Recherche fondamentale

Une injection d'analgésique, une anesthésie gazeuse, une incision, puis une aiguille qui dépose dans l'oreille moyenne une solution chimique détruisant les récepteurs de l'équilibre de l'oreille interne, ou une solution saline pour les témoins : la séquence dure 72 minutes pour chacun des 252 rats femelles. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec perte d'équilibre, troubles de la posture, déshydratation et perte de poids attendues chez les rats lésés. Selon les groupes, ils reçoivent ensuite chaque jour, pendant 3 à 10 jours, de la bétahistine, un médicament contre le vertige, un placebo ou des antagonistes de l'histamine, ainsi qu'un marqueur de prolifération cellulaire, et une partie passe des tests comportementaux à six reprises jusqu'à J30, sans que le porteur les nomme. Tous sont mis à mort à J3, J7 ou J30, pour le prélèvement du sang et du cerveau.

Objectifs

Ce projet porte sur le système vestibulaire, responsable de l’équilibre postural et locomoteur, ainsi que de la stabilisation du regard lors de mouvements de la tête. L’information perçue par les récepteurs vestibulaires localisés dans l’oreille interne est transmise via le nerf vestibulaire aux noyaux vestibulaires (situés dans le tronc cérébral). Un dysfonctionnement de ce système peut causer des symptômes tels que des vertiges, des déséquilibres, des chutes ou encore de l’anxiété, qui affectent la vie quotidienne des patients. La thérapie vestibulaire implique une rééducation vestibulaire et un traitement médicamenteux. Toutefois, le manque d’efficacité des médicaments utilisés ou encore la méconnaissance de leurs sites et mécanismes d’action représentent un obstacle de taille. Un médicament couramment utilisé en France dans la pathologie du vertige est la bétahistine. Certains de ses mécanismes d’action sont connus dans le modèle animal de lésion chirurgicale du nerf vestibulaire. Toutefois, ce modèle est comparable, en clinique, à une ablation curative du nerf vestibulaire, pratiquée uniquement dans le cas de schwannomes (tumeurs bénignes du nerf vestibulaire). Les effets et mécanismes d’action de ce médicament ne sont pas connus dans un modèle animal de lésion vestibulaire mimant des pathologies telles que la névrite ou la maladie de Ménière, qui sont plus couramment observées en clinique. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de la bétahistine sur un modèle de lésion vestibulaire induisant une inflammation telle qu’observée dans la névrite en clinique. Nous savons que la bétahistine augmente la concentration d’histamine, un neurotransmetteur qui module l’inflammation, dans le cerveau. De plus, des cellules intervenant dans l’inflammation sont importantes pour la récupération des fonctions vestibulaires. Ainsi, nous supposons que ce traitement va favoriser des mécanismes essentiels à la compensation vestibulaire via des récepteurs à l’histamine dans ce modèle. Enfin, nous supposons que la bétahistine aura un effet anxiolytique dans notre modèle car elle module un neurotransmetteur intervenant dans l’anxiété (sérotonine). Des tests comportementaux, l’utilisation de molécules chimiques bloquants des récepteurs à l’histamine (antagonistes), ainsi que des analyses sur les tissus des animaux nous permettront de réaliser ce projet.

Bénéfices attendus

Les désordres vestibulaires touchent un tiers des adultes de plus de quarante ans aux Etats-Unis. En France, les vertiges constituent un des motifs prépondérants de consultation chez le généraliste, avec plus de 15 millions par an. En Allemagne, la prévalence des troubles vestibulaires est de 6,5% selon une étude épidémiologique. Ainsi, les désordres vestibulaires représentent un enjeu de santé publique majeur et l’étude des désordres vestibulaires ainsi que des traitements pharmacologiques utilisés restent primordiaux. Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont nécessaires afin d’étudier les déficits vestibulaires et leur compensation. Le modèle de lésion utilisé dans ce projet est un modèle se rapprochant de pathologies humaines telles que la vestibulopathie périphérique aiguë (névrite) ou la maladie de Ménière. Il mime des symptômes vestibulaires retrouvés chez l’humain. A court terme, ce modèle animal et ces tests comportementaux vont permettre d’observer l’efficacité de la bétahistine (traitement étudié prescrit en clinique humaine) sur les symptômes posturo-locomoteurs induits par la pathologie et également sur l’anxiété des animaux. D’un point de vue fondamental, nous mettrons en évidence l’impact de ce traitement sur l’inflammation et sur l’anxiété des animaux dans un contexte de pathologie vestibulaire. Nous préciserons également le rôle de l’histamine dans la pathologie vestibulaire. Enfin, ce projet permettra d’élucider la compensation vestibulaire à un niveau plus global que seulement au sein des noyaux vestibulaires. Plus globalement, d’un point de vue clinique, ce projet pourrait amener à des nouveaux mécanismes quant aux fonctionnements d’un composé pharmacologique de référence prescrit en clinique. A plus long terme, les résultats obtenus permettront d’adapter la prise en charge médicamenteuse des patients afin de mieux traiter les pathologies vestibulaires.

Procédures

Ce projet est composé de trois procédures et chaque rat femelle sera utilisé dans une seule procédure. L’administration transtympanique a lieu une fois, chez l’ensemble des animaux de l’étude. Avant administration, les animaux sont soumis à une injection d’analgésique 30 minutes avant d’être placés sous anesthésie gazeuse et un anesthésique local est appliqué 5 minutes avant incision. Dans chaque procédure, un groupe d’animaux est soumis à une injection transtympanique d’une solution chimique détruisant les récepteurs vestibulaires de l’oreille interne et un autre groupe d’animaux est soumis à une injection transtympanique d’une solution saline. Cette administration se fait dans l’oreille moyenne des animaux en utilisant une aiguille. Les gestes décrits ci-dessus durent 72 minutes pour un animal. Dans chaque procédure, l’administration d’un marqueur de la prolifération cellulaire a lieu une seule fois, chez les animaux, au 3ème ou au 7ème jour post-lésionnel. Dans deux procédures, l’administration de la bétahistine ou du placebo a lieu une fois par jour chez de nombreux animaux. Cette procédure s’effectuera pendant les 10 jours qui suivent la lésion pour les animaux soumis aux tests comportementaux ou pendant les 3 ou 7 jours après la lésion pour les animaux non soumis aux tests comportementaux qui sont utilisés afin d’étudier les effets à court terme du traitement. Dans une seule procédure, l’administration des antagonistes aux 2 types de récepteurs à l’histamine a lieu une fois par jour chez tous les animaux. Cette procédure s’effectuera pendant les 10 jours qui suivent la lésion pour les animaux soumis aux tests comportementaux ou pendant les 3 ou 7 jours après la lésion pour les animaux non soumis aux tests comportementaux qui sont utilisés afin d’étudier les effets à court terme du traitement. Dans chaque procédure, les animaux sont soumis à des tests comportementaux. Ils ont une durée de 25 min10 secondes par animal. Ils ont lieu aux délais pré-administration, J2, J3, J7, J15 et J30. Les tests effectués pour un groupe ont une durée correspondant à une matinée.

Impact sur les animaux

Pour tous les animaux de ce projet, l’introduction d’un liquide dans l’oreille moyenne et l’incision cutanée (qui ont lieu lors de l’administration transtympanique) peuvent être source de douleur et d’inconfort. Dans les 3 procédures de ce projet, les mêmes effets indésirables sont prévus sur les animaux lésés. Les animaux soumis à une lésion transtympanique peuvent avoir un déficit d’hydratation dans les 24-48 heures après l’atteinte vestibulaire et une perte de poids est attendue chez ces animaux lésés. Le syndrome vestibulaire conduit à d’autres effets indésirables tels que des problèmes de maintien de posture et de perte d’équilibre. Également, l’anxiété est connue pour être une des composantes du syndrome vestibulaire. L’injection des antagonistes (quotidiennement durant 10 jours), l’injection d’un marqueur de la prolifération cellulaire (une fois, J3 ou J7 post-lésionnel) ainsi que l’injection d’un analgésique (une fois avant l’administration transtympanique et une fois avant la mise à mort de l’animal) peuvent être perçues comme une nuisance par l’animal. L’ensemble du groupe d’animaux testé est délocalisé hors de son environnement (correspondant à la salle d’hébergement de l’animalerie) pendant une matinée aux différents délais des tests comportementaux (délais pré-administration, J2, J3, J7, J15 et J30 post-lésionnels). Cela pourrait être perçu comme une nuisance par l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures et le sang et les tissus seront récupérés pour procéder à des analyses. Il est nécessaire de procéder à des dosages et marquages histologiques spécifiques dans le cerveau des animaux utilisés dans ce projet afin d’élucider les effets de notre médicament dans notre modèle animal. Le sang récupéré permettra de procéder à des dosages de marqueurs spécifiques du stress et de l’anxiété. Ces mises à mort sont nécessaires pour la mise en évidence des effets à court et à long terme du traitement.

Remplacement

Il existe des alternatives n’utilisant pas de modèles animaux telles que la méthode in silico ou encore in vitro. La méthode in silico utilise des modèles informatiques dans le but de prédire ce qui se passerait dans la réalité. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle informatique mimant de manière aussi complexe la physiologie et la physiopathologie du syndrome vestibulaire. Un autre modèle serait le modèle in vitro qui consiste en l’étude d’éléments hors de leur environnement en conditions définies et contrôlées. Puisque nous avons besoin de l’individu dans son ensemble, autant au niveau cérébral qu’au niveau périphérique (informations quant à la posture et concernant l’état d’anxiété des animaux), nous ne pouvons pas substituer le modèle animal par ces modèles.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction, les rats correctement lésés lors de l’apprentissage de la lésion par l’expérimentateur seront inclus dans l’étude pilote. De plus, cette étude sera effectuée dans le but de permettre une mise à mort des animaux à deux délais au lieu de trois délais différents (J3 ou J7 post-lésionnel et J30 post-lésionnel). L’étude de ces deux délais est nécessaire afin d’élucider les effets à court terme du traitement et la prolifération cellulaire (J3 ou J7 post-lésionnel) mais aussi afin de comprendre les effets à long terme du traitement et la survie et différenciation cellulaire (J30 post-lésionnel). De plus, les animaux mis à mort au 30ème jour après la lésion pour les investigations cellulaires sont les animaux soumis aux tests comportementaux. Également, il a été choisi de faire un test qualitatif permettant d’observer l’expression de plusieurs protéines pro- et anti-inflammatoires, pouvant être modulées dans le syndrome vertigineux. Ce test permettra de cibler les protéines à étudier en profondeur en utilisant des tests semi-quantitatifs et ainsi de ne pas multiplier le nombre d’essai et d’animaux. Enfin, les mêmes animaux seront utilisés afin de réaliser l’ensemble des études biochimiques (correspondant aux dosages des protéines et des marqueurs du stress et de l’anxiété). Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour chaque groupe en fonction de l’expérience précédente de l’équipe et avec l’aide d’un statisticien. Enfin, la répartition des animaux dans les groupes sera randomisée et l’expérimentateur travaillera en aveugle. Dans la dernière procédure de ce projet, les groupes qui auront préalablement été faits lors de la procédure précédente ne seront pas répétés afin de limiter le nombre d’animaux.

Raffinement

Notre modèle d’étude est un modèle de lésion vestibulaire, obtenu par une administration transtympanique d’un produit chimique détruisant les récepteurs vestibulaires de l’oreille interne. Avant cette administration transtympanique, les animaux sont mis sous analgésie et anesthésie gazeuse pour éviter tout inconfort ou angoisse. Leur température est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée et une solution est appliquée sur leurs yeux pour assurer une hydratation oculaire. Après l’administration transtympanique, l’animal est observé jusqu'à récupération de l’anesthésie. Avant le réveil, l’animal est hydraté (injection d’un liquide) afin de compenser les pertes liquidiennes associées à la lésion vestibulaire. Les biberons sont équipés d'une pipette allongée pour faciliter l’hydratation et une solution nutritionnelle complète est déposée dans la cage pour assurer une bonne alimentation durant 1 semaine après la lésion. Puisqu’une perte de poids est un effet indésirable connu à la suite d’une lésion vestibulaire, un suivi de poids sera également effectué (1/jour pendant la première semaine après la lésion puis 1/semaine). L’apparence et le comportement des animaux sont évalués 2x/jour durant la première semaine après la lésion, puis 2x/semaine jusqu’aux derniers tests comportementaux. Cette évaluation se fait en utilisant une grille de score du bien-être animal adaptée au modèle utilisé. Tous les animaux sont soumis à une phase d’habituation à l’expérimentateur ainsi qu’à la salle d’expérimentation pendant une voire deux semaines limitant ainsi tout stress ou angoisse potentielle. Une récompense sera attribuée aux animaux à la fin des tests comportementaux (riz soufflé chocolaté) avant de les ramener dans leur salle d’hébergement au sein de l’animalerie. Les co-porteurs du projet sont formés en expérimentation animale (niveau concepteur de projet) et sensibilisés au bien-être animal.

Choix des espèces

La compensation vestibulaire est un processus présent chez les mammifères. Précédemment, notre laboratoire étudiait le modèle félin, espèce la mieux adaptée au comportement d’équilibration. Les tests comportementaux utilisés chez le chat ont ensuite été adaptés chez le rat. Le modèle rongeur présente de nombreux avantages en termes de manipulation et il reproduit le syndrome vestibulaire rencontré chez différentes espèces, dont l’humain. De plus, la durée totale du syndrome vestibulaire est significativement réduite chez le rat (2 à 3 semaines) par rapport à l’humain (90 jours). Ce gain temporel est avantageux pour l’étude de composés anti-vertigineux et pour la compréhension des mécanismes neurobiologiques responsables du syndrome. De plus, à un niveau cellulaire, nous retrouvons les mêmes modifications post-lésionnelles que celles observées chez le chat (production de cellules, modification dans l’inflammation et dans les marqueurs de l’excitabilité neuronale). La présente étude s’intéresse aux processus de compensation post-lésionnelle adultes présents après lésion vestibulaire et à l’effet anxiolytique de la bétahistine. L’étude de ces mécanismes dans les noyaux vestibulaires sera donc réalisée sur des rats adultes (10 à 13 semaines), afin de s'assurer d’être sorti de la période développementale. Pour un rat, la maturation des neurotransmetteurs et la densité synaptique est atteinte à plus de 8 semaines. De plus, en période développementale, un marqueur de l’excitabilité neuronale (co-transporteur membranaire) est moins exprimé qu'à l'âge adulte. Puisque nous étudions cet élément comme étant une des modifications post-lésionnelles, il est nécessaire d'avoir des rats adultes d'au moins 10 semaines pour tester nos différents composés et avoir une maturation complète du système nerveux central.

Opérées sous anesthésie pour une section définitive du nerf sciatique d'une patte arrière, 54 souris jeunes adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis mises à mort pour le prélèvement de leurs organes. L'équipe veut savoir si le stress oxydatif qui suit la dénervation altère la capacité de régénération des cellules souches du muscle. Le porteur juge les souris "peu invalidées par cette opération pour une vie en captivité", parce qu'elles sont "quadrupèdes et vivant à ras du sol", et estime l'étude "extrêmement rentable pour la société". Il présente la dénervation comme "définitive", puis prévoit de placer la nourriture à portée en raison de l'"absence temporaire de réactivité de la patte dénervée".

Objectifs

Le système nerveux contrôle de nombreuses fonctions dans l’organisme, l’une d’entre elles est la contraction musculaire. En effet, les motoneurones (i.e. neurones qui fonctionnent spécifiquement pour le mouvement) envoient un signal électrique, via leurs axones, qui se traduit en signal chimique au niveau de la jonction neuromusculaire. Ce signal induit la contraction musculaire. Une fibre musculaire est une cellule de forme cylindrique qui résulte, à l’état embryonnaire de l’organisme, de la fusion de nombreuses cellules pré-musculaires appelées myoblastes. La fibre musculaire est alors une cellule contenant de nombreux noyaux, chaque myoblaste ayant apporté son noyau. La fibre musculaire en elle-même ne se divise pas mais comprend sur sa périphérie quelques cellules souches pré-musculaires, dites cellules satellites, qui se divisent quand les fibres musculaires ont besoin d’être réparées ou de croître pour un gain de force. Quand les cellules satellites sont appelées à se diviser elles s’agrègent avec la fibre qui les portait, on parle dans ce cas d’accrétion. La fibre gagne ainsi de nouveaux noyaux avec pour conséquence un gain en molécules contractiles qui réparent la fibre en cas de blessure ou la rendent plus fortes si c’est pour répondre à des exercices intenses. Il a été décrit dans la littérature que suite à la dénervation, qui prive les muscles des signaux du nerf, les cellules musculaires subissent un fort dommage oxydatif. Nous avons récemment montré que le dommage oxydatif peut modifier, in vitro, les capacités régénératives des myoblastes, précurseur en différenciation des fibres musculaires. Les cellules satellites peuvent être isolées du muscle adulte et mises en culture dans des boîtes. Une fois en culture, leur statut biologique change et elles se mettent à proliférer en tant que myoblastes qui selon certaines conditions de culture peuvent fusionner et s’agréger pour donner des fibres musculaires immatures appelés myotubes. Ceci permet d’étudier plus facilement, que dans l’animale, leur biologie régénérative, sachant qu’avec un animal on obtient de nombreuses cellules permettant de faire de nombreux tests. Actuellement les conséquences du stress oxydatif lié à la dénervation sur les cellules satellites sont peu connues. Nos travaux sont destinés à comprendre si et comment l’activité régénérative des cellules satellites est altérée pendant le processus de dénervation.

Bénéfices attendus

Ce projet a deux volets qui ont un intérêt scientifique général : Tout d’abord nous allons évaluer comment le dommage oxydatif, qui suit une dénervation, va affecter les fibres musculaires et les cellules satellites. Nos résultats dans les cellules en culture nous laissent présager que ce dommage va impacter la capacité régénérative des cellules satellites et contribuer au processus d’atrophie musculaire post-dénervation. Une étude aussi complète de l’effet des dommages oxydatifs dans la problématique de la dénervation n’a jamais été effectuée. Quelques études montrent que le nombre de cellules satellites musculaires ne change pas après dénervation, néanmoins il n’y a aucune étude qui montre que leur capacité à fusionner ou à accomplir l’accrétion est la même. Cette investigation est d’autant plus importante car ses conclusions pourraient être applicables aux accidents de dénervation ou pincements des nerfs qui peuvent survenir chez l’humain. Il est important de connaitre les conséquences du dommage oxydatif induit par la dénervation pour pouvoir chercher des thérapies adaptées pour soulager la conséquente atrophie musculaire (détoxification des molécules oxydantes avec des traitements anti-oxydants, préconisations nutritionnelles). De plus, il est essentiel de vérifier si l’activité de régénération des cellules satellites est conservée après dénervation et comprendre comment la préserver pour limiter l’atrophie musculaire. Au vu des bénéfices attendus en termes scientifiques et médicaux et de l’impact limité sur les souris, nous estimons que cette étude sera extrêmement rentable pour la société.

Procédures

Chirurgie sous anesthésie chimique pour section du nerf. 54 souris seront traitées. La durée d'intervention par souris est d'environ 10 min.

Impact sur les animaux

La technique de dénervation définitive, par section du nerf sciatique présente l’avantage d’être une intervention chirurgicale modérément invasive si on l'a compare par exemple à une chirurgie abdominale. Les conséquences de la dénervation permettent une vie quasi-normale en captivité des animaux traités, la cage d’élevage comprenant de la litière adaptée ainsi qu’un enrichissement sous forme de petite cabane. La technique microchirurgicale de dénervation est effectuée avec le maximum de précautions pour limiter les douleurs post-opératoires des animaux (anesthésie générale et en local du nerf et administration d’antalgique en pré-opératoire et anti-inflammatoire en post-opératoire). La dénervation est effectuée sur l’une des pattes arrière de la souris et ne concerne pas tous les muscles, d’autres afférences nerveuses permettent à la souris de se relever ainsi que ses déplacements sans difficulté sur la litière de la cage. Il est par ailleurs à considérer que les souris étant quadrupèdes et vivant à ras du sol, elles sont par conséquent peu invalidées par cette opération pour une vie en captivité.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements d’organes

Remplacement

Le recours à des souris est indispensable parce que la dénervation induit des modifications physiologiques sur l’ensemble du muscle qu’il est impossible de reproduire sur des cellules en culture. De plus, la mise en culture des cellules satellites modifie leur état de quiescence, ce qui peut modifier leur réponse au stress et aux dommages à l’ADN. En effet, la réparation de l’ADN n’est pas la même dans des cellules qui se divisent, des cellules qui ne se diviseront plus ou des cellules quiescentes qui ont toujours une possibilité de se diviser. Nous avons réalisé, en amont de ce projet, des tests préliminaires sur cellules en culture pour certaines mises au point de nos analyses (Immunofluorescence, colorations, traitement aux agents oxydants) permettant de ne recourir aux animaux que lorsque c’est absolument nécessaire.

Réduction

Dans la première phase du projet on prévoit un nombre minimum de 15 souris et un maximum de 18 souris : 5+1 par condition pour 3 temps post-dénervation. La robustesse de la procédure de dénervation et nos résultats préliminaires dans des myoblastes en culture nous ont amené à estimer que 5 souris par condition sera le juste nombre pour avoir des résultats statistiquement valables, une 6eme souris pourrait être utilisée si un problème de reproductibilité se présente. Dans la deuxième phase, on estime un nombre de 12 souris par temps post-dénervation les tests à réaliser demandant 6 souris pour la mesure de l’index de fusion qui correspond à la proportion de cellules comprenant deux noyaux sur l’ensemble de toutes les cellules et 6 souris pour le test d’accrétion qui mesure le nombre de cellules à plus de deux noyaux sur l’ensemble de toutes les cellules présentes. On estime que 5 souris par condition sera le juste nombre pour avoir des résultats statistiquement valables sur la base d’un test statistique dit non paramétrique de Wilcoxon, une 6eme souris pourrait être utilisée si un problème de reproductibilité se présente. Le nombre de souris utilisables dans cette phase sera donc compris entre 30 et 36. Par ailleurs des prélèvements effectués sur ces animaux (cœur, diaphragme, autres muscles, etc ...) seront également mis à profit pour des analyses nécessaires à d’autres projets au sein de notre équipe permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Grâce aux précautions prises pour l’anesthésie générale ainsi que les mesures médicamenteuses anti-douleur et anti-inflammatoires pratiquées en pré et post-opératoire, les souris traitées retrouvent très rapidement un comportement similaire à leurs congénères non traités. Les animaux sont ensuite surveillés quotidiennement pour détecter d’éventuels problèmes (apparence, comportement social, posture, perte de poids) et y remédier par des soins appropriés. Par ailleurs, pour faciliter l’alimentation des souris dénervées qui pourraient présenter une difficulté en raison de l’absence temporaire de réactivité de la patte dénervée, la nourriture sera placée de façon plus accessible dans la cage.

Choix des espèces

La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères. Nous avons choisi le stade jeune adulte de 8 semaines pour notre étude car la croissance musculaire est terminée et les cellules satellites ne se divisent plus dans les conditions d’élevage pratiquées.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une injection de cellules de mélanome dans l'oreille, un suivi par imagerie sous anesthésie une à deux fois par semaine pendant au moins six semaines, et parfois l'ablation chirurgicale de la tumeur, pour étudier la formation des métastases. Le porteur indique que la tumeur de l'oreille occasionne une gêne et que l'apparition de métastases est invalidante. Il affirme que le comportement tumoral ne peut être appréhendé que sur un animal vivant "entier" et que seule la souris immunodéprimée permet l'implantation de cellules humaines.

Objectifs

Le mélanome cutané est une tumeur maligne issue de la transformation des cellules responsables de la couleur de la peau appelées mélanocytes. Ces dix dernières années, le développement de nouvelles thérapies a permis d’augmenter la survie des patients. Cependant, ce cancer est parmi les plus agressifs du fait de sa forte capacité à produire des métastases (cellules disséminées formant des tumeurs secondaires dans d’autres organes) qui sont responsables de la majorité des échecs thérapeutiques et de la mort des patients. Nous avons pu identifier une liste de 21 gènes cibles potentiels pouvant jouer un rôle dans l’émergence des métastases. Nous avons ensuite confirmé et validé 10 cibles grâce à des expériences in vitro et des études sur des prélèvements de patients atteints de mélanomes. Nous souhaitons maintenant confirmer nos résultats en étudiant les effets des modifications d’expression de ces cibles validées sur la formation des métastases in vivo chez la souris. Nous avons choisi le modèle souris pour ce projet car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de valider de nouvelle cible thérapeutique. Cela permet donc d’envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques pour limiter la progression tumorale chez les patients ayant un mélanome avancé (stade 2 à 4) mais n’ayant pas de métastases détectables au moment de l’exérèse de la tumeur primaire. En effet, chez la plupart de ces patients, les métastases ne sont détectables que plusieurs années après la chirurgie. Outre les retombées médicales envisageables, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la progression tumorale des mélanomes cutanés.

Procédures

Injection en sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie locale, au niveau de l'oreille: une injection, durée 30 secondes. Séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse, durée maximale 20 min, 1 à deux fois par semaine pendant au moins 6 semaines. Procédure chirurgicale d'ablation de la tumeur au niveau de l'oreille (si la tumeur atteint une taille trop importante avant l'appartion des métastases, qui sont l'objet d'étude du projet) sous anesthésie gazeuse, une seule fois, durée maximale 30 min.

Impact sur les animaux

La tumeur située dans l'oreille de la souris peut occasionner une gêne. L'apparition de métastases est invalidante et peut entrainer des contraintes

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils développeront tous potentiellement des tumeurs et des métastases.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome dans les organes distants. Nous avons cependant valider nos résultats par différentes techniques in vitro avant de passer à l'in vivo. Nous utiliserons des souris immunodéficientes qui permettent l'implantation de cellules humaines.

Réduction

Nous avons pu identifier une liste de 21 cibles potentielles d'un gène pouvant jouer un rôle dans l’émergence de métastases dans le mélanome (tumeur dermatologique très agressive et très courante), grâce à des expériences in vitro et des études sur des prélèvements de patients atteints de mélanomes, nous avons reduit ce nombre à 10 . Enfin, le nombre d'animaux a été réduit au minimum et déterminé grâce à une étude statistique permettant une interprétation précise et significative des résultats obtenu ainsi qu'en regroupant les expériences: un groupe témoins pour au moins 2 groupes d'intérêt. Les techniques d'injection des cellules ont été très standardisées pour assurer la reproductivité des résultats.

Raffinement

Pour respecter les exigences de raffinement, les animaux sont observés tous les jours par les membres responsables du projet, tout comportement anormal sera évalué selon la grille de score de douleur établie et les points limites seront strictement appliqués. De plus, les animaux sont observés et pesés deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs confirmés responsables du projet. Si une perte de poids d'environ 10% par rapport au poids initial est observé, un aliment complémentaire riche et appétent sera ajouté dans la cage. Les souris seront anesthésiées (anesthésie locale ou générale, suivant les gestes)lors des différentes procédures.. Si un signe de douleur est observé (prostration, agressivité), un analgésique sera administré et un enrichissement supplémentaire ou différent sera ajouté dans la cage.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente sélectionnée est la seule qui permet l'implantation de tumeurs humaines de mélanome avec une efficacité de prise de 70%. Vu la population de patients, les souris seront utilisées à maturité sexuelle, adultes.

512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la patte des injections d'agents pro-inflammatoires comme l'adjuvant complet de Freund ou la formaline, puis leur douleur est mesurée par l'observation des léchages, morsures et secouements pendant quatre-vingt-dix minutes, et par le test des filaments de von Frey. Le porteur décrit ces modèles de douleur comme des standards de la littérature et indique vouloir confirmer in vivo le rôle d'un gène repéré sur des neurones en culture. Les retombées annoncées, des traitements contre les douleurs mécaniques de l'arthrose ou de la polyarthrite, restent une perspective.

Objectifs

Notre projet a pour but d’identifier des acteurs moléculaires impliqués dans la sensibilité mécanique douloureuse afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les désordres liés à la perception exagérée des douleurs d’origine mécanique. Nous avons identifié des gènes candidats impliqués dans la transduction mécanique, i.e. la conversion des stimulations mécaniques en signaux biologiques, dans les neurones sensoriels dont font partie les neurones nociceptifs impliqués dans la douleur. Nous avons ensuite testé ces candidats in vitro et identifié un gène dont l'inhibition diminue significativement les réponses des neurones nociceptifs aux stimulations mécaniques. Nous voulons confirmer ces résultats in vivo en testant l’impact de ce gène sur la perception de la douleur par la réalisation de tests comportementaux. Ces tests seront réalisés en conditions inflammatoires (induites par injection d’adjuvent complet de Freund (CFA) ou de Formaline), qui sont des modèles de douleur établis dans la littérature scientifique, sur des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait être à l’origine du développement de traitement ciblant des types de douleurs mécaniques qui interviennent dans de multiples maladies et syndromes chroniques ou inflammatoires, telles que la polyarthrite rhumatoïde ou l’arthrose qui touche 10 millions de français.

Procédures

Les animaux recevront des injections d'agents proinflamatoires dans la patte ou dans la zone tibio-tarsale. Les animaux ayant reçu une injection dans la patte seront ensuite placés en box d’observation afin de mesurer la durée de comportements douloureux spontanés (léchage, morsure, secouements de la patte) sur une durée maximum de 90 minutes. Les animaux ayant reçu une injection dans la zone tibio-tarsale seront testés avec des fialments de von Frey aux jours 7, 10 et 21 post-injection afin de determiner leur sensibilité mécanique. Le test dure environ 15 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les modèles inflammatoires utilisés dans ce projet constituent les standards de ce type d'étude et sont très bien établis dans la littérature. Ils produisent des phénotypes de douleur légère ou modérée chez l'animal, ce qui est l'objectif du projet de tester l'implication du gène cible dans la douleur. Les procédures de test comportemental (box d'observation ou test de sensibilité mécanique) peuvent induire un stress limité chez l'animal, qui sera minimisé par les temps d'acclimatation.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car ne pouvant plus servir dans de nouvelles procédures. Un certain nombre d'animaux seront utilisés pour le prélèvement des ganglions rachidiens (DRG) pour l'enregistrement électrophysiologique in vitro.

Remplacement

La sensibilité / douleur mécanique et thermique ne peuvent s'évaluer in fine que sur des animaux vivants. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit donc dans la continuité de nos expériences et des résultats que nous avons obtenus in vitro.

Réduction

Réduction du nombre d’animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude est paramétré afin de pouvoir effectuer des tests statistiques afin d’observer des différences significatives sur les paramètres étudiés. Lors de la réalisation des protocoles, le maximum d’informations sera récolté afin de restreindre le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : le nombre de souris par cage respectera les directives européennes du 1er février 2013, sachant que le projet utilise de jeunes adultes entre 20 et 25g, nécessitant 70 cm2 par individus dans les cages, soit 5 animaux par cage de 374 cm2. Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des animaux permettra d’éviter la souffrance des animaux. Ils permettront de définir la nécessité d’un traitement symptomatique (analgésique, modification du protocole expérimental). Les expériences de comportement ont été choisies afin de limiter au maximum la contention de l’animal (animal libre de ses mouvements), et l’environnement des animaux sera enrichi avec des dômes en cartonainsi que des nids de papier kraft (sizzle pad).

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris, du fait de l'existence de souris transgéniques dont le gène d'intérêt a été éteint (souris KO), et pour lequel les tests comportementaux évaluant la perception à la douleur d’origine mécanique et thermique sont établis et documentés dans la littérature scientifique. Nous pourrons ainsi déterminer l’effet spécifique de ces gènes dans la sensibilité mécanique et thermique dans des modèles de douleur. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 8 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ont ainsi fini leur croissance et présentent une sensibilité mécanique et thermique assez stable entre 6 et 8 semaines.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime riche en graisse, elles reçoivent huit poudres de tomate différentes pendant douze semaines, avec prélèvements sanguins sur animal éveillé, tests de tolérance au glucose et à l'insuline, perçage des oreilles et isolements répétés. Le porteur décrit un objectif appliqué, améliorer les effets santé de la tomate en combinant choix de variétés, pratiques de culture et technologie alimentaire. Il affirme que l'étude d'une supplémentation alimentaire ne peut s'envisager que sur un modèle vivant.

Objectifs

La tomate est une des productions agricoles les plus importantes en termes de volume de production et de portée économique. Sa consommation, notamment sous forme de poudre de tomate, est associée à des effets bénéfiques pour la santé métabolique, mais son profil nutritionnel et sa teneur en micronutriments dépend du génotype et des conditions de production. L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact du génotype de tomate et du déficit d’irrigation sur la qualité nutritionnelle des poudres de fruit et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez la souris. Pour ce faire, 4 génotypes de tomate ayant subit 2 niveaux d'irrigation et présentant des profils contrastés en phytomicronutriments seront lyophilisés (8 poudres différentes en tout) puis administrés à 180 souris C57Bl/6J (8 groupes de 9 souris mâles et 9 souris femelles supplémentés et 2 groupes de 18 souris contrôles) durant 12 semaines, dans le cadre d'un régime riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose ainsi qu'un test de perméabilité intestinale à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux évaluer l’impact du génotype et des conditions de culture de poudre de tomate sur les effets sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la tomate avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.

Procédures

Des prélèvements de sang sur un animal vigile seront réalisés. Pour ce faire, les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en isolement des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères. Douleurs possibles lors des interventions de prélèvements sanguins, de perçage des oreilles pour l'identification des animaux lors des injections d'insuline. Ces nuisances ou effets indésirables toutes temporaires et réversibles sont associés à des mesures de raffinement (enrichissement de la cage, manipulation régulière des animaux, soins apportés si nécessité).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de tomate.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de tomate sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (18 par groupe, soit 9 par sexe) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes de manière sexe-dépendante, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé sur la base d’une étude similaire sexe-dépendante et déterminée avec la variation du poids (variable quantitative) comme résultat principal de l’étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie, puis une seconde pour une mini-pompe délivrant de l'angiotensine, afin d'étudier le remodelage des artères sous hypertension et le rôle de gènes de la famille PI3K. Le porteur indique des douleurs modérées post-opératoires, minorées par des antalgiques, et une mise à mort pour prélèvement d'organes. Il présente la souris comme la "seule" espèce disposant des modèles génétiquement modifiés utiles et le recours à l'animal comme un "complément indispensable" des études in vitro.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont particulièrement incidentes chez les patients présentant des pathologies sous-jacentes telles que l'hypertension. Un des processus responsable de la grande majorité des accidents vasculaires est l'athérosclérose. L’athérosclérose va se développer dans différentes zones artérielles, obstruer le vaisseau et dans les étapes ultimes de la maladie provoquer des infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Afin de limiter ce risque, la technique d’angioplastie (pose de "stents") a alors été développée afin de rétablir la lumière du vaisseau. Elle consiste en la pose d’un stent actif, délivrant des substances médicamenteuses, dans le vaisseau endommagé. Cet acte chirurgical est associé à un traiement médicamenteux pour prevenir les rechutes en particulier chez les patients hypertendus. Cependant, des phénomènes de résistance à ces molécules ont été observés. Dans ce contexte, notre équipe se propose donc d'étudier le role des genes de la famille des PI3K dans le remodelage arteriel dans un contexte d'hypertension pour ameliorer ces traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les cibles médicamenteuses pertinentes et efficaces pour lutter contre les complications cardiovasculaires régulièrement retrouvées chez les patients hypertendus.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux interventions chirugicales selon les cas. La première intervention chirurgicale pour implanter la puce de télémetrie dure environ 30min. 1 semaine apres la pose de la puce de la télémetrie, les animaux subiront une deuxième chirurgie de 15 min consistant à la pose en sous cutanné d'une mini-pompe.

Impact sur les animaux

Les deux procédures chirurgicales induisent la pose de 3 sites de sutures sur le thorax et 1 à l'arriere de la tête. Ces actes chirugicaux peuvent entrainer des douleurs modérées post-opératoires qui seront minorées par des antalgiques et les risques d'irritations et de demangeaisons seront minorés par utilisation d'antiseptique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organe.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle animal est un complément indispensable des études in vitro sur des lignées de cellules musculaires lisses que nous avons déjà réalisées au laboratoire. En effet, ces approches de culture cellulaire ne permettent pas d’étudier le remodelage artériel et de mesurer le bénéfice de nos cibles thérapeutiques dans un contexte physiopathologique intégrés prenant en compte l'ensemble des réponses cellulaires mise en jeu au sein d'une artère.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes de publication, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre de bonne analyses statistiques. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs et est donc précisé dans chaque procédure en fonction de la variabilité obtenue des protocoles expérimentaux mis en jeu. La télémetrie permet de diminuer le nombre d’animaux enrolés dans ce protocole en augmentant significativement le niveau de fiabilité et de reproductibilité des mesures de tension arterielle.

Raffinement

Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents mais pas de tunnel ou d'igloo pour éviter à l'animal de se bloquer avec la pompe alzet), pour éviter l’angoisse et eventuellement faciliter l'acces à la nourriture et à l'eau en placant des croquettes humidifiées et de l'hydogel dans la cage. Si les points limites déterminés par le responsable de l'étude sont atteints, nous déterminerons avec la SBEA et le vétérinaire les soins ou l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris, seule espèce animale pour laquelle il existe des modèles animaux génétiquement modifiés pour nos cibles pharmacologiques. Les complications cardiovasculaires en condition d'hypertension font intervenir des mécanismes intégrés qui ne sont pas modélisables par des approches in vitro. L’expérimentation animale est donc une approche complémentaire aux études in vitro, permettant d’utiliser des modèles animaux susceptibles au développement des pathologies vasculaires. Enfin, plusieurs des cibles pharmacologiques potentielles seront validées en utilisant des modèles animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à l'âge de 8 à 20 semaines, au stade jeune adulte car il est nécessaire que leurs systemes cardiovasculaire, immunitaire et métabolique soit entièrement developpé et mature.