Recherche fondamentale

1 800 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux chirurgies cérébrales pour l'injection de virus et l'implantation d'une lentille d'imagerie, une consommation forcée d'alcool sur plusieurs semaines et une tâche d'auto-administration, pour étudier les circuits cérébraux de l'addiction. Le porteur indique que les rats ne développant pas de consommation excessive ou échouant à la tâche sont euthanasiés en cours de route, ce qui explique le grand nombre d'animaux engagés. Sur le remplacement, il affirme que ces effets ne peuvent être étudiés sur modèles cellulaires et que seuls des rats modifiés permettent de cibler les neurones visés.

Objectifs

L’alcoolo-dépendance est une maladie chronique et hautement récidivante en dépit des thérapies existantes puisque 70% des patients rechutent après 12 mois de prise en charge (plus de 90% après 4 ans). Le trouble de l’usage d’alcool (TUA) et toutes les conséquences liées à la consommation d'alcool représentent une charge importante pour la santé publique et les économies du monde entier, notamment en France et particulièrement dans notre région. À l'instar des autres dépendances aux drogues, le TUA est défini comme un syndrome pathologique caractérisé par une perte de contrôle et des envies incontrôlables (« craving »), la persistance de la consommation en dépit des conséquences (usage compulsif), un mal-être et des symptômes physiques à l’arrêt de la consommation (sevrage) et des rechutes qui peuvent survenir même après des années d'abstinence. C’est une maladie grave, complexe, fréquente et hautement invalidante qui est dévastatrice non seulement pour l’individu mais aussi pour l’entourage et la société. Pour identifier les cibles thérapeutiques qui amélioreront les options de traitement disponibles pour le TUA, il y a donc un besoin critique de comprendre les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent l'apparition, le maintien et la rechute de cette addiction à d'alcool.

Bénéfices attendus

Sur le plan scientifique, les données du présent projet offrent non seulement une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques à la base de l’addiction à l’alcool, mais aussi ouvrent des possibilités en termes de nouveaux traitements cellulaires et génétiques de cette maladie. Ce projet scientifique est très ambitieux et très original car il va combiner des techniques de pointes avec l’utilisation des modèles animaux validés pour évaluer le développement d’addiction à l’alcool. Vu la pertinence et l’innovation du projet, les retombées seront importantes en termes de mise en place de techniques originales in vivo, chez l’animal vigile, ce qui n’est pas courant et mérite donc d’être souligné. Les résultats permettront aussi d’avoir des données en fonction du sexe, ce qui est important à l’heure actuelle car ce facteur est assez peu étudié dans les recherches du domaine. Le protocole est aussi original, dans le sens ou l’approche longitudinale va nous permettre d’obtenir des données aux différentes étapes des processus impliqués dans l’addiction et nous serons donc en mesure de proposer des interventions dans le champ de la prévention, avec l’idée d’intervenir précocement. Nous serons en mesure d’identifier des mécanismes dans des voies neuronales spécifiques et dans des types de neurones spécifiques et de démontrer que leur modulation permet de jouer sur la consommation d’alcool et sur certains critères de l’addiction. Cela avancera notre compréhension de comment les structures du circuit de récompense, impliquées dans l’évaluation de la récompense et le control cognitifs (système top-down), sont modifiées suite à l’exposition à l’alcool et comment ces régions cérébrales sont impliquées dans les comportements liés à l’addiction à l’alcool.

Procédures

Les animaux vont subir deux chirurgies espacées de 3 semaines dans le but d'injecter un virus dans différentes structures cérébrales en premier lieu, d'implanter une lentille d'imagerie et de placer une base crânienne d'un miniscope en deuxième lieu. La première chirurgie durera environ 30 minutes, tandis que la deuxième prendra environ une heure. Des prélèvements de sang pour évaluer l'alcoolémie seront réalisés à la lors des différentes étapes de la procédure 1 (début et à la fin de la procédure de la consommation volontaire et à la fin de l'apprentissage opérant d'alcool) et 2 (expériences visant à tester la compulsivité et de la rechute). Nous prévoyons de prélever entre 150 et 200 μL de sang veineux à chaque prélèvement, en respectant un intervalle d'au moins 2 semaines entre chaque prélèvement. Les rats seront anesthésiés pendant le prélèvement, ce qui prendra moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Ces expériences doivent être réalisées avec des animaux placés individuellement dans des cages, ce qui peut entraîner un stress social chez notre modèle animal. D'expérience, les étapes de consommation volontaire d'alcool ne conduisent à aucune souffrance ou douleur chez nos animaux. Les phases qui vont faire subir aux rats une certaine douleur sont les procédures chirurgicales visant à injecter les vecteurs viraux et à implanter des lentilles intracrâniennes.

Devenir

Pour induire une forte consommation d'alcool chez les rats, une première étape de consommation volontaire intermittente est réalisée pendant environ 8 semaines. Les rats ont accès à deux bouteilles pendant 24 heures : une contenant de l'alcool à 20% v/v et une contenant de l'eau. Certains rats développent une consommation excessive d'alcool après environ 10 à 12 sessions, tandis que d'autres ne le font pas. Ceux qui ne développent pas une consommation excessive d'alcool sont euthanasiés, et des échantillons de tissus tels que le foie ou le cerveau peuvent être prélevés sur ces animaux pour des tests ultérieurs. Les rats qui réussissent la tâche d'auto-administration opérante d'alcool sont sélectionnés pour les chirurgies. Ceux qui ne parviennent pas à acquérir cette compétence sont également euthanasiés eet des échantillons de tissus peuvent être prélevés sur eux. À la fin de l'étude, les animaux tous les animaux seront anesthésiés.

Remplacement

Les conséquences de l’exposition répétée à l’alcool sur le circuit de la récompense ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent pas la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des rats génétiquement modifiés permettant de cibler spécifiquement les différentes population neuronale dans nos régions d’intérêt dans le cadre de ce projet, ces modèles n’existent que chez Le rongeur.

Réduction

Pour les tests comportementaux, nous identifions le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif, qui est déterminé en utilisant une « power analysis » basée sur nos résultats précédents, et un n = 30/groupe est généralement suffisant. Il est donc nécessaire de commencer avec un grand nombre d'animaux dans nos groupes. Si nous avons initialement 30 rats par groupe, nous perdrons ensuite environ 15 à 20 % des rats après la première étape d'acquisition de consommation volontaire excessive d'alcool, puis encore 15 à 20 % à la seconde étape d'acquisition de tâche opérante. Cela nous amènera à avoir une vingtaine de rats par groupe avant les tests de compulsivité. Théoriquement, nous aurons au maximum 5 à 6 rats qui développeront un comportement compulsif. Cela représente le nombre minimum nécessaire pour effectuer des tests statistiques. A noter donc qu’il est des fois nécessaires de répéter chaque expérience sur deux cohortes indépendantes, si le nombre de rats compulsif est inférieur à 5. Ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (la consommation du type «binge »; perte de contrôle ; motivation ; consommation compulsive ; abstinence et rechute) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de rats utilisés. Par ailleurs, les animaux sont surveillés quotidiennement.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les rats sont hébergées en groupe sociaux de 2 animaux par cage (Sauf besoin expérimental), et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur. La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. En plus des points limites spécifiques à chaque procédure, nous utiliserons une grille d’évaluation jusqu’à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus couramment utilisé dans les études d’auto-administration opérante d’alcool de part ses capacités d’apprentissage de la tâche opérante mais également pour son attrait naturel pour l’alcool. Les rats adultes seront agés de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire pour une utilisation allant de quelques semaines à plusieurs mois.

186 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la capsaïcine pour provoquer une hypersensibilité douloureuse, puis on leur administre des composés par voie intrathécale et sous-cutanée sous anesthésie, avec des tests répétés de mesure de la douleur, pour améliorer un candidat médicament antidouleur. Le porteur indique qu'il lui est impossible de soulager la douleur de ces animaux pendant l'expérience, puisque c'est précisément l'objet de l'étude. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que l'intégration de la douleur impose des études sur l'animal vivant.

Objectifs

Parmi une série de composés chimiques synthétisés par le laboratoire, nous avons identifié une molécule ayant un effet anti-allodynique à la fois très puissant et prolongé sur des modèles murins d’allodynie mécanique inflammatoire comme neuropathique. Nous voulons améliorer cet effet anti-allodynique via l’optimisation de la formule chimique du composé, pour ensuite comparer l’effet thérapeutique des nouveaux composés à notre référence. Ce projet vise a répondre à deux questions : 1. Détermination de l'effet dose du composé de référence sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire induite par la capsaïcine. 2. Les nouveaux composés ont-ils un effet sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire induite par la capsaïcine ?

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de déterminer si l'amélioration du composé améliore son effet anti-allodynique, afin d'en faire un candidat médicament pour traiter l'allodynie.

Procédures

Toutes les injections intrathécales (1 par animal d'environ 3min) et sous-cutanées (1 par animal d'environ 2min) seront pratiquées sous anesthésie générale. Les tests de mesure de la douleur en comportement sont réalisés 7 fois en 1h30.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels. Une grille de score est mise en place afin d'évaluer le bien être des animaux au quotidien suite aux injections intratéchales et sous cutanées. Les résultats préliminaires obtenus au laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Les données sont traitées selon les données de la littérature. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, systémiques, locales ou sous-cutanées, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, en cas d’injection d’un produit inflammatoire , le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.

1 032 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une parodontite par ligature ou injections répétées dans la gencive, certains subissant une chirurgie stéréotaxique avec injections intracérébrales, un hébergement isolé en cage métabolique et des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien, pour tester le lien entre infection buccale et maladies neurodégénératives. Le porteur indique n'attendre qu'un inconfort léger et des saignements gingivaux, sans effet secondaire notable. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux vivants revêt un caractère de "stricte nécessité" et que ces évaluations ne peuvent se faire sans modèle animal.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives regroupent un ensemble de pathologies affectant le système nerveux, dont la plus prévalente est la maladie d’Alzheimer (MA) faisant partie des tauopathies. Dans les tauopathies, la protéine Tau est hyperphosphorylée et présente un repliement anormal, provoquant une perte de sa fonction physiologique et un gain de fonction toxique. La protéine Tau anormale est délocalisée vers le soma puis les dendrites où elle s’accumule, générant une dysfonction synaptique. Ces dernières années, est apparue l’hypothèse qu’une inflammation, progressive et auto-entretenue, du système nerveux central (SNC), peut constituer un terrain favorable à une neurodégénérescence. Les infections périphériques, en agissant sur les processus neuro-inflammatoires, contribueraient au déclenchement et/ou à l’évolution péjorative de ces pathologies. Les parodontites, pathologies buccales infectieuses figurant parmi les affections humaines les plus fréquentes, sont caractérisées par des lésions inflammatoires chroniques des tissus de soutien des dents. Elles sont reconnues comme associées à la progression négatives de diverses pathologies systémiques dont les pathologies neurodégénératives. Cependant le schéma spatio-temporel pouvant lier tauopathies et pathologie infectieuse/inflammatoire périphérique comme la parodontite est encore mal connu. Dans ce contexte général, notre projet vise a investiguer de manière large le schéma spatio-temporel liant infections et inflammation périphériques, neuroinflammation et tauopathie pour mieux définir dans quelle mesure l’immunité innée/adaptative dans le système nerveux central (SNC) mais également les processus immunitaires périphériques sont impliqués dans le développement de la tauopathie. Notre hypothèse est que les infections et/ou inflammations périphériques aggravent voire induisent les signes biologiques et cliniques des tauopathies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l’obtention de données satisfaisantes permettant : - D’identifier les conséquences d’une infection périphérique buccale ou d’une inflammation systémique sur l’initiation ou la progression des tauopathies. - D’élucider des voies mécanistiques liant les tauopathies et les parodontites afin de mettre en évidence des cibles thérapeutiques ou des marqueurs diagnostiques. En effet, l’induction d’une parodontite expérimentale sur un terrain avéré de prédisposition à une pathologie neurodégénérative permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’exacerbation, l’entretien voire le déclenchement de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence chez un individu susceptible. Si la parodontite est un facteur aggravant les tauopathies, alors cliniquement les patients atteints de tauopathies devraient bénéficier d’un examen parodontal et d’une prise en charge parodontale en cas de pathologie détectée. Les données que nous obtiendrons avec ce projet sont importantes pour améliorer à moyen terme la prise en charge globale des patients atteints de tauopathies dont la maladie d’Alzheimer et à long terme la santé orale de ces patients. D’autre part, l’induction d’une parodontite expérimentale chez un animal sans prédisposition permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’induction de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence. Si ce rôle est vérifié, alors cliniquement les patients atteints de parodontite pourrait faire l’objet de dépistage de troubles cognitifs de manière préventive. Il serait alors interessant de pousser la recherche vers des études cliniques en fonction des stades et grades de la parodontite pour déterminer si une catégorie de patient atteint de parodontite serait plus à risque (parodontite sévère de stade III ou IV, à progression rapide grade C par exemple). Compte tenu de la charge mondiale des troubles du déclin cognitif due aux changements démographiques, la recherche et l’identification de facteurs de risque potentiellement modifiables de tauopathies comme proposé dans notre projet fait partie intégrante des efforts de recherche multidisciplinaires. De plus, l’emploi de différents modèles dans notre projet, devrait permettre d’identifier le modèle le plus optimal pour l’analyse des mécanismes et du schéma spatio-temporel des liens entre pathologies neurodégénératives et parodontite et donc raffiner la modélisation pour les études futures.

Procédures

Ce projet comporte 2 procédures chirurgicales (induction de la parodontite, injection par stéréotaxie). L’induction de la parodontite se fera par 2 techniques différentes, l’une nécessitant une seule intervention et un suivi pendant 4 semaines, l’autre nécessitant des injections répétées trois fois par semaine pendant 24 jours. L’emploi de ces deux techniques permet de reproduire des aspects différents de la parodontite (évolution lente ou évolution rapide) pour des groupes d’animaux différents. Pendant cette période, 540 rongeurs bénéficieront d’un suivi à l’aide de cages métaboliques où les animaux seront hébergés seuls afin de déterminer leur balance énergétique. Pour ces deux techniques il sera attendu 10 jours avant de placer les animaux dans les cages métaboliques et une période d’acclimatation d’au moins 48 heures avec de la litière identique à leur cage d’hébergement et dans un espace suffisant au regard de leur poids. La stéréotaxie sera effectuée une seule fois avec pose de canule permettant des injections intracérébrales une fois par jour pendant 6 jours. L’intégralité des animaux seront suivis d’un point de vue comportemental ayant pour objectif de tester les capacités cognitives des animaux. Au cours des deux procédures, des prélèvements sanguins seront effectués une fois par semaine et juste avant la mise à mort sur animaux vigiles pour lesquels la douleur sera prévenue par application d’un anesthésique local. Au cours de la procédure faisant appel à la stéréotaxie, du liquide céphalo-rachidien sera prélevé une fois sur les animaux anesthésiés, avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Les procédures chirugicales (induction de parodontite, perfusion ou stéréotaxie) seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Le suivi post-opératoire sera réalisé par du personnel formé au bien-être animal. Les procédures comme la stéréotaxie ou la pose de perfusion sont des procédures courantes dans le laboratoire. Les conséquences attendues sont minimes sur le bien-être animal. Aucun effet secondaire n'est attendu sur les animaux du fait de l’induction de la parodontite. Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger (pose d'une ligature à la base d'une dent, et injections dans la gencive). Une absence de perte de poids consécutive à la pose de ligature est attendue comme dans une étude précédente. Les injections au niveau gingival peuvent entrainer des saignements au point d’injection sans nuisance sur le comportement de l’animal. Les injections seront effectuées de manière lente pour éviter l’apparition de grosseurs/nodules au niveau de la gencive. Dans le cas où certains animaux rencontreraient tout de même des difficultés à l’alimentation, de la nourriture en gel sera mise en place.

Devenir

A l'issue des procédures (P1) et (P2), tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour permettre des analyses des tissus parodontaux et cérébraux.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie des tauopathies en lien avec les performances cognitives et des pathologies induites au niveau périphérique. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité. En effet, nos travaux visent à mettre en lien les atteintes périphériques infectieuses et inflammatoires avec des altérations comportementales, histologiques, biochimiques et moléculaires neuronaux et d’en étudier les facteurs modulateurs au cours du vieillissement. Cela nécessite donc le développement d’approches neurobiologiques intégrées. De plus les modèles expérimentaux sont largement utilisés pour vérifier les hypothèses biologiques de la relation entre la parodontite et d’autres maladies systémiques pour permettre le contrôle de facteurs étiologiques supposés. Ces évaluations particulières ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux.

Réduction

Le nombre total d’animaux concernant les procédures de notre protocole sur les 5 ans à venir est donc estimé à 1632 (1032 souris et 600 rats). Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera effectuée pour la mise au point des modèles de parodontite. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R. De plus les animaux seront utilisés pour plusieurs interventions au sein des procédures expérimentales afin de réduire leur nombre. Pour l’étude statistique, une comparaison des groupes d’animaux deux à deux entre les animaux contrôles et les animaux tests sera effectuée.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au moins 1 fois par semaine, par du personnel spécialement formé. Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition: blocs à ronger pour les rats, coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées, après une prémédication analgésique, sous anesthésie générale par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique complémentaire sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront sacrifiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.

Choix des espèces

Ces espèces sont utilisées parce que rats et souris peuvent être évalués par des méthodes comportementales et être génétiquement modifiés par injections de vecteurs viraux ou transgénèse. Les souris transgéniques utilisées dans notre protocole reproduisent un certain nombre d’altérations retrouvées dans la Maladie d’Alzheimer et les tauopathies (lésions amyloïdes : APP/PS1dE9, APPP KI, hyperphosphorylation/troncation, agrégation/altération d’épissage/perte de fonction de la protéine Tau : THY-Tau22, THY-Tau30, TauKO, Tau-KI, MiniTau. Le parodonte des rongeurs et notamment du rat est assez similaire à celui de l'homme notamment d’un point de vue anatomique dans la région molaire. L’avantage de ce modèle animal est aussi de pouvoir mener une étude sur des groupes homogènes et alors minimiser les effets de la variabilité biologique. Dans la plupart des expérimentations, les souris et les rats seront utilisées à l’âge adulte : entre 2 mois à 12 mois.

1 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène tau, elles subissent des tests de mémoire, une privation d'eau limitant l'accès à dix minutes par jour et une diète déplétant les cellules immunitaires du cerveau, pour étudier le rôle d'ApoE4 dans la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique qu'environ 15 % des souris développent une paralysie progressive des membres postérieurs et que des crises d'épilepsie, une hydrocéphalie ou une malocclusion peuvent survenir, avec mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Sur le remplacement, il affirme que la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro et juge le modèle murin "indispensable".

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA tau par 3 modules : 1) Identifier comment ApoE4 modifie la fonction des synapses endommagées par la MA. 2) Identifier comment ApoE4 modifie la structure des synapses endommagées par la MA. 3) Identifier si ApoE4 utilise les microglies (cellules immunitaires du cerveau) pour exacerber la perte synaptique. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les interactions entre l'ApoE4 et la perte des synapses dans la MA. Nous utiliserons un modèle de souris qui reproduit la perte synaptique comme observée chez les patients MA.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4 et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des et microglies qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.

Procédures

- Une biopsie rapide de l'oreille (permettant l'identification et le génotypage des animaux) (2 secondes) - Trois tests comportementaux pour évaluer la mémoire (1 semaine à 3 semaines) - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie (unique, 1 minute) - Possible développement d'un phénotype dommageable à partir de 7 mois (15% des souris P301S, développement progressif de quelques semaines à 1 mois) - Une diète spéciale permettant la déplétion des microglies (1 mois) - Une privation en eau contrôlée (accès à l'eau 10 minutes par jour )

Impact sur les animaux

Il n’y pas d’effet indésirable attendu sur les animaux lié à l’utilisation des traitements proposés (diètes). En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives mais peuvent être stressantes pour les animaux. Les animaux seront privés en eau pour créer un niveau de motivation suffisant pour apprendre et mémoriser les indices olfactifs lors de l'helico Maze. Les souris seront privées en eau de la façon suivante: accès à l'eau 10 minutes par jour 5 jours avant le premier jour d'expérimentation. Puis, lors des jours d'expérimentation (5) les souris auront accès à l'eau pendant 10 minutes chaque jour en plus de l'eau bue pendant l'expérimentation. Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables qui seront discutés dans la procédure et pour lesquels des points limites stricts seront établis). Les animaux issus de la procédure 2 seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique suivi d'une perfusion intracardiaque. Une heure avant l’injection d’anesthésiques, nous injecterons un analgésique en sous-cutané .

Devenir

Pour la partie du projet permettant la création et le maintien de lignées de souris transgéniques à phénotype dommageable, une partie des souris sera utilsée pour la deuxième procédure, l'autre partie sera mise à mort à la fin de la procédure. Pour la partie du projet avec les analyses comportementales, perfusion et prélèvements des tissus, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analyser.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin. De plus, les modèles de test comportementaux n'étant pas possible in vitro, l’utilisation d’un animal qui développe des altérations mnésiques similaires à celles observées dans la MA est donc nécessaire, avec des capacités mnésiques mesurables. Les souris P301S transgéniques permettent de reproduire ces symptômes mnésiques de la MA ainsi que les mécanismes à l’origine de ces troubles.

Réduction

Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.

Raffinement

Les souris seront hébergées sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C(±1°C) dans des portoirs ventilés (12vol/h), sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec la privation en eau ; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera exclue du test comportemental et aura un accès illimité à l’eau afin de recouvrer un poids normal. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois. Les premiers signes sont la rétraction des membres postérieurs quand la souris est soulevée par la queue. Au début, les souris sont entièrement ambulatoires et peuvent accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Cela peut évoluer vers une faiblesse des membres postérieurs et éventuellement une paralysie. Les souris sont observées quotidiennement pour leur capacité à atteindre la nourriture et l'eau. Ce processus, lorsqu'il se produit, progresse au cours des semaines à plus d'un mois. Points limites : Perte de plus de 20% du poids : euthanasie. Signes de souffrances continues (prostration, dos courbé, …) : euthanasie. Incapacité à se déplacer pour atteindre l’eau ou la nourriture : euthanasie. Notre objectif est de les amener à 10 mois maximum. Les souris P301S sont sensibles au bruit et à la manipulation. Si une crise épileptique se produit, nous laisserons la souris récupérer et observerons 5 minutes. Si elle est incapable de se remettre d'une crise, elle sera euthanasiée. Habituellement, les souris récupèrent et se comportent normalement. Si la souris développe une hydrocéphalie, elle sera euthanasiée. Si une malocclusion est identifiée, la souris sera évaluée. Si elle fait partie d'une procédure, les dents seront taillées chaque semaine par le personnel vétérinaire et le poids sera surveillé. Sinon, la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, la dégénérescence synaptique responsable des troubles cognitifs dans la MA est très difficilement modélisable in vitro et nécessite des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. Pour étudier l’impact d’ApoE4 sur la dégénérescence synaptique, nous utiliserons des souris sauvages et les souris génétiquement modifiées P301S exprimant la protéine tau humaine mutée menant au développement de la perte synaptique et des troubles cognitifs. Ces souris seront croisées avec des souris transgéniques exprimant les isoformes humaines ApoE2, ApoE3 ou ApoE4. - Une cohorte sera utilisé à 7 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte sera utilisé à 10 mois (avec tests comportementaux e un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections par jour, par voie intrapéritonéale, sous-cutanée ou par gavage, d'un traitement chronique au THC destiné à provoquer une dépendance puis un sevrage, et 504 d'entre elles passent des tests comportementaux dont le porteur ne précise pas le détail. Il indique que la mise à mort est réalisée rapidement sans anesthésie préalable, pour ne pas fausser les mesures. Sur le remplacement, il décrit des analyses in silico et in vitro déjà menées, mais affirme que l'étude de systèmes intégrés ne peut se faire que chez l'animal.

Objectifs

Le cannabis est la drogue d’abus la plus utilisée dans le monde et compte environ 200 millions d’utilisateurs pour 15 millions de personnes dépendantes. Le cannabis contient naturellement des composés, appelés cannabinoïdes, parmis lesquels le ∆9-tétrahydrocannabinol (ou THC) est le plus abondant. Le THC est principalement responsable des effets toxiques et addictifs du cannabis de part ses propriétés psychoactives, et agit dans le cerveau en se fixant sur les récepteurs aux cannabinoïdes de type 1 (récepteurs CB1). Les récepteurs CB1 sont très abondants dans le système nerveux central et jouent un rôle majeur dans la régulation de l’activité neuronale. L’abus de cannabis, impliquant une action du THC sur les récepteurs CB1, peut donc être à l’origine de troubles neurologiques et psychiatriques importants. Ainsi, une meilleure connaissance du fonctionnement et de la régulation des récepteurs CB1 est primordiale pour comprendre les effets du cannabis et pouvoir les réduire. Dans ce cadre, le projet consistera à évaluer, chez des souris, la réponse comportementale à l’administration chronique de THC, mimant un état de dépendance, et à l’arrêt de ce traitement, induisant un état de sevrage. Nous chercherons à identifier des molécules pouvant diminuer les conséquences liées à la dépendance et au sevrage au THC. Cette étude contribuera ainsi à mieux comprendre les mécanismes de régulation des récepteurs CB1 dans le but de développer un traitement contre les troubles liés à l’abus de cannabis.

Bénéfices attendus

Les récepteurs aux cannabinoïdes CB1 comptent parmi les récepteurs métabotropiques les plus abondants dans le système nerveux, et participent à la régulation de nombreuses fonctions cérébrales. La dé-régulation de l’activité de ces récepteurs est ainsi associée à l’apparition de troubles neurologiques majeurs tels que l’addiction, les psychoses, l’anxiété ou encore les troubles cognitifs. L’idendification de mécanismes de régulation endogènes aux récepteurs CB1 offre donc de nouvelles pistes de recherche dans le but de développer des stratégies thérapeutiques innovantes permettant une amélioration de la qualité de vie des patients concernés. Ce projet consistera ici à produire une meilleure connaissance des mécanismes fondamentaux sous-tendant la régulation des récepteurs CB1.

Procédures

L’ensemble des gestes techniques décrits ci-après sera réalisé par une personne compétente formée à l’expérimentation animale et aux gestes techniques, qui sera sous la responsabilité du porteur de projet et sera en contact régulier avec le personnel zootechnique de l’animalerie d’expérimentation et les responsables du bien-être animal. 1) Administrations per os par gavage: Ces administrations seront réalisées sur un total de 216 animaux vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. L’ensemble des animaux recevra deux injections par jour espacées de 8h minimum pendant 6 jours maximum. 2) Injections sous-cutanées: ces injections seront réalisées sur un total de 144 animaux vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. L’ensemble des animaux recevra deux injections par jour espacées de 8h minimum pendant 6 jours maximum. 3) Injections intra-péritonéales: ces injections seront réalisées sur un total de 792 animaux vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. L’ensemble des animaux recevra deux injections par jour espacées de 8h minimum pendant 6,5 jours. 4) Tests comportementaux : L’ensemble des tests comportementaux prévus dans cette étude concernera 504 animaux. Les tests, classiquement utilisés chez la souris, seront réalisés sur des animaux vigiles. 5) Mise à mort : Un total de 792 animaux fera l’objet d’une mise à mort rapide. Celle-ci sera réalisée chez les animaux sans anesthésie au préalable dans la limite des contraintes techniques imposées par les analyses faites ex vivo.

Impact sur les animaux

L’administration de substances par voie intra-péritonéale, sous cutanée et/ou orale par gavage, ainsi que la contention nécessaire à la réalisation des administrations entrainent des douleurs et du stress. Des nuisances pourraient survenir à la mise en cage individuelle des animaux en raison du stress lié à l’isolement. De plus, les administrations de THC et l’exposition à des tests évaluant le comportement de type anxiété peuvent engendrer des effets indésirables et du stress.

Devenir

Procédures I et II : Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement du sang et du cerveau pour des analyses ex vivo ultérieures. Ces procédures se feront sans utiliser d’anesthésie, celle-ci pouvant modifier les paramètres mesurés (quantification des endocannabinoïdes et neurostéroïdes) et induire ainsi des biais expérimentaux.

Remplacement

Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches substitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Des analyses in silico nous ont permis d’identifier le site de fixation allostérique de la pregnenolone sur le récepteur CB1. De plus, des études in vitro ont permis de montrer l’effet régulateur de la pregnenolone et de ses analogues sur le récepteur CB1. Ce projet s’applique maintenant à l’étude de systèmes intégrés qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal.

Réduction

Dans le cadre de la stratégie de réduction, notre expérience au sein du laboratoire nous a permis de déterminer qu’un nombre de 8 souris par groupe expérimental est nécéssaire pour les prélèvements et analyses ex vivo, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. Ce nombre sera porté à 12 souris par groupe pour les analyses comportementales, afin de pallier à la variabilité inter-individuelle et pouvoir réaliser des analyses statistiques cohérentes. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets traitement. Enfin, les études réalisées au cours du projet précédent et une connaissance accrue de la bilbiographie sur la pregnénolone et le récepteur CB1 nous ont permis de déterminer les doses effectives pour les traitements pharmacologiques. Ceci nous permet de proposer des groupes expérimentaux pertinants avec des conditions témoins appropriées.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne, et ce dès leur réception. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites. De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuisances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur réception, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, sizzle, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Les animaux seront alors placés dans des cages individuelles transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. La mise en cage individuelle est ici nécéssaire afin de minimiser l’impact potentiel de la hierarchie sociale sur le phénotype des et afin de reproduire les conditions d’hébergement dans le projet précédent. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation. Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie, et les animaux seront transférés au minimum 30 minutes avant le début des tests dans la pièce d’expérimentation afin de les familiariser à ce nouvel environnement. Le cas échéant, un enrichissement supplémentaire pourra être apporté dans les cages d’hébergement afin d’optimiser le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal courant pour les études pharmacologiques et l'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permettra une éventuelle transposition des résultats obtenus dans le projet de recherche à l'homme (dans les études de recherche et de développement). De plus, les effets comportementaux des cannabinoïdes ont été bien décrits et validés chez la souris. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes et adultes (âgés de 2 à 5 mois). Ce projet se fera dans la continuité des projets précédents menés sur des animaux du même âge, ce qui nous permettra de compiler les données obtenues entre les différents projets et ainsi faire progresser nos connaissances sur les mécanismes de régulation endogène du récepteur CB1.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'ablation de dépôts de graisse sous anesthésie, des prises de sang à la queue et des mesures de composition corporelle, pour étudier le rôle du tissu adipeux dans le vieillissement musculaire. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer une perte de poids et une douleur à court terme, et fixe la mise à mort à une perte de 20 % du poids. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode sans animaux n'existe pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier" et juge le recours à la souris "indispensable".

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous réaliserons des lipectomies (résection des dépôts adipeux situés au niveau sous-cutané et viscéral) chez des animaux jeunes et âgées afin d'étudier l’implication de ce tissu dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’implication du tissu adipeux blanc (TA) dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du TA ayant un impact négatif sur le fonctionnement musculaire, l’identification d’un pool de métabolites dérégulés avec l’âge appartenant à l’axe TA-muscle devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter pour lutter contre la sarcopénie liée à l’âge.

Procédures

Les souris seront soumises à des prises de sang à la veine de la queue (2 fois au total, durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris), leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système RMN (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et elles subiront une chirurgie (30 minutes d’intervention environ) sous anesthésie et traitement analgésique afin de leur retirer un ou plusieurs dépôts adipeux.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée) - perte de poids et douleur à court terme consécutives à la chirurgie (une administration d’analgésique sera effectuée lors de la chirurgie et un suivi post-opératoire quotidien sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux) - isolement/individualisation des animaux en cas d'agressivité (enrichissement des cages)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier la communication entre différents tissus (tissu adipeux et muscles squelettiques) via de petites molécules organiques, les métabolites. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme entier impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Au regard de la bibliographie et sur la base d'analyses statistiques, 10 souris par condition sont classiquement utilisées pour des études de métabolomique sur tissus de rongeurs. Les tissus prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le métabolome au sein des tissus mais aussi pour des analyses d'expression de gènes, de protéines et des analyses biochimiques (mesures d’activités enzymatiques). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré aux animaux afin d’éviter la perte de poids et les douleurs. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours pendant 7 jours suite à la chirurgie puis 2 fois par semaine par la suite, ce qui permettra de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris de façon à favoriser leur bien-être.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). De plus, c’est un modèle pour lequel nous avons une expertise depuis de nombreuses années. Pour cette étude, nous utiliserons des souris wild-type C57BL/6J de différents âges (3-6 mois pour les souris « jeunes » et 18-24 mois pour les souris « âgées ») afin de caractériser la contribution du TA dans la régulation du métabolome circulant et musculaire au cours du vieillissement.

1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une xénogreffe tumorale et reçoivent des séries d'injections intraveineuses, orales et intrapéritonéales de composés à base d'or, pour comparer l'efficacité anticancéreuse de ces molécules. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements et que sa nécrose peut ouvrir une plaie susceptible de s'agrandir par frottement ou cannibalisme, paramètre qu'il comptabilise comme signe d'efficacité. Sur le remplacement, il souligne que les composés ont d'abord été identifiés in vitro sans animaux, tout en jugeant le passage in vivo nécessaire.

Objectifs

L'identification de nouvelles séries chimiques originales et efficaces sur les cibles thérapeutiques est devenue un des défis majeurs auxquels les industries pharmaceutiques sont confrontées. Dans l’optique d’étendre la diversité chimique et d’explorer de nouveaux territoires synthétiques, en utilisant la chimie organique nous pouvons envisager plusieurs approches et notamment le design de squelette in silico à partir de méthodes computationnelles. L'équipe de chimistes co-porteuse du projet s’intéresse à la conception et la synthèse d’outils chimiques par la synthèse de nouveaux complexes organométalliques de métaux de transition. Ces outils sont conçus en vue d’application en chimie médicinale. Deux familles de composés à base d'or ont été synthétisées, montrant une activité biologique vis-à-vis des cellules cancéreuses in vitro.

Bénéfices attendus

Les traitements anticancéreux à base de métaux sont apparus au milieu des années 1960 avec l’apparition de composé à base de platine comme le cisplatine. Bien que ces complexes soient utilisés en thérapie ils présentent des effets secondaires importants (neurotoxicité, néphrotoxicité...) sur l’Homme et/ou des résistances. Des études ont été menées pour remplacer le platine par de l’or (III). Ainsi nous avons synthétisé de nombreux complexes d’or avec des ligands CN (Carbone - Azote) ou PP (Phosphore-Phosphore) que nous avons testé sur des lignées cellulaires cancéreuses. Sur 28 composés des familles CN et des familles PP, nous avons mis en évidence une activité biologique anti-cancéreuse. Pour le projet présent nous souhaitons testés in vivo les 5 meilleurs par famille (famille CN et famille PP).

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : 9 injections en IV sur animaux vigiles sur réparties sur une durée de 19 jours. 5 injections per os sur animaux vigiles 5 jours d'affilés. 5 injections IV sur animaux vigiles sur 5 jours d'affilés 6 injections IV sur animaux vigiles sur réparties sur une durée de 19 jours. 1 injection IP sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

La xénogreffe provoque le développement d'une tumeur solide. Les tumeurs ne sont pas innervées et elles n'entraînent pas de douleur. En revanche la taille tumorale peut provoquer des difficultés de déplacement des souris. L'efficacité de nos composés à l'image des traitements chimiothérapeutiques standards, quand le traitement a un effet, se traduit par un ralentissement du développement de la tumeur, une stagnation ou encore une baisse de la taille tumorale. Ces effets sont la résultante de la destruction de la tumeur par des phénomènes de nécrose qui peuvent atteindre la surface de la tumeur et provoquer une plaie. Ces plaies peuvent s'agrandir soit par cannibalisme soit par frottement en raison du déplacement de la souris. Cependant plus le traitement est efficace plus la nécrose va se développer. Nous comptabilisons ce paramètre pour évaluer l'efficacité de la thérapie.

Devenir

A l'issus de la procédure 1 les animaux sont mises à mort afin de récupérer la tumeur et procéder à l'analyse fine de l'efficacité de nos composés. A l'issue de la procédure 2 les animaux sont mises à mort afin de récupérer la tumeur et procéder à l'analyse fine de l'efficacité en combinaison de nos composés

Remplacement

Le recours aux expérimentations in vitro a mis en évidence une action biologique des composés chimiques à base d'or parmi des centaines de composés obtenus par des synthèses chimiques. L'action biologique observée a été complétée par des expériences de biologie moléculaire et d'analyse cellulaire par cytométrie afin de mettre en évidence les cibles de nos composées et le mode d'action sur les cellules cancéreuses. Aucun animal n'a été utilisé dans cette découverte majeure pour un traitement anticancéreux.

Réduction

Nous avons limité le nombre d'animaux par groupe sans remettre en cause l'analyse statistique de nos résultats mais en prenant en compte la variabilité interanimales et intergroupes. En tenant compte de la bibliographie, notre expérience dans le domaine du traitement des cancers, des tests de puissance statistique pour la taille des groupes, et des effets attendus un nombre de 10 souris par groupe sera utilisé. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultat et d'analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été élaboré afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux seront hébergés en portoir ventilé et ils disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de maison de type igloo et nous ajouterons des nids végétaux à base de fibres courtes de coton. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bienêtre des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites adaptés) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc...). L'administration des traitements devrait apporter un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression tumorale. De plus, l’ensemble des gestes techniques qui sont réalisés sur animaux vigils sont pratiqués par des personnes formées et expérimentées avec du matériel adéquate permettant de réduire significativement les nuisances liées aux actes techniques.

Choix des espèces

Une espèce couramment utilisée et reconnue en oncologie. C'est un modèle ayant permis de déterminer l’importance du protocole d’administration, l’influence du volume tumoral et la toxicité des traitements. La physiologie de la souris est comparable à celle de l'Homme. Les souris seront achetées entre 4 et 5 semaines d'âges et après 1 semaine d’acclimatation entreront en protocole. Selon la fiche research models de la souche NMRI-Foxn1nu/nu proposée par le fournisseur, le poids des animaux se stabilise entre 28 et 35 jours d’âge. Ce stade de développement est couramment utilisé et validé par la communauté scientifique. L’identification par bague est privilégiée, car la plus pratique pour identifier les souris. Elle sera réalisée au cours de la semaine d’adaptation En cas de perte les animaux seront bagués de nouveau ou à défaut des marquages au feutre de couleur des queues pourront également être réalisées pour sécuriser l’identification.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries douze semaines avec un régime hyperlipidique et gavées chaque jour de deux souches bactériennes, avec prélèvements fécaux et sanguins, mesures de composition corporelle et tests de tolérance au glucose et à l'insuline, pour évaluer l'effet de ces bactéries sur la prise de poids et les troubles métaboliques. Le porteur indique que ces procédures peuvent provoquer des hypoglycémies et un stress lié à la contention et au gavage. Sur le remplacement, il affirme que l'écosystème microbien digestif ne peut pas être étudié in vitro et conclut à la "nécessité" du modèle murin.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier dans un modèle murin d’obésité induite par le régime l’impact de l’administration de deux souches du genre Subdogranulinum sur la prise de poids et le développement d’altérations métaboliques, telles que l’insulino-résistance et l’hyper-lipidémie, susceptibles d'altérer la santé des patients souffrant d'obésité ou de syndrome métabolique.

Bénéfices attendus

Nous espérons réduire la prise de poids et les complications métaboliques associées en conditions obésogènes. Si ces résultats sont obtenus, la possibilité de l’utilisation future des souches sélectionnées chez l'Homme peut être envisagée. Si non, des résultats d'amélioration au niveau des paramètres physiologiques liés à la santé générale et à la santé intestinale sont attendus.

Procédures

La moitié des animaux seront nourris avec un régime hyper-lipidique pendant 12 semaines et 72 animaux en état vigile seront gavés quotidiennement rapidement (10 secondes maximum) en pendant toute la durée de l'étude. Des échantillons fécaux (4 fois en tout ; 15 min/prélèvement), des mesures de la composition corporelle avec résonance magnétique nucléaire (toutes les 3 semaines ; 3 min/mesure), des tests de tolérance au glucose (1 gavage et 5 prélèvements de sang de petit volume) et des tests de la sensibilité à l’insuline glucose (1 injection et 5 prélèvements de sang de petit volume) pour une durée totale de chaque test de 2h30 seront effectués avec un laps de temps d’au moins une semaine entre ces interventions. Finalement, un prélèvement de sang sera effectué sous anesthésie sur tous les animaux avant l’euthanasie.

Impact sur les animaux

La masse grasse et le poids des souris soumises à un régime hyper-lipidique devraient augmenter de façon plus importante que ceux de leurs homologues ayant suivi un régime standard. Ces souris devraient également présenter des altérations du métabolisme, ce qui fait partie du programme expérimental. Certaines procédures puissent entraîner des hypoglycémies, un léger inconfort ou du stress, comme la contention pour la résonance magnétique nucléaire, le gavage ou les challenges métaboliques. L'expérience antérieure d'études menées avec des méthodologies et des produits similaires nous laisse penser qu'aucun autre type d’effet indésirable ne se produira.

Devenir

À la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour collecter les tissus pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Actuellement, l’étude de l’écosystème microbien digestif et de son impact sur les maladies métaboliques ne peuvent pas être réalisés in vitro. La plupart des bactéries digestives ne survivent pas en dehors de leur hôte, d'où la nécessité d'utiliser le modèle murin. De plus, le projet vise à déterminer l'influence de la modification de l'écosystème microbien sur les grandes fonctions systémiques. Celles-ci jouent un rôle important dans la physiopathologie des désordres métaboliques et ne peuvent pas être évaluées en l’absence de ces systèmes.

Réduction

Afin d'utiliser le moins d'animaux possible et de réduire le nombre de groupes dans les expériences suivantes si les résultats sont conformes aux attentes, le design expérimental correspond au nombre minimal de souris nécessaires afin d’obtenir des résultats scientifiquement pertinents et statistiquement fiables (96 animaux dans 8 groupes). A cet effet, ce nombre a été évalué en tenant compte de la variabilité interindividuelle des paramètres mesurés et de la réplication au sein de chaque groupe. De plus, les groupes sans administration de bactéries seront utilisés comme témoins communs, pour éviter d'utiliser un nombre double de souris comme témoins dans deux expériences différentes. Parallèlement, tous les échantillons obtenus dans le cadre de cette expérience seront stockés en vue d'une utilisation future.

Raffinement

Les manipulations seront effectuées par des personnes expérimentées et compétentes afin de réduire au maximum la durée, la sévérité et l’intensité de la douleur. Parallèlement, le matériel utilisé dans les procédures a été choisi pour limiter le stress. En début d'expérience, les animaux bénéficieront d'une semaine d'acclimatation et d'une semaine d'entraînement afin de les habituer à être manipulés et de réduire leur stress. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour observer leur état général et leur comportement. Un contrôle hebdomadaire de la prise alimentaire et du poids sera aussi effectué pour s'assurer que les animaux sont en bonne santé. De plus, un laps de temps de minimum 1 semaine entre les procédures non continues de classe modérée sera respecté afin de laisser un temps de récupération aux animaux. Les souris seront regroupées à 4 par cage au maximum et 3 au minimum pour ne pas souffrir du manque d'interactions sociales. Les souris disposeront de matériel en carton pour enrichir l’environnement. De plus, il existe des points limites définis, adaptés aux différentes interventions de la procédure.

Choix des espèces

La souris C57Bl/6J est la plus utilisée dans la majorité des études antérieures portant sur les maladies métaboliques en raison de sa propension au développement de l’obésité et du diabète de type 2. Les souris sont faciles à manipuler et les administrations orales bien maitrisées et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’expérimentation. Pour observer les effets sur l’état métabolique des animaux à l’âge adulte, les animaux seront donc âgés de 8 semaines au début du traitement et de la mise sous régime.