Recherche fondamentale

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sur deux jours une chirurgie du dos induisant une plaie cutanée chronique avec arrêt de l'irrigation sanguine, puis des traitements par plasma froid trois fois par semaine et un maintien en cage individuelle. Le porteur indique que l'induction de la plaie peut causer une souffrance limitée dans le temps et qu'un excès d'espèces réactives pourrait provoquer une nécrose des tissus, constituant un point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet de suivre la cicatrisation sur plusieurs semaines et conclut que le recours au rat est nécessaire.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. Les plasmas froids produisent des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote qui ont une capacité pro-cicatrisante et antibactérienne. L'utilisation des plasmas froids se différencie par le fait qu’elle est non invasive, c’est-à-dire sans contact, et sans douleur. Les objectifs de cette première étude menée dans le cadre d’un nouveau projet sont d’évaluer les effets de plasmas froids générés par une nouvelle technologie sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques induites chez le rat. Les effets seront comparés à ceux observés sur des plaies cutanées chroniques non traitées. Les traitements par plasmas froids seront effectués sous anesthésie 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète. A l’issue de l’étude, des dosages seront effectués sur un prélèvement de sang après placement des animaux sous anesthésie générale, suivi après leur euthanasie du prélèvement d’organes pour la réalisation d’analyses.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette première étude dans le cadre d'un projet global va permettre d’évaluer les effets de traitements par plasmas froids de "nouvelle génération" sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat, et de comparer ces effets avec des plaies cutanées chroniques non traitées. Les données des analyses effectuées sur les prélèvements de sang, de peau de la région cicatrisée et des organes prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets des traitements effectués sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat. Cela permettra de poursuivre les études sur l’animal dans le cadre de ce projet, et notamment d’étudier les effets d’une combinaison traitements par plasmas froids et pansement actif, et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettra à terme de proposer une nouvelle thérapie innovante pour le traitement de plaies cutanées chroniques chez le sujet sain ou diabétique.

Procédures

Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée chronique avec arrêt de l’irrigation sanguine sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale sur 2 jours consécutifs. Un traitement analgésique sera administré chaque jour avant la chirurgie et 6 heures après la fin de celle-ci le 2ème jour. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ le 1er jour et en 10 minutes environ le 2ème jour. Les plaies cutanées seront traitées 3 fois par semaine et seront protégées par un morceau de gaze stérile et 2 bandes de sparadrap pour le maintien de celle-ci. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps, et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée chronique réalisée sur 2 jours successifs peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements et les changes de gaze et de sparadraps, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. Une toxicité éventuelle des traitements par plasmas froids pourrait se traduire par exemple par une nécrose avancée des tissus traités en raison d'un excès d'espéces réactives de l'oxygène, pouvant alors constituer un point limite. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps au cours de la période de traitement. Cela permet également d’éviter toute interférence avec le processus de cicatrisation qui est un processus long passant par différentes phases successives. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social. Un prélèvement de sang de 3 ml environ sera réalisé sur les 20 rats lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, effectué en moins d’une minute avant leur euthanasie, pour réaliser des analyses sanguines.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 20 rats seront euthanasiés lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, après réalisation d’un prélèvement de sang pour la réalisation d’analyses sanguines. Les rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de la peau au niveau de la région ou la plaie cutanée a été induite, ainsi que des organes pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes successifs. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études menées sur un autre modèle expérimental chez le rat, et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour les 2 groupes de traitement envisagés. Nous utiliserons donc 2 groupes expérimentaux de 10 rats.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque traitement et/ou change de gaze et de sparadrap et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids importante est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière. L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.

Choix des espèces

Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet car il présente une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme, avec une durée de cicatrisation suffisamment longue. Les animaux seront de jeunes rats âgées de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour la réalisation des expérimentations. Les rats auront ainsi une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme.

5 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les bases neurales de l'attention. Chaque animal reçoit un plot de tête et une chambre d'enregistrement fixés par des vis, avec une craniotomie de 18 mm donnant accès au cerveau pour y descendre des électrodes lors des sessions. Le porteur reconnaît un risque d'infection et de lésions cérébrales à mesure que les enregistrements se répètent. Il conclut que le primate non-humain est "essentiel" comme modèle le plus proche de l'humain, et prévoit de réutiliser ces animaux devenus d'une "grande valeur scientifique" plutôt que de les tuer.

Objectifs

La fonction attentionnelle est une fonction cognitive essentielle à l’implémentation de la plupart des autres fonctions cognitive. Elle améliore ainsi les fonctions d’apprentissage, de mémorisation, de planification, de raisonnement etc. Lorsqu’elle fait défaut, suite à un accident cérébral, une maladie neurodégénérative ou encore des troubles neurodéveloppementaux, les personnes se retrouvent en difficultés cognitives dans leur vie quotidienne et leurs apprentissages. Notre objectif est d’identifier les processus neuronaux et métaboliques qui sous-tendent cette fonction à la fois localement (c’est-à-dire comprendre comment chaque neurone et les neurones d’une même région cérébrale fonctionnent ensemble lorsqu’on utilise notre attention), et dans le réseau cérébral attentionnel (c’est-à-dire entre les différentes aires cérébrales qui sont activées lorsqu’on utilise notre attention). Nous analyserons ces réponses neuronales locales et distantes pendant l’exécution de tâches comportementales impliquant l’attention, en situation normale, ou lors de l’utilisation de molécules stimulant le système noradrénergique et ainsi l’attention, ou encore, en utilisant des approches visant à modifier l’activité corticale par le sujet lui-même et lui permettant d’apprendre à optimiser le fonctionnement de ces régions cérébrales. Le projet combine analyse du comportement, et injections pharmacologiques systémiques et intracérébrales, enregistrements électrophysiologiques, et enregistrements métaboliques. Nous ciblerons spécifiquement le cortex pariétal et le cortex préfrontal, deux régions impliquées dans la fonction attentionnelle. Il sera réalisé chez le primate non humain, le seul modèle animal doté d’un système visuel et attentionnel comparable à celui de l’Homme et capable d’effectuer des tâches aussi complexes que celles réalisées par l’Homme. Ce projet nous permettra d’atteindre une meilleure compréhension de la façon dont le cerveau met en œuvre la fonction attentionnelle, et de proposer des pistes thérapeutiques pharmacologiques ou interventionnelles (invasives ou non-invasive) pour sa réparation ou son amélioration.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et la fonction attentionnelle du primate non-humain, et de l’homme par extension. Grâce à ce projet, nous pourrons comprendre comment l’activité neuronale et métabolique du cortex pariétal et du cortex préfrontal organise la fonction attentionnelle et quel rôle la neuromodulation noradrénergique joue dans ce contexte. Nous serons également en mesure de caractériser les bénéfices des approches visant à modifier l’activité corticale par le sujet lui-même (neurofeedback) sur la dynamique cérébrale ainsi que sur la performance comportementale. Ces questions relèvent clairement du domaine des neurosciences fondamentales, et notre principale ambition est de mieux comprendre comment le cerveau met en œuvre la fonction attentionnelle chez l'homme et les primates non humains. Cependant, nous pensons que les réponses que nous apporterons pourront alimenter les neurosciences cliniques.

Procédures

Habituation à la sortie de cage (3 mois) ; 2 Chirurgie sous anesthésie générale (3h/ Chirurgie); Habituation aux tâche comportementales (6 mois); Enregistrements électrophysiologiques et métaboliques (3 mois); 2 Anesthésies générales pour examens d’imagerie anatomique (3h/ examen). La procédure dans son ensemble est considérée comme modérée.

Impact sur les animaux

La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en céramique et en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. Les chambres d’enregistrement pariétale et préfrontales donneront sur une craniotomie (circulaire 18mm de diamètre) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode (d’enregistrement neuronal ou métabolique) au moment des sessions d’expérimentation. La présence de ces chambres d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les différentes phases du projet soit délétère pour la santé de l’animal. Toutes les étapes du projet étant classées en procédure légère, à l’exception des interventions chirurgicales classées en modérée, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives. Les animaux ayant un plot implanté seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant les mêmes approches expérimentales. De ce fait, nous ne prévoyons de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole que sur les animaux pour lesquels une sortie de protocole sera décidée. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques. Les animaux sortis de protocole seront candidats à un replacement dans un sanctuaire. En dernier recours, si aucune solution alternative n’est possible, les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude de recherche fondamentale, utilisant des approches d’électrophysiologie et de pharmacologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Aucun autre modèle animal ne présente ces caractéristiques. Par ailleurs, cette approche d’électrophysiologie telle que décrite dans le projet ne peut être à ce jour réalisée chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations. Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 5 animaux dans le protocole (4 en réutilisation et 1 en nouvelle inclusion). Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques comportementales avec des méthodes d’électrophysiologie chez le primate non-humain, étant données les conditions expérimentales envisagées, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=1). Tous les protocoles seront lancés sur les mêmes animaux ce qui nous permettra de comparer différentes acquisitions sur les mêmes sujets et ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les animaux en réutilisation, pour cette étude, sont déjà entrainés aux tâches comportementales et hébergé dans le laboratoire. Deux sont déjà implantés des chambres d’enregistrements. Cette réutilisation est d’autant plus importante que ces animaux doivent être entraînés sur une longue durée de temps, avec renforcement positif, pour arriver à un comportement stable, avant de pouvoir passer à la phase de collecte de données.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bienêtre des animaux. L’expérimentation implique l’utilisation simultanées de plusieurs types d’enregistrements (neuronaux, métaboliques) avec ou sans manipulation pharamacologique, permettant ainsi de maximiser la qualité et la diversité des données recueillis permettant ainsi le recueil de données de haute valeur scientifique, habituellement recueillis dans le cadre de plusieurs protocoles indépendants. L’implantation du plot, réalisée chirurgicalement sera réalisée avec les meilleures techniques d’asepsie possible, par un neurochirurgien, afin de réduire le risque d’infection ou de désimplantation. Les animaux ne seront implantés avec les chambres d’enregistrement qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes/sondes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiquerons comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques et métaboliques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire. De plus, la mise en place de points limites précoces nous permettra un suivi régulier du stress des animaux.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Cette étude s’intéresse à des mécanismes neurobiologiques chez le macaque pour des raisons de connaissance fondamentale. - Phylogénétiquement, ce modèle animal est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle la rendant notamment plus « facilement » comparable pour des études cognitives -Toutes informations physiologiques ou physiopathologiques obtenues chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les quatre animaux réutilisés sont des animaux matures. Les animaux reçus de nos fournisseurs sont de jeunes adultes (3.5-4 ans). Ils arrivent généralement déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. L’étude portant sur des sujets adultes, les variations de maturation ou de vieillissement au sein de cette tranche d’âge restes minimes et ne devrait pas engendrer de variations significatives des réponses neuronales dans les taches étudiées

200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie cérébrale de 35 minutes avec injection d'une molécule dans le cerveau, la moitié un test de reconnaissance d'objets, et cent d'entre eux une injection intracardiaque terminale sous anesthésie. Le porteur indique attendre une perte transitoire de discrimination des textures par les vibrisses et une perte de poids légère après la chirurgie. Il présente une cible thérapeutique contre Alzheimer ou les AVC comme retombée à terme, l'objectif immédiat restant de comprendre le rôle du glucose dans la mémoire.

Objectifs

Pour fonctionner et assurer des tâches complexes, telles que l’apprentissage et la mémoire, les neurones ont besoin d’énergie. Historiquement, il était admis que le glucose est le seul nutriment principal des neurones, mais des travaux récents suggèrent fortement que le lactate, un métabolite du glucose produit principalement par les astrocytes (cellules du cerveau autres que les neurones), pourrait être également une source d’énergie pour les neurones. De plus, les astrocytes sont idéalement positionnés entre les vaisseaux et les neurones, cette position clé leur permet notamment de réguler de manière adaptée l’information entre les cellules au niveau du cerveau. Le but de ce projet est de mieux comprendre et de définir dans le cerveau, si la source d’énergie des neurones en activité, est le glucose et/ou le lactate. Pour répondre à cet objectif, nous allons évaluer la contribution et le rôle du glucose dans l'apprentissage et la mémoire, chez des rats privés ou non d’un transporteur au glucose. Cette évaluation sera réalisée chez le rat, par l’analyse des capacités d’apprentissage, de reconnaissance et de mémorisation des textures de certains objets de son environnement.

Bénéfices attendus

Notre projet va nous permettre de mieux comprendre le rôle du glucose et du lactate dans l’apprentissage et la mémoire. Cette meilleure compréhension, nous permettra de définir une cible thérapeutique, qui pourra ensuite être évalué dans un protocole thérapeutique chez le rat. A terme cette thérapie sera envisagée pour une évaluation chez l'homme afin d'améliorer la prise en charge des troubles cérébraux répandus comme la maladie d'Alzheimer (15% de personnes atteintes parmi les plus de 80 ans) ou les Accidents Vasculaire Cérébraux AVC (3ème cause de décès après les maladies cardiovasculaires et le cancer).

Procédures

Sur animaux vigiles : Pour tous les animaux, 17 pesées (1 min par pesée). Chez une partie des animaux (160 animaux), 4 injections sous cutanée d’un antalgique avant et après la chirurgie (1 min par injection). Chez 50% des animaux (100 animaux), un test de comportement, reconnaissance d'objets (6 sessions de 10 min). Chez tous les animaux (200 animaux), 1 injection intra-péritonéale d’un mélange anesthésique/analgésique. Sur animal anesthésié : Chez une partie des animaux (160 animaux), 1 application oculaire de pommade ophtalmique afin de prévenir une sécheresse oculaire, 1 acte chirurgical (durée de 35min) sous anesthésie et analgésie avec injection d'une molécule dans le cerveau pour en étudier son effet, 1 injection transdermique et 1 application locale d'antalgique à l'endroit de l'incision chirurgicale. Chez 50% des animaux (100 animaux), 1 chirurgie pour injection intracardiaque avant mise à mort alors que l'animal est encore anesthésié.

Impact sur les animaux

Suite à l'injection, l'effet indésirable attendu sur les animaux est, une perte de la discrimination via les vibrisses entre les différentes textures des objets chez les animaux recevant notamment une molécule contrôle affectant les capacités de reconnaissance des textures. Suite à la chirurgie les effets indésirables attendus sur les animaux sont un inconfort transitoire ainsi qu’une perte de poids légère et transitoire dans les premières 48h-72h après chirurgie.

Devenir

Tous les animaux de chaque procédure seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour des analyses biologiques et métaboliques.

Remplacement

Seul un protocole in vivo peut reproduire la complexité des mécanismes dans le cerveau et permettre l’étude du comportement. Il est donc nécessaire de recourir à un modèle animal.

Réduction

Concernant la réduction, nous réalisons en amont, des expériences sur des neurones en culture in vitro afin de valider l'utilisation des réactifs nécessaires au projet. Cette phase d'étude in vitro limitera le nombre de rats utilisés dans le projet. Le nombre d'animaux, défini pour répondre aux différentes questions du projet, est réduit au minimum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d'organes/tissus afin de mutualiser les échantillons au sein du laboratoire.

Raffinement

Le raffinement de cette étude a été pris en compte, les animaux seront hébergés dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce (matériel de nidification et tunnel) afin d'éviter l'ennui et complété par un suivi quotidien de leur état de santé. Les animaux en pré, per et post-chirurgie feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement, cicatrisation), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe) et des « actions » seront mises en place, sans délai, en cas de « problème(s) » observé(s). Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie centrale et locale sur tapis chauffant, par un personnel compétent et expérimenté à l’expérimentation animale et à la chirurgie, et les animaux bénéficieront d’une prise en charge antalgique pré, per et post-chirurgie afin de réduire au maximum la douleur. Concernant le test du comportement, durant toute la période du test les animaux seront manipulés par la même personne à laquelle ils seront habitués ce qui diminue leur stress. De plus ce test de comportement est considéré comme un enrichissement vu qu’il se base sur le fait de la mise en contact de l’animal avec un objet nouveau qui stimule sa curiosité procurant ainsi un bien-être à l'animal. Enfin, nous avons mis en place une grille de score ainsi que des points-limites adaptés, qui nous permettront d’avoir une prise en charge afin d’arrêter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le choix porté sur le rat Wistar repose sur les critères principaux suivants : 1) L'aspect translationnel, presque tous les gènes humains liés aux maladies neurodégénératives sont équivalents chez le rat. Le rat Wistar présente un répertoire comportemental plus élaboré et proche de l'homme. 2) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. 3) La maîtrise, l’expertise et la validation de la chirurgie dans ce modèle de rat, ainsi que les études de comportement. Les rats arriveront dans l’animalerie à 7 semaines d’âge, puis la procédure chirurgicale sera réalisée chez les animaux après 14 jours d’acclimatation (rats âgés de 9 semaines). Puis 3 semaines après, le test du comportement sera réalisé chez ces rats âgés de 12 semaines, âge adulte pour lequel le cerveau est complètement développé pour avoir une homogénéité de réponse des cellules cérébrales. Le test du comportement sera réalisé durant 1 semaine.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de sept jours, séparés de leur mère, reçoivent quatre instillations intranasales et deux injections d'allergène, avant une trachéotomie sous anesthésie sans réveil pour mesurer les paramètres respiratoires. Le porteur indique que la sensibilisation peut provoquer une inflammation des voies aériennes et une dyspnée, corrigée par nébulisation de salbutamol. Il présente ce modèle comme visant de nouvelles cibles contre l'asthme de l'enfant, un bénéfice renvoyé au long terme, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'estimer le remodelage bronchique.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. La prévalence de l’asthme préscolaire est estimée entre 5-10 pour cent des enfants d’âge préscolaire (moins de 6 ans) et affecte autant les garçons que les filles. Il est associé à un risque accru d'asthme et d'altération de la fonction pulmonaire pendant l’enfance et à l’âge adulte qui à leur tour augmentent le risque d’apparition précoce de comorbidités respiratoires, cardiovasculaires ou métaboliques de décès prématuré. Ainsi, modifier l'histoire naturelle de l’asthme à l'âge préscolaire a été l'un des principaux objectifs de ces dernières années. L’asthme préscolaire est caractérisé par une hyperactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Cependant, si les deux premières caractéristiques sont ciblées spécifiquement par les traitements antiasthmatiques actuels, aucun traitement ne cible spécifiquement le remodelage bronchique. Le remodelage bronchique associe plusieurs anomalies structurelles de la paroi bronchique où l’augmentation de masse du muscle lisse bronchique apparaît comme un élément déterminant dans la physiopathologie et la persistance de la maladie. En effet, une augmentation de la masse du muscle lisse bronchique (MLB) pendant la période préscolaire a été associée à la persistance de l’asthme et à l’altération de la fonction respiratoire à l’âge scolaire. De plus, nous avons récemment démontré que l’augmentation de la masse du muscle lisse bronchique chez les enfants asthmatiques préscolaires était associée à une augmentation de prolifération mitochondrie-dépendantes des cellules musculaires lisses bronchiques. Nos données préliminaires suggèrent que cette dysfonction mitochondriale semble liée à une anomalie de la dynamique mitochondriale et un déséquilibre entre la formation et l'élimination des mitochondries. Afin de confirmer in vivo cette hypothèse, nous avons besoin de mettre en place le modèle murin d’asthme préscolaire. Nous allons également comparer nos data obtenus grâce à ce modèle avec celles issues du modèle murin d’asthme d’adulte qui a été déjà mis en place au laboratoire. Nous espérons ainsi de révéler les mécanismes communs jouant le rôle primordial dans l’asthme chez les enfants en bas âge.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des voies moléculaires conduisant à une augmentation de la masse des muscles lisses bronchiques (MLB) permettra d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement d’asthme chez l’enfant et l’adulte.

Procédures

Les animaux seront soumis aux quatre instillations intranasales sous l’anesthésie gazeuse (durée jusqu’à 2 minutes) et les deux injections intra-péritonéales de l’allergène (2 injections). Pour les instillations les animaux seront séparés de leur mère pendant une vingtaine de minutes. Les mesures de paramètres respiratoires seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés. Il n’y a pas de réveil après les mesures des paramètres respiratoires qui durent environ dix minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels sur les animaux seront : un léger stress suite aux contentions pour l’injection/l’instillation des allergènes et un bref enfermement dans une boîte en plexiglas le temps de la manipulation (2-3 minutes). Les souris ressentiront une légère douleur de la piqûre pendant l’injection (quelques secondes). L’anesthésie sous isoflurane induit également un léger stress. La sensibilisation aux allergènes peut induire des symptômes asthmatiques chez l’animal : l’inflammation des voies respiratoires et éventuel remodelage bronchique. Ces symptômes peuvent survenir après l’instillation de l’allergène et éventuellement provoquer une dyspnée (un essoufflement). Après l’anesthésie légère, les animaux seront observées par l’opérateur et la dyspnée éventuelle sera corrigée par la nébulisation du salbutamol (1g/ml pendant 15 sec).

Devenir

L’objectif de ce projet est de mettre en place le modèle murin d’asthme préscolaire. Suite au développement des symptômes d’asthme, les paramètres respiratoires seront réalisé sur les animaux mis à mort et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. Grace au modèle animale, nous testerons les hypothèses apparues après nos résultats in-vitro sur les lignées cellulaires. L’utilisation du modèle murin d’asthme préscolaire dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Ainsi, nous utiliserons 12 souris dans chacun des trois groupes. Nous allons comparer les organes des groupes de souris asthmatiques avec ceux des animaux témoins.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide (salbutamol 1g/ml). Toute la durée du protocole expérimental, les souriceaux ne seront jamais séparés de leur mère, sauf pour une courte période d’exposition à l’allergène. Afin de ne pas entraîner un rejet des nouveaux nés par la mère après l’exposition à l’allergène, lors de leur introduction, les souriceaux seront frottés avec la litière souillée pour masquer les odeurs. Les souriceaux seront remis tous ensemble dans la cage pour ne déranger la mère qu'une fois. Les animaux seront surveillés après réintroduction. Les mesures respiratoires sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des souriceaux âgés de 7 jours afin d'avoir une maturité du système respiratoire semblable à celle des enfants en bas âge.

150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une craniotomie pour implanter une canule, puis jusqu'à quatre injections de molécules inflammatoires sur les méninges pour reproduire une crise de migraine, avec mesure de la sensibilité par filaments de von Frey. Le porteur indique que le modèle provoque une douleur ressentie deux heures après chaque injection et impose un isolement en cage individuelle de deux semaines pour éviter l'arrachage des canules. Les retombées annoncées, de nouveaux traitements tenant compte des différences femmes/hommes, sont renvoyées au long terme, l'objectif immédiat restant de comparer l'activation cérébrale entre sexes.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’activation des voies de la douleur par des stimulations méningées qui miment le mal de tête ressenti lors de la migraine, en utilisant des marqueurs d’activation neuronale. Nous souhaitons comparer l’activation des régions du système nerveux central chez les mâles et les femelles pour voir s’il y a des différences entre les mâles et les femelles, mais aussi en fonction des variations hormonales qui ont lieu pendant le cycle sexuel chez la femelle. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons un modèle animal mimant l'inflammation qui semble avoir lieu au niveau des méninges pendant les crises de migraine et qui provoque la douleur ressentie. En effet, pendant la phase « mal de tête », la douleur ne peut être générée qu’au niveau des méninges puisqu’il n’existe pas de récepteurs à la douleur dans le cerveau. L’hypothèse actuelle est que cette douleur est la conséquence d’une inflammation provoquée par des molécules (histamine, bradykinine, sérotonine, prostaglandines…) libérées par les fibres nerveuses au niveau des méninges.

Bénéfices attendus

A moyen terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes d’intégration de la douleur ressentie lors des migraines au niveau du système nerveux central chez les mâles et les femelles. En effet la migraine touche plus les femmes que les hommes, mais les études ont été majoritairement réalisées chez les mâles. Pourtant, il est connu qu’il existe des différences d’intégration inhérentes au sexe et au cycle hormonal. Ainsi identifier les différences ainsi que le rôle des différentes régions cérébrales dans cette pathologie nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, mieux comprendre la pathologie peut nous aider à développer de nouveaux traitements qui pourraient mieux soulager les patients en tenant compte des différences hommes/femmes.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 intervention chirurgicale qui consiste en une craniotomie pour pouvoir implanter une canule pour appliquer à la surface des méninges une inflammation, mimant ce qui se passe pendant les crises de migraines. Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. Chaque chirurgie dure environ 30 à 45 min. Injection des molécules sur les méninges afin de mimer les crises de migraine: 4 injections (au maximum) tous les 2 ou 3 jours ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h (4 fois maximum) ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal toutes les 15 min pendant 4 h après l'injection des molécules sur la dure-mère (chaque application dure quelques secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois : cela dure 5 min.

Impact sur les animaux

Nous réalisons une procédure chirurgicale (implantation de la canule). La douleur est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie pendant 2 h après l’injection, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure moins d’une seconde. Un autre effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour la mise en place de la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 2 semaines.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau: les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles.

Raffinement

Les nuisances identifiées sur le bien-être des animaux sont : la douleur engendrée par la chirurgie, la douleur engendrée dans le cadre du modèle, et la séparation des animaux après la mise en place de la canule sur les méninges. Afin de réduire la douleur de la chirurgie, un traitement avec un antalgique est donné pendant 3 jours. Pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie, la cornée est protégée par de la vaseline pendant toute cette étape. Concernant la douleur générée par l’application des filaments de Von Frey, nous respectons les recommandations de l'International Association for the Study of Pain (IASP). Nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour améliorer le bien-être des animaux après la chirurgie, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher avant la chirurgie. Après l’implantation de la canule, les animaux seront seuls dans une cage pour éviter de s’arracher les canules. Les rouleaux seront remplacés (risque d’arracher la canule) par des feuilles de sopalin blanc pour permettre aux animaux de faire un nid.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie à l'isoflurane, elles reçoivent des injections sous-cutanées dans les flancs ou intradermiques dans les oreilles de fragments de cellules sénescentes, puis sont tuées au dioxyde de carbone à 24, 48, 72 ou 168 heures pour prélever ganglions et sites d'injection. Le porteur n'attend qu'une réaction locale, rougeur ou gonflement, sans réponse systémique. Il affirme que cette réponse impliquant plusieurs organes est impossible à étudier in vitro et conclut que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

Dans notre groupe nous étudions la sénescence cellulaire. La sénescence est une destinée cellulaire. Elle se caractérise, entre autres, par la sécrétion de molécules spécifiques et un arrêt permanant du cycle cellulaire en réponse à des stimuli dommageables. De multiples études ont montré que les cellules sénescentes sont à l'origine du vieillissement et des maladies liées à l'âge, mais le mécanisme d’action reste inconnu. Une autre caractéristique observée dans les tissus vieillissants est l'inflammation chronique de bas bruit appelée inlamm’aging, de la contraction d’inflammation et âge. Lors de nos études, nous avons récemment découvert une nouvelle caractéristique de la sénescence que nous avons nommée fragmentation. Les cellules sénescentes génèrent des fragments et comme leur nom l’indique il s’agit de petits bouts qui se détachent des cellules. L’intégrité des fragments est maintenue jusqu’à trois jours après leur formation, après quoi ils se rompent et relarguent leur contenu. Leur rôle est pour le moment inconnu et nous cherchons à le comprendre. L’analyse du contenu des fragments a révélé la présence d’une grande majorité de molécules liées à l’inflammation. Les fragments sont donc potentiellement une source d’inflamm’aging et ils ne sont pas encore décrits dans la littérature scientifique. L’objectif principal de notre projet est de tester la capacité de ces fragments de cellules sénescentes à induire de l’inflammation ou en d’autres termes leur capacité à activer le système immunitaire. Dans cette expérience pilote, nous cherchons à trouver les conditions optimales pour mesurer l'effet des fragments sur l'activation de la réponse immunitaire locale dans un modèle de souris. Pour cela, nous isolerons des fragments et ferons des injections sous-cutanée ou intradermique des fragments et des contrôles appropriés. Nous évaluerons la réponse inflammatoire liée à ces injections à 4 temps différents et en utilisant des techniques communément utilisées en laboratoire telles que l’immunomarquage fluorescent (IF), l’analyse de cytométrie de flux (FACS) et la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR). La meilleure méthode sera sélectionnée pour de futures études des mécanismes des effets pro-inflammatoires des fragments sénescents.

Bénéfices attendus

La senescence est, entre autres, liée aux mécanismes de réparation tissulaire, au vieillissement et aux maladies liées à l’âge. Ce projet va nous permettre d’établir un modèle optimal d’étude des effets immunomodulateurs des fragments produits par les cellules sénescentes. En manipulant ce modèle nous pourront évaluer le caractère et l’intensité de la réponse immunitaire aux fragments. Ce modèle nous servira également à caractériser les mécanismes d’action des fragments et leurs interactions avec les cellules immunitaires.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections sous-cutanées ou intradermiques. Elles seront, au préalable, anesthésiées par inhalation d'isoflurane. La moitié d’entre elles sera soumise à une injection sous-cutanée dans chacun des flancs dorsaux (soit deux injections par souris) _ une injection de fragments d’un côté et une injection d’un contrôle de l’autre. L’autre moitié sera soumise à une injection intradermique dans chacune des oreilles (soit deux injections par souris) _ une injection de fragments d’un côté et une injection d’un contrôle de l’autre. La durée totale de la procédure est estimée à 10 minutes par animal. Aux temps suivants : 24h, 48h, 72h et 168h ; des groupes d’animaux de chaque condition expérimentale seront euthanasiés par exposition à des doses croissante de dioxyde de carbone et les tissus d’intérêts (sites d’injection, ganglions lymphatiques adéquats) seront disséqués pour les analyses ultérieures.

Impact sur les animaux

L’injection de fragments ou cellules syngéniques, c’est-à-dire génétiquement identique à la souris injectée, ne devrait pas déclencher de réponse immunitaire systémique. Au pire, il pourrait y avoir une réponse, locale et limitée, caractérisée par de l’infiltration des cellules immunitaires et de l’inflammation locale. Les effets secondaires qui seraient éventuellement liés à la piqure, tels que des rougeurs, gonflements ou automutilations au niveau du site d’injection seront surveillés pendant les trois jours suivant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à des moments bien précis selon un protocol autorisé, afin d'isoler les ganglions lymphatiques et le site d'injection pour des analyses supplémetaires.

Remplacement

La réponse du système immunitaire à la présence de fragments produits par les cellules sénescentes implique des interactions complexes entre différents organes et différents types cellulaires. Cette réponse complexe est impossible à étudier avec des modèles cellulaires in-vitro. Pour bien comprendre la dynamique de cette réponse immunitaire et les types cellulaires en jeu, l’utilisation d’un modèle in vivo est indispensable.

Réduction

Du fait de l’activation de la réponse immunitaire au niveau local uniquement, nous pouvons appliquer l’échantillon à tester et l’échantillon contrôle sur une même souris, réduisant ainsi de moitié le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Ainsi l’utilisation de 10 souris par conditions devrait être suffisante pour obtenir des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Les souris seront regroupées à plusieurs par cage afin de préserver les interactions sociales, avec un nid comme enrichissement de milieu. Les injections sous-cutanées et intradermiques se feront sous anesthésie gazeuse. Du gel ophtalmique sera appliqué durant tout le temps de l’anesthésie pour prévenir le dessèchement de la cornée. Après l’injection l’animal sera placé dans une cage chauffée à 37°C et surveillé jusqu’au réveil complet. D’une manière générale, l’état de la souris (apparence générale, comportement, posture, mouvements) sera surveillé durant toute la durée du protocole. Si un animal venait à présenter des signes de détresse, il serait soigné et retiré de l’étude. Dans un cas plus sévère, l’animal serait euthanasié.

Choix des espèces

Les systèmes immunitaires humain et murin présentent des similitudes, en termes d’immunité innée et acquise, qui rendent l’utilisation de la souris très appropriée pour cette étude. De plus les molécules des DAMP et leurs récepteurs sont très similaires entre la souris et l’humain. De même, les cellules murines et humaines sénescent de la même manière. Les animaux seront utilisés dès l'âge de 8 -12 semaines pour étudier la réponse immunitaire aux fragments sénescents à l'âge adulte. Nous avons choisi cette tranche d'âge, car à ce stade, le système immunitaire inné et adaptatif est suffisamment mature.