet de nous assurer une efficacité maximale dans la réalisation de ce projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées entre 7 et 15 semaines. C'est la fenêtre d'injection qui premet d'avoir un taux idéal de greffe d'après les données de la littérature, en permettant de réaliser la procédure d'injection dans de bonnes conditions. Ce modèle de xénogreffe est particulièrement applicable à notre étude, car il permet de récapituler l'éventail des signes cliniques de la maladie et de modéliser sa progression.

700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modifiés génétiquement dès l'embryon pour exprimer des mutations cancéreuses, ils sont suivis jusqu'à douze mois et anesthésiés chaque mois pour détecter des tumeurs internes par fluorescence, afin d'étudier l'origine cellulaire de cancers du muscle de l'enfant. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer des troubles de la nage, une léthargie, des œdèmes et une incapacité à se nourrir, déclenchant la mise à mort. Il affirme que les cellules en culture ne modélisent pas l'apparition des tumeurs et que le poisson zèbre partage 80 % de ces programmes génétiques avec l'humain.

Objectifs

Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant 15 ans. Malgré des essais cliniques, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet vise à déterminer si les cancers du muscle fréquemment observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non pas seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules. Cette question est importante, car on sait que la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. In vitro, il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés, fréquemment retrouvés chez les patients atteints par ces cancers, dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Il est maintenant nécessaire de vérifier à l’aide du modèle de poisson que lorsque ces mutations sont introduites dans ces cellules neuronales, elles conduisent bien à la formation de tumeurs. L’objectif de ce projet est de pouvoir déterminer si des cellules neuronales constituent l’une des cellules d’origine des cancers du muscle chez l’enfant lorsqu’elles expriment des mutations fréquemment retrouvées dans ces pathologies. Or, on sait que la réponse aux traitements peut varier en fonction de la cellule d’origine du cancer. Le poisson est un modèle de vertébré particulièrement utile pour l’étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et de très bons outils sont disponibles pour reproduire les altérations génétiques trouvées des patients dans les cellules de poissons. Pour tester l’hypothèse d’une origine neuronale de certains cancers du muscle chez l’enfant, ces mutations seront introduites dans des embryons de poissons. Ensuite, un suivi attentif de la formation de tumeurs sera réalisé sur une durée 12 mois maximum. Le nombre de poisson a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique des résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’origine des cancers des muscles chez les enfants. Cette étape est indispensable pour adapter la prise en charge thérapeutique des jeunes patients, car la cellule d’origine des cancers impacte la réponse aux traitements.

Procédures

Pour les poissons zèbres de 5 jours à 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 3, 2 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 24. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 3. Pour les poissons zèbres de plus de 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 5 poissons, 1 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 15 minutes. Nombre maximal : 36. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 9.

Impact sur les animaux

La fréquence d'observation a été définie de manière à anticiper la détection des tumeurs tout en réduisant le malêtre animal associé à leur manipulation répétée. L'observation attentive des poissons nécessite leur transfert transitoire dans un autre bac (par groupe de 3 ou 5 poissons suivant leur âge). Les poissons seront également légèrement anesthésiés (Tricaïne methasulfonate tamponnée à pH7, 100mg/L) une fois par mois pour permettre d'observer par fluorescence, d'eventuelles tumeurs interne aux poissons. Chez les patients, aucun symptôme majeur n'est observé dans les premiers stades de la maladie en dehors de l'apparition d'une masse préférentiellement proche des muscles. De fait, certains animaux peuvent présenter des signes de malêtre dus au développement de ces tumeurs. Les signes les plus précoces comprennent des modifications de la nage, une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau, une respiration accélérée passagère ou une apathie. Les animaux qui présentent un ou plusieurs de ces signes cliniques seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 48h. En absence d’amélioration des signes mal-être listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. La présence de tumeur, le hérissement des écailles, la présence d’oedèmes, une léthargie (immobilité au fond de l’aquarium) prolongée ou une incapacité à se nourrir constituent des points limites nécessitant une mise à mort immédiate.

Devenir

En cas de mal-être, les poissons zèbres seront mis à mort. Dans le cas d'apparition de tumeurs, afin de récupérer les tumeurs, et permettre leur analyse, les poissons seront mis à mort. A la fin de la procédure (soit à 1 an maximum), les poissons seront mis à mort pour prévenir la survenu d'éventuelle altération tardive du à la procédure.

Remplacement

Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer expérimentalement les conséquences des modifications génétiques impliqués dans les maladies humaines telles que le cancer. Les cellules cancéreuses humaines en culture sont très utiles pour comprendre les mécanismes moléculaires en place lorsque le cancer est déjà établi. En revanche, elles ne représentent pas la complexité des comportements cellulaires là où la tumeur est établie, l’interaction avec les tissus sains et le reste de l’organisme. Les cellules cancéreuses en culture ne peuvent pas modéliser les étapes permettant l’apparition et l’évolution temporelle des tumeurs.

Réduction

Dans un but de réduction et en accord avec la littérature scientifique, la taille de chaque groupe a été calculée pour obtenir des résultats significtifs tout en incluant le minimum d'individus dans cette étude. Des tests statistiques seront utilisés pour s'assurer de la significativité des résultas. De plus, l’analyse des caractéristiques biologiques des tumeurs sera réalisée sur le même groupe que la mesure du taux d’incidence des tumeurs. Dans la mesure du possible, nous essaierons de grouper au maximum les manipulations génétiques de manière à mettre en commun les groupes témoins et réduire ainsi le nombre total d’animaux utilisés. Nous réaliserons en priorité le modèle transitoire (350 poissons) puis nous développerons le système constitutif (350 poissons) si besoin, et en cas d’échec du premier modèle (soit un maximum de 700 poissons).

Raffinement

Tout signe de mal-être des animaux potentiellement dus au développement de tumeurs pourront être prévenus par une surveillance attentive des poissons à la recherche de signes ou de changements de comportement généralement associés à une maladie par l’application de critères d’arrêt définis.

Choix des espèces

Le poisson zèbre représente un bon organisme modèle pour l'étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et nous disposons de très bons outils pour reproduire les altérations génétiques trouvées dans les tumeurs humaines spécifiquement dans certains types de cellules dans les poissons adultes. D'autres espèces d'animaux pourraient être envisagées comme alternative au poisson zèbre, tels que Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, mais ce sont des invertébrés dont de nombreux organes diffèrent considérablement de l’Homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il est un vertébré moins évolué et parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique pour tester l'influence de gènes particuliers sur le développement tumoral. Les micro-injections de vecteurs ADN seront réalisées dans des embryons au stade d’une cellule. L’étude de la survenue des tumeurs primaires sera faite dans des poissons juvéniles ou adultes (âge compris entre 4 et 52 semaines) en fonction de la vitesse d’apparition des tumeurs.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent cinq injections intraveineuses et sont soumises à quatre tests comportementaux non précisés, pour étudier le rôle des lymphocytes B. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et ne décrit qu'un stress bref lié aux injections et aux contentions. Il justifie le recours à la souris par la disponibilité de lignées transgéniques reproduisant la maladie.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle des lymphocytes B dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la MA.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections par voie intraveineuse (5 injections espacées de deux semaines) et des tests comportementaux (au nombre de 4). Chaque injection intra-veineuse durera au maximum une minute (préhension + immobilisation + injection).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effets indésirables sur les animaux car les animaux développeront une maladie modérée. Dans ce modèle bien caractérisé, les souris développent une maladie grave à l'age de 12 mois et donc bien après la période de leur utilisation dans notre étude. Tous les animaux seront mis à mort à l'age de six mois maximum. En revanche, les animaux pourront développer des effets indésirables au cours des injections et des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indisérables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront immobilisés pour être injectés par voix intra-veineuse ou lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Nous avons alors établi des points limites afin de limiter au maximum ces éffets indésirables.

Devenir

AMENDEMENT: Les animaux que nous utilisons développent spontanément une maladie grave à l'age de 12 mois. Tous les animaux seront donc utilisés et mis à mort au plus tard à l'age de 6 mois.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle des cellules B dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 semaines seront utilisées.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la patte puis des injections de chimiothérapie, pour distinguer le rôle de deux types de cellules immunitaires dans la réponse au cisplatine. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité et l'alimentation, provoquer une perte de poids et des nécroses cutanées. Il affirme que la complexité du cancer ne peut pas être appréhendée in vitro et renvoie les retombées pour les patients au long terme.

Objectifs

Si l’impact des chimiothérapies sur les cellules tumorales est connu, les conséquences d’un tel traitement sur les cellules du système immunitaire restent cependant à découvrir. Nos données préliminaires montrent qu’une chimiothérapie peut attirer le système immunitaire dans la tumeur permettant ainsi une meilleure efficacité du traitement contre le cancer. Ce projet consiste à étudier le rôle de 2 types de cellules immunitaires dans la réponse à une chimiothérapie afin de discriminer leur importance individuelle. Pour cela, deux types de souris génétiquement modifiées, ne possédant pas l’une ou l’autre des cellules d’intérêt seront comparées à des souris ayant les deux types de cellules et l’on observera l’efficacité de la chimiothérapie sur la croissance tumorale dans ces différentes souris ainsi que l’évolution du système immunitaire au sein de la tumeur. Cela nous permettra de comprendre l’importance de nos deux cellules immunitaires d’intérêt dans l’efficacité de la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Une augmentation de la réponse immunitaire au sein même de la tumeur via l'augmentation de la présence du système immunitaire pourrait avoir d'importants impacts dans le ralentissement de la croissance tumorale. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 10 jours plus tard, au maximum 3 injections Intrapéritonéale (IP) de 1 minute, réparties sur une semaine et certaines souris auront également 2 Intra veineuse (IV), de 1 minute chacune environ, espacée de 3 jours, la première injection IV ayant lieu le même jour que la première injection IP.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis au maximum à 2 injections IV de 1 minute, 1 injection sous-cutanée de 1 minute et 3 injections IP de 1 minute, sous anesthésie, répartie sur plusieurs jours. Les administrations IV et SC ne sont pas connues pour être particulièrement douloureuses. L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. En réalisant des injections en sous-cutané, il est possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections SC (cellules tumorales) et IP (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une section définitive du nerf sciatique d'une patte sous anesthésie, qui provoque une atrophie et une perte de force du membre, pour étudier la régulation des connexions entre le cerveau et le muscle. Le porteur décrit une chirurgie modérément invasive et affirme que la souris peut continuer à se déplacer sur ses quatre pattes. Il conclut que l'étude ne peut être conduite que sur un "organisme entier", aucun modèle in vitro ne reproduisant la communication entre motoneurones et muscle.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment est régulée la maintenance des connections cerveau-muscle. Le muscle squelettique est le plus grand organe du corps humain, il représente 40 à 50% du poids corporel. Il est essentiel pour la mise en mouvement du squelette, le maintien de la posture, la respiration, la thermogenèse et la régulation du métabolisme des lipides et des glucides. Cette capacité à bouger et à respirer nécessite une communication entre le cerveau et le muscle. Elle a lieu via des synapses hautement spécialisées qui contrôlent la contraction musculaire. Un dysfonctionnement de ces connections est la cause de faiblesse musculaire, d’atrophie musculaire voir de paralysie et est impliqué dans plusieurs pathologies telles que les myasthénies ou la sclérose latérale amyotrophique. Comprendre comment est régulé la formation et la maintenance de ces synapses est donc d’un grand intérêt.

Bénéfices attendus

Des dysfonctionnements de connections verceau-muscle sont observées dans différentes maladies neuromusculaires. L’apport de connaissances fondamentales est un prérequis pour comprendre la physiopathologie des maladies neuromusculaires et permettre le développement de thérapie à plus long terme.

Procédures

Les animaux subiront deux injections : une sur animal vigile pour l’anesthésie générale (durée une minute) et une sur animal anesthésié pour l’analgésie per et post-opératoire (durée une minute). Les animaux subiront une intervention chirurgicale d’une durée de 15 minutes pour réaliser une section définitive du nerf sciatique d’une seule patte. En de douleur post-opératoire, les animaux pourront recevoir une autre injection pour l’analgésie (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

Une chirurgie de dénervation de la patte postérieure gauche sera réalisée. Cette dénervation conduit à une atrophie des muscles de la patte observable à partir de 14 jours, donc à une perte de force musculaire sur le membre. Comme la souris est quadrupède, cette intervention ne l’empêche pas de se déplacer, de grimper dans la cage et de s’alimenter. La technique de dénervation définitive est une chirurgie modérément invasive et parfaitement maitrisée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation afin de collecter tous les muscles squelettiques des pattes postérieures. Ces tissus prélevés serviront pour les analyses de biologie moléculaire et d’histologie pour décrypter les acteurs moléculaires responsables de l'homéostasie musculaire.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite que sur un organisme entier car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le système complexe de communication entre les motoneurones et le muscle. La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères.

Réduction

Un effectif de n=20 animaux par point de collecte sera suffisant pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Après obtention des résultats expérimentaux, les données seront analysées à l’aide d’un test statistique non paramétrique. L’ensemble des muscles des deux pattes postérieures seront collectés. La patte droite non dénervée servira de contrôle contralatéral.

Raffinement

Pendant toute la chirurgie, les animaux seront sous anesthésie générale et locale, coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d’éviter tout dessèchement de l’œil. Après la chirurgie les animaux recevront pendant 3 jours un traitement analgésique et antalgique. Pour une meilleure récupération après l’anesthésie générale, les animaux seront stabulés une nuit en armoire chauffante. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et l’eau derrière l’intervention chirurgicale, des croquettes et de l’eau gélifiée seront déposés sur le sol de la cage. Pendant les 5 jours suivant l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés individuellement quotidiennement afin de vérifier la bonne cicatrisation de la suture, et de traiter la douleur avec des antalgiques adaptés en cas de besoin ou d’euthanasier l’animal en cas de souffrance non jugulée, appréciée par des critères de signes cliniques, d’aspect et de comportement. Toutes les souris de la même cage seront opérées le même jour afin de maintenir le groupe social.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d’animaux génétiquement modifiés conduisant à l’obtention de modèle dans lequel un ou plusieurs gènes peuvent être rendus non fonctionnels. De plus, le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet donc des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles. Les souris seront utilisées à l’âge adulte mature entre 12 et 13 mois car le laboratoire étudie les mécanismes régulant l'homéostasie musculaire. L’âge de 12 mois représente à peu près le milieu de la vie pour une souris.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Saines, elles reçoivent trois injections destinées à produire des anticorps contre des peptides liés à la spermatogenèse, avec prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des lésions ou des ulcérations cutanées et les prélèvements des saignements et des hématomes. Il décrit la souris comme le "meilleur modèle" pour induire l'immunisation et rattache le projet à une étude internationale sur les effets du COVID sur la fertilité.

Objectifs

L’auto-immunité est la conséquence d’un système immunitaire qui s’emballe et dépasse son rôle de défense contre les agents extérieurs pour s’attaquer aux propres cellules de l'organisme. Les agents extérieurs peuvent être des bactéries, champignons, virus. Ainsi l'épidémie de COVID-19 a incité les scientifiques, et en particulier les immunologistes, à étudier l'impact de l'infection par le SARS-CoV-2 sur la population humaine mondiale. La principale préoccupation est de savoir si l'infection peut déclencher une maladie auto-immune. Les anticorps formés contre le SARS-CoV-2 se lieraient aux protéines des tissus humains, entraînant une réactivité auto-immune. La présente étude porte sur l'appareil reproducteur. Les tissus du système reproducteur sont très vulnérables aux infections virales, de plus les ovaires et les testicules expriment des récepteurs qui servent également a la voie par laquelle le virus pénètre dans les cellules. Par ailleurs, plusieurs études ont indiqué que les patients atteints de COVID-19 produisent des auto-anticorps et qu'une partie d'entre eux développent des troubles auto-immuns; à cet égard, une altération de la spermatogenèse a été signalée dans des études menées sur des patients atteints de COVID-19. Notre première analyse a permis d'identifier 4 sequences (peptides) communes liées à la spermatogenèse et la protéine Spike du SARS-CoV-2. Nous avons également découvert que des patients masculins et féminins affectés par le COVID-19 développaient des anticorps contre 2 des 4 peptides sélectionnés liés à la spermatogenèse, soulignant l'apparition de nouveaux troubles de la fertilité dans la population. Le but de ce projet est la production d'anticorps anti-peptides sur des souris saines afin de vérifier l'impact sur la fertilité

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur la population en général. Cette étude nous permettra de produire des anticorps qui seront utilisés dans un projet plus vaste afin de comprendre leur rôle.

Procédures

Trois injections et les prélèvement sanguins sont réalisées sur animal anesthésié. Temps : injections : 1 minute/souris Prélèvement sanguin : 2 minutes/souris

Impact sur les animaux

Les souris peuvent développer des lésions cutanées ou des ulcérations au niveau de la peau ou du muscle. Le prélèvement de sang peut provoquer des saignements excessifs et des hémorragies sous-cutanées.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la prodédure pour prélèvement.

Remplacement

Le projet actuel constitue la phase finale d'une large étude internationale à grande échelle qui a commencé par une analyse visant l'identification de peptides partageant des séquences similaires avec la protéine Spike du SARS-CoV-2 et les protéines liées à la spermatogenèse. Ensuite, nous avons démontré la réactivité des anticorps des sérums des patients COVID-19 envers lesdites protéines/peptides liées à la spermatogenèse par des tests in vitro (sérums collectés de divers centres cliniques internationaux). L'objectif du projet actuel est à présent de produire des anticorps contre les peptides caractérisés et de pouvoir étudier leur effet sur un organisme complexe. Cela nécessite d’induire une réponse immunitaire contre ces peptides, ce qui ne peut être généré que chez ou à partir d'animaux vivants et de prélèvements de tissus à la fin del la procédure.

Réduction

Le nombre d'animaux employés est basé sur les travaux rapportés dans la littérature. Il a été établi pour nous permettre d’obtenir des anticorps en quantité suffisante pour poursuivre vos travaux.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un groupe social et dans des cages enrichies (matériaux de nidation, tubes). L'expérience est arrêtée lorsque l'analyse de sang confirme la présence d'anticorps. Nous avons établi des points-limites nous permettent de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme, et leurs systèmes physiologiques schématisent les observations faites chez l'homme. Aujourd'hui, la souris représente le meilleur modèle pour induire l'immunisation. Des souris âgées de 6 à 8 semaines seront recrutées. À cet âge, les souris sont considérées comme des adultes et leur système immunitaire est pleinement développé.