Recherche fondamentale

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans le cerveau une injection de neurotoxine détruisant les neurones dopaminergiques pour reproduire des symptômes de la maladie de Parkinson, puis subit jusqu'à sept tests moteurs et cognitifs, de rotation, d'agilité, de mémoire ou de force de préhension. Le porteur indique que la neurotoxine provoque une réduction de mobilité et une forte perte de poids, et qu'environ 33 % des souris ne survivent pas aux trois jours suivant la chirurgie. Il affirme que ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles reposent sur un modèle murin de la maladie.

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par une dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substantia nigra (SN) et une dérégulation de l'activité des interneurones dans le cortex moteur primaire. Ce projet vise à évaluer l'impact de cette dégénérescence sur l'expression des gènes, les marques épigénétiques, et le statut de maturation des interneurones du cortex moteur. Nous utiliserons un modèle de souris pour la maladie de Parkinson qui consiste en une ablation unilatérale des neurones dopaminergiques de la SN. Bien que ce modèle ne récapitule pas toutes les caractéristiques de la maladie de Parkinson, la perte importante de ces neurones entraîne plusieurs symptômes de la maladie de Parkinson, notamment des déficits moteurs, qui sont quantifiables. Les objectifs majeurs du projet sont d’analyser les changements moléculaires et physiologiques dans les interneurones du cortex moteur primaire suite aux lésions, de comparer les changements dû au sexe, et d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables dans ces interneurones afin de restaurer une activité normale des neurones moteurs. Ce projet impliquera 1680 animaux et ne peux pas être remplacé par d’autres modèles. Plusieurs analyses seront effectuées sur chaque animale afin de réduire leur nombre, et des mesures spécifiques assureront le minimum de nuisances sur le bien-être des animaux. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour son traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet analysera les changements moléculaires et physiologiques dans les interneurones du cortex moteur primaire de la souris adulte en réponse aux lésions de la substantia nigra comme modèle de la maladie de Parkinson. Ce projet permettra d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables dans ces interneurones pour restaurer une activité normale de neurones moteurs, et d’identifier les diffénces dû au sexe. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement de cette maladie.

Procédures

Une injection stéréotaxique intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 1 heure et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront implantés avec une canule intracérébrale ; cette procédure chirurgicale stéréotaxique sera effectuée sur des animaux anesthésiés, dure environ 1 heure, et sera effectuée une seule fois. Les animaux seront soumis au test de tendance à la rotation qui durent 10 minutes et sera répété 4 fois. Les animaux seront soumis 2 fois à un test de capacité motrice qui durent 3 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau d'anxiété et dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test d'agilité qui dure 2 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test de mémoire spatiale qui dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de capacité sensorimotrice qui dure 5 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de force de saisie qui dure 3 fois 1 minute. Certains animaux seront soumis à un seul test de force neuromusculaire qui dure 3 fois 1 minute..

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale. L’injection de la 6-OHDA (neurotoxine catécholaminergique) peut avoir des effets neurotoxiques qui durent plusieurs jours, entraînant une réduction de mobilité et une perte de poids importante ; le rétablissement complet est attendu au bout de 2 à 3 semaines. Environs 33% des souris ne survivent pas les 3 premiers jours suivant la chirurgie. Les tests de comportement et leur multiplicité peuvent provoquer du stress et de la fatigue chez les animaux. Ils seront soumis à un maximum de 7 tests différents sur une période de 5 jours afin d'évaluer divers aspects de leur comportement locomoteur.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera collecté afin de permettre des analyses histochimiques et biochimiques.

Remplacement

Nos recherches sur les effets de la dégénérescence des neurones dopaminergiques nécessitent des souris pour comprendre comment cela impact les circuits cérébraux implicants notament les interneurones du cortex moteur. Nous utilisons la souris comme modèle pour s'appuyer sur les résultats de recherches antérieures. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent d’un modèle murin de la maladie de Parkinson.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses (comportement, histologie, biochimie) sur chaque souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec une lampe chauffante jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine pour éviter le stress de l'isolement. Pour évaluer les points limites, les souris seront inspectées quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciales), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront un régime alimentaire enrichi. Les animaux seront euthanasiés si aucune amélioration n'est constatée après 2 jours de traitement ou si la perte de poids dépasse 20% du poids de départ.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la maladie de Parkinson. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet implique un modèl de la maladie de Parkinson qui nécessite des souris adultes. Les lesions de la subsantia nigra seront effectuées sur des souris agées de 60 jours, lorsques elles sont considérées comme jeunes adultes. Les injections stéréotaxiques sont effectuées 3 semaines après une lesion afin de respecter une période de récuperation. Le comportement sera évalué pendant 2 sessions : 1) vers 2 semaines après lesion et 2) vers 3 semaines après injections stéréotaxiques (entre 100 et 120 jours).

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit par chirurgie une greffe de cellules tumorales directement dans l'organe visé, prostate ou autre, puis passe deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie pendant six semaines, avant la mise à mort pour prélèvement des tissus. Le porteur indique que la chirurgie et la croissance des tumeurs peuvent provoquer des douleurs. Il justifie le choix de la souris par sa proximité génétique avec l'humain mais aussi par ses "faibles coûts", ses cycles de reproduction courts et sa "facilité de manipulation".

Objectifs

Le cancer touche 382000 personnes par an et avec 157400 décès annuel, soit environ 40 % du total, il représente la première cause de mortalité en France. C'est surtout la première cause de mortalité prématurée (avant 65 ans). Un homme sur deux et une femme sur trois sont concernés, avec des localisations différentes selon le sexe : le cancer de la prostate est de loin le cancer le plus fréquent chez l'homme avant le cancer du poumon et le cancer colorectal, et, chez la femme, le cancer du sein est le plus fréquent avant le cancer colorectal et le cancer du poumon. L'incidence globale du cancer augmente chaque année en raison du vieillissement de la population, de la généralisation des techniques d’exploration et de dépistage, et de causes environnementales. Grâce aux progrès de la prévention, du diagnostic précoce et de la prise en charge, le risque de mourir d'un cancer a diminué depuis 25 ans. Cependant, il n'en demeure pas moins un fléau déclaré priorité de santé publique. Les efforts de développement de nouvelles thérapeutiques doivent donc se poursuivre. Les deux premiers critères mis en jeu dans la sélection de nouveaux médicaments antitumoraux sont, d’une part, l’originalité du mécanisme d’action et, d’autre part, l’activité antitumorale expérimentale dans un modèle animal in vivo. Ce projet s'intéresse au suivi du développement tumoral par une approche d'imagerie non-invasive afin d'évaluer l'efficacité de molécules thérapeutiques chez le petit animal (souris). Il aura pour objectif (i) d'évaluer l'apport des modalités d'imagerie pour différents modèles pathologiques, et (ii) de d'évaluer l'efficacité thérapeutique des molécules thérapeutiques testées. Ce projet permettra également une détection précoce des tumeurs (avant qu'elles ne soient palpables), le suivi de la progression tumorale au cours du temps (croissance / invasion / dissémination), et la quantification 2D et/ou 3D des masses tumorales (tumeurs primaires et métastases).

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales en orthotopique c'est à dire sur le site d'intérêt de la pathologie (au niveau de la prostate dans le cas du cancer de la prostate par exemple). Cette procédure induit de la chirurgie et s'effectue sous anesthésie générale gazeuse (durée d'intervention

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales pour l'implantation des cellules tumorales en orthotopique pourront entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h, c'est pourquoi une analgésie de type buprénorphine sera systèmatiquement appliquée en post-chirurgical pour pallier à une éventuelle souffrance. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications au niveau des zones incisées, une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place et l'anial placé sous surveillance renforcée. En cas d'infection majeure, l'animal sera soumis à un traitement par antibiothérapie. Une observation clinique quotidienne sera également mise en place afin d'évaluer l'état général des animaux opérés. L'administration de traitements par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée et les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire un stress physique aux animaux. L’apparition des tumeurs induites pourra également induire un stress physique et de la douleur. Ces nuisances potentielles nous conduisent à classer ces procédures en classe modérée.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet auront tous subi une induction de tumeur par injection orthotopique de cellules tumorales. Ils seront tous mis à mort à l'issue des différentes procédures d'imagerie mises en œuvre afin de récupérer les différents tissus pour analyses.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant remplacer complètement la tumeur dans son microenvironnement et son évolution au sein d'un organisme vivant (prolifération, invasion, dissémination). Il existe cependant des modèles d'étude de clonogénicité, de migration et d'invasion cellulaires in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal

Réduction

Les molécules testées sur les animaux lors de ce projet ont déjà fait l'objet de tests sur des cellules en culture afin d'en vérifier l'efficacité sur les cellules cancéreuses implantées chez les animaux. L’exploration par imagerie permettra d’effectuer un suivi longitudinal des animaux (mesures répétées à intervalles réguliers) dans le but de diminuer le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation également d’autres approches scientifiques complémentaires après la mise à mort de l'animal permettra également d'optimiser au maximum les résultats obtenus. Les résultats obtenus sont analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63/UE). Nous veillerons à ce que chaque caged'hébergement bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel etc...). Les animaux seront anesthésiés pour chaque procédure d'imagerie et une attention particulière sera apportée au maintien de leur température corporelle pendant l'anesthésie. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, l'utilisation d'analgésique sera mise en place ainsi que l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel et des critères d'arrêt de souffrance.

Choix des espèces

Les petits mammifères, notamment la souris, sont à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et se sont imposés comme modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules car, par la présence de gènes équivalents chez l'homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et apportent de nombreuses connaissances sur les relations entre les cellules tumorales et les tissus normaux, notamment le système immunitaire. Ils permettent également l'étude des phénomènes de vascularisation tumorale et de dissémination métastatique, et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de noter que les molécules utilisées actuellement en clinique, notamment en chimio- et immunothérapie, ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~4 à 8 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Au-delà de cet âge, les tumeurs se développent plus lentement. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

61 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente-huit reçoivent une greffe de tumeur mammaire, puis des injections de paclitaxel qui provoque une hypersensibilité au toucher et au froid, mesurée par des tests répétés pendant trois semaines, et toutes subissent une chirurgie cutanée avant la mise à mort. Le porteur affirme qu'en dehors des tests les souris ne montrent aucun signe de souffrance ni de perte de poids, tout en reconnaissant que la croissance de la tumeur peut endommager les tissus et provoquer des douleurs. Le projet vise à ajouter une tumeur aux modèles existants de neuropathie chimio-induite, un outil destiné à de futurs tests de molécules.

Objectifs

Les neuropathies périphériques associées de douleurs neuropathiques induites par les agents anticancéreux neurotoxiques représentent une des causes principales de l’altération de la qualité de vie des patients survivant à un cancer. Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie (NPIC) sont très fréquentes, plus de 60 % des patients sous chimiothérapie anticancéreuse, et impactent fortement la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie, pouvant conduire à une diminution des chances de survie des patients. A ce jour, il n’existe aucun traitement preventif contre les NPIC. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pharmacologiques spécifiques des NPIC représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge des patients traités par chimiothérapie anticancéreuse. Un modèle de neuropathie sensitive induite par le paclitaxel, un agent anticancéreux communément utilisé dans la prise en charge du cancer du sein triple négatif, a déjà été développé et caractérisé, et a permis de mettre en évidence les propriétés neuroprotectrices de plusieurs molécules. In vitro, l’effet de l’interaction bénéfiques des molécules neuroprotectrices sur l’activité cytotoxique des chimiothérapies, ainsi que leur potentiel anticancéreux propre a été mis en évidence sur des lignées cancéreuses humaines. Fort de ces résultats, nous souhaiterions poursuivre dans un modèle animal plus intégratif impliquant les phénomènes de douleur et d’inflammation. Aucun modèle animal de neuropathie sensitive induite par le paclitaxel et associée à un cancer n’a encore été développé. Un tel modèle permettrait de mieux comprendre le lien entre le cancer et le développement des neuropathies associées à la chimiothérapie neurotoxique et d’évaluer l’effet de molécules candidates neuroprotectrices sur les douleurs induites par la chimiothérapie, ainsi que sur l’activité antitumorale de la chimiothérapie. L’objectif est de mettre en place et caractériser un modèle syngénique de cancer de sein sensible au paclitaxel, et dévellopant une neuropathie induite par le paclitaxel. Le modèle syngénique (greffe de même fond génétique que l'hôte), contrairement au modèle de cancer humain xénogreffé, permet de conserver une immunocompétence. L’intérêt est de pouvoir mettre en évidence l’implication du système immunitaire et de l’inflammation dans le développement des neuropathies chimio-induites en présence d’un cancer.

Bénéfices attendus

L’intérêt principal de ce modèle de neuropathie chimio-induite est la présence de la tumeur. Ce modèle fournira un outil pour la mise en place de nouvelles thérapeutiques neuroprotectrices dans un contexte de chimiothérapie néoadjuvante neurotoxique associé à une chirurgie. Les modèles murins actuels de neuropathie chimio-induite sont exempts de tumeur. Le modèle proposé permettra d’évaluer l’impact de la présence d'une tumeur sur l'évolution de la neuropathie chimio-induite. Ce modèle permettra également, dans des porjets futurs, de valider si nos molécules neuroprotectrices, interagissent avec l’activité anti-tumorale du paclitaxel dans un modèle intégré.

Procédures

Trente huit souris recevront une injection sous-cutanée au niveau du flanc droit de cellules cancéreuses murines. Ving-trois souris recevront une injection sous-cutanée au niveau du flanc droit de 200 µL de sérum physiologique. Cette étape sera réalisée sous anesthésie légère à l'isoflurane pour l'ensemble des animaux. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisée à l'aide de la mesure au pied à coulisse de la tumeur 3 fois par semaine, sous anesthésie légère à l'isoflurane, seuls les animaux ayant reçu des cellules cancéreuses subiront cette intervention. Ving-neuf animaux recevront 4 injections intrapéritonéales de chimiothérapie (1 injection tous les deux jours pendant 7 jours), et les animaux contrôles recevront 4 injections intrapéritonéales de sérum physiologique selon le même shéma. L'ensemble des animaux (soit 61) subiront une chirurgie cutanée, avec résection de la tumeur sous-cutanée pour les animaux ayant une tumeur et ouverture des plans cutanés pour les animaux sans tumeur. Durant la procédure chirurgicale, les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane et recevront une injection sous cutanée de lidocaïne en pré-médication et une injection sous cutanée de buprénorphine en post-médication. L'ensemble des animaux sera soumis à deux test comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et l'autre la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 21 jours environ.

Impact sur les animaux

La neuropathie périphérique induite par le paclitaxel, un agent anticancéreux, se manifeste chez l'Homme par des troubles de la sensibilité, des douleurs neuropathiques ou des faiblesses. Notre équipe a développé et caractérisé chez la souris un modèle de neuropathie induite par le paclitaxel dans lequel nous observons l'apparition d'une hypersensibilité tactile et d’une hypersensibilité au froid en réponse à un stimulus. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluées). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu du paclitaxel ont un comportement similaire aux animaux contrôles et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. La croissance de la tumeur peut générer des nuisances telles que des dommages aux tissus environnants, induissant des douleurs et de l’inconfort, le développement potentiel de métastases. Les souris peuvent souffrir de faiblesse et de déficience physique en raison de la croissance tumorale et de la propagation de la maladie. Les points limites permettront de limiter au maximum ces nuisances.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées au paclitaxel et au développement de la tumeur seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle qui suit le protocole d'injection des agents anticancéreux le plus proche de celui utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet des molécules neuroprotectrices sur les neurones sensoriels humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensoriels humains, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par le paclitaxel (utilisé en chimiothérapie) ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse. De même, l’effet de nos molécules neuroprotectrices sur l’activité cytotoxique du paclitaxel a été évalué in vitro sur des lignées cancéreuses humaines.

Réduction

Le nombre de 10 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé avec un test statistique spécifique qui estime un nombre total de 32 animaux (avec 9 mesures de la sensibilité), soit 8 par groupes (en estimant une prise de tumeur de 100 %). L'analyse statistique sera réalisée à l'aide d'un logiciel dédié. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements de tissus seront effectués sur chaque animal mort. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote (n = 3) pourront être utilisés pour l'analyse statistique de l'étude principale et ainsi permettre d’augmenter le nombre d'animaux de l'étude principale.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seuls des test d'évitements seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la molécule de chimiothérapie doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôles pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal. Les animaux seront anesthésiés légèrement pendant l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses et à chaque contrôle de la croissance tumorale au pied à coulisse. Pendant la chirurgie, les animaux seront profondément endormis par anesthésie gazeuse. Une anesthésie local sera réalisée au niveau du site de la tumeur avant résection. Un onguent ophtalmique sera appliqué durant l’anesthésie afin d’éviter un dessèchement oculaire. Une injection sous-cutanée d'analgésique sera réalisée avant le réveil, afin de diminuer les douleurs post-opératoires et faciliter la récupération. La température corporelle sera maintenue tout au long de la chirurgie à l’aide d’un tapis chauffant, puis à l’aide d’une lampe chauffante durant la phase de réveil.

Choix des espèces

Ces modèles murins de neuropathie induites ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Le choix de la lignée de cellule cancéreuse murine et de la souche de souris a été déterminé pour limiter les risques de réaction immunitaire et de rejet. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.

Pour comprendre le rôle de l'exportine 7, associée à la schizophrénie, dans la maturation des cellules du cerveau, 1 911 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements. Des femelles gestantes sont opérées pendant 45 minutes sous anesthésie générale pour une électroporation in utero, puis les souris transgéniques ou issues des embryons électroporés passent 6 h 40 de tests de comportement répartis sur un mois. L'anesthésie peut entraîner dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire ou un arrêt cardio-respiratoire, et la chirurgie un risque d'infection. Le porteur attend des effets sur la mémoire de travail, l'anxiété et la mémoire sociale, sans nommer les tests qui doivent les mesurer.

Objectifs

Des études récentes montrent que les mutations de certains gènes augmentent considérablement le risque de schizophrénie, une pathologie invalidante qui touche environ un pour cent de la population adulte et se caractérise notamment par des idées délirantes, un retrait social, des difficultés de concentration et de planification. L’ensemble de ces symptômes de la schizophrénie sont mal traités par les médicaments actuellement disponibles, et les effets secondaires de ces traitements sont importants. L’impératif de trouver des traitements efficaces implique de mieux comprendre les fondements neurobiologiques de la schizophrénie. Bien que rares, les mutations génétiques qui confèrent un risque fortement accru de développer la schizophrénie permettent d’identifier des mécanismes neurobiologiques impliqués dans la pathologie.

Bénéfices attendus

La schizophrénie est une pathologie courante (500 000 à 600 000 patients en France) et très invalidante. Les traitements pharmacologiques de la schizophrénie traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Les grandes classes d’antipsychotiques et leurs modes d’action ont très peu évolué au cours des 50 dernières années. Le manque de progrès dans le développement thérapeutique est en grande partie une conséquence de notre compréhension limitée des troubles moléculaires sous-jacents. Très récemment, des mutations rares mais pénétrantes (qui augmentent très fortement le disque de la pathologie) dans certains gènes spécifiques ont été identifiées. Ces mutations sont très informatives car 1) elles ciblent un gène donné et 2) elles peuvent être modélisées chez l’animal. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en modifiant l’expression d’un gène impliqué dans la schizophrénie dans les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont pertinents pour comprendre les mécanismes de la schizophrénie, et possiblement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

1) Femelles gestantes : chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur). Injection d’un composé par voie intrapéritonéale (5 minutes) 2) Souris transgéniques ou issues d’embryons électroporés : Tests de comportement (6h40 en tout, répartis sur un mois). Une euthanasie sera réalisée selon une méthode réglementaire, permettant les prélèvements et analyses ultérieurs.

Impact sur les animaux

La perte d’expression du gène étudié par électroporation in utero sera localisée uniquement dans le cerveau au niveau du cortex frontal. De ce fait, les phénotypes comportementaux liés à la perte d’expression devraient affecter sélectivement des comportements dépendants du cortex frontal (mémoire de travail, anxiété, mémoire sociale). Dans le cadre de la chirurgie, des nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. La chirurgie peut induire un risque infectieux et de douleur associée à l’infection. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire. L’injection intrapéritonéale implique une contention et donc un stress momentané. Un stress léger lié à la découverte de l’environnement du test des différents tests de comportements est attendu.

Devenir

Pour chaque procédure, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie psychiatrique, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, notre étude de l'impact de la diminution d’expression d’un gène associé à la schizophrénie sur le fonctionnement du cortex nécessite d'utiliser des animaux pour pouvoir tirer des conclusions comportementales. Pour ces raisons, seule l’utilisation d’animaux permet d’aborder les mécanismes de régulation des fonctions corticales dans le cadre de cette étude. Cependant, notre laboratoire, dans le cadre de projets portant sur le même thème (bases neurobiologiques de la schizophrénie) utilise aussi des modèles de cellules pour des caractérisations d’effets génétiques.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance.

Raffinement

Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans une pathologie humaine. Ce choix est aussi dicté par la possibilité d’effectuer chez la souris des manipulations qui permettent de cibler une population neuronale générée à un point précis du développement prénatal. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal prénatal sont des embryons à un stade de développement embryonnaire qui permet d’étudier à la fois les conséquences de la modification d’expression du gène étudié sur la prolifération et sur la migration des neurones immatures. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal posnatal sont des souris juvéniles (15 à 25 jours) ou jeunes adultes (60 à 100 jours).

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit de la vincristine, un anticancéreux qui provoque une hypersensibilité douloureuse au toucher, mesurée par l'application de filaments sous la patte à plusieurs reprises, avant que les animaux soient tués pour l'analyse des nerfs. Le porteur affirme que les souris ne présentent en dehors des tests aucun signe de souffrance ni de perte de poids, et teste un composé censé prévenir cette neuropathie. Les bénéfices avancés, un futur essai clinique chez des patients sous chimiothérapie, sont renvoyés au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hépatotoxicité. Dans le domaine de l’onco-hématologie, la vincristine, un agent anticancéreux commumément utilisée pour la prise en charge des lymphomes, constitue une des chimiothérapies les plus neurotoxiques et est responsable de la neuropathie induite par la vincristine, caractérisée notamment par l'apparition d'une hypersensibilité tactile douloureuse. Cette complication impacte autant la qualité de vie des patients que la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de telles stratégies neuroprotectrices constitue un enjeu de santé publique. Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Il a déjà été démontré que la modulation pharmacologique des récepteurs à l’angiotensine II, permettait d’exercer un effet neuroprotecteur dans plusieurs modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Certains éléments du système rénine angiotensine, peu étudiés, pourraient jouer un rôle important dans les phénomènes de neuroprotection/neurorégénération du nerf périphérique. L’activation d'un récepteur du systéme rénine-angiotensine présenterait des propriétés analgésique et neurorégénérative au niveau du système nerveux périphérique. Nous supposons que l'activation de ce récepteur par un traitement préventif pourrait également avoir des effets neuroprotecteurs en l’administrant avant la chimiothérapie. A court terme, nous nous attendons à ce que ce traitement préventif améliore la sensibilité tactile chez des animaux ayant reçu de la vincristine et présentant une hypersentibilité tactile, et restaure/prévienne également les altérations morphologiques des tissus du système nerveux sensitif induites par la chimiothérapie. A plus long terme, nous espérons réaliser la même étude sur nos modèles de neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine, deux autres agents anticancéreux neurotoxiques, avec un effet bénéfique attendu du traitement préventif sur les troubles sensitifs et les atteintes nerveuses induites par les chimiothérapies. La mise en évidence d’un effet neuroprotecteur du traitement préventif dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur le développement des neuropathies induites par la chimiothérapie.

Procédures

Chaque animal (soit 100 animaux) recevra une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours. Sur les 100, 35 animaux subiront une injection i.p. le matin du traitement préventif puis une injection i.p de vincristine l'après-midi. Sur ces 35 animaux, 10 recevront en plus une injection sous-cutanée d'un bloqueur une heure avant l'i.p. du traitement préventif. L'ensemble des animaux sera également soumis au test des filaments qui permet d'évaluer le dégré de sensibilité tactile, une fois avant le début des traitements puis à J1, J3 et J7. L'injection intrapéritonéale a été privilégiée par rapport à l'injection intra-veineuse. Les injections seront répétées tous les jours pendant 7 jours, ainsi la répétition des injections sera plus aisée en intrapéritonéal qu'en intraveineux. La pose d'un cathéter a été exclu afin de garantir une liberté de mouvement totale à l'animal nécessaire pour le test comportemental. L'injection du bloqueur, qui n'est pas un produit irritant, se fera en sous-cutanée, afin de ne pas dépasser le nombre de deux injections i.p. par jour.

Impact sur les animaux

Nous avons déjà dévellopé et caractérisé le modèle de neuropathie induite par la vincristine. Dans ce modèle, nous observons l’apparition d’une allodynie mécanique suite à l’administration de vincristine. Cette allodynie se traduit par une hypersensibilité en réponse à un stimulus focalisé qui est l’application d’un filament sur la voute plantaire. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluée). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu de la vincristine présentent un comportement tout à fait similaire aux animaux témoins. Ils ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. Ainsi, nous nous attendons à ce que les animaux recevant de la vincristine et le traitement préventif présentent une amélioration de leur symptômes, à savoir un retour à la normale de la sensibilité tactile.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées à la vincristine et aux traitements seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique des tissus du système nerveux sensitif. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêts seront prélèvés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l'expérimentation animale disponible qui reproduit l'ensemble des mécanismes mis en jeu à la génération d'une douleur induite par des cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle dont la séquence d'injection des agents anti-cancéreux est la plus conforme aux protocoles de chimiothérapies neurotoxiques utilisés chez l'Homme. En parallèle de cette étude chez la souris, une étude in vitro évaluant l'effet de la vincristine et de sa combinaison avec le traitement préventif sur des neurones sensitifs humains dérivés est en cours. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, ...) mis en jeu au niveau du neurone sensitif humain, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation inhérents aux neuropathies induites par la chimiothérapie, ainsi que toute la complexité des phénomènes aboutissant à la sensation douloureuse.

Réduction

Le nombre de 10 animaux par groupe a été calculé à partir de résultats (moyenne et écart-type) obtenus au cours d'une étude sur le modèle de neuropathie induite par la vincristine. L'analyse statistique sera réalisée à l'aide de deux logiciels. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, le test de comportement puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur de cadavres.

Raffinement

Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement préventif sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide d'un test d'évaluation de la sensibilité tactile. Si le score pour au moins 1 souris est supérieur à 10 alors cette étude pilote sera renouvelée avec des doses deux fois inférieures. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de cette étude pilote, et que le traitement préventif ne présente pas d’effet positif sur la neuropathie, alors la même étude sera réalisée sur deux nouveaux groupes de 5 souris. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement préventif présente un effet positif sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale, à la dose efficace. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul un test d'évitement sera utilisé pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la vincristine et/ou au traitement préventif doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôle pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses au test comportemental seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.

Choix des espèces

Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique. Ces conditions sont les mieux réunies avec des adultes jeunes (7-8 semaines, poids 25-30g).