Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
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- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
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- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Suivi par échographie cérébrale ultrarésolutive des anomalies de perfusion microvasculaires dans les suites d’une hémorragie sous arachnoïdienne chez la souris
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement sévère. On leur fixe un cadre métallique sur le crâne puis on injecte du sang dans leur liquide cérébrospinal pour provoquer une hémorragie méningée, avant des échographies quotidiennes et des tests moteurs de marche, de grimpe sur plan incliné et d'analyse vidéo de la démarche. Le porteur indique que le modèle peut entraîner douleurs, céphalées, paralysie des membres et troubles engageant le pronostic vital, et justifie la mise à mort pour ne pas prolonger ces atteintes. Il affirme que seule l'étude chez l'animal éveillé permet de relier l'ischémie visualisée aux déficits cliniques.
Objectifs
L’hémorragie méningée est une forme d’accident vasculaire cérébral entraînant la mort (30% des patients atteints) ou des séquelles neurologiques (35% des survivants). Ces séquelles sont principalement causées par l’ischémie cérébrale retardée, apparaissant dans les 7 à 21 jours après l’hémorragie initiale et provoquant des zones d’ischémie avec mort des cellules cérébrales. Les mécanismes impliqués dans l’apparition de cette complication sont très mal connus actuellement parce qu’il n’y a actuellement aucun moyen de prédire ou visualiser son apparition. Ce qui fait également qu’aucun traitement préventif ou curatif n’existe à ce jour. L’échographie cérébrale ultrarésolutive pourrait permettre de visualiser l’apparition de cette complication grâce à sa meilleure résolution permettant de visualiser si le sang présent dans le cerveau circule dans les vaisseaux ou pas . Notre projet de recherche propose donc de suivre l’évolution de cette circulation de sang par échographie cérébrale chez des souris chez lesquelles nous provoquons une hémorragie méningée en injectant du sang dans le liquide dans lequel baigne le cerveau. Pour respecter la définition de l’ischémie cérébrale retardée, nous devrons suivre pendant 10 jours l’apparition de troubles de conscience ou de paralysie des membres supérieurs ou inférieurs en parallèle des séances d’échographie cérébrale.
Bénéfices attendus
Premièrement, ce projet permettrait de préciser la pathophysiologie et la cinétique d’apparition des différents mécanismes mis en jeu dans l’ischémie cérébrale retardée. Cette complication reste fréquente, atteint une population jeune (de 30 à 60 ans) et est responsable de lourdes séquelles motrices et psychiatriques. Visualiser l’apparition de l’ischémie cérébrale retardée serait primordiale avant de pouvoir envisager l’étude de traitements préventifs ou curatifs. Deuxièmement, nous pourrions valider l’utilisation d’une technique d’imagerie cérébrale non invasive très prometteuse et plus facilement accessible pour le suivi quotidien au lit du patient que l’imagerie par résonance magnétique. Cette dernière reste la technique de référence d’imagerie cérébrale, mais nécessite le transport de patients graves en dehors des services de réanimation pour pouvoir réaliser les imageries. Troisièmement, cette technique d’imagerie pourrait avoir un intérêt dans de nombreuses autres situations pathologiques dans lesquelles des anomalies de la microvascularisation des organes semblent impliquées.
Procédures
Les différentes interventions dans ce projet sont : La pose d’un cadre métallique sur le crâne des animaux anesthésiés permettant de maintenir la sonde d’échographie lors des séances d’acquisitions. La procédure ne sera réalisée qu’une seule fois pour tous les animaux et dure en moyenne 60 minutes. La réalisation de ponction du liquide cérébrospinal puis injection de sang, sérum salé isotonique ou bleu de méthylène dans le cerveau des animaux anesthésiés selon le groupe attribué pour simuler une hémorragie cérébrale. La procédure ne sera réalisée qu’une seule fois pour chaque animal et dure en moyenne 20 minutes. La réalisation d’une ponction de sang artériel. Cette procédure est réalisée une seule fois uniquement chez les animaux du groupe expérimental et dure 5 minutes en moyenne. Les évaluations fonctionnelles (test de marche, test de grimpe sur plan incliné...) chez des animaux éveillés. Cette procédure est réalisée quotidiennement chez tous les animaux et dure en moyenne 20 minutes. Les évaluations comportementales par système d’analyse vidéo de la démarche qui permet d’évaluer les problèmes et variations de la locomotion. Cette procédure est réalisée quotidiennement chez tous les animaux et dure en moyenne 20 minutes. La réalisation d’échographies répétées avec pose de la sonde d’échographie dans le cadre métallique précédemment installé chez des animaux éveillés. Cette procédure est réalisée quotidiennement chez tous les animaux éveillés. Leur tête sera immobilisée, mais leurs mouvements ne seront pas entravés. Cette procédure dure en moyenne 30 minutes. La réalisation d’échographie cérébrale sous anesthésie générale. Cette procédure est réalisée 4 fois pour chaque animal et dure 30 minutes. L’injection d’un produit de contraste. Cette procédure sera réalisée à 4 reprises dans le groupe expérimental chez des animaux sous anesthésie générale et dure en moyenne 30 minutes.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont à prévoir des suites des différentes interventions sur les animaux : Les différentes interventions chirurgicales peuvent donner lieu à des douleurs post opératoires localisées et être sources de complications (infection post-opératoire par exemple). En particulier des douleurs aux points de fixation du cadre ainsi que des céphalées importantes. Nous nous attendons par ailleurs à observer des troubles de la vigilance et des anomalies mettant en jeu le pronostic vital comme des troubles du rythme cardiaque ou des anomalies de la ventilation suite à l’augmentation de la pression intracrânienne causée par notre modèle. De plus, nous nous attendons à observer l’apparition de troubles moteur et/ou fonctionnels dans les jours suivant l’induction (paralysie partielle ou complète du membre inférieur ou supérieur, troubles de la vigilance ou baisse de l’activité habituelle). Les souris seront amenées à subir un certain stress dû à leur manipulation tout au long des expériences, bien que la durée de manipulation soit progressivement échelonnée. De plus, le maintien des souris dans nos appareils de mesures pourra aussi être une source d’inconfort, au même titre que la présence du cadre métallique sur leurs têtes, qui peuvent limiter certains mouvements. Enfin, la répétition d’anesthésie générale peut entraîner des troubles du rythme circadien et des comportements anormaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue des expérimentations, notre modèle pouvant être cause de douleurs et de handicaps sévère, l’euthanasie des animaux permetra de ne pas les prolonger.
Remplacement
Pour pouvoir transposer notre étude à la pratique médicale humaine, il est essentiel de vérifier que les zones d’ischémie cérébrale visualisées sur l’échographie sont responsables de l’apparition de déficits cliniques. Ceci ne peut être réalisé qu’avec un modèle animal et chez des animaux éveillés pour pouvoir évaluer l’atteinte fonctionnelle. De plus, il n’existe actuellement pas de méthode alternative pour étudier le cerveau dans sa globalité.
Réduction
Pour l’induction de l’hémorragie sous arachnoïdienne, nos calculs de nombre d’animaux (185 animaux dont 40 contrôles) se basent sur des estimations de puissance statistiques ainsi que la littérature afin de s’assurer que nous avons un nombre suffisant d’animaux pour pouvoir produire des résultats statistiquement significatifs. Nous prenons en compte la mortalité des animaux ainsi que l’incidence limitée (30%) de l’Ischémie Cérébrale Retardée. Nous comptons raffiner ces estimations à priori en calculant pendant nos expériences des valeurs plus précises de taille d’effet et de déviation standard pour obtenir une estimation plus précise du nombre d’animaux nécessaire. S’il s’avère que nous avons besoin de moins d’animaux que prévus, nous stopperons les expérimentations. La définition de points limites quant à la qualité d’imagerie des animaux nous permet par ailleurs de limiter les inductions de Hémorragie sous Arachnoïdienne aux seuls animaux dont le signal est exploitable.
Raffinement
La réalisation de la chirurgie pour pose de la cage crânienne et de l’induction de l’hémorragie cérébrale seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie multimodale pré et post-opératoire. Les séances d'imagerie seront réalisées sur animal vigile dont la tête sera immobilisée mais dont le mouvement des pattes ne sera pas entravé L’utilisation d’une cage en fibre de carbone extrêmement légère, reposant sur un flux d’air laminaire (causant l’absence de friction) permet en effet à l’animal de faire bouger la cage lorsqu’il tente de bouger. Ainsi bien que l’animal ne bouge pas par rapport à la sonde d’imagerie, de son point de vue le déplacement est similaire à celui qu’il aurait effectué sans être fixé. Ceci permet de se rapprocher d’une situation normale et de réduire le stress de l’animal pendant la séance. De plus, des séances d'habituation seront effectuées au préalable pour réduire encore plus ce stress et introduire progressivement les animaux dans la machine nécessaire à l’acquisition de l’imagerie. Les souris seront observées plusieurs fois par jour et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques. Les souris seront hébergées dans des cages de 5 animaux enrichies.
Choix des espèces
Des études antérieures existent montrant que l’ischémie cérébrale retardée existe bien chez des souris avec une apparition dans les 3 à 10 jours après une hémorragie cérébrale et l’apparition de déficits cliniques dans les 7 à 10 jours. La souris est donc un modèle convenable pour l’étude préclinique de l’ischémie cérébrale retardée, car elle présente des caractéristiques semblables à ce que l’on observe chez l’homme. La méthode d’imagerie que nous utilisons est particulièrement adaptée à la souris car l’épaisseur de son crâne est très faible et permet de réaliser les séances d’imageries sans avoir recours à des agents de contraste dont l’injection nécessite une anesthésie. Cette méthode d'imagerie éveillée n'existe aujourd'hui que chez la souris. Les imageries éveillées permettent de s’affranchir des effets sur le métabolisme de l’anesthésie, et de mesurer par l’activité de la souris des paramètres comportementaux supplémentaires. Le stade de développement des animaux est de 8 à 10 semaines. Nous effectuons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’hémorragie cérébrales.
Caractérisation des rôles d’une famille de protéines membranaires dans la fonctionnalité du système immunitaire et dans le cancer chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Selon les groupes, elles reçoivent des injections, une infection par deux virus ou une greffe de cellules tumorales, avant un prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'infection virale peut entraîner fièvre, forte perte de poids et mortalité accrue, et que les tumeurs pulmonaires peuvent provoquer des difficultés respiratoires. Il conclut qu'aucune alternative n'existe pour étudier le rôle de ces protéines membranaires dans le système immunitaire et le cancer, et compare souris sauvages et souris génétiquement modifiées.
Objectifs
Certaines protéines cellulaires sont capables de se lier aux membranes cellulaires et de modifier leur comportement, influençant ainsi un large nombre de fonctions de la cellule. Parmi elles, certaines protéines lient les membranes et interfèrent avec la fusion entre membranes cellulaires et virales. Si cette action protège la cellule de l’infection virale, elle l’expose potentiellement à des disfonctionnements, car la façon dont les membranes se comportent en demeure changée. En utilisant un modèle souris dans lequel les gènes codants pour ces protéines membranaires sont non fonctionnels et qui présente un phénotype non-dommageable pour l’animal, le but du projet est de déterminer si des tels protéines membranaires peuvent modifier le développement du système immunitaire après infection virale ou en réponse à des immunogènes modèles (protéines qui stimulent le système immunitaire), et si elles peuvent influencer le développement des tumeurs chez la souris.
Bénéfices attendus
L’identification de mécanismes d’action des protéines membranaires permettra dans le court terme d’avancer dans les connaissances sur les fonctions de ces protéines et dans le long terme, de les transposer à l’homme pour une meilleur compréhension du système immunitaire, ainsi que du processus de développement du cancer.
Procédures
Procédure 1. Les animaux seront soumis à une seule injection sur animal vigile (1 fois, 20 secondes, 60 souris). Procédure 2. Les animaux seront soumis à une injection sur animal vigile. Dans le groupe A, les animaux recevront 1 seule injection (20 secondes, 90 souris). Dans le groupe B, les animaux recevront 2 injections (à J0 et J28 ; de 20 secondes chacune, 90 souris). Procédure 3. Les animaux seront soumis à une infection sous anesthésie générale par deux virus donnant lieu à une infection aigue ou chronique (1 fois, 1 minute, 300 souris au total). Procédure 4. Les animaux seront soumis à une injection sous anesthésie générale de cellules tumorales (1 fois, 1 minute, 240 au total).
Impact sur les animaux
Procédures 1 et 2. L’acte d’injection peut provoquer une gêne potentielle au site d’injection, mais pas d’autres effets indésirables prévus. Procédure 3. L’infection virale peut conduire à une mortalité accrue, à de la fièvre, à une perte de poids importante ainsi qu’à modifications d’activité/comportement. Procédure 4. La croissance des cellules tumorales dans les poumons peut provoquer difficultés respiratoires et mortalité accrue.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d’organes afin d’analyser de manière exhaustive le développement du système immunitaire et de la tumeur chez l’animal
Remplacement
A ce jour, le seul modèle alternatif à l’utilisation d’animaux pour l’étude des protéines membranaires est représenté par de modèles de culture cellulaire in vitro. Si ce modèle a permis d’affiner un certain nombre de questions sur les fonctions de ces protéines dans la cellule (et de ce fait de restreindre le nombre d’animaux pour répondre à une série bien plus ciblée de questions biologiques), l’approche ex vivo ne permet pas de comprendre le rôle de ces protéines dans le fonctionnement du système immunitaire et dans le cancer. Pour répondre à ce type de question biologique le nombre d'acteurs cellulaires et moléculaires mis en jeu est trop important et leurs interactions trop complexes pour pouvoir être modélisés par des approches ex vivo. Aucune alternative existe donc à l’utilisation d’animaux pour atteindre les objectifs spécifiques de ce projet et de ce fait le projet n’envisage pas l’usage d’alternatives animales en remplacement partiel et/ou complet. Ainsi, la comparaison entre modèles de souris sauvages et souris dont les protéines membranaires sont non fonctionnelles constitue le modèle biologique plus pertinent pour explorer leurs fonctions.
Réduction
Une étude bibliographique approfondi a permit d’identifier les doses optimales de produits et de virus, ainsi que les points d’analyses plus pertinents pour répondre aux questions scientifiques de chaque partie du projet. Cela a permis de réduire le nombre d’animaux à utiliser au maximum.
Raffinement
Les animaux resteront en groupes sociaux afin de limiter le stress lié à l'isolement et des points limites prédictifs et précoces seront mis en place pour préserver le bien-être animal. Afin de réduire le stress et la douleur de l’animal, les gestes d’injection plus invasifs seront faits après anesthésie général. Après chaque intervention sur l’animal, son état général, son poids, sa température et son comportement seront surveillé le lendemain de l’intervention et puis de façon régulière.
Choix des espèces
Malgré l'existence de différences entre les souris et les hommes, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. De plus, la richesse des outils et des réactifs disponibles chez la souris permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant pour le projet. Des souris âgées de 8-12 semaines seront utilisées pour les expérimentations. A cet âge, les souris ont un système immunitaire mature.
Impact d’un stress inflammatoire chronique sur le vieillissement, la longévité et la descendance chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime appauvri en fibres et pro-inflammatoire, des gavages répétés et des prises de sang, et 40 % d'entre elles absorbent un produit induisant une inflammation intestinale pendant sept jours, cinq fois de suite. Le porteur indique attendre une perte de poids de 5 à 10 % et des diarrhées durant les phases inflammatoires, et héberge les souris seules pour éviter la coprophagie. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de modéliser in vitro la rupture de la symbiose entre l'hôte et son microbiote.
Objectifs
Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles, dont maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète…, ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à notre environnement (microbiote, régime alimentaire). Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins des êtres vivants. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres au sein du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Récemment il a été montré que ce déséquilibre résulte d’une altération de la symbiose hôte-microbiote, elle-même caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Nos travaux suggèrent que ce déséquilibre résulte d’une rupture du dialogue microbiote-hôte due à des signaux inducteurs inflammatoires. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies chroniques, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par une diminution qualitative du microbiote. L’objectif de notre projet est d’étudier la mise en place d’une rupture de symbiose microbiote-hôte occasionnée par un stress inflammatoire chronique chez l’animal et d’évaluer les conséquences de cette rupture sur le vieillissement des animaux et leur descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’humain et permettront d’identifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques inflammatoires intestinales.
Bénéfices attendus
Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. Dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales, une perturbation du microbiote intestinal est souvent associée à une dérégulation de l’état de santé chez l’humain. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance de cette perturbation conduit souvent à une succession de phases aigües de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.
Procédures
Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et inducteur d’inflammation susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Tous les animaux adultes recevront une solution par gavage au minimum 4 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de gavage contention comprise est de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue de 40 µL. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 1 et au maximum 2 prises de sang à la joue de 200 µL. Le temps de collecte contention comprise est de 30 seconde à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux adultes seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans les procédures. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. 40% des animaux adultes recevrons dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin durant sept jours consécutifs répéter 5 fois avec une semaine de récupération entre chaque prise.
Impact sur les animaux
Les animaux seront placés en cage individuelle, entrainant un stress modéré, afin d’éviter des contaminations croisées de microbiote par coprophagie. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise de poids et soient sujets à des diarrhées pendant les phases inflammatoires aigues. Des prises de sang engendrant un léger stress de très courte durée seront réalisées et les animaux seront également gavés oralement avec des solutions permettant d’évaluer respectivement le temps de transit et la perméabilité intestinale. Ces protocoles constitueront un stress modéré notamment dû à la contention. Des signes de douleurs intestinales (diarrhée) sont attendus pendant les phases inflammatoires.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte. En effet, comprendre et caractériser l'évolution de la symbiose microbiote-hôte nécessite la mise en place d'intéractions bidirectionnelles complexes entre l'hôte et son microbiote. Ces intéractions sont difficilement controlables et pertinentes dans des modèles in vitro actuel de type microbiote/organoïde, notamment sur des temps longs tels que ceux décrient dans notre projet, ou nous ciblons particulièrement les périodes post stress et plus particulièrement la résilience ou non de la symbiose.
Réduction
D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 134 animaux pour le groupe contrôle et 188 animaux pour le groupe expérimental sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux, leur comportement et leur prise de poids.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.
Création d’une lignée de hamsters Syriens (Mesocricetus auratus) génétiquement modifiés par électroporation in vivo du système CRISPRCas9
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
7 750 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, la quasi-totalité tuée à l'issue et 21 femelles réutilisées. Jusqu'à 950 femelles subissent une superovulation par injections hormonales, un accouplement puis une chirurgie de 30 minutes pour modifier génétiquement les embryons par CRISPR-Cas9, et les petits nés reçoivent une biopsie de l'oreille et un tatouage. Le porteur indique que les petits ne portant pas la modification ciblée sont tués, faute de pouvoir vérifier l'ensemble de leur génome. Il présente ce nouveau modèle comme un moyen d'étudier la reproduction saisonnière et rattache les bénéfices humains, sur la fertilité, à une perspective lointaine.
Objectifs
Le hamster Syrien est un modèle de rongeur saisonnier très bien caractérisé avec une activité de reproduction contrôlée par la photopériode (durée du jour sur 24h). Nous souhaitons développer des modèles de hamster génétiquement modifiés permettant une étude approfondie de la fonction de certains peptides impliqués dans la régulation saisonnière de la reproduction. Depuis longtemps on sait que les variations annuelles de la sécrétion nocturne de mélatonine permettent une représentation centrale des saisons. Au cours des dernières années plusieurs équipes ont montré que la mélatonine, via des récepteurs spécifiques exprimés dans le cerveau contrôle la production de thyréostimuline (TSH) qui régule la production d’hormones thyroïdiennes dans le cerveau. Ces hormones thyroïdiennes agiraient ensuite notamment sur l’expression d'un peptide spécifique pour moduler l’activité de l’axe reproducteur. Cette voie moléculaire sous le contrôle de la mélatonine reste néanmoins hypothétique. Les études de cette voie se limitent à des études uniquement pharmacologiques par manque de modèles de rongeurs saisonniers génétiquement modifiés. Nous souhaitons donc développer ces modèles de hamster génétiquement modifiés permettant une étude approfondie de la fonction de ce peptide régulateur dans la régulation saisonnière de la reproduction.
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice de ce projet est de faire avancer les connaissances sur l'implication des peptides RFAmides dans la régulation saisonnière de la reproduction sur un modèle pertinent. Par ailleurs, de plus en plus d’études montrent l’importance des variations saisonnières sur la régulation des fonctions physiologiques et notamment de la fonction de reproduction chez l’humain avec notamment des variations saisonnières de fertilité, de l'activité gonadique et de l'hypophyse qui contrôle l'activité des gonades (Meyer, 2016 ; Castro Dopico, 2015 ; Rojansky, 1992). Ces variations saisonnières seraient tout comme chez le hamster doré sous contrôle de la mélatonine, dont la durée de sécrétion nocturne varie en fonction des saisons qui sont elles-mêmes encodées notamment par une variation de la durée de la phase lumineuse/24j. L’étude de l’intégration de ces facteurs saisonniers dans le système nerveux constitue donc un premier pas vers une meilleure connaissance des mécanismes par lesquels l’humain est affecté par les variations annuelles de la lumière.
Procédures
950 femelles au maximum subiront un protocole de superovulation par injection de deux hormones à 3 jours d'intervalles. Chaque injection dure 30 secondes. Chaque femelle superovulée sera accouplée une nuit avec un mâle reproducteur. Chaque femelle sera le lendemain soumise à une contention (animal vigile) pour vérifier la présence d'un bouchon vaginal signe de copulation et donc de fécondation. Les femelles bouchonnées seront soumises à une chirurgie sous anesthésie/analgésie d'une durée égale à 30 minutes. Les petits génétiquement modifiés seront soumis à une biopsie d'oreille et un tatouage des doigts (durée 5 minutes).
Impact sur les animaux
Chirurgie : perte de masse moyenne de 8 à 10% maximum , douleur modérée, inflammation, agrafes arrachées. On ne peut totalement exclure un risque infectieux et inflammatoire. Piqure ip superovulation : 2 à 3j d’intervalle alternance coté injection : saignement si piqure dans un organe, risque d’inflammation. Accouplement : agressivité de la part de la femelle envers le mâle conduisant à des blessures si pas dans la bonne phase du cycle (oestrus) Electroporation : réduction possible du nombre de petits par résorption fœtale ou par mort in utéro des embryons . Identification tatouage et biopsie d'oreille : douleur aigue transitoire. On ne peut exclure une inflammation et un saignement consécutifs à la piqûre du doigt et au prélèvement du fragment d'oreille. Stress transitoire lié à l'isolement des femelles suite à la chirurgie.
Devenir
Les femelles superovulées non accouplées seront réutilisées dans d'autres projets chaque fois que cela sera possible. Les femelles gestantes seront gardées en vie pour suivre la gestation et la mise bas. Néanmoins nous ne pouvons en estimer à priori le nombre car cela dépendra du fait qu'elles soient ou non en pleine ovulation lors de la mise en accouplement avec le mâle. Les petits présentant la modification ciblée seront quant à eux conservés pour être utilisés dans des projets. Les autres seront mis à mort car il est impossible de vérifier tout le génome de ces animaux pour vérifier si la procédure a pu induire une modification génétique ailleurs que sur le gène cible.
Remplacement
Nous travaillons à la génération d’un nouveau modèle animal adapté à la recherche sur la régulation saisonnière de l’activité de reproduction qui est un mécanisme complexe faisant intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines (hypothalamus, hypophyse, gonades); aussi est-il impossible de réaliser une telle étude sur des organes isolés ou de reproduire l’axe gonadotrope dans sa complexité dans un modèle in silico.
Réduction
Ce projet a pour objectif la mise au point et la validation d’une nouvelle approche de transgénèse sur une nouvelle espèce : le hamster doré.Le nombre d'animaux néc essaires aux mises au point de la méthode et ensuite à la production d'animaux nécessaires à l'établissement d'une colonie ont été estimé empiriquement sur la base des connaissances que nous avons du modèle animal , de la littérature disponible sur le rat et la souris et d'échanges avec des scientifiques qui utilisent la méthode du I-GONAD . Avec cette aproche il n'est actuellement pas possible d’estimer le nombre d’animaux qui seront génétiquement modifiés sur l'ensemble des petits nés ni s'ils seront aptes à se reproduire. En fonction du sexe et de l’espèce le peptide cible influe différemment sur la reproduction des animaux. Néanmoins, pour la durée du projet, nous estimons donc que nous aurons au maximum à utiliser 750 femelles pour la production d’animaux génétiquement modifiés et 100 femelles maximum pour la mise au point complète de l'approche méthodologique sur l'espèce. Dès validation de la méthode et dès que nous aurons le nombre d’animaux des deux sexes suffisant pour lancer une colonie, les expériences seront interrompues. Aucune analyse statistique ne sera réalisée au cours de ce projet. L’approche choisie diminue drastiquement le nombre d’animaux utilisés puisqu'il ne sera plus nécessaire de produire des mâles vasectomisés pour obtenir ensuite les femelles pseudo-gestantes indispensables au transfert d’embryons en transgénèse classique. Chaque fois que cela sera possible nous proposerons à la réutilisation dans d'autres projets les femelles superovulées mais non accouplées que nous ne pourront donc pas utiliser.
Raffinement
Hébergement: 1 animal/cage après chirurgie pour suivi et traçabilité des mises-bas et suivi des petits. Cage enrichie avec un barreau à ronger et matériel de nidation. Contact maintenu entres congénères grâce aux cages transparentes ouvertes. La chirurgie nécessaire pour l’électroporation in oviducte sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie profonde. La température corporelle des animaux est maintenue pendant toute la durée de la chirurgie par un tapis chauffant thermostaté couplé à une sonde rectale puis les animaux sont replacés dans leur cage respective qui sont également maintenues sur tapis chauffants thermostatés ou lampe chauffante jusqu’à leur complet réveil. Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire pendant 3 jours et seront suivis quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie et leur état de santé sera évalué grâce à une grille de score avec examen de la locomotion spontanée, provoquée, poids, état général, état de la plaie). Si une souffrance est détectée chez l'animal, l’avis du vétérinaire de l’EU sera demandé et le traitement requis mis en place ou mise à mort (analgésie ou mise à mort). De plus, des poinst limites ont été préalablement établis permettant de limiter la souffrance animale en interrompant chaque fois que nécessaire la procédure.
Choix des espèces
Le rat et la souris ne sont pas des modèles adaptés à l’étude des rythmes saisonnier pour laquelle le hamster est le modèle de rongeur le plus utilisé. De plus, la technique de transgénèse par CRISPR Cas9 a déjà été réalisée avec succès sur le hamster Syrien et le génome est entièrement séquencé ce qui donne accès à la séquence du gène cible Nous utiliserons des animaux adultes pleinement sexuellement mâtures donc à partir de 10 semaines.
Etude du rôle d’une protéine dans la progression de l’ostéosarcome et la restauration du sytème immunitaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales à la patte, jusqu'à treize séances d'imagerie sous anesthésie et des injections répétées de molécules, pour tester des candidats médicaments contre l'ostéosarcome de l'enfant. Le porteur affirme que le développement tumoral ne génère pas de douleur apparente, tout en prévoyant une surveillance trois fois par semaine et des points limites précoces. Les retombées cliniques annoncées restent renvoyées à un futur transfert vers la clinique, l'objectif immédiat étant de valider l'effet antitumoral chez la souris.
Objectifs
Dans les cancers pédiatriques, l’ostéosarcome (OS) est un cancer rare qui touche 3.4 cas par million d’habitants/an. Ces tumeurs d’origine osseuse se développent dans diverses localisations comme au niveau des os long (tibia, fémur), épaule ou encore au niveau de la mâchoire. La survie à 5 ans des patients est d’environ 75% alors qu’elle est inférieure à 27% chez les patients dont la maladie s’est propagée à d’autres parties du corps (métastases). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. De nouvelles molécules ciblant les cellules immunitaires ont été identifiées, dont leur rôle va être de rétablir le système immunitaire afin de combattre la tumeur. Il faut donc démontrer que ces molécules possèdent des caractéristiques de candidats médicaments antitumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale de l’ostéosarcome chez l’enfant, les adolescents et jeunes adultes. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité antitumorale de ces molécules c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume de ces tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (ostéosarcome) en vue d’un transfert technologique vers la clinique.
Procédures
Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe au niveau de la patte gauche avant l'anesthésie. Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée : 5 min maxi) 13x max (entre 5 et 13 selon la procédure) pour l'imagerie lumineuse (Durée : 8 min maxi par point d’acquisition soit 1x/semaine). Traitement : 2 jours/7 pendant 5 semaines maximum ou 3jours/7 injection des molécules pendant 3 semaines maximum. Évaluation de l’efficacité des composés et prise de greffe par imagerie lumineuse sous anesthésie (1x/semaine) et par mesure au pied à coulisse de l’épaisseur des pattes (2x/semaine) pendant 90 jours maximum (de 35 à 90 jours selon les procédures)
Impact sur les animaux
La toxicité des molécules a été évaluée précédemment et n’a pas montré de toxicité aux doses que nous allons utiliser. La greffe de cellules tumorales ne génère pas de douleur, de plus quand cela est compatible l'animal est anesthésié et reçoit un antalgique. Le développement tumoral ne génère pas de signes de douleur apparente, ni de problème de locomotion. Par conséquent, les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Toutefois les animaux sont surveillés 3x/semaine pour prévenir et détecter tout mal être animal. Lors du traitement pharmacologique, un cadran sera défini et les zones d'injection seront alternées (gauche-droite-haut-bas) pour le bien-être animal. Ce protocole d'administration a déjà été mis en œuvre et il n'a pas été observé de souffrance particulière. Le développement de métastases pourrait entrainer une difficulté respiratoire, des douleurs abdominales à la palpation (foie), un envahissement de plusieurs organes altérant leur fonction qui seront détectés par imagerie (1x/semaine).
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Pour le remplacement, les traitements à évaluer ont déjà démontré des résultats prometteurs in vitro sur de nombreux tests comme des évaluations à partir de cellules de sang humain frais ou de tumeurs isolées de patients. Les modèles tumoraux chez la souris nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme, ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts et de déterminer les doses maximales tolérées. De plus, pour chaque modèle tumoral orthotopique, la progression de la tumeur sera suivie par imagerie par bioluminescence. Cette approche non invasive et quantitative nous permet de suivre la progression de la maladie et de décider de la mise à mort des souris avant même l’apparition de symptôme critique. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.
Raffinement
Nous avons généré une lignée cellulaire qui émet de la lumière afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir recours à sa mise à mort dans un but de raffinement. Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 souris par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe au niveau de la patte, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.
Choix des espèces
L’utilisation des souris a un âge un peu plus précoce, nous permettra d’avoir une meilleure reproduction du système immunitaire et des hormones retrouvés chez les patients pédiatriques. Nous avons déjà démontré qu’à des âges plus précoce la prise de greffe reste fiable et donne de résultats clairs afin d’analyser l’efficacité de nouveaux traitements. De plus l’utilisation de souris nous permettra de réellement étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans le développement tumoral. Nous avons également l’avantage de posséder des souris génétiquement modifiées rendant possible l’utilisation d’un anticorps humain permettant alors un rapprochement entre le pré-clinique et clinique plus robuste.
Régulation de l’évitement comportemental dans l’hippocampe
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont quatre cents dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et trois cents en gravité modérée. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections, une à deux chirurgies stéréotaxiques du cerveau et un test d'évitement de place répété cinq jours, avant mise à mort pour analyse des organes. L'objet est fondamental, identifier les circuits de l'hippocampe qui commandent l'évitement, le porteur reliant ce comportement au stress post-traumatique et espérant à terme des cibles thérapeutiques. Il affirme qu'il est "impossible de remplacer l'animal vivant" pour étudier ce comportement.
Objectifs
Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les neurones de l’hippocampe qui jouent un rôle clef dans la navigation spatiale et les comportements de défense. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’hippocampe contrôle l’évitement de place chez la souris. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ce circuit.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.
Procédures
Ce projet s’étalera sur 5 ans et impliquera 6 procédures expérimentales. Les procédures comprennent toutes les injections intra-péritonéales (3 injections sur la vie de l'animal, quelques secondes), la chirurgie stéréotaxique (1 à 2 chirurgies d'une heure chacune), le comportement (5 jours, 30 min par jour) et la mise à mort (quelques secondes) pour collecter les organes pour analyse ultérieure.
Impact sur les animaux
Le comportement d’évitement de place, les injections intrapéritonéales, les approches de chirurgie stéréotaxique, et la mise a mort engendrent des douleurs et stress modéré. L'isolement engendre de l'inconfort modéré.
Devenir
Notre étude nécessite de mettre à mort les animaux pour récupérer les organes que nous étudierons notamment par histologie.
Remplacement
Il est impossible de remplacer l’animal vivant pour l’étude du comportement d’évitement. La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 704 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera avec des analyses statistiques en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.
Raffinement
Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont proches les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être et des points limites adaptés. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.
Choix des espèces
L’évitement est un comportement extrêmement important pour la survie et est donc conservé chez les mammifères. Par ailleurs, ce projet requiert l’étude fine de populations de neurones accessibles uniquement via des modèles murins transgéniques. Les souris se reproduisent rapidement (une portée par mois) et leur système nerveux atteint son développement adulte en 12 semaines. Ainsi, la souris adulte représente un modèle de choix pour étudier les mécanismes neuronaux qui contrôlent le comportement d’évitement.
Développement d’une méthode d’observation du système glymphatique/lymphatique par imageries in-vivo.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
50 souris vont être utilisées et toutes tuées à l'issue, vingt sous anesthésie sans réveil et trente dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie crânienne puis une injection d'agent de contraste après ouverture de la dure-mère, avec des séances d'imagerie sous anesthésie, pour mettre au point une méthode d'observation de la circulation du liquide céphalorachidien. Le porteur indique que cette injection peut provoquer une hypotension intracrânienne avec troubles visuels, auditifs et vertiges, et que les animaux ayant reçu l'agent de contraste ne peuvent être réutilisés. Sur le remplacement, il reconnaît caler une partie des réglages d'imagerie sur des tubes de solution, mais conclut à l'impossibilité d'éviter le recours aux souris.
Objectifs
Le liquide céphalo-rachidien (LCR) correspond au liquide présent autour et dans le cerveau et la moelle épinière. Ces rôles dans le cas du cerveau sont multiples. L’un d’eux consiste à l’évacuation des déchets cérébraux gâce à la circulation du LCR dans le cerveau, décrit comme le système glymphatique/lymphatique. Depuis environ 10 ans, avec l’émergence de nouvelles méthodes d’observation utilisant l’imagerie par résonance magnétique (IRM) ou le microscope bi-photons, ce rôle du LCR se révèle être impactée dans le développement de différentes neuropathologies (Alzheimer, SEP, AVC, Parkinson, traumatisme cérébral …), par des perturbations du sommeil et le vieillissement cérébral. Il représente donc un biomarqueur important et surtout une potentielle cible thérapeutique. Dans ce contexte, la nécessité de développer les outils in-vivo pour l’observation de ce système est important pour donner accès à cette nouvelle cible au fort potentiel et pour comprendre les mécanismes de neuropathologies.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous disposerons d'un nouvel outil pour observer les perturbations du système glymphatique/lymphatique représentant un biomarqueur important dans l’évolution des pathologies neurologiques permettant une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à leur développement et une cible potentielle pour de nouveaux traitements.
Procédures
Procédure 1 : Les animaux seront soumis à : deux examens en imagerie sous anesthésie d'une durée maximum de 1h et une injection (1 min) précédée par une chirurgie (environ 20 min) Procédure 2: un examen en imagerie sous anesthésie d'une durée d'une heure et une injection (1 min) précédée par une chirurgie (environ 25 min)
Impact sur les animaux
L’anesthésie entraîne une hypothermie, une dépression respiratoire et cardiovasculaire. L’injection nécessite une ouverture de la dure-mère assurant l'étancheité du cerveau, pouvant induire une hypotension intracrânienne source de différents troubles : visuels, auditifs, vertiges, …
Devenir
Les animaux ayant reçu un agent de contraste, ne pourront être réutilisés dans un autre projet. Pour cette raison, ils seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Cette étude ayant pour but de développer des méthodes d’exploration du système glymphatique/lymphatique correspondant à la circulation du liquide céphalo-rachidien, nous ne pouvons éviter l’utilisation d’animaux. Toutefois, une partie des mises au point des paramètres des imageurs se feront sur des tubes de solutions d’agent de contraste à différentes concentrations.
Réduction
Nous avons estimé le nombre minimum d’animaux nécessaire à cette mise au point intégrant le risque d'une mauvaise injection de l’agent de contraste. Ce projet représente une étude pilote aux projets à venir nécessitant l’observation de ce système. Nous utiliserons autant que possible des animaux de réforme non déclarés dans une demande d’autorisation. Le choix de l’usage de techniques d’imagerie in-vivo permet de réduire le nombre d’animaux par la possibilité de suivre dans le temps chez un même animal, l’évolution temporelle du liquide céphalo-rachidien.
Raffinement
Les animaux seront anesthésiés durant les examens en imagerie et l'injection intrathécale. Une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée lors de leur arrivée dans notre animalerie où ils seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi (tunnel, élément pour nidification, baton à ronger). Des points limites ont été définis et adaptés par procédure.
Choix des espèces
La souris étant le modèle de prédilection dans la majorité des neuro-pathologies, nous réaliserons cette étude sur cette espèce à un stade adulte, correspondant au stade des animaux utilisés dans les études de maladies neurodégénératives.
Distribution de vesicules fluorescentes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
60 souris vont être utilisées, en gravité légère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. En bonne santé, elles reçoivent des vésicules bactériennes fluorescentes par injection ou par gavage, puis sont épilées et passées jusqu'à dix fois en imagerie sous anesthésie, pour cartographier la distribution de ces vésicules dans les tissus. Le porteur qualifie les nuisances de légères mais répétées et présente l'objectif comme fondamental, comprendre les échanges entre flore intestinale et organes de l'hôte. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de cet axe dans un "organisme entier" ne peut se faire qu'in vivo.
Objectifs
Il a été decrit recemment que le sang humain contient des vesicules extracellulaires produites par les bactéries provenant de la flore intestinale. Les vesicules seraient donc un intermediaire de communication entre la flore intestinale et l'organisme hôte. Afin de comprendre les échanges entre la flore intestinale et l'hôte, il est nécessaire dans un premier temps de suivre le devenir de ces vésicules bactériennes après leur translocation au travers de l’intestin. Le but de ce projet est donc de cartographier par imagerie chez la souris, la distribution de vésicules bactériennes fluorescentes dans les tissus de l'hôte. Nous voulons suivre le transport de vésicules bactériennes fluorescentes de la flore intestinale vers les organes chez des souris en bonne santé.
Bénéfices attendus
Nous ignorons la cinétique de la biodistribution des vesicules dans le corps de l'animal. Un article a montré que les vesicules de la bactérie Paenalcaligenes introduite par gavage dans la souris se retrouvent dans le cerveau. Ce projet nous permettra de comprendre le role des vesicules bactériennes dans l'axe microbiote/cerveau et dans l'axe microbiote/système immunitaire.
Procédures
Chaque souris subit soit une injection intra-veineuse unique sur animal légèrement anesthésié (de l'ordre d'une minute), soit une administration par gavage (durée : quelques secondes ; jusqu'à 3 gavages espacées de 48 à 76h) sur animal vigile. Puis les souris seront epilées pour permettre l'imagerie (jusqu'à 10 séances d'une minute 30 sur une semaine) sur animal anesthésié . Les prélèvements sanguins (2 minutes / souris) seront realisés sous anesthésie volatile, a chaque passage sur la plateforme d'imagerie. Lorsque les animaux (ou un des animaux) atteindront un des points limites, ils subiront une anesthésie volatile terminale puis un prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
Les vésicules, pouvant entrainer une réaction inflammatoire, ne présentent a priori aucune toxicité pour la souris. Les gestes expérimentaux (injections, gavages, prélèvements sanguins, imagerie sous anesthésie générale) sont liés à une douleur et un inconfort donc une contrainte de niveau léger mais répétée afin de suivre la distribution du signal fluorescent dans tout l'organisme de l'animal. Il existe un risque d'hémoragie lors des prélèvements sanguins qui sera limité par hémostase. Les nuisances restent légères.
Devenir
Tous les animaux en fin d'expérimentation seront euthanasiés, pour des prélèvements d'organes nécessaires à l'analyse des résultats expérimentaux.
Remplacement
Le rôle des vesicules bactériennes de la flore intestinale dans un organisme entier ne peut être étudié qu'in vivo. En effet, les interactions hôte/microbes et notamment système immunitaire et cerveau de l'hôte/microbes nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n'existe donc pas d'alternative à ce jour. Nous avons cependant deja realisé des manipulations de vesicules fluorescentes ex vivo sur sang humain. Il est également prevu dans le projet de faire des mesures de passage de la barrière intestinale à l'aide d'inserts de cultures cellulaires mais ces experiences ne pourront que quantifier le nombre de vesicules fluorescentes qui passent cette barrière mais ne pourra pas décourvir le role de cette translocation.
Réduction
Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse aux différents traitements, des groupes de 8 animaux seront constitués. Ainsi, malgré la variabilité, ce nombre d'animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique. De plus, plusieurs conditions expérimentales seront testées en parallèle, afin de mutualiser les groupes contrôles, et donc de réduire le nombre d'animaux contrôles utilisés.
Raffinement
Afin d'assurer le bien-être des animaux, les souris seront hébergées en groupe sociaux, avec environnement enrichi, eau et aliment standard à volonté. Les injections et l'imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Les expériences seront interrompues dès lors qu'un point limite est atteint. En tout nous proposons de reduire le nombre de souris utilisées a 60 animaux.
Choix des espèces
La plateforme d'imagerie est adaptée a l'analyse de la fluorescence chez la souris dont les tissus ne fluorescent pas naturellement. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d'âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées et le système immunitaire est pleinement mature et permet donc son étude.
Impact d’un composé anti-inflammatoire sur la fonction musculaire dans un modèle murin de la Myopathie de Duchenne
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
36 souris vont être utilisées, en gravité légère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles. Génétiquement porteuses de la myopathie de Duchenne, elles reçoivent un composé anti-inflammatoire mêlé à la nourriture, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie, pour évaluer un candidat-traitement d'une maladie aujourd'hui sans thérapie. Le porteur limite les gestes invasifs, composé dans l'aliment plutôt qu'en injection et mesure par voie cutanée, et n'attend pas d'atteinte au-delà du stress de manipulation. Il indique avoir mené des analyses in vitro au préalable et présente la validation in vivo comme l'étape suivante.
Objectifs
La myopathie de Duchenne est une maladie musculaire irréversible pour laquelle il n'existe actuellement pas de thérapie. Cette pathologie est associée à une inflammation chronique. Des évidences existent montrant un bénéfice d'un traitement anti-inflammatoire sur le muscle, mais actuellement le traitement proposé sont les glucocorticoides qui ont des effets indésirables majeurs lors d'une prise à long terme. L'objectif du projet est d'évaluer l'impact d'une molécule anti-inflammatoire, qui a montré des effets positifs dans d'autres maladies, sur la fonction musculaire de souris atteintes de la myopathie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Le projet vise à évaluer le bénéfice d'un composé anti-inflammatoire sur le muscle malade. Si le composé améliore la force musculaire des animaux malades, des analyses plus poussées pourront être menées (en utilisant les tissus prélevés lors de cette étude), dans une perspective d'utilisation thérapeutique.
Procédures
Les animaux subissent une anesthésie générale pour pouvoir effectuer la mesure de la force musculaire sans stress. La mise en place dans la cage d'anesthésie dure environ 10 secondes et sera effectuée une fois.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont le stress généré par la manipulation des animaux au moment de l'anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en vue de prélever leurs muscles pour des analyses.
Remplacement
Des analyses in vitro ont été menées au préalable et montrent un effet anti-inflammatoire du composé. L'étape suivante est donc de valider in vivo l'efficacité de ce composé. L'amélioration de la fonction musculaire ne peut être réalisée que de façon intégrée et permet d'évaluer l'intérêt thérapeutique de ce traitement dans des conditions précliniques.
Réduction
La force musculaire est un paramètre variable d'un individu à l'autre. Le nombre d'animaux nécessaire pour avoir un résultat définitif a été calculé au plus juste avec un test statistique.
Raffinement
Le composé à tester est inclus dans la nourriture (ce qui évite des injections ou du gavage). La mesure de la force musculaire est réalisée en cutanée (pas d'introduction d'électrodes dans le muscle). Des études précédentes ont montré une prise alimentaire normale et aucun effet indésirable pendant le traitement à la même dose. Aucun impact sur le bien-être de l'animal n'est attendu. Donc, les points limites habituels en vigueur dans l'EU seront suivis en cas de mal être animal, attesté par le comportement (faible mobilité, prostration).
Choix des espèces
La souris myopathe reproduit au niveau de son muscle les défauts observés dans la myopathie de Duchenne, c'est donc un modèle adapté pour tester un composé susceptible d'améliorer le muscle. Les animaux sont utilisés à partir de 8 semaines, c’est-à-dire à l'apparition des symptômes de la maladie dans le muscle.
La larve de poisson-zèbre comme modèle d’étude in vivo pour évaluer les effets « cocktails » de perturbateurs endocriniens sur la progression pathologique des NAFLD et le rôle des vésicules extracellulaires hépatiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
4 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras puis exposées à des cocktails de perturbateurs endocriniens entre le cinquième et le onzième jour après la fécondation, elles servent à étudier la progression des maladies du foie gras, avec une atteinte hépatique et une nage altérée attendues. Le porteur présente la larve comme un modèle "alternatif" au rongeur qui limite l'usage de mammifères, tout en qualifiant l'expérimentation animale d'"indispensable". Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit les interactions entre organes nécessaires à l'étude.
Objectifs
Les maladies du foie gras sont devenues une priorité de santé publique car elles touchent plus de 20 % de la population générale et surtout les personnes obèses (>70% de personnes atteintes). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. L’exposition aux perturbateurs endocriniens, seuls ou en mélange, notamment via l’alimentation, est reconnue comme un facteur pouvant participer au développement de ces maladies. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact de ces molécules sur la santé et en particulier sur les maladies du foie gras. Etant donné la nature complexe de ces maladies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est nécessaire d’avoir une approche utilisant des organismes entiers et donc uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Le premier objectif de ce projet est donc de poursuivre l’évaluation de la larve de poisson-zèbre comme modèle alternatif aux modèles rongeurs pour l’étude des effets cocktail des perturbateurs endocriniens sur les maladies du foie gras. En outre, l’un des mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication important entre les organes participant à la progression de ces maladies du foie. Ces vésicules représentent également de potentiels biomarqueurs d’exposition et/ou de progression de la maladie dans la mesure où elles sont facilement accessibles par prélèvement sanguin. Ainsi, un second objectif de ce projet est de caractériser la production des vésicules extracellulaires issues du foie suite à l’exposition à un cocktail de perturbateurs endocriniens.
Bénéfices attendus
Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le potentiel de ce modèle de larve de poisson-zèbre en alternative au modèle murin classiquement utilisé. En parallèle, des travaux seront d’ailleurs conduits sur un modèle murin pour compléter ce projet (ces travaux sont intégrés à une autre saisine). En outre, ce projet permettra de vérifier nos hypothèses sur les vésicules extracellulaires et, en cas de confirmation, ouvriront la voie à des études plus avancées sur le rôle de ces vésicules dans les maladies du foie gras ou à leurs utilisations en tant que potentiels biomarqueurs.
Procédures
Alimentation avec un régime enrichi en graisse de 4 à 10 jours post-fertilisation des oeufs. Exposition à des cocktails de perturbateurs endocriniens (de 7 à 11 jours post-fertilisation des oeufs)
Impact sur les animaux
L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons, cependant celui-ci devrait rester modéré et se traduire éventuellement par des modifications légères du comportement (nage altérée).
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement), l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste toutefois une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.Plus précisément, l’un des objectifs de ce projet est de déterminer si les vésicules extracellulaires produites par le foie peuvent servir de biomarqueurs d’exposition et/ou d’atteintes hépatiques dans le contexte d’exposition à des polluants environnementaux. Pour cela, il est nécessaire de reconnaitre spécifiquement les vésicules issues du foie au sein de toutes les vésicules produites par l’organisme et d’identifier les changements qualitatifs ou quantitatifs de cette population de vésicules qui pourraient corréler avec les niveaux d’exposition aux polluants ou avec les atteintes du foie. Ainsi, seule l’expérimentation sur un modèle in vivo peut permettre d’évaluer de manière intégrative la production de vésicules et le développement de ces maladies du foie (maladies qui dépendent en partie de la communication entre différents organes). A l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternatives (in vitro, in silico ou ex vivo) permettant de reproduire l’ensemble des interactions entre organes liées à ces maladies du foie ni la grande variété de vésicules retrouvées dans un organisme entier.
Réduction
Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Ainsi, nous avons prévu de réaliser des tests de comparaison de moyennes ANOVA avec un seuil de significativité à 5% (p
Raffinement
Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale. Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux. En outre, les animaux seront attentivement suivis et l’atteinte éventuelle des points limites évalués selon des critères adaptés, gradés et précis entrainera l’arrêt des expérimentations.
Choix des espèces
Ce projet vise à évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens en mélange sur l’apparition et la progression des maladies du foie gras. Le modèle de poisson- zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et limite ainsi l’utilisation de ces modèles mammifères. L’objectif de ce projet est en partie de renforcer cette notion en particulier pour l’étude des perturbateurs endocriniens et des vésicules extracellulaires. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude avec l’Homme notamment concernant le foie et les maladies du foie gras (types cellulaires et métabolisme); une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 5 et 11 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des maladies du foie gras (induite par l’alimentation notamment).
Mise en place et description de 3 modèles de cancers étendus au péritoine pour évaluer l’intéret de traitements immunomodulateurs : étude expérimentale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent, éveillées, une injection de cellules tumorales dans l'abdomen, puis on laisse la carcinose péritonéale se développer, ce qui peut provoquer douleurs, ascite et cachexie, jusqu'à la mise à mort. L'objet du projet est de créer trois modèles de cancer du péritoine destinés à tester ensuite des traitements, le bénéfice pour la médecine humaine restant à ce stade la seule production de ces modèles. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre la tumeur et son environnement et retient la souris qui "mime la clinique humaine".
Objectifs
Mettre en place, chez la souris, des modèles de cancer envahissant l'abdomen (carcinose péritonéale, venant d'un cancer du colon ou cancer de l'estomac) pour permettre dans un second temps de tester l'intéret de potentiels traitements ayant la possibilité d’être utilisés rapidement chez l’homme pour une transition clinique. Le projet vise aussi à une meilleure compréhension du mécanisme d’action et de l’effet du traitement sur la tumeur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont l’obtention de données permettant de développer de nouvelles thérapies pour la médecine humaine et vétérinaire. Plus précisément, les questions explorées et les apports pour la connaissance scientifique sont les suivantes : Création de nouveaux modèles animaux pour tester des médicaments dans le traitement des cancers du péritoine (carcinose)
Procédures
Les gestes techniques sont seulement l’injection dans l’abdomen de cellules tumorales sur animal éveillé, qui aura lieu une fois, avec des aiguilles de petite taille, durant au maximum 30 secondes. les souris seront manipulées pour effectuer les pesées 2 fois par semaine, geste durant environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour l’animal sont en lien avec : - L’injection dans l’abdomen de cellules tumorales sur animal éveillé, qui aura lieu une fois. - la croissance de la tumeur dans le peritoine, qui peut provoquer des douleurs, qui seront calmées par des antalgiques si ce sont des douleurs aigues, et amenant à la mise à mort de l’animal si elles ne sont pas calmées par les antidouleurs ou si elles deviennent chroniques. - la croissance de la tumeur dans le peritoine peut provoquer de l’ascite (eau dans le ventre), qui peut être inconfortable et cacher une perte de poids. En cas de douleur non calmée par les antidouleurs, de prise de poids importante ou de poids stable mais avec des signes de perte de muscle (cachexie), les souris seront mises à mort.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour permettre d’observer la progression de la tumeur dans l’abdomen/péritoine. Les tumeurs seront aussi analysées au microscope (histologie) et avec d’autres méthodes d’analyses du système immunitaire
Remplacement
A ce jour, il n'existe aucun modèle de carcinose péritonéale mimant correctement l’intéraction entre la tumeur et son environement (très variable dans la carcinose, en contact avec de nombreux organes, avec intéraction avec les système immunitaire mature), in vitro ou de modélisations informatiques ou autres modèles alternatifs susceptibles de répondre à notre objectif de travail. C'est pourquoi, nous utiliserons, comme modèle animal, la souris qui mime la clinique humaine.
Réduction
Le modèle choisi a une variabilité relativement faible par rapport aux autres modèles existants. Cela permet de limiter le nombre d'animaux par groupe. Les expériences seront accomplies dans un ordre et regroupées pour permettre de limiter la nécessité de réaliser des groupes contrôles pour chaque question scientifique. Tous les animaux seront utilisés à la fois pour une analyse des paramètres cliniques mais aussi pour les analyses biologiques/histologiques, permettant de ne pas avoir à reproduire les expériences pour le simple fait de récupérer des résultats biologiques/histologiques. Il n’est pas attendu de décès pendant l’injection des cellules tumorales ni pendant le suivi qui nécessiterait d’augmenter ce nombre. Si un modèle n’a finalement pas des caractéristiques satisfaisantes (pas de prise des cellules, progression trop rapide ne permettant pas de commencer les traitements, etc), il ne sera pas utilisé par la suite pour tester l’intérêt des traitements.
Raffinement
Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois, maison. Les animaux sont surveillés 3 fois par semaine par les expérimentateurs (puis tous les jours quand la maladie sera avancée) afin d’évaluer la non atteinte des points limites et la recherche de signes de douleur. Dans le cas où un de ces points limites est atteint, nous agirons en première intention pour mettre un terme à cette gène (par exemple antidouleur). Si cela ne suffisait pas nous mettrons à mort la souris afin de réduire la souffrance. Des croquettes mouillées et de l’eau gélifiée seront utilisés en cas de difficultés à se déplacer de la part d’une des souris de la cage ou en cas suspicion de début de cachexie. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine pour le suivi et la détection de l’ascite.
Choix des espèces
Les modèles de carcinose péritonéale chez la souris miment bien la clinique humaine. Nous utiliserons des souris adultes de plus de 8 semaines afin de mimer une pathologie qui touche plutôt l’adulte chez l’homme. Les souris auront environ 8-9 semaines (stade adulte) au début des expériences et au plus environ 15 semaines à la fin des expériences.
Modèle murin pour identifier le mécanisme d’action du vaccin anti-tumoral APAVAC®
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe sous la peau des cellules de lymphome ou de cancer du côlon, laissées croître jusqu'à un volume de deux mille millimètres cubes, avec des prélèvements sanguins par la queue, pour identifier le mécanisme d'un vaccin antitumoral déjà commercialisé en médecine vétérinaire. Le porteur écrit qu'un anti-inflammatoire "introduirait des biais" en défaveur de l'étude et ne sera donc pas administré, et annonce une efficacité qui "devrait" reproduire celle observée chez le chien. Sur le remplacement, il indique avoir mené des travaux in vitro et ex vivo mais juge la vérification in vivo "primordiale".
Objectifs
Le lymphome B diffus à grandes cellules est le lymphome le plus fréquent. La prise en charge thérapeutique est basée sur une immunochimiothérapie couplant le rituximab à la polychimiothérapie. Pour le patient âgé, cette thérapie n’est pas toujours applicable en particulier en raison de comorbidités notamment cardiaque. Pour pallier ce problème et envisager des traitements pouvant stimuler le système immunitaire, nous avons développé une thérapeutique basée sur l’utilisation de protéines autologues actives sur le système immunitaire. La procédure de préparation de ce vaccin est basée sur la purification de protéines tumorales sur des particules de phosphate de calcium d’hydroxyapatite. Ces particules devront être réinjectés au patient pour une réactivation spécifique de son système immunitaire contre les cellules tumorales. Cette préparation vaccinale est utilisée depuis 2013 en médecine vétérinaire dans le modèle canin. Une étude récente a mis en évidence un doublement de la survie des chiens après traitement par le vaccin. Etant donné Les résultats spectaculaires ont, la mise en place d’un essai clinique est envisagée chez l’homme. Cependant les équipes cliniques requièrent une analyse mécanistique de l’efficacité vaccinale dans un modèle pré-clinique murin. Il est envisagé d’inclure dans le protocole clinique d’autres types de cancers qui font également face à des obstacles thérapeutiques, tel que le cancer colorectal dans le projet. Enfin nos données préliminaires sur la composition du vaccin indiquent la présence de différentes protéines de choc thermique. Il est donc pertinent d’étudier leurs effets dans l’efficacité du vaccin. Nos objectifs sont donc dans ce projet, (1) de mettre au point la préparation vaccinale à partir de tumeur de lymphome B murin et de côlon, (2) de mettre au point la condition de traitement la plus efficace dans le modèle murin, (3) d’identifier les cellules immunitaires anti-tumorale et les protéines de choc thermique impliquées. L’utilisation de ce modèle dans des souris possédant un système immunitaire fonctionnel (Balb/c) a montré, dans plusieurs études, une pertinence pour identifier les cellules contrôlant le développement du lymphome et du cancer du côlon.
Bénéfices attendus
La vaccination des animaux devrait permettre une réduction tumorale significative comme celle observée chez le chien. L’identification des mécanismes antitumoraux de la vaccination nous permettra de valider les prérequis nécessaires à la mise en place d’un essai clinique de Phase I/II dans le lymphome B et le cancer du côlon.
Procédures
Il s’agira de prélever une goutte de sang pour déterminer la composition sanguine de l’animal en réponses aux vaccins. Pour dilater la veine de la queue, les souris sont placées sous une lampe d’animalerie chauffante pendant 10 minutes. Elles sont ensuite glissées dans un tube de contention adapté aux souris et acheté chez un fournisseur spécialisé. Le placement des souris ne durera qu’une dizaine de secondes par souris. Le prélèvement de sang est ensuite effectué avec une aiguille (26 Gauge) ou une lame tranchante stérile. Cette opération durera en moyenne 10 secondes par souris. Cette méthode est recommandée pour des prélèvements répétés de moins de 0,1 mL de sang. Les animaux sont maintenus dans le tube de contention pendant toute la durée du prélèvement. Le volume prélevé est au maximum de 100 microlitres (2 à 3 gouttes). Après la prise de sang un point de compression sera réalisé afin d’éviter tout saignement à l’endroit de l’incision. Une prise de sang (100uL) à J-1 avant l’injection des cellules tumorales et le jour de la mise à mort à la fin de la procédure expérimentale seront réalisés. Total de 2 prises de sang par souris. Le nombre de souris concerné par ces prises de sang sera de 532. Les 36 autres souris qui seront employées à la génération des tumeurs nécessaires à la fabrication des vaccins ne seront pas concernées par ces prises de sang. Les injections de cellules tumorales A20 (2x106 cellules) et CT26 (5x105 cellules) seront réalisées en sous-cutanée à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 26 Gauge et concerneront les 568 souris du projet expérimentale. Un maximum de 100 µL de suspension cellulaire seront injectés. Chaque injection de cellules tumorales durera en moyenne une dizaine de seconde. Les injections de préparation vaccinale concerneront ¬532 souris à hauteur de 4 injections vaccinales par souris et seront réalisées à J5, J7, J9 et J14 en post-injection des cellules tumorales. Chaque vaccination durera en moyenne une dizaine de seconde. Au total, pour une souris, deux prises de sang auront lieu, (à J-1 avant injection des cellules tumorales et avant la mise à mort), 5 injections (1 de cellules tumorales A20 ou CT26 et 4 injections de solution vaccinale).
Impact sur les animaux
L’utilisation du vaccin chez le chien depuis 2013 n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection des inhibiteurs d’HSP chez la souris n’a pas montré d’effets indésirables. L’injection du vaccin peut engendrer de la souffrance et du stress au souris, c’est pour cela que l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. Également, l’injection des cellules cancéreuses A20 et CT26 par voie sous-cutanée se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 2000 mm2.
Devenir
L’analyse de la réponse des souris à la vaccination nécessite une étude approfondie des tumeurs et des cellules du système immunitaires. Le prélèvement de la tumeur ainsi que des organes lymphoïdes (rate et ganglions) contenant les cellules immunitaires nécessite la mise à mort des animaux.
Remplacement
Les résultats préliminaires obtenus à partir des nombreuses expériences in-vitro et ex-vivo ont été très encourageants et ont permis de réduire le nombre de souris au regard des différents axes restant à être investigués. Des marqueurs phénotypiques ont été découvert via ces expériences ex-vivo. Toutefois, ce modèle ne nous permet pas de tester notre hypothèse d’une stimulation de certaine populations anti-tumorales du système immunitaire. C’est la raison pour laquelle il est primordial de pouvoir vérifier ces résultats dans un modèle in-vivo. Ces expériences constituent des tests pré-cliniques et ont pour but d’observer l’immunogénicité de notre traitement dans un organisme vivant immuno-compétent. Ces expériences in-vivo sont donc nécessaires afin de mettre en valeur les aspects physiologique résultants de notre thérapie. Mais également de retrouver les marqueurs phénotypiques vérifiés par les expériences ex-vivo.
Réduction
Pour chacune des combinaisons thérapeutiques (vaccination préventive ou curative, effets des inhibiteurs de HSP, ou déplétion des HSP) réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 7 souris maximum, ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques et valable avec le test non paramétrique adapté aux petits échantillons (< à 10) de Mann-Whitney. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.
Raffinement
Dans le but de préserver le bien-être animal et pour anticiper l’arrivée des signes de souffrance liés à la maladie, nous suivrons l’évolution de la croissance tumorale en mesurant tous les 2 jours par un pied à coulisse le volume des tumeurs, puis tous les jours lorsque la tumeur atteindra un volume égal ou supérieur à 1500 mm3. Dans le but de réduire, supprimer/soulager la douleur/détresse pour l’ensemble de nos animaux (vaccinés ou non), ces derniers seront minutieusement observés lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Les injections des cellules cancéreuses A20 et CT26 pourraient engendrer de la souffrance et du stress au souris, ainsi l’injection se fera sous anesthésie à l’isoflurane. La croissance tumorale sera monitorée et ne dépassera jamais les 2000 mm2. L’injection du vaccin par voie sous-cutanée sera réalisée sous anesthésie à l’isoflurane. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales en sous-cutané (s.c.), et des vaccins (s.c.), pour nous assurer que les souris retournent à une activité normale (confort, vivacité, état sanitaire). L’utilisation d’un anti-inflammatoire introduirait des biais en notre défaveur, car cela irait à l’encontre de l’intérêt de l’étude (l’immunisation via l’utilisation d’un biomédicament). Pour pallier à cela, les animaux seront quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance un analgésique sera administré. Si la souffrance persiste, l’expérience sera stoppée. De plus, des mesures seront prises pour améliorer le bien-être des animaux. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu sera également mis en place. Un contenant sera placé dans chaque cage permettant aux souris de se cacher et de développer leur répertoire comportemental (exploration, enfouissement…). Les animaux seront mis à mort par les personnes formées. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane. Après la mise à mort, la mort des animaux est constatée par l’absence des signes vitaux : respiration, battements cardiaque, absence des mouvements volontaires et des réflexes.
Choix des espèces
Les souris BALB/c seront utilisées afin de se rapprocher au maximum des conditions de développement tumorale en présence d’un système immunitaire compétent. Cette condition est nécessaire pour tester les effets d’une vaccination anti-tumorale sur le système immunitaire. La souris a pour intérêt d’avoir un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Le modèle de lymphome B murin A20 et le modèle CT26 de cancer du côlon ont été montré comme pertinent comme modèles pré-cliniques or ces modèles se développent dans des souris BALB/c. Nous utiliserons des souris femelles et mâles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et, en ce qui concerne les modèles de souris immunocompétentes, soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel.