Recherche fondamentale
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Rôle de CD44 et de l’ostéopontine au cours des complications hépatiques liées à l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras, elles reçoivent des injections répétées induisant fibrose puis cancer du foie, avec des prélèvements sanguins, pour évaluer le rôle de deux protéines dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur résume les retombées en une phrase, la validation des "effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs". Il affirme qu'"il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé" et conserve les organes pour tirer un maximum de données de chaque souris.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs ont été déjà identifiés (diabète, inflammation, modification du microbiote intestinal). Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à 2 acteurs clefs impliqués dans le développement de ces maladies. Ces acteurs peuvent agir de pair favorisant le développement de ces maladies chroniques du foie. Pour une meilleure compréhension de leurs rôles, nous évaluerons sur des animaux, l’impact potentiellement bénéfique de leur absence sur le développement et la progression de ces maladies du foie.
Bénéfices attendus
Ces études précliniques valideront les effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs dans les maladies chroniques du foie .
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la cicatrisation hépatique. Pour la procédure 2 : les souris recevront une injection 2 fois par semaine pendant 6 semaines à partir de 7-8 semaines d’âge. Pour la procédure 3 : une unique injection sera réalisée sur les souris mâles âgés de 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont les contentions, les prises de poids régulières ainsi que les injections en fonction des procédures. Les effets indésirables attendus pourraient être principalement une faible inflammation locale au site d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, certains aspects du projet seront réalisés sur des cellules. Cependant, il est nécessaire de réaliser des études précliniques car les études sur cellules ne permettent pas de reproduire la maladie humaine. Ainsi, il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé pour ces études.
Réduction
Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes et exploitables. Les expériences seront reproduites pour confirmer la significativité statistique. Les organes obtenus à partir des souris seront conservés et stockés pour des analyses ultérieures afin d'enregistrer autant de paramètres que possible à partir d'une seule souris.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières (grille d’observation) nous permettront d'identifier précocément tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée et pertinente pour étudier ces maladies. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La maladie développée par la souris récapitule les symptômes et les caractéristiques de la maladie chez homme. Pour la procédure 1, la mise sous régime riche en graisse débutera lorsque les souris auront 8-10 semaines d’âge. En effet, un tel régime induit une prise de poids importante et peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Cette procédure permet d’analyser la progression des maladies chroniques du foie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline. Pour la procédure 2, le traitement chimique induisant la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge. Cette procedure permettra d’étudier les mécanismes moléculaires associés à la fibrose hépatique. Pour la procédure 3, l’injection du réactif induisant le cancer hépatique sera effectuée à environ 2 semaines d’âge (âge approprié pour cette procédure) et la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge (animaux relativement jeunes). Cette procédure permettra d’étudier les stades le plus avancés de la maladie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline.
Mise au point chez la souris des conditions d’utilisation d’une molécule d’intérêt thérapeutique potentiel dans les maladies du neurodéveloppement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
646 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une molécule par voie intraveineuse sous anesthésie ou par voie orale, certaines subissant cinq anesthésies en vingt-quatre heures pour de l'imagerie, l'étude portant aussi sur des femelles gestantes ou allaitantes, leurs embryons et leurs souriceaux. Le porteur décrit une molécule "très peu toxique" utilisée comme complément alimentaire et vise à préciser ses doses avant une éventuelle application à l'homme. Il affirme que l'analyse de la distribution d'une molécule doit "nécessairement" être réalisée in vivo, et les tue pour la doser dans leurs organes.
Objectifs
Chaque jour, le cerveau humain utilise 20% de l’énergie apportée par l'alimentation. Ce besoin énergétique est encore plus important chez l’enfant, ce qui rend le cerveau particulièrement sensible aux perturbations énergétiques survenant pendant le développement embryonnaire et l’enfance, et qui peuvent causer des pathologies du neurodéveloppement telles qu’épilepsie ou retard mental, dont la prévalence est estimée à une naissance sur 100 dans les pays industrialisés. L’objectif de ce projet est d’étudier une molécule d'intérêt thérapeutique qui promeut la production d’énergie cérébrale. C’est une molécule très peu toxique, utilisée comme complément alimentaire, et qui a montré son intérêt chez la souris dans des modèles de troubles neuropsychiatriques (dépression). Nous avons observé son efficacité dans des modèles de pathologie du développement neuronal, quand elle est donnée à des femelles gestantes ou allaitantes. Cependant, nous ne savons pas encore si la molécule agit directement sur l'embryon/le souriceau, ou a un effet bénéfique chez la mère qui bénéficie indirectement à l'embryon. D’autre part, nous ne savons pas quand la molécule doit être administrée pour agir au mieux. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire de conduire une étude dite de pharmacocinétique qui permettra de connaitre la vitesse d’absorption, de transformation et d’élimination de cette molécule, ainsi que sa distribution dans les différents tissus et notamment le passage chez l’embryon ou dans le lait. A notre connaissance ces données ne figurent pas dans la littérature
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de la molécule d'intérêt et d’affiner ses conditions d’utilisation dans des études de neurodéveloppement. Cela permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique potentiel de cette molécule pour des maladies du neurodéveloppement, ainsi que de déterminer avec plus de précision les doses et voies d’administration. Ces données renseigneront les futures études sur cette molécule avant une éventuelle proposition d’application à l’homme.
Procédures
Administration de la molécule d'intérêt, sous anesthésie par voie intraveineuse (1 seule fois), ou sur animaux vigiles (sans anesthésie) par voie orale (1 seule fois). Une partie des animaux subira des anesthésies répétées (5 anesthésies sur 24 heures) pour de l’imagerie. Les animaux seront placés en hébergement individuel après administration de la molécule d’intérêt, pour un maximum de 24 heures. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure, selon une cinétique après l'administration de la molécule d'intérêt et au plus tard 24 heures après le début de la procédure.
Impact sur les animaux
Les animaux ne suburont pas d'effet secondaire lié à l'injection de la molécule. Un risque de réaction allergique ou de fausse route est en théorie possible suite à l'injection bien que jamais constaté en pratique. L'anesthésie répétée chez certains animaux peut engendrer un stress lié aux manipulations répétées et un changement du comportement (prostration, perte d'appétit). L'isolement de moins de 24 heures, nécessaire chez certains animaux, peut entraîner un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'organe permettant le dosage de la molécule d'intérêt
Remplacement
La preuve de l’efficacité de la molécule d'intérêt a été obtenue dans un premier temps in vitro. L’analyse de la distribution d’une molécule implique tout l’organisme (absorption intestinale, distribution sanguine, captage par les différents organes) et doit nécessairement être réalisée in vivo. Dans la mesure du possible les paramètres de l'expérience sont basés sur l’analyse de la littérature et notamment de la cinétique d’élimination de molécules similaires.
Réduction
L’étude sera conduite sur des groupes d’animaux réduits au minimum de façon à obtenir une information biologique pertinente. Des mesures de la répartition de la molécule dans les différents organes seront réalisées sur des lots de trois animaux, qui est le minimum permettant de faire une analyse statistique. En parallèle, un suivi longitudinal qui n’entraînera pas d’analyse statistique, sera réalisé sur deux animaux par condition pour confirmer que les résultats sont reproductibles.
Raffinement
Les animaux auront un temps d’acclimatation de 7 jours avant l’étude pour limiter le stress lié au nouvel environnement. Pour chaque groupe d'animaux, deux semaines sépareront les groupes expérimentaux, permettant d’analyser rapidement les résultats et d’adapter les paramètres de l’expérience d'un groupe à l'autre. Des points limite, adaptés et prédictifs, ont été définis pour limiter les souffrances que pourraient subir les animaux.
Choix des espèces
Notre étude précédente démontrant l’efficacité de la molécule d'intérêt sur des modèles de troubles autistiques a été réalisée chez la souris. Conduire l’étude de la biodistribution de la molécule d'intérêt chez la souris permettra d’éclairer les mécanismes qui ont abouti à ce résultat positif lors de la première étude, et de guider des études ultérieures en raffinant les doses employées ou le moment auquel le traitement doit être administré. Procédure 1 : animaux adultes. Dans cette procédure l’objectif est d’obtenir des paramètres de base avant d'étudier l'effet de la molécule d'intérêt chez des femelles reproductrices (procédure 2). Procédure 2 : animaux adultes (femelles gestantes et allaitantes) et embryons de 15j (E15)/souriceaux de 5 jours (P5). Ces stades correspondent à des étapes clés du développement cortical.
Control de la fonction synaptique par les microglies
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Soixante reçoivent des électrodes crâniennes posées par chirurgie, puis sont isolées et câblées pour enregistrer leur sommeil, dont une privation de six heures, tandis que quarante subissent des tests de mémoire par reconnaissance d'objets après privation de sommeil. Le porteur reconnaît que la chirurgie entraîne des effets dommageables et isole les souris câblées en cage individuelle. Il décrit le sommeil de la souris comme un modèle "irremplaçable" et les tue pour valider l'inactivation génétique dans le cerveau.
Objectifs
Le contrôle de la neurotransmission permet d’adapter les réponses des neurones aux modifications de l’environnement. Ces dernières années, nous avons montré que les microglies, qui sont les macrophages du cerveau, sont fortement impliquées dans le contrôle de la fonction des neurones. Ce résultat est également potentiellement important dans des situations non physiologiques puisque les microglies sont activées dans la quasi totalité des maladies du cerveau. Nous voulons maintenant montrer que les microglies contrôlent certaines fonctions cérébrales et identifer les mécanismes mis en jeu. Il y a en effet pour l’instant peu de données qui analysent l’implication des microglies dans les fonctions dites supérieures du cerveau. Des études préliminaires nous ont permis de montrer que dans le cortex, les microglies sont nécessaires à la régulation de neurones du cerveau qui sont clés dans la régulation du sommeil. Le présent projet s’appuie sur ces observations et cherche à comprendre l’implication des interactions microglie-neurones dans la régulation du sommeil et des fonctions qui dépendent du sommeil comme la mémoire. Ce projet sera réalisé chez la souris car elle permet: 1) de mettre en place des outils de génétique pour d'identifier les molécules impliquées dans l'action des microglies (souris génétiquement modifiées) et 2) de subdiviser le sommeil en sommeil lent et sommeil paradoxal, les deux stades de sommeil qui sont également présents chez l'homme. Ainsi, nous utilserons 2 modèles de souris génétiquement modfiées chez lequelles nous analyserons: 1) la structure du sommeil après implantation d'électrodes pour enregistrer les états de vigilance et 2) la mémoire grâce à des tests comportementaux qui reposent sur la reconnaissance d'objet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre de nouveaux rôles de la microglie dans le fonctionnement cérébral et dans le contrôle du sommeil. Ces cellules étant activées dans toutes les pathologies du cerveau, on peut espérer que cette étude permettra une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques cellulaires de ces maladies.
Procédures
La procédure sommeil durera 6 semaines. Nous réaliserons une procédure chirurgicale pour implanter des électrodes qui nous permettront de réaliser les enregistrements de sommeil chez la souris. Cette implantation se fera par une courte chirurgie (
Impact sur les animaux
La procédure d'implantation d'électrode et d'enregistrement du sommeil, entraine sans aucun doute des effets dommageables car ils nécessitent de réaliser une chirurgie d'environ minutes. Pour réaliser les enregistrement de sommeil, les souris sont isolées dans des cages individuelles (les souris sont cablées ce qui oblige à les isoler). La procédure de privation de sommeil qui est induite par ajout de nouveaux objets dans la cage de vie de la souris occasionne une gêne de courte durée et qui n'est réalisée qu'une seule fois.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude car nous analyserons ensuite leur cerveau pour valider l'inactivation génétique.
Remplacement
Le sommeil est une activité complexe et integrée. Il ne peut s'étudier que sur des animaux entiers. Par ailleurs, le sommeil des souris se subdivise en sommeil lent et sommeil paradoxal (comme chez l'homme) contrairement à d'autres modèles animaux de laboratoire ce qui en fait un modèle à l'heure actuelle irremplaçable. De plus, nous souhaitons étudier l'importance de certaines molécules produites par les microglies et pour cela nous utiliserons des outils génétiques disponibles chez la souris. Nous serons néanmoins vigilants quant au développement de méthodes alternatives pendant la durée de ce projet.
Réduction
Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, le design des expériences comportementales et des expériences de physiologie a été calculé au plus juste, en tenant compte de la puissance des analyses statistiques et de nos expériences précédentes. Ce projet impliquera 100 souris.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en conditions standard, entre 2-4 souris du même sexe par cage sur des portoirs ouverts. La température et les cycles jour-nuit sont contrôlés. Un enrichissement cellulosique, renouvelé à chaque change (1/semaine), permet la confection d’un nid végétal. Le raffinement des méthodes expérimentales visant à réduire à son maximum la souffrance animale est mise en oeuvre grâce à l’utilisation d’anesthésiques et d'antalgiques appropriés lors de chirurgies, à la mise en place de soins post-opératoires et de points limites clairement établis. Pour la chirurgie, les animaux reçoivent 1) un analgésique sédatif et myorelaxant et 2) un anesthésique général injectés par voie intrapéritonéale et la douleur traitée par 1) un anesthésique local au niveau de la zone d'incision et 2) l'injection d’un analgésique avant et 24 heures après la chirurgie. Une période de récupération post-chirurgicale de 10 jours est respectée permettant de déceler d’éventuelles complications (
Choix des espèces
Travailler sur la souris permet de travailler dans la continuité de nos études précédentes. Cela permet également de bénéficier des nombreux outils pharmacologiques et génétiques déjà élaborés, diminuant par là le recours à des animaux pour mettre au point les techniques. Par ailleurs, nous cherchons à identifier de nouveaux mécanismes de régulation du sommeil et les souris nous permettent de réaliser ce projet car elle possèdent des cycles de sommeil qui comprennent le sommeil lent et le sommeil paradoxal. Les états de vigilance sont analysés sur des jeunes adultes de 2 à 5 mois. A cet age, la régulation des états de vigilance et des comportements est stable (pas d'interférence liée au développmeent ou à la vieillesse). Les expériences de comportement se feront sur des jeunes adultes de 2 à 5 mois, comme dans les articles de références utilisant le mêmes tests pour évaluer la mémoire des souris.
Les troubles anxio-dépressifs liés à une douleur chronique induite par constriction du nerf sciatique : Evaluation comportementale et traitement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
180 souris, mâles et femelles, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une ligature du nerf sciatique leur inflige une douleur neuropathique chronique, suivie de dix-sept évaluations de la douleur et de six tests comportementaux sur sept à neuf semaines, pour comparer selon le sexe les troubles anxio-dépressifs liés à la douleur. Le porteur indique que le développement de ces troubles est attendu et "ne peut être évité car c'est l'objet de l'étude". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation comportementale de l'animal vigile.
Objectifs
La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur. En effet, environ 50% des patients présentent cette co-morbidité. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de cette co-morbidité restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données d’imagerie neuroanatomique et fonctionnelle chez l’homme, ainsi que des résultats obtenus par des approches lésionnelle et d’imagerie, chez la souris montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des régions céréblales. De plus, de nombreuses données de la littérature ont démontré d’importantes différences dans la sensibilité à la douleur entre les hommes et les femmes ; données également observées chez les rongeurs. La prévalence des troubles anxieux et dépressifs, dans la population générale ainsi que chez les patients douloureux chronique, présente également des différences intersexuelles. De telles différences suggèrent très probablement des mécanismes spécifiques à chaque sexe. Ainsi, bien que les régions cérébrales impliquées dans les troubles de l’humeur provoqués par la douleur chronique soient sans doute les mêmes, les altérations des réseaux que ces structures forment sont sans doute différentes chez des individus mâles et femelles. Le but de ce projet est donc de comparer les changements comportementaux éventuels entre mâles et femelles dans un modèle de constriction du nerf sciatique par ligatures chez la souris.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de comparer chez la souris mâle et femelle les comportements de troubles anxio-dépressifs liés à la douleur chronique. Cette comparaison sera aussi menée vis-à-vis des effets des traitements contre la douleur et contre l’état anxio-dépréssif selon le sexe. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de définir le développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes dans un modèle de ligature du nerf sciatique. Cette avancée pourrait permettre d’affiner les interventions thérapeutiques selon le sexe.
Procédures
L'ensemble des animaux subiront une chirurgie (durée 10 min maximum) sous anesthésie. A la suite de quoi les animaux auront une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Pour les animaux de l’expérience 1, nous évaluerons à 17 reprises de la douleur neuropathique (durée du test est de 30min avec 5min d’habituation avant) et 6 tests sur comportement (durée de 5 à 25 min chacun selon le test) une période de 9 semaines de alors que ceux des expériences 2 et 3 seront soumis à 13 évaluations de la douleur neuropathique (durée du test est de 30min avec 5min d’habituation avant) et 6 tests de comportement (durée de 5 à 25 min chacun selon le test) sur une période de 7 semaines.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. De plus comme dans toute chirurgie, il peut apparaitre des signes de douleur, d’inflammation, d’infection ou une perte de poids. Le développement de troubles anxio-dépressifs est attendu et ne peut être évité car c'est l'objet de l'étude.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse du développement des troubles anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 souris mâles et 10 souris femelles. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental. Des analyses statistiques finales seront réalisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé et le poids corporel des animaux sera mesuré au minimum lors de chaque expérimentation (test de comportement ou traitement). Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines).
Rôle des cellules natural killer au cours des complications hépatiques associées à l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Nourries d'un régime gras, elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, mises à jeun et prélèvements sanguins répétés, pour étudier le rôle des cellules NK dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer gêne, rougeur, infection ou nécrose au point d'injection, et que peuvent survenir obésité, hyperglycémie ou diabète. Il conclut qu'"aucune autre espèce ne peut être utilisée" et que les études in vitro ne reproduisent pas les interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires et ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Notre objectif est de comprendre comment une famille de cellules immunitaires participent au développement des maladies du foie associées à l’obésité. Afin de répondre à notre problématique, nous utiliserons des animaux qui n’expriment pas une molécule indispensable pour le développement de ces cellules. Nous espérons ainsi démontrer le rôle exact de ces cellules immunitaires dans ces maladies afin de proposer de nouvelles thérapies les ciblant. Ces études seront réalisées dans le souci d'utiliser un nombre raisonnable d'animaux sans compromettre les objectifs du projet et tenant compte des exigences de remplacement, réduction et raffinement. Le nombre total d'animaux utilisé dans ce projet sera de 540. Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Leur bien-être sera scrupuleusement pris en compte en termes de conditions d’élevage, d’hébergement et de soins (environnement enrichi, suivis réguliers par les expérimentateurs) afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’une part de valider in vivo le rôle exact des cellules tueuses naturelles (NK) dans le contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et d’autre part de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. Nous espérons pouvoir proposer de cibler les fonctions des cellules NK comme nouvelle stratégie thérapeutique pour ces maladies qui actuellement ne disposent pas de traitements pharmacologiques.
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront soumis à un prélèvement sanguin en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine pendant 6 semaines.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal, la contention, les mises à jeun de 4h et 6h, les injections intrapéritonéales et les gavages par voie orale, les prélèvements sanguins à la base de la queue, la survenue d'une obésité, d'une hyperglycémie ou d'un diabète. Les injections pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...). Des animaux agressifs pourront été également être isolés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin d'analyser la réponse immunitaire au sein des organes d'intérêt.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires (effets des lipides et des dérivés bactériens comme le lipopolysaccharide sur la physiologie des cellules). Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris sauvages contrôles et 50% de souris pour lesquelles Eomes est invalidé dans les cellules NK ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expériences.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés à chaque nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa fécondité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée Nous utiliserons des souris à partir de la 7ème semaine d'âge c'est à dire à l'âge adulte avec un poids stabilisé.
Etude du métabolisme cardiaque dans le cadre des phénomènes de cardiotoxicité induite par les chimiothérapies.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Une souris qui perd plus de 20 % de son poids, ou atteint un score de 3 sur la grille clinique, est mise à mort avant la fin du protocole. 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue juste après une prise de sang dans le cœur sous anesthésie. Selon les combinaisons testées, elles reçoivent, éveillées, de la doxorubicine trois fois dans la veine, jusqu'à 20 injections de malonate dans l'abdomen en quatre semaines ou des inhibiteurs de BRAF et MEK par gavage, et passent jusqu'à quatre échocardiographies sous anesthésie. Le porteur écrit que "L'objectif même du projet est de travailler sur la toxicité des chimiothérapies" sur le cœur, et attend douleur, perte de poids, inactivité et stress. Les combinaisons étudiées "pourraient fortement modifier" les traitements en cancérologie selon lui, et la protection du cœur qu'il espère montrer reste au conditionnel.
Objectifs
Un grand nombre de traitements utilisés en oncologie sont cardiotoxiques et peuvent aboutir à l’émergence de maladies cardiovasculaires (MCV). Celles-ci peuvent contraindre le corps médical à diminuer voire arrêter le traitement de patients et sont à l’origine de nombreux décès à court et moyen termes. L’amélioration remarquable de la prise en charge thérapeutique de certains cancers a permis une augmentation significative des chances de survie de ces patients. Cela a conduit, pour certains cancers, à ce que les décès liés à la maladie soient dépassés par les décès causés par la cardiotoxicité des traitements. Pour ce projet, nous nous intéresserons à différentes chimiothérapies particulièrement cardiotoxiques utilisées dans de nombreux cancers (leucémies aigues myéloïdes (LAM), pancréas, sein et mélanome). Depuis quelques années, de nombreuses combinaisons thérapeutiques à base de chimiothérapies et d’inhibiteurs métaboliques ont passés le cap des essais cliniques, en particulier dans le cadre des LAM. Ces combinaisons prometteuses semblent permettre une sensibilisation des cellules cancéreuses aux traitements antitumoraux. En parallèle, la recherche sur l’insuffisance cardiaque et les MCV à aussi progressé dans la caractérisation des dépendances métaboliques liés à ces pathologies. Dernièrement, des approches d’inhibition de certaines enzymes du métabolisme ont permis d’obtenir une amélioration des capacités cardiaques dans plusieurs modèles de pathologies aigues ou chroniques. Ce projet a aussi pour objectif de dresser une carte métabolique de la réponse du tissu cardiaque aux traitements antitumoraux afin d’en détailler les dépendances précises. L’objectif final de ce projet est de déceler les dépendances métaboliques communes des cellules cancéreuses et cardiaques afin de sensibiliser les premières au traitement et de protéger les secondes. Pour cela, il est important de comprendre et d’identifier les mécanismes mis en jeux afin de rendre plus favorables la balance bénéfices/risques des traitements antitumoraux.
Bénéfices attendus
Ce projet mêlant la cardiologie à la cancérologie aura plusieurs objectifs susceptibles de bénéficier à long terme aux patients atteints par ces maladies. Dans un premier temps, ce projet a un intérêt fondamental de par la description et la compréhension du métabolisme cardiaque dans le cadre de l’utilisation de ces thérapies cardiotoxiques. Ces traitements entrainent des mécanismes de toxicité pour les cellules cardiaques connues mais dont on ne sait quasiment rien en termes de perturbation du métabolisme. En décrivant les modulations et régulations du métabolisme des cellules cardiaques nous pourrons aussi mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’émergence de stress (induit ou non par une chimiothérapie) pouvant aboutir à une insuffisance cardiaque. Deuxièmement, nous étudierons les effets bénéfiques potentiels des combinaisons thérapeutiques associant chimio²thérapies et inhibiteur métabolique. Ces nouvelles associations de molécules thérapeutiques sont actuellement très étudiées et pourraient fortement modifier les schémas thérapeutiques utilisés en oncologie. Si à travers ce projet nous pourrions montrer un potentiel bénéfice de cardioprotection, nous appuierions alors l’utilisation de ces combinaisons et accélèrerions possiblement leur utilisation en routine. En effet, la validation in vivo de nos hypothèses pourrait bénéficier à de nombreux domaines de la recherche médicale comme en cancérologie ou en cardiologie.
Procédures
Toutes les souris de ce projet seront manipulées de la même manière et uniquement pour des interventions d'intensité légère à modérée (IV, IP, gavage et echocardiographie) de leurs vivant. Un prélèvement de sang sera effectué en terminal, directement suivi par la mise à mort des souris. En détail : - IV = 3 fois par souris vigiles (traitement doxorubicine), durée de 1 à 2 minutes par souris - IP = maximum 20 fois par souris vigiles (traitement malonate de 4 semaines), durée de moins de 1 minute par souris - OG = 3 fois par souris vigiles (traitement inhibiteurs BRAF et MEK), durée de 1 minute par souris - Echocardiographie = maximum 4 fois par souris anesthésiées, durée de 10 minutes par souris environs - Ponction de sang = une seule fois en terminal, durée de 2 à 5 min par souris sous antalgique et anesthésiées - Euthanasie = une seule fois en terminal, durée 1-3 secondes par souris sous antalgique et anesthésiées.
Impact sur les animaux
L’objectif même du projet est de travailler sur la toxicité des chimiothérapies et de leurs combinaisons sur le cœur. Il y aura donc des évènements indésirables, que nous chercherons à réduire à travers l’utilisation des inhibiteurs métaboliques. Ces évènements indésirables, suivis grâce à un scoring rigoureux des souris, peuvent prendre la forme de douleur, de perte de poids, d’inactivité, de stress à la suite des traitement chimiothérapeutiques. Toutefois, les doses de chimiothérapies nécessaires pour obtenir ces résultats sont maintenant bien connues et permettent d’éviter les effets secondaires non voulus en cours d’expérience. Les inhibiteurs utilisés le sont déjà dans de nombreuses publications récentes aux concentrations choisies. Les souris seront uniquement manipulées pour l’injection des traitements et pour la ponction intracardiaque en terminal ; en suivant les recommandations détaillées dans les procédures expérimentales. Pour chaque expérience, nous ferons un suivi quotidien des souris avec un scoring rigoureux permettant de mesurer l’état de santé global des souris. Pour cela, chaque signe clinique sera noté selon l'échelle suivante : (aspect du poil [score 1], posture courbée [score 2], défaut de mobilité [score 3]) et la mesure du poids (perte de poids 20% [score 3]) observés et quantifiés quotidiennement serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant l’efficacité du traitement et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer un point limite : score≥ 3 et/ou perte de poids > 20% au-delà duquel les animaux seront euthanasiés même avant la fin du protocole expérimental.
Devenir
La mise à mort des souris est necessaire pour obtenir les résultats voulu pour ce projet. Un grand nombre d'organe seront prélevés à la suite de l'euthanasie pour étudier les mécanismes déclanché par les traitement anticancéreux qui pêuvent être toxiques.
Remplacement
Une phase in vitro d’expérimentation a eu lieu avant d’envisager les expériences in vivo. Ces expériences, même si partielles, sont prometteuses et nous motivent à poursuivre nos hypothèses grâce à l’utilisation de modèle murin de cardiopathie induite par des chimiothérapies. Les modèles murins permettent d’avoir un niveau de preuve supérieur de par la complexité d’un organisme vivant en comparaison d’une culture cellulaire maintenue en vie en flasque plastique. Les données que nous mesurerons par échocardiographie sur les souris ne sont pas remplaçables et nécessaires pour démontrer une amélioration des fonctions contractiles du cœur après traitements.
Réduction
Pour chaque combinaison, nous utiliserons un nombre limité de souris (192 au total). Ce nombre reste pourtant élevé de part le domaine de recherche auquel nous appartenons, la cardiologie. En effet, les mesures fonctionnelles faites en échocardiographie nécessitent un nombre assez élevé de souris pour obtenir des résultats robustes et significatifs (8 souris par groupe). En effet, les variations fonctionnelles des paramètres cardiaques mesurés en échocardiographie sont légères (+/-10% parfois) mais ont des conséquences fortes sur l’organisme et peuvent entrainer la mort. Ce nombre de souris necessaire au bon déroulement du projet à été calculé avec l'utilisation d'un logiciel de calcul de cohorte et en utilisant des paramètres rigoureux et des tests statistiques utilisés aussi en clinique. Notre projet vise à étudier l’ajout d’inhibiteurs métaboliques à des traitement chimiothérapeutiques cardiotoxiques. Ces combinaisons sont utilisées dans différents projets d’autres équipes avec qui nous sommes en collaboration. Nous chercherons à mettre en commun certaines expériences pour réduire le nombre de souris engagées dans ce projet. Nous utiliserons au maximum chaque souris et réduirons le nombre de manipulation au strict nécessaire. Chaque souris apportera des données d’échocardiographie, d’histologie mais aussi une analyse complète du sérum et une extraction des cardiomyocytes après traitements. Pour les souris xénogreffées avec des cellules cancéreuses, nous récupérerons aussi les organes touchés par la maladie. Ces analyses s’ajouterons aux expériences initialement prévues par nos équipes collaboratives, permettant d’extraire le plus de données possibles à partir d’un nombre limité de souris.
Raffinement
L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les souris sont hébergées dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Des lanières de papier cartonné sont ajoutées pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les cages possèdent des dômes transparents dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées en rouge de manière à apaiser les animaux. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris C57Bl6 (168), une souche très étudiée en cardiologie et idéale pour l’étude des cancers de par l’existence de modèles in vivo utilisés couramment. Ces modèles xénogréffés seront uniquement généré dans la zootechnie des équipes collaboratives. Nous utiliserons uniquement des souris C57Bl6 adultes de 8 à 10 semaines. Ces souris présentent toutes les caractéristiques nécéssaires à l'étude des fonction cardiaque chez l'adulte et ne necessitent pas d'hébergement longue durée que l'on pourrait avoir pour l'étude de souris agées.
Rôle des cellules immunitaires dans la régénération musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une blessure musculaire provoquée par électrostimulation sous anesthésie, jusqu'à quatre mesures de force sous anesthésie et jusqu'à quatre injections intraveineuses, pour étudier le rôle des cellules immunitaires dans la régénération du muscle. Le porteur reconnaît un cumul d'actes qui induit du stress, puis les tue pour analyser leurs tissus. Il affirme qu'un "système biologique entier" est requis et écarte les analyses in vitro pour "difficultés méthodologiques".
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Il a été montré que ce processus dépend de l’implication des cellules immunitaires après une blessure sévère. Toutefois, le rôle de ces cellules est encore inconnu dans le cadre de blessure légère. L’objectif de cette étude est d’évaluer le rôle des cellules immunitaires dans un modèle standardisé de blessure musculaire induit par des stimulations électriques
Bénéfices attendus
Le projet vise à comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la réparation du tissu musculaire. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs pathologies (cancer, myopathie…).
Procédures
Les souris sont soumises à un protocole d’électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 10-15 minutes), une mesure de force musculaire (4 au maximum, anesthésie générale de 5-10 minutes) et des injections intraveineuses (4 au maximum)
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables légers sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et peuvent diminuer la réponse immunitaire.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de réaliser des analyses tissulaires post-mortem.
Remplacement
L’implication et le rôle des cellules immunitaires dans la régénération requiert un système biologique entier pour évaluer leur impact au niveau du fonctionnement du muscle. Des analyses in vitro ne peuvent être considérées en raison des difficultés méthodologiques permettant d’isoler spécifiquement ces cellules. Ces éléments justifient le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. La réalisation complète du projet est conditionnée à la mise en évidence de la diminution des cellules immunitaires dans le sang lors d’une première phase expérimentale.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors des injections, de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Le projet porte sur le rôle des cellules immunitaires dans la régénération musculaire. Des souris adultes, âgées de 12 semaines, sont donc utilisées.
Evaluation de l’efficacité de molécules contre les modifications physiologiques et comportementales induites par un stress chronique chez le rat adulte (acronyme : STCH-2023).
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Trente-six d'entre eux subissent un stress chronique de 2 h 30 par jour pendant 21 jours, un traitement oral quotidien et cinq prises de sang sur animal vigile, pour tester des molécules contre le stress et l'anxiété. Le porteur héberge les rats stressés seuls, sans enrichissement, et précise qu'aucun analgésique ni anti-inflammatoire ne sera administré, tout en affirmant qu'aucune procédure n'engendrera de douleur. Il affirme que le remplacement n'est "pas envisageable" et que la complexité des mécanismes ne peut être appréhendée qu'in vivo.
Objectifs
Les troubles anxieux et les troubles liés au stress sont particulièrement fréquents dans les pays industrialisés. Il est estimé que 13 à 22% des habitants de ces pays développeront une pathologie anxieuse au cours de leur vie. Par ailleurs, le stress est impliqué dans l’apparition de pathologies d’ordre psychiatrique telle que la dépression, avec, au-delà de l’aspect individuel, un coût important pour la société. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la dépression concerne 300 millions de personnes dans le monde et 800 000 personnes meurent en se suicidant chaque année. Les traitements disponibles concernant l’anxiété et le stress présentent de nombreuses limites dues aux effets secondaires importants et/ou à l’efficacité limitée. Dans le cas de stress chronique, différents traitements médicamenteux peuvent être prescrits mais l’indication de ces traitements n’est pas toujours prioritairement l’effet anti-stress et ils ne sont pas dénués d’effets secondaires. Dans ce contexte, la recherche de nouveaux produits plus efficaces représente donc un enjeu sociétal et économique majeur.
Bénéfices attendus
L’enjeu de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans la lutte contre le stress et l’anxiété qui pourront être développés pour une utilisation chez l’Homme.
Procédures
Dans cette étude, les 48 animaux seront tout d’abord soumis à un test de préférence au sucre pendant 3 jours (1h de test par jour), après mise à jeun pendant 1 heure chaque jour, et placement en cage individuelle afin d’avoir une mesure de la consommation hydrique pour chaque individu. Ensuite, 36 des 48 animaux seront soumis à un stress chronique pendant 21 jours (2,5 heures par jour). Un traitement sera administré sur les 48 animaux vigiles par voie orale pendant 23 jours (environ 1 minute par jour). Un prélèvement sanguin effectué en 1 minute environ sera réalisé sur ces 48 animaux à l’état vigileà 5 reprises au cours de l’étude. Des tests comportementaux seront réalisés à l’issue de l’étude sur 2 jours, avec une durée maximale de ces tests de 5 à 20 minutes par jour pour évaluer les effets des traitements sur le stress induit. Enfin, à la fin du projet, un ensemble d’organes sera prélevé pour analyses. Aucune procédure n’engendrera de douleur.
Impact sur les animaux
L’hébergement en cage individuelle des animaux est nécessaire durant la totalité du projet pour les groupes soumis au stress chronique. Le stress chronique induit tout au long de ces 21 jours peut entrainer une aggressivité, il est donc préférable de limiter les interactions avec leurs congénères. Les traitements par voie orale s’effectuent sur animal vigile afin d’éviter les fausses routes et aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire ne sera utilisée. Pour le test de préférence au sucre, une mise à jeun des animaux est nécessaire 1h avant les mesures afin de garantir le bon déroulé du test. Les séries de prélèvements sanguins comme les tests comportementaux s’effectuent sur animal vigile sans aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire pour ne pas perturber l’activité des animaux et les dosages qui seront réalisés.
Devenir
Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort 24 jours après le début de l’induction du stress chronique, c’est-à-dire à la fin de l'unique procédure expérimentale.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire ou d’évaluer les effets antistress d’un traitement. Le modèle rat est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress. La complexité des mécanismes mis en jeux ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont, et notre expérience du modèle, permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non des traitements testés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes. Les rats du groupe Contrôle non stressé seront 3 par cage avec des feuilles de papier kraft et des briques en bois en guise d’enrichissement. Les rats des autres groupes soumis au stress chronique seront hébergés en cage individuelle sans enrichissement pour assurer le bon déroulé de l’étude. Les animaux auront un accès non restreint à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée du projet sauf lors des 3 sessions de test de préférence au sucre où une mise à jeun d’une heure est nécessaire. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5 jours sur 7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Lors des séances d’induction du stress, à la sortie du dispositif, une attention particulière sera apportée à l’animal pour vérifier l’absence de blessure. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant les tests comportementaux. Un expérimentateur surveillera en permanence l’écran vidéo situé dans le couloir jouxtant la salle de test afin d’intervenir en cas de nécessité. Les traitements oraux et les prélèvements sanguins seront effectués par du personnel ayant les compétences requises et une observation régulière des animaux sera effectuée après réalisation de chaque traitement oral ou prélèvements, week-end et jours fériés inclus. Des points limites adaptés sont fixés, si nous constatons le dépassement d’un de ces points limites, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
Le modèle rat est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress. De plus, ce modèle est déjà très utilisé dans les tests visant à étudier les comportements de type anxieux et dépressif. Dans cette étude et afin d’être le plus représentatif possible, nous utiliserons des rats des deux sexes. Les animaux utilisés seront des rats mâles et femelles Sprague Dawley de 30 jours à l’arrivée au laboratoire (125-150 g). Nous effectuerons notre modèle sur de jeunes rats afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles dans la littérature scientifique sur les modèles de stress chronique.
IMPLICATION DE L’INFLAMMASOME NLRP3 DANS LA REPONSE INFLAMMATOIRE LORS DES INFECTIONS A KLEBSIELLA PNEUMONIAE
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Klebsiella pneumoniae, par voie nasale sous anesthésie ou par gavage, reçoivent un inhibiteur de l'inflammasome, puis sont tuées au cinquième jour pour prélever poumons, intestins, foie, rate et sang. Le porteur indique que l'infection pulmonaire peut provoquer sifflements, écoulements nasaux, insuffisance respiratoire et fièvre, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Il reconnaît avoir mené des essais in vitro sur cellules mais les juge insuffisants, et conclut à la nécessité d'un organisme complexe.
Objectifs
L’axe intestin-poumons résulte d’une communication croisée entre le microbiote intestinal et la sphère pulmonaire. La survenue d’une dysbiose intestinale favorise un état d’hyper-inflammation, exacerbe les lésions pulmonaires et aggrave les pathologies respiratoires. Les mécanismes sous-jacents sont méconnus, et notamment les liens entre microbiotes et les complexes protéiques de l’immunité innée que sont les inflammasomes qui ont été identifiés comme de puissants modulateurs de l’inflammation. L’ambition de ce projet est de décrypter le rôle de l'inflammasome en lien avec l’interface hôte/microbiote dans l’axe intestin-poumons via un modèle infectieux impliquant le pathogène respiratoire Klebsiella pneumoniae (bactérie opportuniste commensale de l'intestin). Les objectifs sont d’identifier 1) s'il existe une activation differentielle de l'inflammasome dans le tissu pulmonaire et/ou intestinal chez des souris infectées par K. pneumoniae et 2) les conséquences de son activation (ou inhibition) sur le transfert d’informations immunologiques et bactériennes dans l’axe intestin-poumons. Pour cela, deux modèles murins seront développés: un modèle intestinale (modèle de colonisation intestinale par inoculation intra-gastrique de K.pneumoniae) et un modèle pulmonaire (instillation intra-nasale de K. pneumoniae). Dans les deux modèles, un inhibiteur de l'inflammasome sera administré afin d'étudier l'impact de l'inflammasome dans l'inflammation intestinale, pulmonaire et dans l'axe intestin-poumons. Les connaissances générées permettront d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour une approche spécifique du traitement des pathologies pulmonaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a deux effets levier majeurs. Le premier est clinique, puisque le projet a pour objectif d’identifier le rôle des inflammasomes dans l’axe intestin-poumons et ainsi de générer des nouvelles pistes diagnostiques et/ou thérapeutiques. L’identification de bactéries commensales immunomodulatrices permettra le développement de bactéries probiotiques ou d’interventions nutritionnelles ciblées chez des patients atteints de pathologies respiratoires infectieuses et/ou inflammatoires. Ce projet vise également à décrire les interactions du microbiote intestinal avec les poumons en réponse à un pathogène. Ce domaine est encore largement méconnu mais il représente un levier majeur pour améliorer les connaissances sur la pathogénie, la persistance et la transmission des pathogènes. Ainsi, les données acquises lors de ce projet permettront d’initier un programme de plus grande envergure qui pourra faire l’objet d’un dépôt dans le cadre d’appels à projets nationaux.
Procédures
Deux modèles d'infection avec le pathogène bactérien seront mis en place pendant 5 jours. Le premier modèle expérimental correspond à la mise en place d'un modèle d'infection pulmonaire dans lequel le pathogène est introduit dans les voies aériennes par inhalation réalisée sous anesthésie légère (moins de 5 min). Cette première procédure nécessitera 3 lots soit 72 souris. Le deuxième modèle sera un modèle de colonisation intestinale dans lequel les animaux (3 lots soit 72 souris) recevront une unique dose de pathogène par voie orale. Dans chaque modèle, un lot de souris recevra en plus un inhibiteur de l'inflammasome (3 injections tous les 2 jours). Des collectes de fécès quotidienne seront réalisés sur les animaux inclus dans le modèle de colonisation intestinale. Aucun prélevement sur animaux vigiles ne seront réalisés sur les animaux inclus dans le modèle d'infection pulmonaire. Les animaux seront mis à mort au bout des 5 jours de procédure.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables pourraient etre observés avec les animaux infectés par le pathogène en intra-nasale (modèle d'infection pulmonaire). Ils pourraient montrer des signes respiratoires tels qu'un sifflement pulmonaire, des écoulements nasales ou une insuffisance respiratoire accompagnés de fièvre.
Devenir
Tous les animaux des procédures 1 et 2 seront mis à mort afin d'effectuer des prélements d'organes (poumons, intestins, foie, rate), du sang et du liquide broncho-alvéolaire et permettre des analyses immunologiques afin d'étudier le rôle du pathogènes sur la réponse inflammatoire intestinale et pulmonaire et plus précisement sur l'inflammasome. Des analyses microbiologiques seront également effectuées par le dénombrement du pathogène dans les différents organes prélevés ainsi que dans le sang afin de voir l'impact de l'inflammasome sur les processus de colonisation, translocation et dissémination de la bactérie.
Remplacement
Notre approche expérimentale a inclus une première analyse in vitro avec des cellules eucaryotes en culture, mais elle reste largement insuffisante pour analyser l’implication de l’inflammasome dans la réponse inflammatoire induite par K. pneumoniae, car elle n’englobe que très partiellement la complexité de l’in vivo. Le modèle murin utilisé permettra de reproduire fidèlement dans un organisme complexe ce qui est observé en clinique lors de d’infections pulmonaires à K. pneumoniae et permettra ainsi de mieux caractériser le rôle de l’inflammasome (au niveau pulmonaire ou par l’intermédiaire de l’axe intestin-poumons) dans le développement des processus hyperinflammatoires lors des infections à K. pneumoniae.
Réduction
Les expérimentations seront organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible, et chaque expérience sera exploitée au maximum (prélèvement d’un maximum d’organes, prélèvement de sang, réalisation de lavages broncho-alvéolaires...). Le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs est calculé à partir d’analyses statistiques. Nous utiliserons des lots de 8 souris ; ceci est classiquement utilisé afin de prendre en considération la variabilité/reproductibilité intra-lot. La variabilité inter-lot (entre les différentes conditions) ne peut pas être évaluée. Nous estimons que 3 répétitions par point de mesure pour chaque condition de culture (3 lots de 8 souris) sera suffisant pour prendre en compte la répétabilité inter-lot, et seront suffisantes pour obtenir une puissance statistique recevable. Nos précédentes études nous ont permis de confirmer que l’étude de groupes de 8 animaux permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Des antalgiques seront administrés aux animaux pour réduire la douleur si nécessaire. Si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.
Raffinement
Des échelles cliniques journalières et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des animaux. Une grille de score et l'utilisation de points limites adaptés à chaque modèle permettra repérer les signes de stress et de douleur des animaux. Si des signes de douleur sont observés, l’animal concerné sera isolé dans une cage individuelle et des analgésiques lui sera administré. Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% par rapport à leur poids en début d’expérimentation ou présentant des effets indésirables durant les procédures seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des souris C57BL/6. Des publications internationales montrent que cette lignée est parfaitement adaptée pour étudier la virulence de K.pneumoniae au niveau pulmonaire et intestinal; le fond génétique C57BL/6 est préférable pour l’étude de l’immunité et des outils moléculaires sont disponibles pour cette espèce. Les animaux seront âgés de 6 semaines, âge où les souris ont un système immunitaire mature et fonctionnel caractérisé par un développement maximal des organes lymphoïdes secondaires et une réponse lymphocytaire complète (présence des différentes populations lymphocytaires matures).
Biodistribution et suivi pharmacologique de vecteurs conjugués VHH chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sur animal vigile, elles reçoivent des injections intraveineuses ou sous-cutanées de vecteurs-médicaments et des prélèvements de sang à la queue, pour mesurer la biodistribution de molécules censées passer la barrière du cerveau. Le porteur, une société privée, indique un risque de choc anaphylactique parmi les effets possibles. Les bénéfices médicaux annoncés pour les patients sont renvoyés au long terme.
Objectifs
Les neuropathies, myopathies, et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. A l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent malheureusement très insatisfaits, sans aucuns traitements curatifs, ou palliatifs. Les maladies neurodégénératives telles qu’Alzheimer ou démences associées, les maladies lysosomales, les myopathies (Duchenne) sont des exemples d'enjeux de santé publique. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste en la conjugaison de vecteurs (peptides) à des pro-drogues ou médicaments capables de passer les barrières physiologiques naturelle et dons d’atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). En effet, la plupart de ces médicaments restent inefficaces par manque de passage et d'accès aux régions ou organes à traiter. L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaitre leurs partenaires naturels spécifiques, au niveau des barrières cellulaires protectrices de l'organisme et d'utiliser leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. Par cette technique du cheval de Troie, nous faciliterons le passage de médicaments à travers la Barrière Hématoencéphalique (BHE) vers le système nerveux central (SNC). A travers cette demande de projet nous souhaitons développer et optimiser nos « vecteurs » (VHH) pour améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par des approches systémiques, en administrations intra-veineuses ou dermiques, en sous cutanées, nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments, sur une lignée murine de fond consanguin, génétiquement modifiée et humanisée pour le récepteur cible de ce projet.
Bénéfices attendus
> Choix d’une lignée murine "Humanisée" pour le récepteur : La transposition de nos recherches sur un modèle murin, aux récepteurs humanisés, permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. Enfin, le fait de pouvoir humaniser notre cible endogène chez la souris constitue un excellent outil stratégique et scientifique, se traduisant par une réduction importante du nombre d’animaux au sein des études, par un gain de temps considérable (et donc économique), tout en réduisant par la suite de potentiels essais sur modèles animaux plus gros. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos Vecteurs médicaments (VHH) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures en validant sur un modèle souris pathologique, puis à terme, dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil. Les manipulations expérimentales, sur animaux vigiles, (Pesées, intraveineuses ou sous-cutanées, prélèvements intermédiaires de sang) seront précises et rapides (≤ 2min). • Posologie : Les pesées (calculs posologies), annotations queues des souris (marqueur spécifique pour animaux), et l’ensemble des gestes à suivre seront réalisés par le même expérimentateur. En cas de procédure à doses répétées (≥ 24h), une pesée sera systématiquement effectuée avant chaque administration. • Administrations de VHH : Les administrations se font sur animaux vigiles au niveau caudal pour les intraveineuses, à la base du crâne (nuque), pour les sous-cutanée. Pour les administrations répétées (x3 maximum), un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. • Prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique, à différents « time points » sur animaux vigiles en contention spécialisée. Par une micro-incision de l’extrémité caudale, 3 à 5 gouttes de sang (≤50μl) suffiront pour quantifier la 1/2 vie plasmatique de nos VHH. Ces prélèvements de sang se feront aux temps intermédiaires de 4h, 24h, 72h ou encore 168h, en fonction des groupes, contrôles et VHH.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Ainsi, nous ne modifierons pas leur quotidien (cycles) et garderons les mêmes cages et aliments (absence de faim). Les animaux seront groupés par 4, ce, dès leur réception par les animaliers (absence isolement). Une salle spécifique servira de stabulation lors des cinétiques, elle présentera les mêmes conditions de vie qu’en hébergement. Dans ce projet, il n’y aura pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni d’intervention chirurgicale avec réveil (absence douleur, lésions). Les administrations, précises et rapides, se feront sur animaux vigiles et tenus en contention pour les intraveineuses (réduction stress et peur). De plus, nous proposons d’étudier nos VHH sur des temps d’incubations majoritairement courts. Certaines cinétiques pourront être élargies à 1 ou encore maximum 3 mois, en fonction du délai d’action pharmacologique. Si on se fie aux données de la littérature et notre expertise, les cinétiques d'incubations de quelques semaines à 3 mois ne suffisent pas pour générer des effets indésirables ou engendrer des conséquences physiologiques. En effet, les conjugués administrés présentent des demi-vies dites « relativement courtes », de quelques heures à quelques jours, seuls les effets cibles pharmacologiques de nos médicaments optimisés peuvent nécessiter des cinétiques plus longues avant d’en mesurer pleinement leurs efficacités. Ici, post-administration, le principal risque se trouve être la réaction immunitaire (choc anaphylactique), ainsi que d’autres effets indésirables (réaction allergique ; détresse cardio-respiratoire ; modification et troubles comportementaux). Mais là encore, ces problématiques sont étudiées en amonts et en post-expérimentales (immunogénicité) couplées à de la littérature et le savoir de nos experts en chimie et pharmacologie. Nos composés VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité, il en va de l’intérêts des animaux mais aussi de l’étude. Malgré ces précautions, une observation comportementale des animaux sera faite de manière quotidienne, à la recherche du moindre signe de souffrance, le tout accompagné d'un suivit du poids, du début des administrations à la fin des cinétiques, afin de s'assurer que les animaux ne perdent pas plus de 10% de poids initial.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements tissulaires en point final. Si, entre temps, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également euthanasié en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.
Remplacement
Pour mener à bien nos projets, nous envisageons de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres physiologiques, mécanistiques et homéostasiques, indispensables pour pouvoir étudier une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit pour cela de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. Les faibles cohortes d'animaux permettront d’obtenir un maximum de résultats, suffisant pour l’obtention de données statistiques significatives.
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs et voies d’administrations permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), de limiter les possibles effets secondaires, mais aussi le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur de petits groupes de n=4, à raison de 240 souris/an, réparties sur 10 études de 24 individus. Cette estimation est basée sur notre expérience et d’anciens projets, similaires, réalisés sur le modèle souris par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des tests statistiques adaptés (non-paramétriques) permettant d’utiliser un faible nombre de souris sans compromettre les objectifs de l’étude. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl) en cours de cinétique permet d'obtenir des données de ½ vies plasmatiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires afin d’appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal (Annexe II : grille score et points limites). Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux pour un minimum de 14j dès réception. La veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 4 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil. Les manipulations expérimentales, sur animaux vigiles, (Pesées, intraveineuses ou sous-cutanées, prélèvements intermédiaires de sang) seront précises et rapides (≤ 2min). La simplicité des administrations nous permet facilement d’envisager différentes stratégies pharmacologiques plus complexes, à doses uniques ou répétées (x3 maximum) (administration i.v. 5.5ml/kg, s.c. 10ml/kg). Des points limites seront établis en cours de cinétique, lors du suivi des animaux. Un score modéré (7-9) conduira automatiquement à une exclusion et sortie de l’étude, puis à l’euthanasie (cf. 3.3.3) du ou des animaux en question (Pas de maintiens isolés inutiles, ni de soins ou d’utilisation d’analgésique). En point final de l'étude, les animaux seront tous euthanasié sans stress ni douleur, pour collecter les tissus d'intérêt. La lignée humanisée utilisée n’a jusqu’alors jamais présenté d’apparitions de phénotypes dommageables chez les animaux. Nous utiliserons des animaux issus du même élevage et fournisseur.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières études précliniques. Le développement préclinique nécessite tôt ou tard une première approche in vivo, sur un modèle animal tel que le rongeur, dans notre cas, la souris. C’est le modèle le plus standardisé et utilisé en expérimentation animale, car sa physiologie, bien connue (mammifère), est relativement proche de l’homme. Le modèle rongeur facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la partie pharmacologie (diminution des posologies). En pratique, on l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations et l’obtention de groupes allant jusqu’à 4-5 individus sans trop de contraintes de stabulation. Notre modèle souris humanisé est particulièrement avantageux dans notre projet car il présente l’avantage d’avoir notre cible endogène humanisée (récepteurs). Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, organes ou liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 25-27g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).
Test de composés induisant la régénération des cellules beta pancréatiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de protéines et des prélèvements de sang réguliers, une partie développant un diabète, pour tester cinq variantes d'un composé censé régénérer les cellules bêta du pancréas. Le porteur revendique une application "stricte" de la règle des 3R, tout en prévoyant 900 animaux. Les bénéfices annoncés se limitent à l'identification de candidats médicaments contre le diabète de type 1.
Objectifs
Le pancréas joue un rôle clef dans le maintien du taux de sucre sanguin. Cet organe contient de nombreux types cellulaires dont les cellules bêta sécrétant de l'insuline, une hormone permettant de diminuer le taux de sucre sanguin en cas d'apport sucré. Notre recherche se concentre sur le diabète de type 1, une maladie qui se caractérise par la perte sélective de cellules bêta. Sans traitement, cette maladie peut avoir de graves conséquences telles que des dommages vasculaires, des risques de cécité, d’amputation, ou même la mort. Les traitements actuels consistent en l’injection d'insuline pour compenser la déficience en cette hormone. Cependant, des facteurs environnementaux (l'alimentation, l'age, le stress, etc...) peuvent provoquer de fortes variations dans les niveaux de glucose sanguin, malgré un traitement à l'insuline, et donc éventuellement conduire aux complications présentées précédemment. Dans le but de pallier aux limitations des thérapies actuelles, nous nous intéressons à la régénération des cellules beta. Nous avons ainsi récemment identifié un composé pharmacologique capable d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques. Le but de notre projet est donc de tester 5 différentes variations de ce composé (visant à le rendre encore plus efficace) dans un modèle de diabète. Nous utiliserons 900 souris afin d’évaluer et comparer les capacités de ces composés à contrer un diabète. Une attention particulière est portée sur l’application stricte de la règle des 3R.
Bénéfices attendus
Le but de ces travaux est de démontrer une activité accrue de l’une (ou plusieurs) de nos protéines afin d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques et ainsi contrer les effets de la perte des cellules beta pancréatiques.
Procédures
Les animaux recevront des injections quotidiennes ou hebdomadaires de protéines. Des prélèvements sont prévus pour suivre la glycémie des animaux (1 fois par semaine, 1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures de glycémie) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets attendus sont un inconfort modéré dû aux piqures, aux prélèvements et à la mise à jeun de 5 h. Une partie des animaux développeront un diabète modéré n’entrainant pas de souffrance particulière.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour examen post-mortem des organes et du pancréas en particulier.
Remplacement
Le diabète est une maladie complexe. C'est une pathologie qui s’exprime à l’échelle d’un organisme et qui fait intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose (la plupart donc). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques nous a permis de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables et sans prévoir de répétition des expériences.
Raffinement
Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en oeuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé ou la souffrance des animaux seront observés selon des grilles d'évaluations indiquées. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi (maisonettes et buchettes), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
Le diabète est une maladie d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Les souris utilisées ici représentent un modèle de choix pour nos travaux visant à contrer un diabète : il est en effet très difficile de trouver une autre espèce animale développant un diabète provenant d'une attaque des cellules beta pancréatiques. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines, cet interval d'âges correspondant à une période sans diabète. Nous souhaitons en effet initier nos traitements avant l'apparition du diabète (et ainsi contrer son développement).
Etude de l’inflammation et de la régulation par les glucocorticoïdes et leurs récepteurs dans les maladies neurodégénératives
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
3 765 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 125 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des chocs brefs répétés, un stress de défaite sociale où une souris agresseur peut les blesser, un isolement, des tests de mémoire de la peur et des chirurgies, pour étudier le rôle des glucocorticoïdes et de l'inflammation dans les maladies de Parkinson et d'Alzheimer. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier la mémoire et le vieillissement pathologique sans le modèle murin. Les pistes thérapeutiques annoncées restent lointaines, l'objectif immédiat étant de comprendre des mécanismes.
Objectifs
Notre intérêt de recherche se focalise sur les actions des glucocorticoïdes et leur récepteur, le récepteur aux glucocorticoïdes, dans l’inflammation chronique qui caractérise la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. De plus nous étudions le rôle des médiateurs de l’inflammation dans les processus neurodégénératifs qui induisent des anomalies comportementales et cognitives. Les objectifs de ce projet sont de comprendre : a) comment les glucocorticoïdes et leur récepteur GR, par leurs actions sur les cellules immunocompétentes (par exemple les cellules gliales dans le cerveau) et dans les neurones régulent la pathogenèse des maladies neurodégénératives b) les actions des récepteurs aux glucocorticoïdes dans le stress chronique pouvant déclencher des processus neurodégénératifs c) le rôle des molécules inflammatoires dans les anomalies comportementales et cognitives liées à ces maladies.
Bénéfices attendus
Les mécanismes par lesquels le stress, l’inflammation, les glucocorticoïdes et le récepteur aux glucocorticoïde modifient le comportement, l'humeur et la cognition chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson ne sont pas connus. De plus en plus d’études menées chez ces patients montrent un rôle important du stress environnemental ainsi que du système immunitaire. Nos travaux vont apporter une meilleure compréhension de ce sujet et approfondir nos connaissances sur la pathologie de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson. Nos travaux d’analyses moléculaire et cellulaire ainsi que de l’expression des gènes chez nos modèles murins identifieront des facteurs et des processus qui permettront de réaliser ensuite des études chez des patients de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson.
Procédures
(1) Injections sur souris vigiles, durée=environ 1 minute/souris. Au maximum 2x par jour pendant 5 jours (2) Prélèvement de sang sur souris vigiles (10-20 microlitres) x4 (dans un intervalle de 3h), durée 1-2 minutes par prélèvement (3) Tests comportementaux sur souris vigiles pouvant entrainer une diminution de la prise de nourriture, durée 3 semaines (4) Hébergement en cage individuelle, durée10 jours (5) Certaines souris seront soumises à un choc : durée 2 secondes x3. (6) Procédure chirurgicale avec réveil: injections d’anesthésie et d’analgésie préopératoire, durée de la procédure : environ 30 minutes par souris ; traitements anti-inflammatoire/analgésique post-opératoire-durée 1-3 jours (7) Protocoles de stress (chronique ou aigu), durée 10-15 minutes à 3 h selon le stress. (8) Procédure chirurgicale et sans réveil –injections de l’analgésie suivi par l’anesthésie profonde - durée 20 minutes.
Impact sur les animaux
(1) L’incision dans la queue pour les prises de sang peut entrainer une douleur si elle ne cicatrise pas correctement. (2) Les souris qui seront hébergées individuellement pendant les tests de comportement pourront montrer a) une perte du poids (5-10%) et/ou une diminution du toilettage et/ou une diminution de la locomotion. (3) Douleur possible durant la chirurgie sans réveil. (4) Risque d’hypothermie ou d’arrêt cardio-respiratoire suite à l’anesthésie, douleur et affaiblissement post-opératoire possible, risque d’infection ou inflammation autour des zones de suture après les procédures chirurgicales. (5) Effets possibles du protocole de stress: anxiété, dépression, diminution du toilettage et de la prise du poids, diminution des interactions avec les congénères. (6) Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. (7) Pendant les injections, les souris peuvent avoir « peur » ce qui se manifeste par des vocalisations, des émissions d’urine et une défécation. (8) Les souris sont limitées dans leurs mouvements pendant le stress de contention aigu. (9) Durant le stress de défaite sociale, la souris "agresseur" peut blesser la souris soumise à ce stress (10) L’étude de la mémoire à la peur peut entrainer une douleur.
Devenir
Les souris seront euthanasiées, les tissus prélevés pour les analyses biochimique et immunohistochimiques (analyse de la pathologie, de l'inflammation, changements dans chaque type de cellule) et pour les études moléculaires et génomiques.
Remplacement
Notre modèle de souris est le modèle le plus adéquat pour cette étude car les structures impliquées dans la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer chez l’Homme (régions de cerveau qui régulent des comportements moteurs, la mémoire, humeur et le cellules de système immunitaire) sont conservées chez la souris et présentent le même phénotype comportemental associé à des déficits moteurs ou un apprentissage. L'absence de méthodes alternatives quant à l'étude de la mémoire ou de l'apprentissage au cours du vieillissement pathologique nous oblige à utiliser les modèles murins mentionnés.
Réduction
Le nombre total d’animaux estimé est 3765. Nous analyserons nos résultats avec des tests statistiques appropriés pour avoir des valeurs significatives, afin d’obtenir des conclusions sur ces résultats. Pour ce projet nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental avec une analyse prédictive du nombre d’animaux en utilisant un outil statistique.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation et « handling » puis expériences). Une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement l’euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire leur stress. Pour les procédures chirurgicales, les souris sont injectées avec un analgésique suivi par un mélange anesthésique. Les souris sont surveillées étroitement. Des points limites adaptés ont été définis pour toutes les procédures.
Choix des espèces
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. La souris possède un éventail génétique vaste, une reproductibilité fiable et rapide, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre projet. Dans ce projet, l’étude d’animaux est indispensable puisque nous explorerons les altérations physiopathologiques dans le cerveau et le système immunitaire périphérique ainsi que le rôle du stress. Les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du comportement par le système nerveux central ne peuvent pas être abordés uniquement par des études à l’échelle cellulaire ou subcellulaire. Nous utilisons des souris adultes dont le cerveau est totalement développé pour étudier le rôle du stress dans le contexte de maladies neurodégénératives qui se développent à l'âge adulte chez l'homme. Nous utilisons aussi des animaux au stade périnatal car un stress précoce dans la vie de l'individu a des répercussions une fois adulte, et en particulier, affecte sa réponse au stress. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements moléculaires causés par le stress sur des circuits neuronaux intacts. La nature expérimentale de notre recherche requiert donc l’utilisation de modèles animaux. Nos études sur le rôle du stress dans les maladies neurodégénératives seraient importantes non seulement pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mais donnera de nouvelles pistes thérapeutiques.