Recherche fondamentale

272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent un traitement par gavage puis un suivi mensuel de la force musculaire, des tests de sociabilité et un test du nid avec isolement d'une nuit, avant un électromyogramme sous anesthésie et la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur teste si la relocalisation de la protéine FUS dans le noyau des neurones rétablit les capacités motrices. Il présente une extension possible à l'humain comme un axe futur, sans traitement existant à ce jour.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable caractérisée par une paralysie des muscles qui entrainent le décès des patients par insuffisance respiratoire. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime cette maladie en reproduisant la mutation d’une protéine mutée chez les patients. Le but du projet est de relocaliser cette protéine dans le noyau des neurones et de voir si cela suffit à rétablir les capacités motrices de nos souris.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace de la SLA. Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche en remettant une protéine qui s’est déplacée à cause de la maladie dans sa localisation normale puis d’évaluer si cette stratégie permet de rétablir les capacités motrices de ces souris. Si en remettant FUS à sa place, nous arrivons à réduire les troubles moteurs et sociaux observés, nous pourrons envisager que les prochains axes de recherche se tourneront vers la possibilité de trouver un moyen pour relocaliser FUS dans le noyau des patients souffrants de SLA.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure d’administration par gavage d’un traitement durant 5 jours. Nous réaliserons un suivi mensuel des capacités motrices (force musculaire) sur un dispositif dédié afin de voir l’évolution de la maladie. Ce test se passe en 3 session de 3 minutes maximum chacune, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes. Les animaux seront toujours remis en groupe et de l’enrichissement sera mis à disposition dans leur cage d’élevage. Nous réaliserons deux tests de sociabilité 2 ou 3 fois au cours de la vie de l’animal (à 4, 10 et peut-être 14 mois selon l’évolution de la maladie). Le premier test dure 5 minutes tandis que pour le second, les souris passeront 4 sessions de 5 minutes chacune (avec des phases de retour en cage de 8 minutes entre les sessions). La passation du premier et du second test sera espacée d’une semaine. Le test du nid sera réalisé 2 ou 3 fois au cours de la vie de l’animal et nécessitera que les souris soient isolées durant une nuit. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris endormies afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement. Pour éviter cela, l’expérimentateur en charge de cette partie a suivi des formations pour apprendre à réaliser ce geste et s’est entrainé un grand nombre de fois. Nous pourrions également observer un léger stress causé par la passation du test moteur et des tests de sociabilité. Un temps de repos sera systématiquement appliqué pour les procédures nécessitant plusieurs passages successifs pour le test moteur. Si nous remarquons que les souris sont fatiguées, nous espacerons les différentes sessions. Un délai d’une semaine sera appliqué entre chaque test social. La procédure d’électro myo gramme qui permet d’observer la présence ou non d'atteinte des muscles sera réalisée sous anesthésie, les souris ne ressentiront donc aucune douleur.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures 1 et 2 car nous avons besoin de prélever les tissus pour vérifier 1. la relocalisation nucléaire de FUS mais aussi 2. pour étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer s’il est possible de remettre à sa place une protéine dont le changement de localisation entraine la SLA. Pour étudier cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale (avec l’apparition possible des troubles de la sociabilité) mais aussi une complexité structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme. La souris nous offre la possibilité de travailler avec ces deux niveaux de complexité.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé le suivi longitudinal. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pilote pour valider l’approche expérimentale utilisée et potentiellement réduite le nombre de groupes contrôles que nous utiliserons. Si cette étude pilote est validée sur ces deux aspects, nous pourrons réduite de moitié les animaux nécessaires à la réalisation de la seconde partie du projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles.

455 souris vont être utilisées, 450 tuées à l'issue et 5 mâles reproducteurs réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées pendant vingt-huit jours, de la gestation jusqu'à trois semaines après la naissance, et les souriceaux sont tués pour prélever leur cerveau. Le porteur teste un peptide censé limiter la mort neuronale dans un modèle murin de trisomie 21. Il inscrit ce traitement dans le cas où les parents décident de poursuivre la grossesse après un diagnostic prénatal.

Objectifs

La trisomie 21 est le syndrome génétique le plus fréquent dans la population générale. En raison des différentes politiques de dépistage et d’interruption médicale de grossesse, cette maladie concerne 1 naissance sur 700 à 1 naissance sur 2000 dans les pays industrialisés. Le projet s’inscrit dans une étude visant à développer une nouvelle approche thérapeutique visant à corriger les désordres neurologiques impliqués dans la trisomie 21. Agir sur le nombre de neurones pourrait permettre de diminuer le risque de déficience intellectuelle dans cette pathologie et de changer son pronostic. Pour cela, le but est de trouver un traitement pour protéger le cerveau lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse. Notre étude s’intéresse à une molécule d’origine embryonnaire qui possède des propriétés neuroprotectrices et qui diminue la mort des neurones. Il pourrait donc protéger contre de tels désordres neuro-développementaux. Notre première étude a montré des effets positifs sur le cerveau de souriceaux présentant des caractéristiques de la trisomie 21, traités pendant la gestation. Dans cette étude, le traitement sera administré par injection sous-cutanée à la mère durant la gestation et durant 21 jours après la naissance. Des analyses seront réalisées sur les cerveaux de la descendance ayant reçu ou non le traitement afin de déterminer de quelle façon il est protecteur, d’évaluer son innocuité et sa persistance à l’âge adulte. 5 mâles reproducteurs et 30 femelles seront nécessaires pour le traitement et quatre groupes de souriceaux seront constitués : des témoins traités et non traités et des trisomiques traités et non traités, pour un total de 420 souriceaux.

Bénéfices attendus

Cette pathologie, associée à une déficience intellectuelle, à des troubles du comportement et du langage, impacte l’autonomie des personnes porteuses de ce syndrome. Ce projet permettrait de continuer à explorer les mécanismes conduisant à des anomalies cérébrales dans la trisomie 21 ainsi que de pouvoir définir les mécanismes impliqués dans les effets du traitement administré. Ce traitement pourrait être considéré comme une approche thérapeutique dans le but de diminuer la déficience intellectuelle lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse suite à un diagnostic prénatal de trisomie 21.

Procédures

5 mâles seront utlisés pour la reproduction. 30 femelles recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ou du traitement. Ce geste sera réalisé sur l’animal vigile, à partir du 14ème jour de gestation, jusqu’à 21 jours après la naissance des souriceaux soit durant 28 jours. Les souris issues des femelles gestantes seront utilisées pour étudier les mécanismes impliqués dans l’effet du traitement sur le cerveau.

Impact sur les animaux

Les injections aux femelles gestantes de la molécule seront effectuées sur l'animal vigile et effectuée selon les bonnes pratiques vétérinaires et n'induisent pas de douleur ou d’inconfort à l'animal autre que la piqûre de l'aiguille ainsi que du stress engendré par la manipulation.

Devenir

Tous les souriceaux utilisés seront mis à mort afin de prélever les cerveaux pour effectuer des analyses sur le nombre de neurones, la mort neuronale ainsi que pour déterminer les mécanismes d’action du traitement. Toutes les femelles pour les analyses du foie et des reins afin de confirmer la sécurité du traitement. Les mâles reproducteurs seront réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

Pour atteindre les objectifs du projet basé sur un traitement, un organisme entier et vivant est nécessaire, n’ayant pas la possibilité de créer artificiellement la complexité d’un organisme avec tous les différents types de cellules présentes dans le cerveau.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé après avoir établi l’ensemble des procédures expérimentales à l’aide d’un test de puissance statistique en se basant sur la variabilité entre animaux et la distribution des valeurs.

Raffinement

Afin de garantir le bien-être des animaux, le milieu sera enrichi par l’ajout d’un nid végétal et d’un rouleau en carton. Pour les femelles gestantes et avec leurs petits, de l’enrichissement supplémentaire sera apporté sous forme d’une cabane en carton. Les approches expérimentales seront accompagnées d’une surveillance journalière afin de vérifier tout comportement anormal traduisant une souffrance, comme des signes de prostration, d’agressivité, d’apparence physique. Le poids des femelles gestantes sera relevé tous les jours lors de l’injection du traitement. Une absence de prise de poids sera particulièrement surveillée afin de déterminer s’il s’agit d’une dégradation de l’état de santé de l’animal et/ou d’une interruption de la gestation afin de retirer l’animal de l’étude. Du gel enrichi pourra être proposé dans la cage. Concernant plus spécifiquement les souriceaux, ils seront observés lors des pesées ayant lieu trois fois par semaine selon des critères spécifiques liés à leur âge (coloration, mouvement, respiration, comportement, etc). Lors de la manipulation des souris, les mains de l’expérimentateur seront systématiquement frottées avec de la litière de la cage afin de favoriser des odeurs familières moins stressantes pour les petits et la mère. Un changement de gants aura lieu entre 2 cages de femelles gestantes.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet nous permet de pouvoir réaliser des analyses sur un modèle établi comme modèle de la trisomie 21. Les injections du traitement seront réalisées sur des femelles adultes à partir du 14ème jour de gestation jusqu’à 21 jours après la naissance des souriceaux (soit durant 28 jours) afin de réaliser le traitement durant la gestation et après la naissance. Les analyses réalisées sur le cerveau des souris 30 jours après leur naissance permettront d’étudier l’effet du traitement sur les désordres neurodéveloppementaux et d’évaluer la persistance de son efficacité au stade jeune adulte. Ceci permettrait également à l’étude d’évaluer le potentiel thérapeutique transposable à l’Homme dans le cas d’une administration chez la femme pendant la grossesse pour corriger très précocement la déficience intellectuelle associée à la trisomie 21.

1 336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'objectif en une phrase et ne détaille comme acte qu'un tatouage et une biopsie à quatre jours, alors que la mutation de deux gènes peut empêcher la myélinisation. Il indique que les souriceaux pourraient présenter dès la naissance des rétractions articulaires les rendant immobiles, avant une mise à mort pour prélever les nerfs sciatiques. L'écart est net entre un effectif de plus de mille animaux et une justification scientifique réduite à quelques lignes.

Objectifs

Cette étude vise à confirmer l’importance de deux protéines dans la formation du système nerveux et leur impact en développement humain.

Bénéfices attendus

Dans le cas de de maladies neurogénératives telles que Charcot-Marie-Tooth, les neuropathies périphériques ou l'arthrogrypose , les causes précises restent parfois obscures et, malheureusement, aucun traitement curatif n'existe. Nous identifierons ainsi un nouvel acteur qui pourra être utilisé en diagnostic et qui pourrait être une cible thérapeutique

Procédures

Les animaux sont tatoués et prelevés par biopsie à 4j, sous anesthésie afin de les identifier. Cette procédure unique dure moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Comme la mutation des 2 gènes risque d’impacter le développement de la myéline périphérique, les souriceaux pourraient présenter des rétractions articulaires qui les rendraient immobiles dès la naissance

Devenir

Tous les animaux seront euthanasies pour prélèvement des nerfs sciatiques post-mortem pour analyse de celui-ci par différentes méthodologies complémentaires

Remplacement

L'arthrogrypose est une maladie musculaire et articulaire avec une atteinte de l’intégrité des axones, suite à leur non myélinisation. Ce phénotype a été visualisé chez l'Homme. Les multiples tissus impactés et l' interaction entre différents types de cellules impliquées dans la mise en place du système nerveux périphérique est donc nécessaire pour faire cette étude et nécessite donc un organisme entier mammifère. Aucun système cellulaire ex vivo ne peut rendre compte de la physiologie du développement qui fait intervenir des interactions cellulaires (contact entre nerfs et muscles), molécules informatives véhiculéee par le sang (hormones, cytokines) ou des effets environnementaux. Cette complexité est donc difficile voir impossible à reproduire in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux notamment dans notre cas et le remplacement complet n’est pas possible. De plus, l'inactivation d'un gène dans une lignée de cellules spécifiques indispensable pour nos études n'est possible que chez le rongeur.

Réduction

D ans un 1e temps, nos lignées sont le plus souvent hétérozygotes pour le gène étudié. Ensuite, ces derniers seront croisés entre eux pour générer les homozygotes et les contrôles au sein de la même portée afin de limiter les animaux ne protant pas mutations. Le nombre d'animaux utilisés à des fins de recherche a été calculé en tenant compte de la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux dans une animalerie agrée, dans des conditions de températures et hygrométrie controlées. Elles ont acces ad libitum à la nourriture et l'eau. Les cages présentent un enrichissement du milieu et sont quotidiennement surveillées (week end inclus). Des protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis en cas de souci et tous les prévelements sont post-mortem. Des points limites précoces ont été clairement définis afin d'éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utilisons l'animal le plus utilisé par les chercheurs, la souris. Ces animaux constituent un excellent modèle pour l’étude du développement, des processus morphologiques et des pathologies, observées chez les Mammifères. Leur génome est très bien connu, ce qui permet de les "modifier génétiquement". Cet avantage nous permet d’utiliser des souris mutées et des souris sauvages du même fond génétique dans nos études expérimentales. De plus,l'inactivation du gène d'intérêt dans une lignée de cellules spécifiques indispensable pour nos études, n'est possible que chez le rongeur. Les stades de développement choisis sont ceux qui sont aussi pertinents chez l'Homme afin de pouvoir transposer les résultats

2 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à sept actes en un peu plus d'un mois, dont des injections, deux anesthésies rapprochées, une hyperthermie localisée et un prélèvement de sang intracardiaque terminal, pour tester des nanoassemblages contre l'hépatite auto-immune. Le porteur obtient ce total en triplant un effectif de 896 animaux, soit trois répétitions indépendantes. Le bénéfice annoncé, un traitement ciblé épargnant l'immunité globale, reste une perspective, ces produits n'ayant jamais été administrés à des animaux.

Objectifs

Les maladies auto-immunes comme le diabète de type I, la polyarthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque résultent d’un dérèglement du système immunitaire. Parmi ces maladies, l’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie rare avec une prévalence en Europe de 16 à 18 cas pour 100 000 habitants. Ce dérèglement hépatique provoqué par une attaque du foie par des lymphocytes T peut entraîner des défaillances hépatiques et/ou des cirrhoses. Le traitement actuel, non-spécifique (à base d’immunosuppresseurs combinant des corticostéroïdes et de l’azathioprine) présente de nombreux effets secondaires et entraîne une rémission complète en 18 mois pour seulement 75% des patients. De plus, 50 à 90% des patients rechutent dans l’année après arrêt du traitement. Des nouveaux traitements sont donc nécessaires. Nous souhaitons tester une nouvelle approche de thérapie sous la forme de nanoassemblages (NA) complexes combinant plusieurs stratégies. Une première étape de caractérisation, de validation, et de test de toxicité dans des cellules en culture a été réalisée pour plusieurs formulations, à l’issue de laquelle, 4 différentes formulations ont été sélectionnées pour faire l’objet d’une poursuite d’étude dans un modèle animal. Nous disposons de 2 modèles murins complémentaires d’une atteinte autoimmune hépatique. Les objectifs du projet sont de tester l’innocuité des 4 formulations sélectionnées sur des souris sauvages, puis de tester l’effet thérapeutique de ces NA sur les modèles murins d’hépatite. Ces travaux permettront in fine de combler l’absence actuelle d’approche thérapeutique ciblée pour le traitement de l’hépatite autoimmune.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir l’efficacité d’une nouvelle approche pour le traitement de l’hépatite autoimmune. Le traitement actuel de cette maladie n’a pas évolué depuis plus de 30 ans et consiste en une immunosuppression non spécifique prise au long cours, qui présente des effets indésirables certains. L’approche testée dans ce projet permet d’envisager un traitement ciblé, permettant de ne pas altérer l’immunité globale du patient.

Procédures

Au maximum, les animaux subiront 7 actes, sur une période de 34 à 37 jours. Des animaux recevront une injection (durée 1 minute, animal anesthésié), suivie 10 jours après d’une injection (durée 30 secondes, animal vigile), puis deux injections seront réalisées à une semaine d’intervalle (durée 1 minute chacune, animal anesthésié). Des souris subiront deux anesthésies à des temps rapprochés, la première pour une injection (durée 1 minute) et la seconde, 6 heures après, pour une phase d’hyperthermie modérée localisée (durée 30 minutes), Enfin, un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Des animaux subiront deux anesthésies gazeuses rapprochées (6 heures d’intervalle), ce qui pourrait engendrer un stress. De plus la seconde anesthésie, d’une durée de 30 minutes pourrait entrainer une dépression cardiovasculaire transitoire, ainsi qu’une diminution de la température corporelle de l’animal. Les modèles d’hépatite utilisés provoquent tous deux une hépatite modérée qui n’entraine pas d’effets indésirables notoires. Pour ce qui est des traitements testés, on ne peut pas savoir à l’avance puisqu’ils n’ont jamais été utilisés chez l’animal. Toutefois en se basant sur la bibliographie utilisant des produits comparables, aucun effet indésirable n’a été rapporté. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive après les traitements.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer le foie, les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses d’histologie, de microscopie, de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les étapes de mise au point ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser en vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 2688 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 112 lots de 8 animaux = 896 ; 3 répétitions indépendantes : 2688 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. S’il s’avère qu’un traitement présente une toxicité, l’étude de ce traitement ne sera pas poursuivie dans les procédures suivantes. Dans un but de réduction, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les concentrations sont les mêmes pour plusieurs produits et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les manipulations invasives seront précédées d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. A notre connaissance, il n’existe pas de modèle pertinent autres pour notre étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 8 à 10 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. A des âges plus avancés le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de la pathologie et dans la réponse au traitement.

920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée par injection de cellules cancéreuses, suivie d'injections de nanoparticules d'or et d'immunomodulateurs, de séances d'imagerie et d'une irradiation localisée. Le porteur indique que la tumeur et le traitement peuvent réduire l'alimentation et affaiblir fortement les souris, tuées ensuite car porteuses de tumeurs. La triple combinaison est présentée comme "prometteuse" pour les patients, mais l'apport reste une évaluation d'efficacité chez l'animal.

Objectifs

Le projet répond au besoin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques pour augmenter la sensibilité des tumeurs aux rayonnements (radiosensibilité). Augmenter la dose maximale de radiation dans les tissus tumoraux tout en cherchant à réduire les dommages aux tissus normaux a toujours été un grand défi en radiothérapie. Les développements technologiques ces dernières décennies ont permis une amélioration croissante de l’indice thérapeutique (différence entre la dose thérapeutique et la dose toxique). En outre, plusieurs stratégies ont été développées et testées pour surmonter la radiorésistance de la tumeur et pour augmenter l’efficacité de la radiothérapie comme l’utilisation de radiosensibilisants. Les radiosensibilisants sont des produits chimiques ou des agents pharmaceutiques qui peuvent améliorer l’effet destructeur sur les cellules tumorales en accélérant les dommages à l’ADN et en produisant indirectement des radicaux libres. À cet égard, le rôle émergent de la nanomédecine pour le traitement de différents types de cancer peut représenter une approche prometteuse pour équilibrer l’efficacité de la thérapie et les effets secondaires. En particulier, l’utilisation d’une nouvelle classe de nanoparticules améliorant le rayonnement pourrait constituer une approche révolutionnaire pour le traitement local des tumeurs solides traitées par radiothérapie. L’objectif principal de ce projet est de mettre au point des nanoparticules synergiques et non persistantes pour la chimio-radiothérapie en vue de la gestion avancée du cancer. Afin d’améliorer l’application potentielle aux cliniques des nanoparticules, leur efficacité sera évaluée dans des modèles in vivo avancés, avec un intérêt particulier pour le carcinome de la tête et du cou qui est globalement le sixième cancer le plus fréquent par l’incidence dans le monde et il est caractérisé par une résistance aux médicaments importants.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules métalliques sont développées de plus en plus comme agents prometteurs en oncologie en tant que vecteurs de médicaments et radiosensibilisants. Avec ce projet, nous allons évaluer l'efficacité anti-tumorale des nanoparticules d’or. Nous eallons évaluer l'efficacité de la triple combinaison radiothérapie, nanoparticules métalliques et immunomodulateurs pour obtenir des effets antitumoraux systémiques. Cette triple combinaison propose un modèle original et nouveau de coopération thérapeutique pour lutter contre le cancer, qui pourrait améliorer la prise en charge des patients de cancers des voies aériennes et digestives supérieures.

Procédures

Les animaux auront une injection de cellules tumorales (durée 1 minute, sous anesthésie générale). Les animaux subiront aussi une injection de nanoparticules et, pour certains, une injection d'immunomodulateur (durée 1 minute). Les animaux auront 3 séances d'imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée 10 minutes). Des animaux subiront une irradiations localisée sur la tumeur par animal (durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Le traitement ainsi que la façon dont croît la tumeur peuvent réduire la capacité de la souris à s’alimenter et affaiblir fortement la souris. Les animaux subiront aussi du stress lors des préhensions pour examen, des injections (peu de nuisances car anesthésie locale) et des séances d'imagerie (stress de préhension).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car ils seront porteurs de tumeurs. De plus, sur certains lots, des analyses post-mortem seront efectuées sur des tissus .

Remplacement

Nous avons utilisé au préalable des tests in vitro pour évaluer l'efficacité des nanoparticules sur les différentes lignées cellulaires utilisées dans ce projet. Les modèles in vivo s’avèrent indispensables pour valider ces résultats avec un système d’administration proche à celle que sera utilisée en clinique (injections intratumorales). Le recours à des modèles animaux est aussi incontournable pour étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et qui permet donc l’interaction des cellules tumorales avec le stroma (dont les cellules immunitaires sous dépendance de médiateurs type cytokines ou cellules provenant du reste de l'organisme). Cela est indispensable dans le contexte de la radiothérapie (par exemple: effet «bystander» de l’irradiation i.e. effets que les cellules irradiées pourraient exercer sur des cellules non irradiées à proximité ou à distance par exemple). Il n’existe pas de modèle alternatif permettant une telle étude. Le projet nécessite donc d’être mené sur un organisme vivant disposant d’un système immunitaire complet, et permettant l'étude du microenvironnement tumoral.

Réduction

Nous avons utilisé au préalable des tests in vitro pour évaluer l'efficacité des nanoparticules sur les différentes lignées cellulaires utilisées dans ce projet. ces tests ont permis de sélectionner certaines types de nanoparticules qui ont montré une meilleures efficacité en combinaison avec la radiothérapie. Nous allons donc effectuer les test in vivo uniquement avec le meilleur candidat sélectionné sur la base de ces tests préliminaires, ce qui va nous permettre de réduire le nombre d'animaux nécessaires. En outre, la connaissance des deux modèles tumoraux nous permet d'utiliser uniquement deux doses unique de radiothérapie, car nous connaissons déjà la radiosensibilité de ces modèles. De plus, ces modèles sont bien maitrisés au laboratoire, ce qui a permis d'avoir un tas d'inclusion élevé (très bonne prise de croissance des tumeurs). Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour ce projet nous nous sommes basés sur des analyses statistiques. Le suivi hebdomadaire des animaux permettra de réduire le nombre d'animaux utilisées (augmentation de la puissance statistique).

Raffinement

Un suivi quotidien clinique pour recherche de signes éventuels de souffrance sera effectué, et des mesures d'analgésies seront mises en oeuvre en cas de besoin. Le développement de la tumeur sera suivi par la mesure du volume tumoral grâce à l'imagerie in vivo et par des mesures directes. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront strictement appliqués. L'environnement sera enrichi avec des sizzlenests et des tunnels en carton afin de diminuer l'angoisse. Les interventions (injections, imagerie) seront faites sous anesthésie.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: - La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. - Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - Les modèles de tumeur étudiés sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature.

1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime riche en graisses pendant seize semaines pour devenir obèses, un protocole de course sur tapis de huit semaines et des tests de tolérance au glucose avec prélèvements de sang répétés. Le porteur ne décrit comme nuisance qu'un risque d'irritation aux points d'injection, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'étude vise à préciser le rôle d'une protéine adipocytaire dans l'obésité, sans bénéfice thérapeutique annoncé au-delà d'une hypothèse.

Objectifs

Ce projet concerne l'étude d'une protéine cible de l'hypoxie et induite en réponse aux stress. Nous étudieorns son implication dans le développement de la résistance à l'insuline induite par un régime riche en graisses et nous déterminerons si la délétion de cette protéine dans les adipocytes potentialise les effets bénéfiques de l’activité physique. Ce projet ne duplique pas d'études déja publiées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir d'une part, le rôle d'une protéine adipocytaire dans le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline, et d'autre part si son invalidation peut avoir des effets bénéfiques sur le traitement de l'obésité.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines afin d'induire une prise de poids. Les souris seront soumises à un protocole d'exercice d'endurance (tapis de course adapté à la souris) pendant 8 semaines. Certaines souris obèses seront renourries avec un régime normal afin de réverser les effets de l'obésité. Les souris seront soumises à des prélèvements de sang sur souris vigiles lors des tests de tolérance au glucose (GTT) ou à l'insuline (ITT). Lors de ces tests, une goutte de sang est prélevée pour mesurer la glycémie au cours du temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes). Un prélévement de sang sur souris vigile sera effectué à la semaine 6, 14, 20, 22, 24 et 28 (max 100µl) de la procédure 1 et à la semaine 6, 20, 26 et 29 de la procédure 2.

Impact sur les animaux

Lors des injections en intra-péritonéale (lors des GTT, ITT ou tamoxifène) il pourrait y avoir un risque d'irritations et d'infection aux zones d'injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer les organes.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études sur des cellules adipocytaires cultivées in vitro et nous avons montré que la protéine d'intérét est impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline in vitro. Pour comprendre l’implication de cette protéine chez l’Homme, il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de la physiologie et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer trop d’animaux en excès. Chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Le nombre d’animaux a été calculé pour limiter les variations inter-individus et atteindre un niveau statistique validé par une analyse prédictive. Les procédures seront répétées 3 fois. Cependant, si une différence statistiquement significative est observée après 2 répétitions, nous ne ferons pas la troisième répétition.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux (par les expérimentateurs ou l'équipe zootechnique), ce qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal facile à utiliser grâce à sa natalité importante, son faible coût d’élevage et notre expertise nous permettant d’avoir des locaux d’hébergements et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de leur patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont réalisées sur des souris et cette espèce nous permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques et génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Seules les souris adultes seront utilisées dans ce projet. Pour l’étude du métabolisme, les souris seront mises sous régime alimentaire à 6 semaines. Ceci permet de diminuer la variabilité inter-animaux et donc de réduire les effectifs.

77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs ovaires sont retirés par chirurgie pour reproduire l'ostéoporose post-ménopause, puis elles reçoivent des injections tous les deux jours pendant jusqu'à huit semaines et deux prélèvements de sang. Le porteur admet une mortalité chirurgicale acceptée jusqu'à 10 %, et une mise à mort finale pour analyser les tissus osseux. Le test porte sur une famille de molécules développée avec des chimistes, dont l'effet reste à consolider.

Objectifs

L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Dans le cadre du développement de traitements contre l’ostéoporose nous avons développé, conjointement avec une équipe de chimistes, une famille de molécules agissant à la fois sur les symptômes directs de la maladie associés au remodelage osseux (pertes osseuses) mais également sur les phénomènes inflammatoires associés. L’objectif de ce projet est donc de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de ces molécules, en étudiant la restauration du phénotype osseux associé à leurs emplois, dans un modèle murin d’ostéoporose induit chez l’animal par le retrait des ovaires (ovariectomie). Cette approche expérimentale permet de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause et impactant l’homéostasie tissulaire osseuse (ostéoporose post-ménopause). Ce travail permettra donc, à terme, de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre l’ostéoporose.

Bénéfices attendus

L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse ou des substituts hormonaux, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques. En traitement de première intention, si certaines molécules bloquent la formation et l’activité des cellules qui dégradent naturellement l'os limitant ainsi la perte osseuse, cette approche thérapeutique ne permet pas de récupérer de la densité osseuse car elle bloque également à terme la reformation osseuse. Par ailleurs de nombreux effets secondaires sont associés à ces différents types de traitements : douleurs musculo-squelettiques et troubles digestifs auxquels s’ajoute un risque de destruction des os de la mâchoire avec certaines molecules. L’approche proposée vise à l’obtention d’une efficacité similaire à celle de ces molécules via des modes d’actions différents, laissant présager de ne pas reproduire leurs effets indésirables principaux, favorisant la prise en charge des patientes souffrant d’ostéoporose post-ménopause.

Procédures

Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30min sous anesthésie générale visant au retrait de leurs ovaires, puis des injections tous les 2 jours pendant 8 semaines au maximum sur animaux vigiles, sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale. Les animaux auront également deux prélèvements sanguins (100µL chacun) à la queue, sous anesthésie générale, le premier en pré-opératoire et le second à 4 semaines post-opératoires.

Impact sur les animaux

Toute approche chirurgicale implique un risque non négligeable de mortalité. Une mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie de 10% est le maximum acceptable au-delà duquel la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée en post-opératoire, est attendue dans les premiers jours.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés suite à la nécessité de réaliser un prélèvement sanguin puis de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner et analyses histologiques et immunohistochimiques afin de pouvoir évaluer l'efficacité des traitements.

Remplacement

A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace pour étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme. Les modèles d’organes isolés ne peuvent pas, à notre connaissance, fournir une réponse pertinente. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.

Réduction

Des analyses à mi-parcours avec dispositif d’arrêt de l’expérience si l'expérmentation ne peut statistiquement pas donner de résultat seront appliquées. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Nous proposons donc d’effectuer une première série de 5 animaux par groupe, avec une analyse statistique intermédiaire permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique satisfaisante dans la limite de 10 animaux par groupe au maximum. Des tests statistiques adaptés aux effectifs de cette étude seront ensuite utilisés.

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de quarantaine d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton…) permettant aux animaux d'améliorer leur milieu. A chaque intervention les animaux seront anesthésiés si nécessaire afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’approche chirurgicale, une douleur post-opératoire sera anticipée avec l’injection préventive et curative d’antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les trois jours suivants la chirurgie et dès les premiers signes d’inconfort détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours lors des injections de façon à contrôler l'absence de points limites tout au long de l'étude. Les molécules choisies seront injectées sur animaux vigiles sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale (afin de réduire le stress des animaux) tous les deux jours pendant 28 à 56 jours. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés sous anesthésie générale gazeuse.

Choix des espèces

La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures de l’équipe ont donné des résultats exploitables concernant les traitements dans d’autres champs d’application. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie abdominale de quarante minutes qui dérive le canal lymphatique, puis un gavage d'une formule riche en oméga-3 et une collecte de lymphe pendant six heures en cage individuelle. La dérivation étant irréversible, tous sont tués en fin de protocole, leurs organes servant aussi à d'autres analyses. Le porteur relie ce travail à des recommandations nutritionnelles et à la "valorisation" de matrices alimentaires pour les consommateurs.

Objectifs

Une meilleure compréhension de la biodisponibilité des nutriments permet de fixer des recommandations nutritionnelles appropriées pour un effet santé. Les données scientifiques relatives à l'amélioration de la biodisponibilité des oméga-3 sont éparses. Ce projet vise à déterminer l'ensemble des facteurs susceptibles d'améliorer l'absorption intestinale et la biodisponibilité des oméga-3 pour des effets santé avérés. Il s'agit d'un sujet de fond qui permettra d'acquérir des données scientifiques originales utiles à la valorisation des nutriments lipidiques dans des matrices alimentaires innovantes ciblant la santé et le bien-être des consommateurs.

Bénéfices attendus

Ce sujet permettra d'acquérir des données scientifiques pour valoriser des nutriments lipidiques d'interet tels que les omega-3 pour des bienfaits santé et le bien-être des consommateurs. Egalement ces données permettront d'acquérir des arguments scientifiques pour appuyer les recommendations et besoins nutritionnels chez l'Homme. C'est un sujet de santé publique en lien avec les recommendations nutrtionelles.

Procédures

La technique chirurgicale de dérivation du canal lymphatique est réalisée sur les animaux et dure environ 40 minutes sous anesthésie générale. Les animaux reçoivent une seule intubation gastrique de l'une des formules lipidiques riches en oméga 3. Cette manipulation ne dure pas plus de 30 secondes , sous la réalisation de personnel qualifié. Les animaux sont ensuite placés en cage individuelle où ils disposent à volonté d'eau tout au long de l'expérimentation. La lymphe s'écoule et recueillie au travers de la canule placée a demeure vers un tube entreposé dans la glace sur les 6 heures suivantes.

Impact sur les animaux

La technique de micro chirurgie implique une incision large de l'abdomen. Après la pose d'une sonde à demeure, l’animal est suturé. Au reveil cela peut induire une douleur à l’animal, ce qui est anticipé par l’injection en amont et après la chirurgie d’un anti douleur ( analgésique). En outre, le recueil de la lymphe, nécessite une immobilisation de l'animal dans une cage individuelle, le temps de l'expérimentation (6 heures post prandial). Pour éviter tout stress, les animaux sont isolés au calme sous une température de 24°C. Enfin, l’administration des formules lipidiques, par gavage gastrique peut induire un stress chez l’animal. Ces volumes sont calculés de sorte à ne pas dépasser 1mL par animal pour limiter le temps de manipulation. En outre, la manipulation de gavage est réalisée par les techniciens de laboratoire, formés, habilités à le faire et qui en l’occurrence maitrisent parfaite le geste technique pour limiter tout stress à l’animal.

Devenir

L'intervention permet de dériver le canal lymphatique. Or après dérivation il n'est pas possible de replacer le canal lymphatique dans le circuit général, et sans quoi les animaux ne peuvent pas vivre "naturellement". Ceci implique l'euthanasie de l'ensemble des animaux en fin de protocole expérimental.En outre les organes sont également recueillis en vue d'autres études et pour limiter le nombre d'animaux en rechercher expérimentale pour du prélevement d'organes.

Remplacement

L'absorption intestinale et le métabolisme des lipides ne peuvent être directement estimés chez l'Homme. Le rat est le modèle de choix dans ce type d'étude car il les systèmes digestif et intestinal sont semblables à ceux observés chez l'Homme. Les méthodes alternatives type cultures cellulaires ne peuvent être envisagées car elles ne présentent pas à ce jour les mêmes caractéristiques que celles observées chez le rat et l'Homme. Notamment les cellules intestinales utilisées en recherche sont issues de cellules cancéreuses et ne présentent pas les caractéristiques impliqués dans l'absorption intestinale des lipides chez l'Homme et le rat.

Réduction

La taille de la population cible est calculée à partir de données avec une marge d’erreur, acceptable de 5% et un niveau de confiance : 95% . Cette ta taille l’échantillon est calculée via un logicile qui prend en compte les données. En conséquence, une taille d'échantillon totale de 8 rats par groupe a été obtenue.

Raffinement

Pour éviter toute douleur liée à l'intervention, les animaux recoivent un analgésique pour prévenir de la douleur juste avant l'intervention. Une grille de suivi et d'évaluation de la douleur est mise en place pour chaque animal en post chirurgie. Selon le score obtenu dans cette grille, de nouvelles injections d'analgésique peuvent être réalisées afin de limiter la douleur aux animaux. Les animaux sont placés dans des cages individuelles jusqu'au réveil où ils disposent d'eau à volonté, dans une pièce d'isolement au calme, dont la température est maintenue à 24°C pour leur éviter tout stress.

Choix des espèces

Le modèle rat est le modèle le plus utilisé dans les études d'absorption et de métabolisme des lipides dans l'organisme, en vue d'une extrapolation chez l'Homme. Ce modèle a l'avantage de possèder les mêmes systèmes digestif et enzymatiques que ceux observés chez l'Homme. D'autre part depuis près de 30 ans nous avons cumulés des données obtenues à partir de ce modèle, ce qui nous permet de poursuivre nos investigations sur la base de précédentes études mais aussi de mettre en régard nos données à celles d'autres travaux de recherche à l'internationnal. Les animaux sont reçus à 8 semaines au stade de jeunes adultes. Nos études reflètent l'absorption de lipides d'interet chez les adultes ( pour la population saine adulte en général) et nos animaux sont des jeunes mâles adultes. Les animaux sont acclimatés 1 semaine avant de rentrer dans le protocole expérimental.

688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypothyroïdie leur est induite par un régime carencé et un antithyroïdien, associée à une chirurgie cérébrale et à un hébergement en obscurité constante ou en cycle jour-nuit atypique, en cage individuelle. Le porteur attend une bradycardie, une température abaissée et un état d'anxiété supérieur à la normale, évalué par des tests comportementaux, avant la mise à mort pour prélèvement de tissus. Les débouchés annoncés pour les patients, une luminothérapie ou des thérapies comportementales, restent conditionnés à la mise en évidence d'un dérèglement de l'horloge interne.

Objectifs

L'hypothyroïdie correspond à un déficit en hormones thyroïdiennes. Toutes causes confondues, l'hypothyroïdie touche près de 10% de la population. Les patients souffrent de fatigue chronique, de bradycardie, d'une sensibilité accrue au froid, et de prise de poids. Ils présentent aussi des troubles liés à l'humeur tels qu'irritabilité, anxiété ou dépression, dont l'étiologie reste mal comprise. Plusieurs observations sur des patients et des modèles animaux suggèrent que l'hypothyroïdie pourrait perturber l'horloge circadienne. Cette horloge biologique coordonne les rythmes physiologiques et comportementaux avec le cycle jour-nuit. Comme le dérèglement de l'horloge cause des troubles de l'humeur tels que ceux observés chez les patients hypothyroïdiens; il est tentant de supposer un lien de causalité entre ces troubles et les rythmes biologiques au cours de l'hypothyroïdie. Nous souhaitons tester cette hypothèse dans un modèle murin d'hypothyroïdie induite.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de mieux comprendre l'étiologie des troubles de l'humeur souvent associés à l'hypothyroïdie, et d'envisager des approches thérapeutiques au-delà du traitement hormonal de substitution. En effet, la prise d'hormone thyroïdienne est efficace pour le traitement de l'hypothyroïdie sur le long terme, mais définir et ajuster la dose optimale de chaque patient s'avère souvent très long et laborieux. La mise en évidence d'un dysfonctionnement de l'horloge circadienne ouvrirait de nouvelles possibilités d'accompagnement des patients dysthyroïdiens pendant cette période d'ajustements hormonaux, par exemple par la mise en place d'une luminothérapie ou de thérapies comportementales pour resynchroniser les rythmes biologiques.

Procédures

Induction d'une hypothyroïdie par régime hypo-iodé et traitement anti-thyroïdien. Maintenue pendant 2 à 3 semaines. Prélèvement unique de 3µl de sang, à la pointe de la queue de souris vigiles. Chirurgie cérébrale ciblée, sous anesthésie générale. Hébergement en cycle jour-nuit atypique (11.5 heures de lumière, 11.5 heures d'obscurité; ou obscurité constante pendant 2 semaines). Hébergement en cage isolée, avec contacts sociaux visuels.

Impact sur les animaux

La présence d'un agent anti-thyroïdien dans l'aliment hypo-iodé le rend moins appétant. Les souris mangent moins mais continuent à prendre du poids, et se stabilisent à environ 90% du poids des souris nourries avec l'aliment contrôle. Les souris hypothyroïdiennes présentent aussi une température corporelle légèrement abaissée par rapport aux souris contrôles (uniquement pendant leur phase d'inactivité), ainsi qu'une bradycardie (ralentissement de la fréquence cardiaque d'environ 25%). Comme cela est le cas chez les patients, nous nous attendons aussi à un état d'anxiété supérieur à la normale, qui sera évalué au travers des tests comportementaux. Le fonctionnement de l'horloge interne sera testé par mesure de l'activité locomotrice volontaire en absence de repères temporels (suppression du cycle jour-nuit). Cette étape requiert un hébergement des souris en cages individuelles équipées d'une roue d'activité, dans l'obscurité constante pendant une vingtaine de jours. Un prélèvement sanguin unique sera réalisé pour évaluation du statut thyroïdien par dosage hormonal. Cela nécessite la collecte d'une goutte de sang suite à une incision à la pointe de la queue (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement de tissu.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier l'impact d'une perturbation systémique (l'hypothyroïdie) sur le fonctionnement du cerveau et ses conséquences en terme de comportement. La souris constitue un excellent modèle d'étude des rythmes circadiens chez les Mammifères, pour lequel la physiologie générale, les comportements, et le fonctionnement de l'horloge interne sont suffisamment bien décrits pour servir de référence dans le cadre de ce projet. Notre objectif sur le long terme est d'établir un modèle mathématique suffisamment riche et prédictif pour anticiper le devenir de l'horloge circadienne dans différentes situations physiopathologiques en complément/remplacement des modèles animaux. Les données que nous obtiendrons dans ce projet s'inscrivent dans cette ambition et serviront à préciser et compléter une version initiale du modèle que nous avons proposé.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux impliqués dans les tests comportementaux a été estimée par un calcul de puissance a priori (n=26 souris par groupe). Chaque souris sera évaluée de façon longitudinale dans plusieurs tests, permettant de réduire le nombre total d'animaux. Pour la procédure d'imagerie in vivo, chaque souris sera testée sous régime contrôle et sous régime hypothyroïdien. Chaque souris étant son propre contrôle, le nombre d'animaux impliqués sera réduit. Notre expérience démontre qu'il faut opérer 6 à 8 souris pour obtenir n=4 souris avec un signal suffisamment fort afin de décrire le fonctionnement de suffisamment de neurones horloges dans une condition donnée (un minimum de 10 neurones visibles dans le champ optique par animal.

Raffinement

Dans un souci de raffinement du protocole, nous avons préféré mettre en oeuvre un modèle d'hypothyroïdie induite plutôt que de réaliser une ablation chirurgicale de la glande thyroïde. Cette approche ne nécessite pas d'adaptation particulière des conditions d'élevage. Toutefois, l'apport de matériel de nidification sera renforcé afin de permettre aux souris hypothyroïdiennes (en légère hypothermie) de mieux maitriser la température de leur environnement. Les animaux seront habitués à être manipulés par la personne en charge des tests comportementaux. En vue d'évaluer le statut thyroïdien de façon la moins invasive possible, nous avons développé un protocole de dosage ultra-sensible de l'hormone TSH, à partir d'un volume extrêmement faible de sang total (3 µl, à comparer avec 50 à 100 µl pour les kits commerciaux). La chirurgie préparatoire à la procédure d'imagerie est conduite sous anesthésie générale, avec médication post-opératoire pendant 48 heures. Toutes les souris hébergées en cage isolée conserveront un contact visuel avec d'autres congénères. L'hébergement dans les cages à roue constitue un enrichissement très apprécié, et la mesure de l'activité locomotrice volontaire fournira un index de l'état général des souris : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par les souris contrôles sera pesée et observée. En cas de perte de poids supérieure à 10% du poids initial, de prostration ou de poil hérissé, les souris auront accès à de la nourriture hydratée et/ou un anti-inflammatoire non-stéroïdien pendant 24 à 72 heures. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% à son poids initial, alors elle sera mise à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix dont l'horloge circadienne et la physiologie thyroïdienne reposent sur les mêmes principes moléculaires et cellulaires que l'espèce humaine. Cette espèce donne accès à un large éventail d'outils génétiques et moléculaires pour manipuler les systèmes biologiques (ex : nous utiliserons ici des lignées exprimant des allèles modifiés de gènes de l'horloge), ou pour mesurer l'activité neuronale par imagerie in vivo. Jeunes adultes de 6-7 semaines en début d'expérimentation.