Recherche fondamentale

2 375 hamsters communs vont être utilisés, dont 375 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec l'intention de les relâcher dans la nature. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'enregistreurs de température, des prises de sang sous anesthésie et la pose de puces, pour étudier en enclos l'effet de différents régimes sur leur reproduction et leur hibernation. Le projet vise la préservation d'une espèce en fort déclin en plaine d'Alsace, liée aux monocultures de blé et de maïs. Le porteur précise que les hamsters seront tués si les autorisations de lâcher ne sont pas obtenues.

Objectifs

Le hamster commun est inféodé à la plaine agricole en Alsace où les cultures de blé et de maïs représentent plus de 80% de la surface agricole utile certaines années. Nous avons montré que ces 2 monocultures ne répondaient pas aux besoins nutritionnels de l’espèce : une carence en protéines dans le blé cause une importante mortalité juvénile tandis que dans le maïs, une carence en vitamine B3 et son précurseur le tryptophane, entraîne du cannibalisme chez 90% des femelles. Pour pallier à ces carences et améliorer la reproduction des hamsters en milieu naturel, nous recherchons des cultures qui sont naturellement riches en acides aminés essentiels et d’intérêt technico-économique pour les agriculteurs. En conditions semi-contrôlées en enclos, nous allons soumettre des hamsters mâles et femelles à différentes associations de cultures et mesurer l’effet de ces régimes sur le succès reproducteur des hamsters et sur leur hibernation.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des retombées scientifiques en fournissant de nouvelles connaissances sur les besoins nutritionnels d’une espèce hibernante, qui seront valorisées au travers de communications scientifiques écrites et de conférences. Il contribuera également à la préservation d’une espèce en déclin en proposant de nouvelles pratiques culturales permettant un meilleur succès reproducteur et une et une meilleure survie hivernale de l’espèce. Enfin, ces nouvelles pratiques agricoles devraient bénéficier plus largement à toute la biodiversité des agrosystèmes et répondre aux nouveaux enjeux technico-économiques des agriculteurs.

Procédures

Implantation/desimplantation de ibuttons (15 min par chirurgie) et prise de sang (2 min par prise de sang, 1 prise de sang par animal par an, 2 prises de sang au total par animal) sous anesthésie : 75 hamsters par an. Transpondage (implantation en sous cutané d’une puce individuelle) et prélèvements poils sur animal vigile : toute la descendance produite, 400 hamsters par an environ.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à la chirurgie : Procédure modérée : douleur liée à la laparotomie, inflammation, infection, perte de poids, hématome lié à la prise de sang. Effets liés aux manipulations en enclos : stress lié au transport, lâcher, capture, et manipulation : implantation interscapulaire de transpondeur, douleur aigue transitoire liée à l’injection du transpondeur. Perte de poids lié au changement de régime alimentaire

Devenir

Lâcher en milieu naturel pour le renforcement des populations sauvages, sous réserve d'obtention des autorisations de la DREAL et de l'OFB (en charge des opérations : financement, recherche des parcelles où lâcher les hamsters) et de la DDPP. Si nous n'obtenons pas les autorisations de lâcher en milieu naturel, les hamsters seront euthanasiés.

Remplacement

Cette étude concerne la préservation du hamster commun en plaine d’Alsace et ne peut être réalisée sur une autre espèce, ni par des études de modélisation.

Réduction

Nous allons expérimenter sur 12 femelles et 3 mâles par condition expérimentale. Ce nombre d'individus est le minimum pour qu'une différence éventuelle entre les différents groupes puisse être statistiquement décelée. Les résultats seront soumis à des tests non paramétriques du fait du faible effectif des groupes. Le sex ratio déséquilibré est lié à la biologie de cette espèce : les mâles ont un domaine vital plus grand que les femelles, et lâcher un plus grand nombre de mâles par sous-enclos entraînerait des agressions entre congénères.

Raffinement

En animalerie : Les animaux sont élevés en cages individuelles, car le hamster d’Europe n’est pas une espèce sociale et fait preuve d’agressivité envers ses congénères. Des objets visant à enrichir le milieu (tubes) et des éléments permettant le comportement de construction de nid sont placés dans les cages. Nous réaliserons une surveillance accrue des animaux opérés et un analgésique sera administré en post-opératoire dans l’eau de boisson pendant 3 jours. Les hamsters seront lâchés en enclos uniquement après complète cicatrisation et s’ils présentent une bonne condition corporelle. A noter que nous réalisons ces procédures d’implantation intra-péritonéale d’enregistreurs de température chez cette espèce depuis 10 ans, sans qu’aucune complication post-opératoire n’ait été observée. En enclos : Les hamsters seront transportés à l’enclos à 10 min de l’animalerie dans des boîtes adaptées avec du papier absorbant. Les lâchés seront réalisés en soirée au moment du pic d’activité de l’espèce. Nous serons très vigilants au bien-être des animaux dans l’enclos en réalisant des observations régulières (pièges photos et captures). Un suivi de la masse corporelle et de l’aspect général permettra d’évaluer leur état nutritionnel et sanitaire et d’agir en conséquence : supplémenter leurs apports alimentaires dans l’enclos ou ramener l’animal au laboratoire pour le soigner ou l’euthanasier en fonction du niveau d’atteinte de points limites.

Choix des espèces

Ce programme de recherche s’intéresse spécifiquement à la préservation de cette espèce. Les populations sauvages sont en déclin en raison notamment des pratiques agricoles intensives. Notre objectif est d’améliorer les pratiques agricoles afin de restaurer l’état des populations de hamsters communs. Les animaux seront étudiés à partir de l’âge de 4 mois et jusqu’à l’âge de 1,5 ans. Au-delà, une plus grande variabilité interindividuelle du succès reproducteur est observée et pourrait biaiser nos résultats.

Chaque rat reçoit, sous anesthésie générale, une injection sous la rétine de chacun de ses yeux, de cellules dérivées de cellules souches humaines ou d'une solution tampon, puis jusqu'à six séances d'imagerie de la rétine et d'électrorétinogramme, chacune sous anesthésie. Les 325 rats, d'une lignée immunodéficiente atteinte d'une dégénérescence de la rétine qui les rend aveugles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et passent aussi des tests de vision éveillés : test optomoteur et test d'évitement de la lumière. Le porteur prévoit une "douleur oculaire" après l'opération, puis justifie l'injection du second œil en affirmant que "La rétine ne possède pas de récepteurs spécifiques de la douleur". Tous sont mis à mort à la fin de chaque procédure pour l'analyse de leur rétine.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’un canal ionique. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines, appelées cellules iPS. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une perte visuelle provoquée par une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules modifiées après transplantation. L’utilisation de cellules rendues artificiellement sensibles à la lumière vise à contourner les difficultés rencontrées par différents groupes, et rapportées dans différentes études, d’obtenir une restauration fonctionnelle.

Bénéfices attendus

Les travaux de thérapie cellulaire développées ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont permis d’obtenir un certain succès en termes de survie et d’intégration dans le tissus hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d'édition du génome qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante. Les bénéfices attendus sont donc une restauration au moins partielle de la vue chez les animaux modèles aveugles. Ces résultats pourraient permettre à terme de proposer à des patients souffrant de cécité irréversible une thérapie visant à rendre au moins partiellement la vue ; les seuls traitement disponibles à l’heure actuelle permettent au mieux un ralentissement de la perte visuelle avant la cécité complète.

Procédures

Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection intraoculaire (sous la rétine) de cellules en suspension (2 groupes pour deux types de cellules différentes), ou de solution tampon (1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes et est réalisée une seule fois dans chaque œil de l’animal. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. Ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. L’animal étant déjà anesthésié pour la procédure chirurgicale, par conséquent il n’y aura pas d’impact significativement négatif sur le fait de pratiquer une injection intra-oculaire dans chaque œil. La rétine ne possède pas de récepteurs spécifiques de la douleur et, par conséquent, une injection dans l’œil contralatéral n'aura pas d'impact significatif sur la santé globale de l'animal. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.

Devenir

A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (survie cellulaire ; différenciation et intégration aux tissus de l’hôte ; réponse à la lumière des cellules transplantées ; reconnexion avec les autres types cellulaire).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans les deux yeux. Par ailleurs, la majorité des actes peut être réalisée sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 325 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importante des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à environ un quart des expérimentations (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.

Raffinement

Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec éléments d’enrichissement pour toute la durée du protocole ; nourriture et abreuvement à volonté. Les procédures prévoient une surveillance de leur état physique général (et particulièrement du système oculaire). Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux d’évaluation de la fonction visuelle (OCT, test optomoteur, test de comportement d’évitement de la lumière, ERG), qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue pour certains examens (imagerie, ERG) les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant ces différents actes. Le geste chirurgical, qui peut générer une nuisance ou une douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique puis un anti-inflammatoire non stéroïdien à durée d’action longue. Les signes de comportement anormal, signe de possible souffrance, seront également surveillés. Les points limites adaptés sont définis de manière adaptée aux procédures mises en œuvres et inclus une surveillance de l’état physique et comportemental de l’animal. L’observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal selon les méthodes adaptées et réglementaires.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.

Livrées supposées gestantes au deuxième jour de gestation pour les rates, accouplées sur place pour les souris, 4 664 rates et 2 420 souris, soit 7 084 femelles, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit une chirurgie, pose d'une pompe osmotique sous la peau ou ligature des artères utérines, un recueil d'urine de 18 heures en cage spéciale, douze jours de mesure de la pression au brassard sur la queue, et des injections quotidiennes sous la peau pendant 4 à 21 jours ou une injection intraveineuse. L'équipe déclenche une prééclampsie, entre autres par perfusion de vasopressine ou de dDAVP, puis teste des peptides censés la traiter sans traverser le placenta. Toutes sont mises à mort pendant le dernier tiers de leur gestation, et le résumé ne dit rien du sort des fœtus, alors qu'une procédure mesure le passage des molécules vers eux.

Objectifs

La prééclampsie est une maladie qui survient pendant la grossesse et qui provoque une hypertension artérielle chez la mère. Les complications pouvant être graves pour la mère et le fœtus, la prééclampsie peut nécessiter le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Les femmes ayant souffert de prééclampsie et les adultes nés prématurément ont un risque augmenté de maladies cardiovasculaires. Il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie. Des études cliniques ont mis en évidence une augmentation (avant même le diagnostic) de la vasopressine (ou AVP) et une diminution de l’apeline circulant dans le sang des mères atteintes de prééclampsie, suggérant fortement que l'AVP et l'apeline jouent un rôle dans le développement de la maladie. De plus, des études chez le rongeur suggèrent un rôle spécifique d’un récepteur, le V2R, dans la maladie et montrent que l'administration préventive d'apeline améliore les symptômes liés à la prééclampsie. Le premier objectif sera donc de comprendre le rôle de l'AVP et de l'apeline dans la physiopathologie de la prééclampsie chez le rongeur. Pour cela, i) nous évaluerons le rôle de chacun des récepteurs de l'AVP dans la prééclampsie en comparant le modèle préexistant par infusion d'AVP (qui active les trois récepteurs de l'AVP) à un nouveau modèle par infusion de dDAVP (qui a une affinité très élevée pour le V2R), et ii) nous étudierons le rôle du récepteur de l'apeline dans la prééclampsie en utilisant l'antagoniste MM 54, et nous décrirons le rôle de chaque ligand endogène du récepteur de l'apeline. Le second objectif sera d'évaluer le potentiel impact thérapeutique d’un antagoniste du V2R ou/et d’un agoniste du récepteur de l'apeline chez le rongeur atteint de prééclampsie. Pour ce faire, nous utiliserons des peptides qui ne traversent pas la barrière placentaire, c’est-à-dire sans risque pour le fœtus, et qui présentent une haute affinité et une sélectivité absolue pour le V2R ou le récepteur de l'apeline.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la prééclampsie qui demeure, à ce jour, incertaine. En particulier, ce projet va clarifier le rôle des récepteurs de la vasopressine et l’apeline dans la prééclampsie. Malheureusement, il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie, ce qui nécessite le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Ce projet va donc chercher à développer une stratégie thérapeutique contre la prééclampsie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale qui consistera soit en une intervention courte de 5-10 minutes de pose d’une pompe osmotique sous-cutanée soit en une intervention plus longue de 20 minutes de ligature des artères utérines. Les animaux seront également soumis à un seul prélèvement urinaire qui aura lieu durant 18 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines. Les animaux seront aussi soumis à un enregistrement de la pression artérielle par une méthode non-invasive (une fois par jour pendant 30 minutes maximum) durant une période de 12 jours consécutifs. Enfin les animaux seront soumis soit à des injections sous-cutanées répétées (une fois par jour) s’étalant sur 4 à 21 jours maximum, soit à une seule injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs aux chirurgies (implantation d’une pompe osmotique sous-cutanée ou ligature des artères utérines) sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie, soit 7 jours après la livraison des rongeurs, et ne devront pas s’étendre au-delà de 72h après la chirurgie. Pour éviter ces effets indésirables la zone sera désinfectée abondamment avec de la Vétidine, un analgésique local injectable sera appliqué au niveau du site chirurgical (Lidocaïne/Laocaïne) et un antidouleur global à action diffuse par voie sous-cutanée (Buprénorphine) sera injecté. Cependant, si une infection est décelée et perdure au-delà de 72h, l’animal sera exclu de l’étude et pris en charge par le vétérinaire de l’installation. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets débuteront 7 jours après la livraison des rongeurs jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Pour éviter ces effets indésirables i) une pommade analgésique local sera appliquée, au préalable, sur le site d’injection, ii) la localisation du site d’injection variera quotidiennement et iii) les injections seront faites dans une pièce au calme sans passage. Les effets indésirables liés aux molécules administrées (inhibiteur de nitrique oxyde synthase, antagoniste du récepteur de l’apeline, AVP, dDAVP, antagoniste du récepteur de l’AVP, agoniste du récepteur de l’apeline) sont décrits dans la littérature et dans nos précédentes études « preuve de concept » et de « toxicité ». Les doses sélectionnées dans ce projet ont été choisies afin de ne pas induire d’effets indésirables chez les animaux.

Devenir

Les rates seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation à la fin de chacune des procédures expérimentales. Les souris seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation à la fin de chacune des procédures expérimentales.

Remplacement

Nous avons étudié in vitro des molécules d’intérêts pour traiter la prééclampsie (antagonistes du récepteur de l’AVP de type 2 et agonistes du récepteur de l’apeline) afin de sélectionner le plus petit nombre possible de molécules à tester in vivo. Il est indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d’un organisme entier car il n’existe pas de modèle in vitro de prééclampsie et car cette étude s’inscrit dans le cadre d’une phase préclinique d’un nouveau traitement d’une pathologie chez l'Homme.

Réduction

Le projet s’intéresse au développement de la préécleampsie dont le paramètre caractéristique est la pression artérielle. Or, la pression artérielle est un paramètre très variable. De ce fait, le nombre minimum d’animaux par groupe calculé afin d’obtenir la puissance statistique nécessaire s’élève à 8 rates ou 15 souris par condition différentes, les difficultés de mesures étant plus importantes chez la souris. Une des procédures expérimentales a pour but de mesurer la capacité des molécules d’intérêt à passer la barrière materno-fœtale et donc de sélectionner les molécules non-toxiques pour l’embryon, c’est-à-dire celles ne franchissant pas cette barrière. Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse pour cette procédure. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum. De plus, nous allons essentiellement réaliser notre étude sur des modèles déjà publiés et bien décrits dans la littérature de prééclampsie, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point de modèles. Enfin, si une des doses de molécule étudiée parait adéquate, toutes les doses indiquées ne seront pas nécessairement testées afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pendant 7 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux administrations sous-cutanées quotidiennes, une pommade analgésique sera appliquée localement sur le site d’injection, la localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, une analgésie locale injectable par voie sous-cutanée (laocaïne) sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse par voie sous-cutanée (buprénorphine). Pendant toute chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Pour réduire ou supprimer la douleur relative aux enregistrements de pression artérielle, nous utiliserons une méthode non-invasive qui consiste à mesurer la pression artérielle et le rythme cardiaque des rongeurs à l’aide d’un brassard placé au niveau de la queue des rongeurs. Cette méthode non-invasive est toutefois légèrement stressante pour l’animal. Pour réduire ou supprimer le stress relatif à cette méthode nous entrainerons donc les animaux quotidiennement entre le treizième jour et le vingtième jour de gestation pendant un temps n’excédant pas 30 minutes par jour. Enfin, bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, de souffrance et d’angoisse associées à l’administration des composés, une étroite surveillance quotidienne des animaux sera réalisée à l’aide d’une grille de scoring associée.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces pertinentes pour l’étude de la prééclampsie car plusieurs modèles préexistants ont déjà été publiés et sont largement décrits. De plus, nous avons déjà étudié chez le rat et la souris dans des études « preuve de concept » et dans des études de « toxicité » les molécules d’intérêts que nous souhaitons utiliser pour traiter la prééclampsie. Les animaux utilisés seront des rates et souris gestantes. Les rates seront commandées et livrées supposées gestantes au deuxième jour de gestation. Les rates seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison, soit entre le neuvième jour et le vingtième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Les souris seront commandées et livrées non-gestantes. L’accouplement se fera sur place à l’animalerie. Les souris seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison soit de la semaine précédant leur accouplement jusqu’au dix-neuvième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation.