Recherche fondamentale

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès leur première semaine de vie elles subissent un tatouage des doigts et un prélèvement de queue, puis une injection intrapéritonéale quotidienne pendant six semaines, susceptible de provoquer une inflammation douloureuse au point d'injection. Le porteur cherche à savoir si un inhibiteur peut empêcher la disparition de cellules immunitaires de la peau privées d'autophagie. Il affirme que ces cellules changent de phénotype hors de leur tissu et qu'un animal adulte vivant est donc nécessaire, avant prélèvement de la peau et des ganglions.

Objectifs

Les cellules dendritiques (DCs) sont les sentinelles du système immunitaire, elles détectent les signaux de leur environnement et migrent jusqu’aux ganglions lymphatiques pour activer les lymphocytes T et déclencher les réponses immunitaires. Chaque organe contient des DCs, les cellules de Langerhans (LCs) étant les seules DCs de l’épiderme, la couche externe de la peau. L’autophagie est un processus de dégradation de composants du cytoplasme (réserves lipidiques, organelles endommagées…) qui permet aux cellules de mieux résister à un stress énergétique ou à une irradiation. Une activité autophagique basale est également indispensable aux cellules à durée de vie longue, capables d’auto-renouvellement. Nous avons obtenu des souris dans lesquelles une déficience en autophagie est restreinte aux LCs. Nous avons analysé la peau et les ganglions lymphatiques de souris déficientes ou non à 2 et 8 semaines. En l’absence d’autophagie, les LCs ne semblent pas affectées à 2 semaines de vie. En revanche, nous avons constaté à 8 semaines une réduction significative et pérenne de leur population, liée à l’induction de ferroptose, un processus de mort cellulaire liée à l’oxydation des réserves lipidiques dans les LCs. A présent, nous souhaitons déterminer s’il est possible de pallier les effets de l’absence d’autophagie par un inhibiteur de la ferroptose et ainsi éviter la disparition des LCs.

Bénéfices attendus

Les cellules de Langerhans (LCs), présentes dans les couches supérieures de la peau, ont un rôle essentiel dans le maintien de son intégrité et de sa fonction barrière, ainsi que dans l’initiation et le contrôle des réponses immunitaires cutanées. L’autophagie confère en outre aux LCs une capacité antivirale, en permettant l’élimination du VIH. La présence de LCs représente donc un moyen de maintenir une immunosurveillance de la peau, par exemple dans le cadre d’une radiothérapie, à laquelle les LCs sont capables de résister. Pour toutes ces raisons, le projet de recherche décrit ici apportera des connaissances nouvelles sur les LCs. Des applications thérapeutiques sont envisageables dans le traitement du cancer et des infections virales, à travers l’utilisation de modulateurs de l’autophagie ou de la ferroptose.

Procédures

Un tatouage des doigts à l’encre et un prélèvement de queue (< 1mm) pour le génotypage sont effectués sur chaque animal dans sa première semaine de vie. Le souriceau vigile sera rendu à sa mère dès la fin du prélèvement pour limiter au maximum le temps de séparation maternelle. Aucun autre prélèvement ne sera effectué. Une injection i.p. sera réalisée chaque jour pendant 6 semaines sur l’animal vigile, en alternant le côté d’injection. Ces manipulations n'exigent pas plus de quelques minutes.

Impact sur les animaux

L’inhibition de la ferroptose in vivo par la ferrostatine-1 aux doses proposées ici et par différentes voies d’administration n’a pas d’effets secondaires décrits dans la littérature, pour des traitements quotidiens d’une durée allant jusqu’à 3 semaines. Une inflammation et/ou une infection potentiellement douloureuses pourraient se développer au niveau des points d’injection intrapéritonéale de ferrostatine-1.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans les procédures seront mis à mort. Ceci est nécessaire aux analyses de tissus prévues, réalisées par immunohistochimie ou par cytométrie au niveau de suspensions cellulaires obtenues par digestion enzymatique.

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant afin d’observer dans la peau et les ganglions lymphatiques les conséquences de l'absence d'autophagie sur le réseau épidermique de LCs. En outre, les LCs extraites de leur tissu d’origine changent rapidement de phénotype et ne peuvent donc être traitées in vitro.

Réduction

Plusieurs analyses pourront être réalisés simultanément à partir d’un même animal. Nos protocoles expérimentaux sont basés sur les paramètres décrits dans la littérature (ex : quantité des produits à administrer), permettant ainsi de réduire le nombre de variables testées, et donc le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux, si possible par fratrie après sevrage, dans un environnement enrichi (tubes en polycarbonate rouge translucides, frisures de carton, barre en bois à ronger, rouleaux de coton). Un relevé des températures est effectué quotidiennement dans les pièces d’élevage. La nourriture, l’eau et l’environnement de la cage sont vérifiés par le personnel compétent. Les animaux adultes sont habitués à la contention ce qui contribue à réduire le stress lié à l’injection par voie intrapéritonéale, réalisée sur animal vigile. Les animaux sont observés tous les jours afin d’évaluer leur bien-être et de détecter tout signe de douleur ou de stress, qui seront quantifiés, le cas échéant, selon le tableau des points limites (Annexe) mis au point d’après les recommandations de la Structure Chargée du Bien-Être Animal. Le score sera défini par l’addition des points attribués en fonction de l’état général de l’animal (perte de poids, comportement, apparence physique, nutrition, locomotion, aspect des fèces) et des dommages éventuels résultant de la procédure expérimentale (état des sites d’injection). Ceci permet de tenir compte d’éventuels effets secondaires directs et indirects du traitement.

Choix des espèces

Le système immunitaire et les modèles inflammatoires de la souris sont proches des pathologies humaines que nous souhaitons étudier. Outre une littérature abondante sur ces modèles, nous disposons de nombreux outils d'analyse et l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, nous permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous avons choisi de traiter les animaux dès l’âge de 2 semaines car nos expériences préliminaires ont montré que la densité du réseau épidermique de cellules de Langerhans déficientes en autophagie diminue lentement à partir de cet âge, la différence avec les animaux contrôles devenant significative à partir de 6 à 8 semaines.

1 250 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité expédiée vers des laboratoires clients et les autres tués. Chaque animal subit sous anesthésie une ablation du rein, partielle ou étendue aux cinq sixièmes, ou une ligature de l'uretère, pour produire une insuffisance rénale ou une hypertension. Le porteur présente cette activité comme une prestation de service, les animaux étant opérés puis expédiés à des tiers pour leurs propres études, sans aucune analyse statistique du nombre utilisé. Il affirme qu'aucune méthode de substitution n'est réalisable puisque l'objet même du projet est de livrer des modèles animaux déjà préparés.

Objectifs

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, l'oncologie, etc. Ce projet a pour but de fournir des rongeurs avec une insuffisance rénale et/ou une hypertension pour nos clients en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année pour nos clients sur nos animaux (rats, souris),(environ : 250/an).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Chaque animal subira sous anesthésie, une néphrectomie (unilatérale ou 5/6 ème) ou une ligature de l'uretère pour une durée maximum de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie, celle en post-opératoire, également l'insuffisance rénale et l'hypertension.

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés, les autres seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres systèmes métaboliques proches de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connue ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection intraveineuse de cellules tumorales, une autre développe en vieillissant des plaques cutanées inflammatoires qui s'étendent si l'animal n'est pas tué, avant prélèvement d'organes. Le porteur indique étudier le rôle d'une protéine, E-Syt2, dans la surveillance immunitaire des tumeurs et l'inflammation de la peau. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire humain ne convient car les cellules concernées changent de comportement hors de leur tissu, et justifie ainsi le recours à la souris.

Objectifs

Nous avons récemment montré que la protéine E-Syt2 joue un rôle important au niveau du système immunitaire en permettant l’activation d’un facteur clé de l’inflammation. En particulier, son rôle se situe au niveau de la reconnaissance par les cellules de l’immunité de lipides. Ces lipides, lorsqu’ils sont exprimés par des cellules cancéreuses donnent lieu à leur reconnaissance et à leur destruction par un processus appelé « immunosurveillance tumorale » ayant pour but de détruire les cellules cancéreuses circulantes. Le but de ce projet est donc de déterminer si les souris déficientes pour E-Syt2 peuvent se défendre contre la présence de cellules tumorales. Si le processus d’immunosurveillance tumorale est altéré, ces souris ne pourront plus détecter les cellules cancéreuses qui se multiplieront et donneront des métastases. Par ailleurs, les souris invalidées pour E-Syt2 possèdent un phénotype dommageable au niveau de la peau lorsqu’elles vieillissent (3-6 mois) qui pourrait être du à un défaut d’activation des cellules de l’immunité reconnaissant les lipides (cette fois ci au niveau de la peau). Nous aimerions étudier le mécanisme responsable de cette anomalie.

Bénéfices attendus

Globalement, ce projet nous aidera à mieux comprendre les mécanismes immunitaires responsables de l’immunosurveillance antitumorale et de quantifier la sévérité de l’inflammation de la peau et de proposer des nouvelles thérapeutiques basées sur les connaissances acquises.

Procédures

Injection intraveineuse de cellules issues de lignées tumorales par voie intracaudale . L’injection durera environ 30 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Apparition d’un phénotype dommageable au niveau de la peau après 3 à 6 mois. Les lésions seront des plaques inflammatoires au niveau du dos des souris qui ne régresseront pas mais au contraire s’étendrait si la souris n’était pas rapidement mise à mort .

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront mis à mort pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Après avoir mis en évidence le fait que certains types cellulaires sont augmentés dans les souris invalidées pour la protéine que nous étudions, nous avons besoin de réaliser des tests in vivo dans notre modèle murin qui reproduit certains aspects de la pathologie humaine. Ce modèle est disponible dans notre laboratoire. Dans ce projet, il n’est pas possible d’avoir recours à un modèle cellulaire humain car nous avons besoin d’étudier les conséquences de l’absence de notre protéine d’intérêt (E-Syt2) in vivo chez la souris en étudiant l’influence des interaction cellulaires entre cellule présentatrice de lipide et cellules de l’immunité, en mesurant la productions cellulaire de médiateurs de l’inflammation (cytokines), et en analysant le phénotype des souris, c’est-à-dire les conséquences visibles de l’absence d’E-Syt2 sur la souris. 1- pour mesurer l’activation des cellules d’intérêt et leur production de cytokines in vivo et notamment, dans un organe, le thymus. 2- Pour mesurer l’activation des cellules d’intérêt par des cellules présentatrices naturelles, les macrophages péritonéaux 3- Pour quantifier la nature des lipides exprimés in vivo à la surface de ces macrophages 4- Pour effectuer des expériences in vivo permettant d’appréhender le rôle d’E-Syt2 dans le devenir de cellules tumorales. Pour étudier le rôle d’Esyt2 dans l’apparition d’un phénotype dommageable au niveau de la peau que nous avons observé chez les souris KO vieillissantes

Réduction

Il s’agit de terminer un projet pour lequel nous avons déjà accumulé beaucoup de résultats. 80 souris seront utilisées. Pour le calcul de puissance des analyses statistiques envisagées, nous avons supposé un effet cage de 15%. Les effectifs proposés devraient permettre d’obtenir des résultats significatifs pour des tailles d’effet supérieur à 0.58 (effets forts à très forts contre 0.44 sans effet cage devraient être suffisant. 2 types de cellules tumorales seront inoculées (expérience), 4 âges ou temps post-inoculation seront utilsiés (« groupe »), 2 cages par groupe (« répétitions ») et 5 souris par cage soit 2x4x2x5= 80.Les souris seront des 2 sexes sans discrimination.

Raffinement

Les prélèvements seront réalisés sur des souris recevant une dose létale d’anesthésique (pour les prélèvements de macrophages péritonéaux) ou euthanasiés par dislocation cervicale pour éviter tout l’inconfort, douleur ou détresse occasionnée par le prélèvement d’organes. A la fin de l’experience, la dislocation cervicale sera réalisée aussi sur le souris qui ont reçu une dose lethale d’anesthesie. Pour les expériences nécessitant l’injection de cellules tumorales, les souris seront surveillées de façon journalière, mises à mort aux dates indiquées sur le schéma ou avant si les points limites précoces (diminution de la prise de nourriture, déshydratation, diminution de la locomotion, respiration laborieuse) que nous avons établi sont atteints. Les souris injectées seront placées dans des cages à part dans l’animalerie d’expérimentation sans aucune restriction. Les souris susceptibles de présenter un phénotype dommageable seront examinées toutes les semaines et euthanasiées dès l’apparition du phénotype dommageable qui se manifeste par des lésions psoriasiformes au niveau de la peau très inflammatoires.

Choix des espèces

Les modèles animaux doivent, de manière idéale, refléter tout ou la majorité des caractéristiques de la maladie observée chez l’homme. Dans ce contexte, les souris de laboratoire partagent des nombreuses propriétés avec celles des êtres humains. Plusieurs études utilisant des souris ont déjà permis une nette avancée des connaissances dans le cancer et dans la physiopathologie des maladies inflammatoires cutanées. Les résultats issus de ce projet nous permettront d’obtenir des nouvelles pistes sur les mécanismes humains impliqués dans la sévérité de maladies comme le psoriasis et de proposer des nouvelles approches thérapeutiques. Tous les animaux utilisés seront adultes (3-6 mois) pour les animaux destinés aux biopsies cutanées étant donné que le phénotype cutané se manifeste très tardivement et 6 semaines pour les animaux qui seront mis à mort pour obtenir leur thymus (le thymus involue avec l’âge) ou leurs macrophages péritonéaux. Les souris destinées à l’injection de cellules tumorales auront 6 semaines au moment de l’injection.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation d'élastase dans la trachée par une incision au cou pour provoquer un emphysème, des injections répétées de tamoxifène pouvant causer une péritonite, puis leurs poumons sont prélevés 21 ou 90 jours plus tard. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal ne permet d'isoler les cellules pulmonaires vieillissantes en cause et justifie ainsi le recours à la souris. Les retombées annoncées pour les patients atteints de BPCO, une éventuelle médecine réparatrice des alvéoles, restent renvoyées au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat étant de caractériser ces cellules.

Objectifs

La Bronchopneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) peut entraîner des complications chez l'homme comme la perte progressive des alvéoles pulmonaires. Dans les poumons des patients atteints par cette maladie, les cellules vieillissantes exprimant le gène p16 sont augmentées et empêchent la réparation des alvéoles. Nos données préliminaires montrent que la délétion de p16 ou l’élimination des cellules vieillissantes corrige les lésions alvéolaires chez la souris. Notre hypothèse est que les cellules vieillissantes bloquent la régénération alvéolaire et expliquent le manque de réparation dans cette maladie. Ainsi, l’objectif du projet est d’étudier le devenir et les propriétés non régénératives des cellules épithéliales vieillissantes dans la perte d'alvéoles liée à la BPCO. La connaissance des propriétés non-régénératives des cellules épithéliales vieillissantes nous permettra de confirmer l’effet délétère de ces cellules sur la réparation des tissus. Si notre hypothèse est validée, nous pourrons ensuite envisager l’utilisation de sénolytiques, molécules permettant d’éliminer les cellules sénescentes, et ainsi restaurer les alvéoles pulmonaires dans l’emphysème pulmonaire chez l’homme. Pour cette étude, nous utiliserons des souris ayant des cellules vieillisantes exprimant le gène p16 fluorescentes, permettant de les isoler et les caractériser au niveau épithélial par différentes analyses.

Bénéfices attendus

Nous anticipons l'identification : i) de(s) mécanisme(s) de l'effet délétère des cellules épithéliales vieillissantes dans la perte alvéolaire, ii) une ou plusieurs sous-populations épithéliales aux capacités régénératives modulées par les cellules p16 vieillissantes. Ces cellules régénératrices seront considérées comme cruciales dans la régénération alvéolaire et leur signature génétique sera analysée. La caractérisation des cellules délétères et des cellules régénératives permettera l'identification de biomarqueurs (caracteristiques biologiques mesurables) d'un processus de régénération réussi ou non. Ce processus serait la dernière étape avant d'envisager le lancement d'un essai clinique pour tester un médicament régénératif identifié avec la plus grande chance de succès. Au total, nous espérons que ces avancées élargiront le champ de la médecine réparatrice aux patients atteints de ces maladies caractérisées jusqu'à présent par une perte terminale et irréversible des alvéoles conduisant à un handicap respiratoire majeur.

Procédures

Instillation intra-trachéale (dans la trachée) sous anesthésie générale, injection intra-péritonéale (dans le péritoine) sur animal vigile et prélevement des poumons sous anesthésie générale, sans réveil.

Impact sur les animaux

Pour activer l'expression de la protéine fluorescente dans notre modèle, il est nécessaire de faire une injection par jour pendant 3 jours de Tamoxifen en injection intra-péritonéale. Cette procédure cause une douleur de courte durée au moment de l'injection. Dans de rare cas, les injections peuvent causer des péritonites chez les animaux. Nous utiliserons sur ces mêmes souris le modèle d’emphysème induit par l’élastase qui consiste en une instillation intratrachéale unique d’élastase. L’élastase est instillée à l’aide d’une aiguille directement dans la trachée. Cela nécessite une petite incision au niveau de l’avant du cou que nous refermons avec du fil de suture. La plaie au site d’injection pourrait s’infecter. Les souris seront mises à mort à 21 et 90 jours après l’instillation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever et étudier leurs poumons.

Remplacement

La variabilité des caractéristiques des patients comme leur âge, leur consommation de tabac, ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Le modèle de souris emphysèmateuse ayant des cellules p16Pos fluorescentes permettra d’étudier directement les cellules responsables de la non régénération qui sera uniquement lié à l’emphysème pulmonaire. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 40, correspondant au minimum pour obtenir des résultats pour une expérience pilote. Pour l’ensemble des manipulations animales un total de 40 souris seront utilisées. Les animaux seront répartis de cette manière : - Caractériser les cellules épithéliales vieillissantes dans les poumons des souris emphysémateuses : 4 souris instillées à l’élastase vs 4 souris instillées au PBS (contrôle) à 21 jours de l’instillation. 4 souris instillées à l’élastase vs 4 souris instillées au PBS (contrôle) à 90 jours de l’instillation. Malgrés le nombre de cellules limités que nous pouvons analyser (limite de cette technique), nous utiliserons 4 souris par condition pour lisser la différence inter-individu. - Tester les propriétés des cellules souches en formant des organoides alvéolaires avec des cellules p16Pos vs p16Neg : 6 souris instillées à l’élastase vs 6 souris instillées au PBS (contrôle) à 21 jours de l’instillation. 6 souris instillées à l’élastase vs 6 souris instillées au PBS (contrôle) à 90 jours de l’instillation. Nous avons besoin d’une quantité suffisante de cellules pour faire au moins 6 puis d’organoïdes (correspondant à 6 souris) par condition pour obtenir un résultat significatif. Le choix du nombre d'animaux pour ce projet a été déterminé par rapport aux précédentes expérimentations effectuées sur des souris utilisées dans le cadre d'un autre projet.

Raffinement

Les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière sur l’aspect des animaux traités. Il y aura un présence quotidienne des zootechniciens et une surveillance accrue de notre part durant les 24h suivant l’instillation d’élastase. Les souris sont hébergées en groupe de 4 par cage. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal être, les points limites suivants constituront des critères d'arrêt et conduiront à la mises à mort des souris : blessure, infection, masque facial ou signes de douleur.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique injection d’obtenir un emphysème important chez la souris. De plus, ce modèle est très utilisé dans la littérature pour étudier l’emphysème plutôt que, par exemple, le modèle d’exposition à la fumée de cigarette qui implique une exposition longue et pénible pour des animaux : 2h par jour pendant 6 mois pour obtenir un emphysème léger. Les animaux seront utilisé à l’âge 2 mois, correspondant à la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau de 45 minutes, jusqu'à six passages en chambre de mesure respiratoire et un test de tolérance au glucose de deux heures, avec un régime hypercalorique de huit semaines. Le porteur qualifie l'exposition aux odeurs d'"inoffensive" et affirme que la prise de poids ne cause pas de souffrance. L'étude, menée sur des souris transgéniques, cherche comment les odeurs modulent des neurones du contrôle de la faim, les pistes contre l'obésité restant hypothétiques.

Objectifs

Dans ce projet nous nous intéressons à la régulation de la prise alimentaire. Cette régulation implique notamment un réseau de neurones situé dans le noyau arqué de l’hypothalamus. Les expériences porteront sur 2 populations de neurones ayant un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire. Il s’agit d’une part, des neurones POMC ayant pour action supposée de limiter la prise alimentaire et d’autre part, des neurones AgRP stimulant la prise alimentaire. De précédentes études réalisées sur des souris ont révélé la capacité de ces neurones à répondre non seulement lorsque le cerveau détecte la présence de nutriments en quantités mais également à des signaux sensoriels issus notamment de la nourriture. Ainsi les neurones POMC et AgRP peuvent être modulés par l’odeur de nourriture avant même qu’un aliment ne soit ingéré. Le présent projet propose de caractériser les mécanismes à l’origine de cette modulation des neurones du noyau arqué par les odeurs de nourriture chez la souris. Différentes odeurs présentes dans des nourritures palatables seront utilisées pour tester leur effet sur la physiologie des neurones POMC et AgRP.

Bénéfices attendus

Les expériences proposées permettront une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques de la régulation de la prise alimentaire. Dans le contexte de l’augmentation forte du nombre de personnes en surpoids ou obèses dans le monde, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour le contrôle de la prise alimentaire s’appuyant sur l’utilisation d’odeurs modulatrices des circuits neuronaux régulant la prise alimentaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une durée d'environ 45 minutes. Toutes les précautions seront prises pour éviter une douleur de l'animal. Ils seront ensuite testés 6 fois maximum en chambre pléthysmographique (animal libre de ses mouvements) pour une durée d'environ 15min par session. Les animaux seront testés pour leur tolérance au glucose (effets métaboliques potentiels des régimes alimentaires administrés) une seule fois à la fin des expérimentations pour une durée de 2h.

Impact sur les animaux

Les odeurs utilisées proviennent d’aliments ou d’arômes alimentaires et seront utilisées à des doses faibles (les doses nécessaires à leur détection par les souris) et sur des durées inférieures à 2h. Cette exposition est donc inoffensive pour les animaux. Le régime hypercalorique entrainera une prise de poids qui sera mesurée une fois par semaine. Durant les 8 semaines d’administration du régime hypercalorique, la prise de poids sera limitée et ne causera pas de souffrance à l’animal. Les perfusions intracardiaques seront réalisées sur animal en cours d’euthanasie à la suite de l’administration d’un antalgique 30min avant.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des expérimentations pour vérifier la bonne implantation des fibres optiques. Si un animal atteint les points limites avant la fin de la procédure, il sera euthanasié.

Remplacement

L’objectif général du projet vise à comprendre les mécanismes à l’origine de la modulation de la prise alimentaire par les odeurs. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des neurones impliqués dans le contrôle de la prise alimentaire reste donc une nécessité expérimentale pour fairre avancer notre compréhension de ces processus modulateurs. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.

Réduction

Plusieurs éléments permettent de répondre au principe de réduction tout en évitant de compromettre l’obtention de résultats interprétables : i) les tests statistiques envisagés, ii) la variabilité couramment observée permettant d’avoir au maximum n=15, iii) la réalisation de plusieurs tests différents sur le même animal.

Raffinement

En accord avec la structure chargée du bien-être animal au sein du laboratoire, nous avons défini les meilleures conditions d'hébergement possibles ainsi que les points limites précoces. Dans ce projet, nous avons 5 à 10 souris par cage, présence de différents enrichissements (batonnet de bois, dôme en carton et bandelettes de papier pour former un nid), surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Nous appliquons les méthodes recommandées pour l’analgésie, l’anesthésie et l’euthanasie. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience.

Choix des espèces

Le projet proposé porte sur l’étude de populations particulières de neurones hypothalamiques ayant un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire. Les expérimentations seront réalisées sur des souris transgéniques nous permettant de cibler ces populations neuronales afin d’en comprendre le fonctionnement. La souris est le seul modèle animal permettant les modifications transgéniques nécessaires à la transformation ou à la visualisation de la population neuronale étudiée dans ce projet. D’autre part, la souris est un animal à l’odorat très développé qui utilise les odeurs dans son comportement alimentaire. Enfin, sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues servent les explorations thérapeutiques chez l’humain. Les procédures expérimentales débuteront à l’âge de 5 semaines (mise sous régime modifié). Les mesures neurophysiologiques seront réalisées chez l'adulte au cours de la 13ème semaine de vie.

2 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité expédiés vivants vers d'autres laboratoires et les autres tués. Chaque animal subit sous anesthésie une ablation des glandes surrénales de 30 minutes, puis son eau de boisson est remplacée par du sérum physiologique pour compenser la chute de sodium. Le porteur indique une douleur chirurgicale et post-opératoire, une hyponatrémie et une déshydratation. Ce projet prépare à la demande des rongeurs sans glandes surrénales, décrits comme "préparés en vue de leur utilisation", pour d'autres projets de recherche.

Objectifs

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, l'oncologie, etc. Ce projet a pour but d'avoir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année sur rats et souris (environs 400/an).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Le bénéfice est aussi de ne pas avoir l’influence hormonale (hormones de stress, hormones minéralocorticoides, glucocorticoides et androgènes) intervenant dans la régulation du métabolisme, de la pression artérielle ...

Procédures

Chaque animal subira sous anesthésie, une ablation des glandes surrénales, pour une durée maximale de 30 minutes. Après la chirurgie et durant toute la vie de l'animal, l'eau de boisson sera intégralement remplacée par du liquide physiologique 0.9 % pour compenser l'hyponatrémie.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie, celle en post-opératoire, également l'hyponatrémie (baisse de sodium dans l'organisme) et la deshydratation.

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés, les autres seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins adaptés et l'eau de boisson intégralement remplacée par du liquide physiologique 0.9 % pour compenser l'hyponatrémie, afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres systèmes métaboliques proches de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connue ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet.

234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèle de trisomie 21, elles reçoivent des injections dans l'abdomen chaque jour pendant jusqu'à 23 jours, puis passent des tests d'apprentissage et de mémoire. Le porteur indique une douleur accentuée par la répétition des injections et un stress lié à l'isolement et à l'appauvrissement du milieu. L'objectif affiché est de tester trois molécules censées améliorer les performances cognitives, les souris étant tuées pour prélever les cerveaux.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) aussi appelé Trisomie 21 (T21), est dû à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement crânio-facial et le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent des anomalies crânio-faciales ainsi qu’une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observée dans la T21. Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la T21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. Des collaborateurs proposent 3 nouveaux composés ayant la propriété d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons déterminer le composé parmi ces 3 candidats (composés 1,2 et 3) qui se révélera le plus efficace en termes de restauration des fonctions intellectuelles. Ces composés ont été synthétisés et testés pour l’ADME pharmacologique (administration, distribution, métabolisation et excrétion) par nos collaborateurs. Ces composés seront ainsi administrés par notre équipe à des souris modèles de T21. Les souris traitées feront l’objet de différents tests comportementaux afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une amélioration significative des performances cognitives (notamment dans 2 types de mémoire, mémoire de travail et mémoire explicite) dans un modèle souris de trisomie 21, qui montre de faibles résultats dans ces 2 tests.

Procédures

Les animaux seront injectés quotidienement par voie intraperitonéale avec des molécules à visée thérapeutique pour une durée maximale de 23 jours. Le temps de l'injection dure 20 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une aiguille pour l'injection en intraperitoneale. Cette douleur sera accentuée à cause de la repetition des injections, 23 au total, soit 1 par jour. L'isolement des animaux et l'appauvrissement du milieu peut entrainer un stress.

Devenir

Pour la phase 1 (validation de l'activité de la proteine d'intérêt), tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des 12 jours de traitement. Les cerveaux seront prelevés pour réaliser un dosage de l'effet des molécules à visée thérapeuthique. Pour la phase 2 (test d'apprentissage et de mémoire), tous les animaux seront euthanasiés 24 heures après la fin du test permettant d'evaluer les effets des molécules à visée thérapeuthique sur la mémoire et l'apprentissage. Les cerveaux seront prélevés pour des analyses moléculaires.

Remplacement

L’utilisation de la souris dans cette étude est justifiée par le fait que les anomalies à observer (altération des capacités d’apprentissage et déficit de la mémoire) nécessitent un modèle vivant et suffisamment proche de l’homme pour pouvoir être transposé à l’espèce humaine.

Réduction

Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées à partir de 12 semaines, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons les 3 composés sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. Une première phase visant a s’assurer de l’effet des inhibiteurs sur l’activité kinase de Dyrk1a sera effectuée. Dans le cas où les molécules testées ne montrent pas l’effet inhibiteur attendu, la phase 2 ne sera pas menée. Pour cette 1ère phase, nous utiliserons 90 souris, réparties en 10 souris sauvages non traitées, 10 souris trisomiques non traitées et 10 souris trisomiques traitées, soit 30 souris x 3 composés évalués, soit 90 souris. Pour cette 1ère phase, notre expérience dans ce domaine nous indique que 10 individus sont suffisant pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Pour la 2ème phase de projet, nous allons utiliser un total de 144 souris. L'étude se déroulera en 3 groupes d’expériences (1 groupe par composé) comme détaillée ci-dessous : Pour chacun des différents composés nous aurons besoin de 3 lots d’animaux : - 16 Souris contrôles sauvages non traitées - 16 Souris contrôles trisomiques non traitées - 16 Souris trisomiques traitées, pour 3 molécules différentes. Notre experience dans ce domaine nous montre que 13 animaux par groupe sont nécessaires pour avoir une puissance statistique suffisante. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne reponderont pas, c'est pourquoi nous testeront 3 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien à partir du début de leur traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Et dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus des analyses et soignés ou euthanasiés selon leur état. Pour la manipulation des animaux, et afin de limiter le stress, nous utiliserons des tubes de contention, ce qui évite la manipulation par la queue. Les tubes seront laissés dans les cages d'élevage pour palier à l'absence de nid, comme enrichissement du milieu. Les animaux seront elevés en groupe de 2 animaux minimum pour éviter l'isolement, sauf au moment du test du nouvel objet, pour augmenter le niveau d'exploration des souris. Le point d'injection sera alterné droite gauche tous les jours pour limiter la douleur et surveillé quotidiennement. Si des plaies apparaissent au site d'injection, elles seront désinfectées par un antiseptique local + crème cicatrisante (Betadine + Vetramil). Si la plaie devient importante et/ou profonde avec développement d’une infection ou une aggravation à 48h malgré les soins, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement. En outre, le génome de la souris étant manipulable, cela permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du Syndrome de Down. Les souris seront étudiées à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 3 mois, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présents. Dans cette étude, les deux sexes seront utilisés. Nous voulons être sûre que les hormones et donc le sexe n’impactent pas sur l’effet des produits testés.