Recherche fondamentale

1 124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une douleur chronique leur est infligée par chirurgie de la patte, entretenue de cinq à douze semaines, avec jusqu'à vingt-cinq tests comportementaux par animal pour la mesurer. Le porteur indique que cette douleur ne peut pas être soulagée puisqu'elle est l'objet même de l'étude, menée pour tester un plasma riche en plaquettes. Les bénéfices annoncés pour les patients, prévention et soulagement de douleurs neuropathiques et post-chirurgicales, restent renvoyés au conditionnel et à un usage clinique futur.

Objectifs

La douleur neuropathique est par définition consécutive à une lésion ou une maladie affectant le système somatosensoriel. Chez la plupart des patients, elle a une origine périphérique, par exemple à la suite d'une lésion des nerfs périphériques. La douleur post-chirurgicale chronique quant à elle est définie comme une douleur qui persiste au-delà de 2 mois après la chirurgie sans autre cause potentielle de douleur telle qu’une infection. Généralement chroniques et invalidantes, ces 2 grands types de douleurs, fréquemment rencontrés dans la population, affectent fortement la qualité de vie des patients et ont un impact socio-économique important par leurs répercussions sur la vie professionnelle. La prise en charge de ces douleurs constitue donc un enjeu important de santé publique. D'un point de vue thérapeutique, ces douleurs sont cependant difficiles à traiter. Certains antidépresseurs et anticonvulsivants sont actuellement les meilleures thérapies disponibles mais leur utilisation clinique est limitée par des effets indésirables. Il en est de même pour les douleurs post-chirurgicales chroniques habituellement traitées avec des opiacés qui entraînent de nombreux effets indésirables et parfois même une addiction. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements et/ou approches thérapeutiques pour soulager ces types de douleurs chroniques. Dans ce contexte, un nouvel outil thérapeutique autologue a été développé ces dernières années : l'injection de plasma riche en plaquettes (PRP) qui est un concentré sanguin plaquettaire autologue contenant une concentration naturelle de facteurs de croissance et de cytokines. Cette technique, largement utilisée en rhumatologie ou en médecine du sport reste encore peu utilisée dans le domaine de la douleur chronique. L'intérêt médical de cette préparation est que les plaquettes concentrées vont favoriser une augmentation des facteurs de croissance libérés au niveau du site de lésion, favorisant ainsi le processus de guérison. Cependant, le mécanisme d'action du PRP reste peu clair. Pour aller au-delà des connaissances actuelles, nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique du PRP dans un modèle murin de douleur neuropathique induite par une compression du nerf sciatique, de généraliser cette évaluation à une autre étiologie de douleur couramment rencontrée : la douleur post-chirurgicale et d'étudier les mécanismes d'action sous-jacents.

Bénéfices attendus

Nous postulons que le PRP pourrait non seulement avoir un potentiel thérapeutique dans le soulagement de la douleur neuropathique installée, mais pourrait également être bénéfique dans la prévention de son initiation et de son maintien. Le PRP pourrait également être efficace pour traiter d’autres étiologies de douleurs comme les douleurs post-chirurgicales qui sont actuellement mal soulagées par les analgésiques acutels (patients non répondeurs ou présentant trop d'effets indésirables). Nous espérons, avec ce projet, proposer un outil thérapeutique pour empêcher le développement des douleurs neuropathiques et post-chirurgicales. A l’issue de ce projet, nous espérons pouvoir proposer ce traitement chez l’Homme en clinique afin de prévénir et de soulager les douleurs neuropathiques et post-chirurgicales. Cette avancée pourrait également permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une douleur chronique allant de 5 semaines pour la douleur post-chirurgicale à 12 semaines maximum pour la douleur neuropathique. Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Un groupe d’animaux recevront du plasma riche en plaquettes (PRP) au niveau du site de lésion pendant la chirurgie et un autre groupe d’animaux recevront du PRP par administrations lombaires sous anesthésie gazeuse (5 administrations maximum espacées de 24h, la durée d’une injection intrathécale est de 5 min environ) une fois la douleur chronique installée. Ces animaux subiront également plusieurs tests comportementaux (maximum 25 tests par animal avec un délai de 24h minimum entre chaque test) afin d’évaluer leur douleur (durée des tests allant de 2 min à 20 min avec l’habituation). La durée totale du projet sera de 14 semaine pour la douleur neuropathique et de 7 semaines pour la douleur post-chirurgicale.

Impact sur les animaux

Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Mais l'objectif de l'étude est d'évaluer l'effet analgésique préventif et curatif du PRP, celui-ci devrait donc avoir un effet bénéfique sur la douleur. Suite à la chirurgie neuropathique ou incision de la patte, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies neuropathiques ou incisionnelles vont induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ces modèles. Certains animaux vont subir des injections intrathécales lombaires. Les animaux subiront toute une batterie de tests comportementaux nociceptifs sur lesquels ils gardent le contrôle (retrait de la patte).

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour prélèvements.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’effet thérapeutique du PRP dans un modèle de douleur neuropathique ainsi que dans un modèle de douleur post-opératoire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 14 souris mâles et 14 souris femelles, le risque de variabilité lié à l’activité intrinsèque du PRP étant inconnu et non négligeable. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d'analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la Société du Bien-Etre Animale (SBEA) de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie du crâne d'environ une heure trente pour l'implantation de capteurs intracérébraux, puis deux tests comportementaux et un régime cétogène, afin de suivre le glucose et le lactate du cerveau chez l'animal éveillé. Le porteur choisit le rat plutôt que la souris pour sa taille, seule capable de porter le dispositif miniature fixé sur la tête. Il présente les effets neuroprotecteurs du régime au-delà de l'épilepsie comme des hypothèses, l'apport immédiat restant la mise au point d'un système de mesure sans fil.

Objectifs

Le jeûne induit des adaptations métaboliques qui produisent des effets bénéfiques sur la santé, notamment mentale. Au fil des jours de jeûne, l’organisme puise son énergie dans les réserves de graisses du tissu adipeux et les corps cétoniques issus de leur dégradation, remplacent en partie le glucose dans le sang et le cerveau. Cet état métabolique, appelé cétose, peut-être reproduit par un régime dit cétogène, riche en graisse et dépourvu de sucres. Certains effets neuroprotecteurs du jeûne sont reproduits par le régime cétogène, notamment l’effet anti-épileptique, d’autres sont encore à l’état d’hypothèse, comme des effets anti-neurodégénératifs et protecteurs vis-à-vis de la maladie d’Alzheimer ou de Parkinson. Cependant, les effets de ce régime sur le métabolisme cérébral sont encore mal connus. Malgré l’absence de sucres dans la nourriture ingérée sous régime cétogène, le foie reste capable de produire du glucose. Cependant l’évolution des concentration intracérébrales de glucose au cours d’une diète cétogène reste inconnue, tout comme celle du lactate. Or le glucose et le lactate sont les principaux métabolites énergétiques du cerveau et la compréhension des effets du régime cétogène sur le métabolisme cérébral commence par une connaissance de ses effets du le glucose et le lactate cérébraux. Le but de ce projet est de monitorer les concentrations interstitielles de glucose et de lactate dans le cerveau au cours des premiers jours d’un régime cétogène grâce à des biocapteurs électrochimiques. Ce projet est aussi un défi technologique car la détection du glucose et du lactate repose sur des capteurs dont la durée de vie in vivo n’excède par 12h. Un nouveau procédé de fabrication qui permet d’obtenir une sensibilité stable pendant 5 à 7 jours a été mis au point. Ce projet permettra aussi de valider le concept d’un monitorage de plusieurs jours chez l’animal vigil, grâce à ces nouvelles microélectrodes.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet permettra d’évaluer comment la diète cétogène affecte le métabolisme cérébral. D’un point de vue méthodologique, ce projet permettra de mettre au point un système sans fil innovant, embarqué sur la tête de l’animal et qui rendra possible les études du métabolisme cérébral chez l’animal vigil. Sachant que l’anesthésie générale perturbe largement le métabolisme et notamment la régulation du glucose et du lactate intracérébral, cette innovation permettra une meilleure compréhension des mécanismes régulant le métabolisme cérébral. L’effet du régime cétogène sur le métabolisme cérébral une thématique importante du laboratoire pour laquelle un autres financement a déjà été obtenu de la FRC, la possibilité d’étudier ces effets chez l’animal vigil sans anesthésie représente un progrès considérable.

Procédures

Une chirurgie initiale durant environ 1h30 avec implantation de capteurs intracérébraux Deux tests comportementaux chez l'animal vigil et modification de l’alimentation. Les animaux seront hébergés individuellement pour pouvoir suivre leur prise alimentaire.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du crâne qui peut occasionner des douleurs qui seront traitées par l’administration de buprénorphine pendant les premières 24h, puis de carprofène pendant 12h supplémentaires. Ensuite, l’animal sera soumis à des protocoles des stimulations sensorielles très peu invasives. Le régime cétogène présente aussi peu d’effets secondaires, ceux-ci incluent une constipation ou des diarrhées peu fréquentes. Sur l’ensemble du projet la nuisance principale représente le réveil après la chirurgie du crâne, ce qui justifie un niveau de gravité modéré.

Devenir

La survie des animaux impliquerait une deuxième chirurgie pour la désimplantation des électrodes et probablement des souffrances consécutives à l'intervention

Remplacement

Le régime cétogène induit des adaptations lentes du métabolisme dès le changement de régime alimentaire. Ces adaptations impliquent l’ensemble de l’organisme : intestins, foies, pancreas, circulation sanguine, reins, cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir recours à l’animal vivant pour étudier ce phénomène. Le remplacement par des approches in vitro n’est pas possible actuellement.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre des analyses statistiques fiables. Au cours de ce projet, les analyses statistiques consisteront à comparer les données obtenues pendant la phase de diète standard 36h-48h après chirurgie, à celles obtenues après 3 jours de diète cétogène. Des tests de t de Student appariés seront appliqués après une analyse de normalité par le test de shapiro-Wilk. Dans le cas d’échantillons de données non normales, des tests de Mann-Whitney seront pratiqués. Les effectifs sont calculés sur la base de 10 animaux par groupe. Des mâles et des femelles seront inclus à part égale dans l’étude et nous disposerons de 5 comparaisons pour pouvoir détecter d’éventuelles différences liées au sexe. Les analyses statistiques seront pratiquées dès que six animaux auront été enregistrés. S’ils sont significatifs ou si des calculs de taille d’échantillon par des test beta révèlent qu’aucune différence claire n’apparaît, les expériences seront interrompues sans utiliser l’effectif annoncé au départ, ce qui peut réduire l’effectif.

Raffinement

Tout au long de ce projet, les animaux seront hébergés par paire dans des cages enrichies avec des matériaux de nidification et des baguettes de bois à ronger, afin d’améliorer leur bien-être général. Pendant la phase de réveil après chirurgie, le bien-être de l’animal sera évalué par une grille de score et la douleur sera traitée par des analgésiques. Tout au long du projet, des interactions régulières avec la cellule bien-être et la vétérinaire référente permettront éventuellement d’intégrer des mesures supplémentaires permettant d’améliorer le confort des animaux (par exemple un allongement de la période d’administration des analgésiques au-delà des premières 36h).

Choix des espèces

La plupart des études sur les effets du régime cétogène ont été effectuées chez le rongeur, qui représente le modèle animal de prédilection dans ce domaine, ce qui permet de s'appuyer sur un corpus bibliographique conséquent. Par rapport à la souris, le rat présente une taille et une masse musculaire plus importantes. Seul cet animal pourra porter le poids du potentiostat miniature évalué à moins de 10 g. Rats adultes de 10 semaines (environ 330g chez les mâles et 240g chez les femelles). L'étude concerne des animaux adultes

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le parasite de la leishmaniose est injecté dans l'oreille, puis les lésions sont suivies pendant plusieurs mois, le porteur indiquant que des ulcérations peuvent se développer et durer jusqu'à douze semaines. Il étudie le rôle d'un récepteur immunitaire dans cette maladie et situe le bénéfice, une thérapie, à long terme. Il affirme que les mécanismes inflammatoires ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un organisme entier.

Objectifs

Les leishmanioses sont des pathologies causées par le parasite leishmania qui font de plus en plus de ravages autour du monde. Aujourd’hui plus d’un milliard de personnes vivent dans des zones endémiques et peuvent donc contracter le parasite et développer la maladie. Les manifestations cliniques des leishmanioses cutanées chez l’homme peuvent varier de nodules, pustules, ulcères, jusqu’à atteindre des défigurations au niveau du visage et parties externes du corps. La nature de la réponse immunitaire dans la physiopathologie des leishmanioses cutanées joue un grand rôle dans la résolution ou la persistance de la maladie. La reconnaissance du pathogène par le système immunitaire se fait grâce à des recepteurs présents sur les cellules immunitaires. L’objectif principal de notre projet est d’étudier l’interaction du parasite avec un récepteur immunitaire pour comprendre le rôle que joue ce dernier dans cette pathologie et suivre la réponse immunitaire qui peut en résulter.

Bénéfices attendus

Les leishmanioses cutanées peuvent être contractées par l’homme de tout âge, comme par l’animale. Plusieurs tentatives ont été faites pour développer des traitements efficaces mais à ce jour il n’existe pas de traitement effectif pour cette pathologie. Il devient donc de plus en plus urgent de se pencher sur cette pathologie car cette dernière risquerait de se propager rapidement dans les prochaines années. Cela serait dû à plusieurs facteurs dont le réchauffement climatique. L’objectif à long terme est de développer une thérapie efficace en ciblant des récepteurs présents sur des cellules immunitaires afin de réduire et limiter ainsi l’invasion parasitaire.

Procédures

-1 Injection dans l'oreille pendant 15 secondes -Suivi hebdomadaire de l'évolution des lésions pendant 15 mois

Impact sur les animaux

Suite à l’injection de parasites, les souris peuvent présenter une douleur modérée, une inflammation localisée au site de l’injection. Par la suite, des ulcérations peuvent se développer à partir de la semaine 2-3 et peuvent durer jusqu’à 12 semaines. La manipulation de souris pour le suivie s’effectuera à partir du moment de l’injection jusqu’à la semaine 20 post injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocol expérimental afin de réaliser diverses prélèvements (tissus, sang, organes...)

Remplacement

Ce projet s’intéresse à la compréhension du rôle du récepteur CD32a dans la réponse inflammatoire dans le cas des leishmanioses cutanées. La pathologie étant cutanée, le développement de lésion est le symptôme dominant observé dans cette pathologie. Ainsi, les mécanismes physiologiques et immunologiques complexes aboutissant à cette inflammation ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un contexte d’organisme entier, dans des modèles in vivo.

Réduction

Un total de 96 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet permettant de réaliser 3 études de 6 groupes (groupes contrôles et groupes infectés) avec 6 animaux par groupe (pour les groupes infectés) et 4animaus (pour les groupes contrôles) sur une durée de 2 ans. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable de 5. La nourriture, et l’eau de boisson seront fournies. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être ainsi que de l'enrichissement (batonnet de bois, coton, maison en cellulose). Au moment de leur entrée, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation (une semaine) et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h – 12h), d’une température (20 - 24°C). Les souris seront surveillées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie gazeuse général et avec un analgésique. Les injections sous la peau seront réalisées avec grand soin pour éviter d’atteindre le muscle. On a mis en place une fiche de scoring comme point limite fafin de prendre en charge l’animal au cas où il y a atteinte à son bien-être et pour éviter la souffrance animal.

Choix des espèces

Deux modèles murins sont choisis pour étudier le rôle du récepteur, des souris sauvages qui n’expriment pas le récepteur et une lignée transgénique de souris exprimant ce récepteur. La souris adulte, agée entre 6 et 8 semaines, est le modèle le plus utilisé dans l'étude de la leishmaniose cutanée puisque c'est un mammifère et qu'il est aussi bien connu. En plus de cela, le comportement de la souris est bien étudié ce qui nous permet de lui administrer les soins nécessaires pour limiter et réduire sa douleur.

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale pour injection de virus et implantation d'une fibre optique, un isolement d'une semaine pour la calorimétrie, une restriction hydrique pour les tests d'apprentissage et une aversion olfactive provoquant un inconfort gastrique. Le porteur étudie le rôle de neurones de l'hypothalamus dans la prise alimentaire et l'olfaction, en lien avec l'obésité. Il affirme que ces paramètres comportementaux ne peuvent être obtenus ni in vitro ni chez les invertébrés, dépourvus des structures cérébrales équivalentes.

Objectifs

Le métabolisme et le comportement alimentaire sont en majeur partie régulé par le cerveau. L'expression des certains facteurs au niveau cérébral pourrait en particulier avoir des effets sur le dialogue entre olfaction et métabolisme . Ces mécanismes étant encore très mal connus, le but de cette étude est de les disséquer afin de comprendre leur impact des conditions physiologiques et physiopathologiques (obésité). L’inactivation ou la surexpression ciblée de facteurs de transcription dans des régions précises du cerveau de souris sera mise en place pour mieux comprendre leur rôle. La balance énergétique des animaux (calorimétrie indirecte) ainsi que différents comportements (tests olfactifs) seront alors analysés. L’activité des neurones sera également enregistrée à l’aide d’une méthode optique (photométrie fibrée). Cette étude ne peut être remplacée par d’autre moyen, comme la culture cellulaire, car nous regardons le métabolisme et le comportement de l'animal. Ce projet utilisera le minimum de souris nécessaire (4 études comportant des groupes de 12 à 16 souris (contrôles et traitées); soit 396 souris sur les 4 ans de projet) et respectera le bien-être animal. Lors de ces études la règle des trois R sera respectée, le nombre d’animaux sera réduit au minimum et nous raffinerons les procédures pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Nous effectuerons l'administration d'analgésique lors des procédures. Les cages individuelles sont agrémentées d’un nid végétal et quelques croquettes sont mises à même le sol pour éviter les douleurs de tension au niveau de la suture après les opérations.

Bénéfices attendus

En combinant des études comportementales et métaboliques après l’inactivation ou la surexpression ciblée d'une protéine dans des régions précises du cerveau de souris, nous comprendrons mieux les liens entre les régulations neuronales hypothalamiques et la métabolisme en lien avec l'obésité. Nous considérons que cette étude apportera également une information importante concernant la composante olfactive de la prise alimentaire et de la balance énergétique chez la souris dans les différentes conditions décrites. Ce sont des paramètres très sensibles où le bien-être animal est absolument crucial, autant pour l’animal que pour la validité des résultats obtenus.

Procédures

Nous utiliserons différentes procédures de chirurgie pour l’injection de virus et l’implantation chronique de fibre optique pour des études chez les souris éveillées (chirurgie entre 40 min et 1h), Analyse de calorimétrie indirecte (les animaux sont isolés pour environ 7 jours), Analyse métabolisme du glucose (prélèvements de sang sur environ 2h d’expérience), Tests olfactifs (30 min d'habituation à la cage puis 30 min de test le jour suivant), aversion olfactive conditionnée (injection d’une solution induisant un inconfort gastrique de 1 heure environ, test le jour suivant), test d'apprentissage (environ 1 séances de 20 min par jour pendant 8-10 jours, la prise hydrique des animaux est diminuée dans la cage d'hébergement, les animaux boivent dans la cage de test).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pourront se produire lors de la chirurgie cérébrale, lors de la mise en restriction alimentaire ou hydrique, lors de l'isolement des souris. La chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer douleur et problème de récupération. Pour toutes ces raisons, nous avons prévu des injections d'anti-inflammatoire et une récupération post-chirurgicale sous surveillance pour détecter toute perte de poids ou d'autres problèmes de santé ou de bien-être. Pour les tests métaboliques, des problèmes de volume sanguin prélevé peuvent survenir mais nous avons prévu les prélévements en calculant au plus près les volumes nécessaires aux mesures de l'insuline donc les volumes sont minimes (détaillées dans les procédures expérimentales). Lors de la restriction alimentaire les souris sont surveillées, si un mal être est observé chez un individu il est immédiatement remis ad libitum. Pour la procédure de régime hypercalorique, nous n'avons pas de nuisance attendue. Nous n'avons jamais observé de problèmes de souris ne voulant pas se nourrir avec une nourriture hyperlipidique. De plus, le surpoids induit chez les souris sous régime hyperlipidique n'entrave pas leur locomotion.

Devenir

Mise à mort pour tous les animaux afin de prélever le cerveau pour vérifications des points d'injections et analyses.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles).

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 3 mois) afin que les réseaux neuronaux soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale accrue.

1 010 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras pendant quinze semaines, des injections quotidiennes, des tests métaboliques dont un test à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie sévère, et des séances de nage forcée deux fois par jour, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur étudie le remodelage cardiaque lié à l'obésité et au vieillissement et attend une amélioration des fonctions cardiaques par un composé testé. Il présente l'analyse de la fonction cardiaque, décrite comme celle d'un "organe entier", comme impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Dans un premier temps, il s’agit d’effectuer une analyse in vivo et histologique de modèles murins pour les tissus d’intérêt comme le cœur, le rein, le foie et le tissu adipeux dont le but est de : 1) comparer la reproductibilité des données en utilisant un protocole unique et standardisé sur les modéles murins de diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses, 2) mettre en place une bio-banque d’échantillons de sang et de tissus pour réaliser des analyses multi-translationnelles, 3) étudier le rôle des macrophages résidents du coeur dans un contexte d’obésité. Le deuxième objectif du projet est de définir des nouvelles stratégies thérapeutiques prévenant le développement de cardiomyopathie dont la formation est liée aux altérations induites par des troubles métaboliques (l’obésité et le diabète) et le vieillissement accéléré du cœur dans ce contexte d’obésité (inflammation, dommages faits à l’ADN, dysfonction mitochondriale). Etape 1) Evaluer l’effet de molécules à fin thérapeutique modulant spécifiquement l’action de molécules impliquées dans le métabolisme sur la fonction cardiaque. Etape 2) Valider et optimiser la molécule cible sur les troubles métabolliques. Etape 3) Définir les mécanismes d’action spécifiques de la molécule thérapeutique sur l’amélioration de la fonction cardiaque et sur la résolution de l’inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester la reproductibilité des données en comparant dans différents laboratoires en Europe l’impact d’un régime riche en graisses chez des souris mâles et femelles de type C57BL/6 sur la structure et la fonction cardiaque ainsi que l’évaluation métabolique et l’impact sur d’autres organes comme le foie, le rein ou le tissu adipeux. L’identification du rôle des macrophages dans le vieillissement cardiaque permettra d’identifier de nouvelles voies pathophysiologiques et donc d’envisager de nouvelles thérapies. Enfin, nous attendons une action géroprotrectrice et plus généralement une protection renforcée des tissus avec une haute tolérance du produit chez les animaux traités. De plus, de façon plus spécifique, nous attendons une amélioration des fonctions cardiaques avec une action anti-fibrotique ainsi qu’une amélioration des dommages faits à l’ADN. Ces données pourraient permettre de repositionner certaines molécules dans le traitement des cardiomyopathies métaboliques, pourvoyeuses d’insuffisance cardiaque en pathologie humaine.

Procédures

Echocardiographie : Geste non-invasif permettant d’évaluer les fonctions cardiaques, réalisé sur animaux vigiles préalablement épilés, sur tous les animaux. Il s’agit de maintenir les animaux sur le dos pour une durée de 3-4 minutes, le temps d’appliquer la sonde d’échographie et de procéder à l’enregistrement de l’échocardiogramme. Grip test : Test de préhension soutenue non-invasif qui permet d’évaluer la force musculaire. Il sera réalisé sur animaux vigiles pour l’ensemble des animaux. Il s’agit de laisser les animaux s’agrippés par leurs pattes avant en utilisant les barres reliées à un capteur permettant d’enregistrer le temps de résistance musculaire à une force et de quantifier la force maximale du rongeur (en secondes). Glycémie : Mesure du taux de glucose sanguin de tous les animaux. Sur animaux vigiles, on prélève une goûte de sang à la queue que l’on récupère afin de procéder à la lecture de la glycémie. Injections : Sur animaux vigiles, on effectue en quelques secondes une injection quotidienne en i.p. ou en sous-cutané (selon l’efficacité de distribution du produit) en utilisant des aiguilles fines afin de limiter la souffrance chez l’animal. Exercice physique : Séances biquotidiennes de natation en cuve d’eau chauffée à 33°C ± 2°C espacées de 6h et augmentant progressivement de 5 à 40 min pendant une période de 6 semaines. Après la natation, les animaux sont essuyés et laisser sous lampe chauffante le temps du séchage. Régime riche en graisse : Alimentation des souris avec un régime enrichie en graisse apportant 60% de l’apport énergétique sous forme de lipides pendant 15 semaines. Insuline-tolérance test (ITT) et glucose-tolérance test (GTT) : Tests métabolliques permettant d’évaluer la résistance à l’insuline et la tolérance au glucose. Sur animaux vigiles mient à jeun pendant 6h, injection en i.p. (vol max 200µl, calculé en fonction du poids de l’animal) soit d’insuline (ITT), soit de glucose (GTT) et de suivre la glycémie à T=0, T=15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min. La moitié des animaux seront soumis à un test GTT et l’autre moitié au test ITT en début et fin de régime. Gavage : Technique non utilisée sur les animaux âgés (8 et 24 mois) et uniquement dans le contexte d’un produit ne pouvant être administré en eau de boisson. Sur animaux vigiles, on effectue un gavage quotidien ( maximum 30 sec) pendant 30 jours à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une sonde de gavage adaptée sans induire de souffrance ou détresse chez les souris.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu lors de la réalisation de l’échocardiographie ou du test de tolérance au glucose. Lors de la réalisation du test métabolique de tolérance à l’insuline, l’injection d’insuline peut entraîner une hypoglycémie sévère qui pourra être détectée par mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre et qui sera immédiatement prise en charge par l’administration d’une dose de glucose. L’animal sera alors sous haute surveillance jusuqu’au rétablissement d’une glycémie normale, c’est-à-dire à partir de 80 mg/dL. La pratique de l’exercice physique peut entraîner une perte de poids et une fatigue chez l’animal qui est directement lié à la pratique régulière d’une activité physique. À la suite de ces observations, les temps de pratique de l’exercice physique seront ré-évalués chez les animaux concernés. Le régime enrichi en graisse entraîne une prise de poids et peut conduire à des troubles métabloliques. La surveillance hebdomadaire de la prise de poids puis un contrôle de la glycosurie en cas de prise de poids trop importante assurera le suivi nécessaire à cet effet. Les injections quotidiennes peuvent entraîner l’apparition d’un hématome. Pour éviter cela, les injections seront pratiquées en changeant de côté régulièrement pour laisser du temps à la résorption d’un éventuel hématome. L’administration orale du produit se fera autant que possible dans l’eau de boisson. Nous limiterons l’utilisation de la méthode de gavage pouvant entraîner un stress chez les animaux, surtout âgés et afin de limiter les désagréments chez l’animal et le dépôt de la substance dans le poumon ou la rupture de l'estomac ou de l'œsophage.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisses est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. Par ailleurs, l’évaluation de l’action combinée de l’obésité et de l’âge sur les mécanismes conduisant au développement d’événements cardiovasculaires nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Pour cela, nous utilisons le modèle expérimental de la souris. Nous remplaçons les cellules primaires par des lignées cellulaires dans nos tests "in vitro" : soit en utilisant les lignées cellulaires H9C2 de cardiomyocytes, les lignées 3T3L1 d'adipocytes pour les co-cultures, soit des lignées cellulaires de macrophages murins (raw264) comme cible de l’action sénolytique des molécules thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à notre étude a été calculé pour nous assurer de l’obtention de résultats concluants afin de répondre aux questions posées en tenant compte des expériences antérieures du laboratoire sur le stress métabolique induit par le régime riche en graisse ayant été étudié préalablement sur ce fond génétique: il faut entre 10 à 15 animaux par lot pour obtenir une réponse statistique fiable des expériences puisque nous n'obtenons pas de réponse équivalente chez tous les animaux en expérimentation. De même, le nombre de souris a été optimisé pour chacune de nos procédures expérimentales tout en assurant une reproductibilité et une robustesse dans nos expérimentations, mettant à profit nos connaissances sur les tranches d’âge auxquelles nous devons réaliser nos expérimentations afin d’être le plus pertinent possible dans l’établissement de nos procédures. Enfin, afin d’utiliser au mieux les animaux, nous regarderons simultanément différents tissus d’intérêt dans un même animal (réduction importante du nombre d’animaux prévus)..

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime riche en graisse (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.

Choix des espèces

La cardiomyopathie est bien caractérisée chez les mammifères avec des méthodes d’analyse facilement accessibles et reproductibles. Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisses est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. Par ailleurs, l’évaluation de l’action combinée de l’obésité et de l’âge sur les mécanismes conduisant au développement d’événements cardiovasculaires nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Le modèle expérimental choisi est donc la souris. Ce modèle murin présente l’avantage de développer un vieillissement relativement rapide et d’offrir des conditions très reproductibles de développement d’une cardiomyopathie métabolique. Enfin, la souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme sur les paramètres liés au métabolisme du glucose et la surcharge pondérale. L’étude se fera sur des souris à un stade de jeune adulte (5 mois) et à deux stades âgés (12, 18 mois) et à un stade très âgé (24 mois). Pour l’étude portant sur le vieillissement cardiaque, nous utiliserons des animaux mâles âgés de 12, 18 et 24 mois. Pour l’étude de l’obésité conjugué au viellissement, nous utiliserons des souris jeunes adultes de 5 mois dont le fonctionnement du système cardiovasculaire commence à subir les effets du vieillissement et de 12 mois d’âge dont leur système cardiovasculaire est altéré spontanément par le vieillissement.