Recherche fondamentale

80 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe sous la peau des cellules cancéreuses humaines du pancréas sous anesthésie, puis on les soumet à un champ de pression mécanique une heure par jour, cinq jours par semaine pendant trois semaines. Le porteur indique un stress lié aux anesthésies répétées et une douleur modérée possible due à la croissance des tumeurs. Ce projet teste l'effet d'une pression mécanique sur des tumeurs pancréatiques, les retombées pour les patients étant annoncées à long terme, les souris étant tuées pour prélever les tissus cancéreux.

Objectifs

Le cancer du pancréas représente un problème de santé publique en occupant le deuxième rang des cancers digestifs en France. Ce cancer est très souvent de très mauvais pronostic et est diagnostiqué à un stade avancé avec un nombre de cas en constante augmentation. Il devrait être la deuxième cause de mortalité par cancer en Europe en 2030. Dans le but de développer de nouvelles pistes de traitement des cancers du pancréas de très mauvais pronostic, nous nous proposons d’étudier l’impact d’un champ de pression mécanique sur le développement de ces cancers. En effet, des études antérieures ont montré qu’un champ de pression mécanique inhibait la croissance des cellules cancéreuses pancréatiques en culture. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer les effets anti cancéreux d'une contrainte mécanique sur le développement du cancer du pancréas après greffe de cellules cancéreuses du pancréas humain chez la souris.

Bénéfices attendus

Compte tenu des échecs des différentes thérapies mises en œuvre dans le traitement du cancer du pancréas, nous nous dirigeons vers de nouvelles pistes thérapeutiques des cancers du pancréas. Les avancées au cours de ces dernières années sur les contraintes mécaniques appliquées aux tumeurs nous laissent envisager l’intérêt des champs de pression sur les tumeurs pancréatiques pour en inhiber sa progression. Les retombées attendues de ce projet seront de caractériser une nouvelle thérapie du cancer du pancréas et à plus long terme de soigner ce type de cancer chez l’homme.

Procédures

On réalise deux injections sous la peau de souris femelles adultes (1 injection sur chaque flanc de l'animal), de cellules cancéreuses humaines de pancréas, sous anesthésie. Les cellules vont s’implanter à l’endroit de l’injection et commencer à croître. Cette injection dure moins de 30 secondes. La taille des tumeurs va être suivie. Lorsque les tumeurs auront démarré leur croissance, les souris seront soumises à un champ de pression mécanique sous anesthésie gazeuse à raison de 1 heure, 5 jours par semaine et ce pendant 3 semaines. Les souris vont être suivies tous les jours et les points limites évalués chaque jour de traitement (5 jours par semaine). A l'issu du traitement, les souris vont être suivies et leurs tumeurs mesurées encore 2 semaines, période durant laquelle elles ne subiront pas de traitement. L’ensemble des souris sera alors évalué 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs, mesurées à l’aide d’un pied à coulisse, au cours du temps.

Impact sur les animaux

1) Un stress physique serait une nuisance induite par les anesthésies répétées et (2) une douleur modérée peut être engendrée par la croissance des tumeurs sous-cutanées. Les animaux ne subissent pas d'autres stress ou douleurs dans ce projet.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés et les tissus cancéreux seront prélevés pour analyses.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu de la complexité physiologique de la tumeur comprenant plusieurs types cellulaires impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant de travailler à l'échelle d'un organisme. Des études sur cellules en culture sont, par ailleurs, prévues pour étudier d’autres paramètres qui complèteront ce volet d’expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Chaque souris sera implantée avec des cellules cancéreuses aboutissant au développement d'une tumeur sur chaque flanc, ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre d'animaux qui entre dans l'expérience.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les animaux seront anesthésiés au moment de la greffe des cellules cancéreuses sous la peau. Au cours de l’expérience, une surveillance visuelle quotidienne et un suivi de l’état général des animaux (3 jours par semaine durant 3 semaines puis 3 fois par semaine durant les 2 semaines d’observation post traitement) seront réalisés. De plus nous avons établi une grille de score qui définit les actions à mettre en œuvre (administration d’analgésie en cas de douleur, euthanasie lorsque un point limite est atteint). Des conditions d’hébergement standard adaptées sont appliquées avec une alimentation standard sans limite de quantité. Enfin, un enrichissement composé de coton et de lanières cartonnées en accordéon sera proposé aux animaux afin qu’ils puissent se confectionner des nids.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser l’espèce souris dans notre projet de recherche car la physiologie du cancer du pancréas induit dans cette espèce animale est proche de celle chez l’Homme. Nous pourrons ainsi répondre aux questions que nous nous posons sur les effets d’un champ de pression mécanique sur le développement de ce type de cancer chez l’Homme. De plus, ce modèle apporte 2 autres avantages : sa taille et sa masse qui limite les quantités de traitement à administrer et le nombre extrêmement grand d'outils biologiques qui permettent la caractérisation des tissus cancéreux chez la souris. Les souris utilisées sont des femelles adultes pour que les animaux restent au même stade de développement tout au long de l’expérience. Nous avons privilégié des femelles pour limiter les conflits entre mâles hébergés dans une même cage.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux interventions chirurgicales au cerveau sous anesthésie, une restriction alimentaire pouvant durer sept jours et des injections cinq jours de suite, avant une tâche de mémoire récompensée par de la nourriture. Le porteur indique que la restriction alimentaire peut être stressante car elle empêche certains comportements naturels, comme cacher de la nourriture. L'objectif est de comprendre le fonctionnement d'une région du cerveau impliquée dans la mémoire, les bénéfices pour les maladies humaines restant renvoyés à d'autres projets de l'équipe.

Objectifs

L’objectif global de notre projet est de contribuer à la compréhension des processus d’encodage et de stockage des mémoires chez les mammifères. Plus spécifiquement, nous souhaitons étudier les mécanismes sous-jacents la formation de la mémoire à long terme dans une zone spécifique du cerveau. Cette zone de cerveau a été impliquée dans plusieurs maladies humaines. Une meilleure compréhension de son fonctionnement en conditions normales est nécessaire afin d’identifier et de comprendre les altérations, qui se manifestent en conditions ‘anormales’, telles queles maladies neuro-développementales ou neuro-dégénératives

Bénéfices attendus

La zone de cerveau ciblé par notre étude a été impliquée à plusieurs maladies humaines. Une meilleure compréhension de son fonctionnement en conditions normales est nécessaire afin d'identifier et de comprendre les altérations, qui se manifestent en conditions 'anormales', telles que les maladies touchant le système nerveux central. Les connaissances obtenues grâce à ce travail nous permettront de renseigner d'autres projets en cours dans l'équipe, explorant le rôle de cette région du cerveau dans les altérations pathophysiologiques présentent, par exemple, lors des maladies neuro-développementales ou neuro-dégénératives. La réorganisation structurelle des circuits neuronaux est également un domaine de recherche largement négligé par les études précliniques et notre travail apportera des nouvelles connaissances dans le domaine des mécanismes de plasticité.

Procédures

Les animaux sont nourris avec un régime alimentaire modifié. Ils subissent deux brèves interventions chirurgicales (< 45 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale nécessitant une motivation appétitive pour laquelle ils reçoivent une récompense nutritive. Cette tâche nécessite que la quantité de nourriture disponible soit limitée pendant 7 jours. Ils reçoivent également des injections pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent deux brèves interventions chirurgicales sous anesthésie. Cependant, grâce à l'utilisation appropriée d'analgésiques, d'outils et de matériels stériles, et à une surveillance et des soins post-chirurgicaux adaptés, les conséquences négatives pour les animaux sont minimisées. Une période de rétablissement (4-7 jours) est prévue avant toute autre manipulation. Les animaux sont soumis à une restriction alimentaire. Cela peut être stressant pour les souris car cela ne leur permet pas d'exprimer certains de leurs comportements naturels, comme cacher de la nourriture dans la cage. Pour compenser ce stress, nous manipulons les souris préalablement et nous essayons également de les nourrir à la même heure de la journée afin qu'elles apprennent à associer la présence de l'expérimentateur à l'apport de nourriture. En adaptant le programme d'entraînement, nous maintenons la période de restriction alimentaire aussi courte que possible (maximum 7 jours consécutifs). Le paradigme de la restriction alimentaire nous oblige également à loger les souris individuellement, afin d'éviter la compétition pour la nourriture et l'agression entre congénères. Pour pallier cette contrainte, nous maintenons les souris en hébergement collectif le plus longtemps possible avant cette étape. Nous augmentons la quantité de matériel disponible pour la construction du nid et nous augmentons l'enrichissement en manipulant les souris avant l'expérience. Tout au long des expériences, les souris sont nourries avec un régime spécial (sans effets délétères pour l'animal). Elles reçoivent également des injections intrapéritonéales, qui provoquent un léger inconfort. Pour atténuer les conséquences de cette injection répétée, nous utilisons des aiguilles de très petite taille, ce qui minimise l'inconfort pour l'animal. La solution injectée elle-même n'a aucune conséquence négative pour l'animal. Toutes les manipulations sont effectuées par un expérimentateur formé et compétent ayant plus de 8 ans d'expérience dans la manipulation des animaux.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet porte sur l’étude des mécanismes sous-jacents la formation et stockage de la mémoire dans une zone spécifique de cerveau. Pour mener notre étude, nous aurions besoin d’un modèle : i) complexe et intacte, ii) adapté à la réalisation des tests cognitifs, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) disposé facilement à la modification de son génome, v) possédant la structure cérébrale ciblée, vi) adapté aux approches expérimentales invasive. Conformément à la Directive Européenne et au principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer des approches alternatives lorsque cela était possible. A notre connaissance, seuls les modèles de mammifères, notamment les souris, répondent à l'ensemble de ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et ne sont donc pas adaptés à l'objectif de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones associés au stockage de la mémoire et les analyses de connectivité possibles au niveau clinique n'ont pas la résolution nécessaire pour répondre à la question scientifique posée. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas de modéliser le cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, l'utilisation d'animaux est malheureusement nécessaire.

Réduction

Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : selon les caractéristiques de nos données nous appliquons les tests statistiques appropriés à notre question scientifique et à nos données.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant et après chaque manipulation/étape) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Intervention immédiate et appropriée (en cas de besoin) - mesures conservatoires à privilégier. iv) Raffinement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques (pré- et post-op) pour chaque procédure chirurgicale v) Application de soins préventifs après la chirurgie; stratégie de nursing si nécessaire vi) Manipulation quotidienne des animaux avant les sessions comportementales pour réduire le niveau de stress lié à l'interaction avec l'expérimentateur vii) Optimisation de notre tâche comportementale pour minimiser la durée de la restriction alimentaire viii) Entraînement progressif de l'animal (séances d'habituation) intégré à la tâche afin de minimiser le stresse ix) Utilisation d’aiguilles de petite taille pour minimiser l'inconfort associé à l'injection i.p. x) Utilisation, dans la mesure du possible, de méthodes non invasives (par exemple, l'administration dans la nourriture) pour l'administration des médicaments afin d'éviter les contraintes associées aux autres méthodes d'administration. xi) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs proposants les méthodes de raffinement. xii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus le plus longtemps possible dans des cages collectives.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquant, par exemple, le marquage permanent des cellules activées lors de l’apprentissage, ou l'expression d'une sonde calcique. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier le génome et pour laquelle les modèles créés ont été caracterisés au niveau comportemental et moléculaire. Le choix d'utiliser la souris est également motivé par nos données précédentes et la disponibilité de paradigmes expérimentaux déjà élaborés qui garantissent le succès de notre étude.

390 lapins et poules vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections destinées à leur faire produire des anticorps, puis des prélèvements sanguins répétés, avant d'être mis à mort pour récupérer la quasi-totalité de leur sang. Le porteur décrit des réactions locales possibles, gonflement ou abcès, et générales, fièvre, perte de poids, baisse d'activité. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est assez efficace, écartant la production d'anticorps par criblage de phages jugée "décevante" malgré son existence depuis 1990.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de poules et lapins. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic… Ce projet respecte la réglementation relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques en vigueur.

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements, possibilité d'observation chez les animaux de réactions locales (gonflement, abcès...) et/ou générales (augmentation température, perte de poids, diminution de l'activité...) après les administrations.

Devenir

Les animaux inclus dans ces études seront mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité du volume sanguin circulant selon les besoins et surtout de respecter le principe de précaution.

Remplacement

La production d'anticorps (AC) polyclonaux nécessite 1 immunisation de l'animal dans le cadre de ce projet. Il n'existe actuellement aucune méthode substitutive assez efficace pour répondre aux objectifs du projet. Une nouvelle approche a été publiée en 1990 pour le développement d'AC par un système de criblage de collection de phage qui ne nécessite pas l'immunisation d'animaux, mais les résultats restent très décevants. En effet, depuis 1990, aucun anticorps n'est utilisé en thérapie ou en diagnostic clinique malgré un certain nombre de publications scientifiques utilisant cette technologie. Seuls 1 AC anti-TNFα et plus récemment des AC neutralisants du SARS-Cov-2 ont été développés à partir de collection de donneurs humains dont les derniers sont des donneurs ayant été en contact avec le virus, donc immunisés. A ce jour, l'alternative aux immunisations animales consiste à développer des AC synthétiques à partir de banques ou "Library" synthétique pour le criblage d'un nombre important de fragments de molécules ("binders"), ayant une bonne interaction avec l'antigène. Ces fragments sont plus petits que les AC et peuvent réagir avec une certaine affinité avec l'antigène mais aussi tout autre antigène ayant une structure proche de celle recherchée. Ces réactions croisées sont, parmi d’autres inconvénients, souvent rencontrées par cette approche synthétique. Un autre inconvénient majeur, est que le fragment ne reconnait qu’1 seul épitope (partie d'une molécule capable de stimuler la production d'un anticorps), alors qu’un sérum polyclonal est multi-épitope, ce qui permet d’augmenter la sensibilité de la détection et aussi faciliter son développement dans le temps. Tous les AC synthétiques développés et publiés à ce jour sont dirigés contre des protéines recombinantes qui ont été utilisées pendant les étapes de criblage. Leur utilisation est très limitée et ne dépasse pas l’étape de résultats préliminaires, puisqu’ils ne reconnaissent pas les protéines endogènes (élaborées par l'organisme) qui ont des structures natives et conformationelles. Les AC synthétiques ne reconnaissent pas certaines modifications des protéines qui leur donnent telle ou telle fonction biologique. C'est pourquoi la majorité de ces anticorps n'est pas utilisée par la communauté scientifique qui continue de travailler et publier avec les anticorps conventionnels. L'approche de criblage par phage est testée en parallèle pour comparer les performances et valider ou non cette alternative.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum. Entre 2 et 6 animaux (poule ou lapin) seront inclus par étude. Le nombre sera choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Pour les poules, un nombre de 8 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 240 poules sur 5 ans (calcul à partir de 6 poules par étude). Pour les lapins, un nombre de 5 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 150 lapins sur 5 ans (calcul à partir de 6 lapins par étude). La réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sera respectée.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : lapins = bois à ronger, foin/paille, de quoi grimper et se cacher... ; poule = perchoir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et un enrichissement compensatoire. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce particulièrement immunoréactive, permettant ainsi d’obtenir un sérum disposant d’une concentration importante en anticorps, avec des anticorps de forte affinité. En plus de leur immunoréactivité importante, les poules disposent d’anticorps spécifiques, les immunoglobulines Y, notamment extraits à partir du jaune d’oeuf. Ainsi, l’immunisation de poules permet de contrôler facilement le taux d’anticorps en limitant la contrainte imposée aux animaux. De plus, il existe des différences de séquences entre la partie constante des immunoglobulines Y et des immunoglobulines G. L’utilisation d’immunoglobulines Y permet ainsi de réduire le bruit de fond, les réactions croisées et les signaux aspécifiques. Les anticorps de poules sont également une alternative aux anticorps de lapin pour les expériences nécessitant des anticorps provenant de plusieurs hôtes différents. Le choix de l’espèce se fera donc en fonction de l’utilisation prévue des anticorps. Les lapins seront âgés de 6 semaines à 2 ans environ et les poules d'1 jour à 2 ans environ, car c’est à ces stades qu’ils sont entièrement immunocompétents.

3 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier par IRMf le codage des transformations somatomotrices. Chaque animal est habitué sur plusieurs mois à la sortie de cage et aux tâches, subit une chirurgie possible sous anesthésie et des injections d'un agent de contraste à base d'oxyde de fer, avec restriction hydrique et contention. Le porteur reconnaît un stress lié à l'immobilité et au bruit de la machine, et un risque de troubles hépatiques dû au fer. Il présente le primate non-humain comme "essentiel", modèle le plus proche de l'humain, et prévoit de réutiliser ces animaux plutôt que de les tuer.

Objectifs

Au quotidien, nous intégrons plusieurs modalités sensorielles afin d’interagir de façon flexible avec l’environnement. Par exemple, la coordination des informations visuelles, proprioceptives et tactiles nous permet d’attraper précisément une tasse sur une table. La transformation de l’information visuelle en mouvement de la main a été largement étudiée en laissant de côté le rôle de l’information tactile dans la planification de l’action, de ce fait nos connaissances sur cet aspect sont restreintes. Pour frapper, de nuit, un moustique posé sur notre main avec notre autre main, notre cerveau a besoin de guider le mouvement de notre main non pas quelque part à l’extérieur du corps, mais quelque part sur le corps. Cette transformation est complexe car notre corps peut prendre de multiples configurations : debout, assis, bras croisés etc. Le traitement tactile-moteur prend très probablement place dans le cortex postérieur pariétal (CPP). Cependant, les régions cérébrales précises ainsi que les mécanismes responsables demeurent méconnus. Notre projet a pour objectif d’identifier, par imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), les régions cérébrales impliquées dans l’organisation de mouvements vers le corps et d’élucider les mécanismes cérébraux sous-jacents. Pour ce faire, des macaques exécuterons des mouvements oculaires vers un endroit sur les mains défini soit par des cibles visuelles placées près des mains, soit par des cibles tactiles sur les mains. Les mains seront tantôt croisées tantôt décroisées passivement grâce à un moteur tactile. La comparaison des activations cérébrales lorsque les mouvements des yeux sont dirigés vers une information visuelle ou vers une information tactile, placées sur des mains croisées ou non croisées, nous permettra de répondre aux questions suivantes : Comment est-ce que la planification des mouvements de yeux change en fonction de la position de la main par rapport au corps ? Comment est-ce que la planification du mouvement des yeux change en fonction de la nature de l’information qui guide ce mouvement, visuelle ou tactile ? Cette étude s’inscrit dans une perspective comparative, puisque les mêmes expérimentations sont réalisées chez l’humain, dans l’objectif de comparer les fonctions du cortex pariétal humain et du primate non-humain, dans le contexte de la préparation de mouvements vers le corps.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral du processus de transformations somato-motrices. Grâce à ce projet, nous serons en mesure de décrire plus précisément les aires cérébrales impliquées ainsi que leur dynamique de fonctionnement. Ce projet permettra également une comparaison entre l’humain et le macaque et ainsi d’expliquer des différences évolutives entre ces deux espèces proches. Cette comparaison est rendue possible grâce à l’utilisation de l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle chez des sujets éveillés chez ces espèces, permettant ainsi la comparaison directe entre les activations cérébrales obtenues. Ces questions relèvent clairement du domaine des neurosciences fondamentales, et notre principale ambition est de mieux comprendre comment le cerveau met en œuvre ces fonctions cognitives chez l'homme et les primates non humains. Cependant, nous pensons que les réponses que nous apporterons pourront alimenter de nombreux domaines des sciences appliquées, des neurosciences cliniques, des sciences vétérinaires à l'intelligence artificielle.

Procédures

Habituation à la sortie de cage (3 mois) ; 1 Chirurgie potentielle sur un animal maximum, sous anesthésie générale (3h) ; Habituation aux tâche comportementales (6 mois); Habituation à l’injection d’agent de contraste (2 mois) comprenant 1 injection vigile (injections: 5s à 10s); Campagnes d’acquisitions IRMf vigile comprenant (3 semaines, 1 session par jour, maximum de 3 campagnes d’acquisition par an): 1 injection pour chaque session (injections: 5s à 10s), 3 prélèvements sanguins pour chaque campagne d’acquisitions IRM pour contrôler les niveaux de fer circulants (prélèvement: 10s à 15s). La procédure dans son ensemble est considérée comme modérée.

Impact sur les animaux

L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. Les animaux peuvent toutefois subir un stress de par l’immobilité imposée ainsi que de par le bruit important généré par la machine. La restriction hydrique peut s’avérer stressante. La tâche implique le déplacement passif des bras dans un système de contention. Des injections de produit de contraste seront effectuées en vigile. Ce produit de contraste est un oxyde de fer supra-magnétique, qui peut induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives. Les animaux ayant un plot implanté seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches IRMf. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques. Si la décision est prise d’une sortie de protocole, le plot de tête sera désimplanté. A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes pourront être réutilisés pour une autre étude, ou un replacement dans un sanctuaire sera envisagé. En dernier recours, si aucune solution alternative n’est possible, les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude de recherche fondamentale et comparative, utilisant des approches d’imagerie IRMf. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables (approche évolutive) transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, le projet scientifique porte spécifiquement sur la comparaison des fonctions cognitives chez l’homme et le macaque. A terme, cela permettra donc de préciser les circonstances expérimentales et cliniques dans lesquelles le macaque peut être utilisé comme un modèle de la cognition humaine, et les conditions où il ne le peut pas.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations. Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 3 animaux dans le protocole (2 en réutilisation et un en nouvelle inclusion). Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=2) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques comportementales avec des méthodes d’imagerie chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=1). Tous les protocoles seront lancés sur les mêmes animaux ce qui nous permettra de comparer différentes acquisitions sur les mêmes sujets et ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les animaux en réutilisation, pour cette étude, suite à des recherches peu invasives, sont déjà entrainés à l’IRM et hébergé dans le laboratoire. Cette réutilisation est d’autant plus importante que ces animaux doivent être entraînés sur une longue durée de temps, avec renforcement positif, pour arriver à un comportement stable, avant de pouvoir passer à la phase de collecte de données. Nous prévoyons de lancer 9 campagnes d’acquisitions par animal (15 sessions par animal, chaque session incluant de 2 à 15 scans en fonction de la motivation des animaux).

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bienêtre des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. L’implantation du plot, réalisée chirurgicalement sera réalisée avec les meilleures techniques d’asepsie possible, par un neurochirurgien, afin de réduire le risque d’infection ou de désimplantation. En dehors des sessions d’imagerie qui seront réduites le plus possible sans compromettre les résultats scientifiques, les animaux seront hébergés dans un environnement social, incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement (selon un protocole défini en SBEA et implémenté par les chercheurs et les techniciens animaliers). Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire. Une sortie de cage vers la chaise sans canne est également à l’étude dans notre structure. De plus, la mise en place de points limites précoces nous permettra un suivi régulier du stress des animaux.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Cette étude s’intéresse à des mécanismes neurobiologiques chez le macaque pour des raisons de connaissance fondamentale. - Phylogénétiquement, ce modèle animal est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle la rendant notamment plus « facilement » comparable pour des études évolutives - Cette étude s’inscrit explicitement dans une perspective comparative entre espèces, la comparaison homme macaque étant un point clé de cette étude. En plus des connaissances fondamentales générées cela va permettre de préciser l’opportunité d’utiliser le macaque comme un modèle de la cognitive humaine et de ses dysfonctions. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes du point de vue des neurosciences fondamentales. -Toutes informations physiologiques ou physiopathologiques obtenues chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. « Les deux animaux réutilisés sont des animaux matures. Les animaux reçus de nos fournisseurs sont de jeunes adultes (3.5-4 ans). Ils arrivent généralement déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. L’étude portant sur des sujets adultes, les variations de maturation ou de vieillissement au sein de cette tranche d’âge restes minimes et ne devrait pas engendrer de variations significatives des réponses neuronales dans les taches étudiées. A terme, des analyses portant sur un possible effet âge sur les traitements cognitifs qui nous intéressent pourront être entreprises à plus large échelle.

405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection induisant un cancer mammaire, jusqu'à trois examens d'imagerie sous anesthésie, une injection de sonde et un prélèvement de sang terminal avant la mise à mort. Le porteur indique n'avoir observé aucun effet indésirable notable au cours de deux années d'études antérieures et suit les tumeurs au pied à coulisse. Il présente la validation in vivo de ces agents de contraste comme "primordiale" et "indispensable", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la dissémination métastatique.

Objectifs

Depuis 2 ans, les études de notre client, menées dans le projet autorisé sur la « validation in vivo de nouveaux agents de contraste spécifiques pour la netrin-1, potentiel biomarqueur du cancer mammaire métastatique », ont démontré des résultats prometteurs in vitro e in vivo. La suite des études a permis la conception d’autres agents de contraste pour le même biomarqueur (nétrine-1), ainsi que l’identification d’autres biomarqueurs pour lesquels notre client a cependant conçu des sondes d’imagerie, qui ont été synthétisées et testés in vitro. Notre client souhaiterait pouvoir les étudier in vivo, sur des souris témoin ainsi que des souris porteuses de tumeur mammaire. Pour cette nouvelle demande, il s’agit de pouvoir effectuer le même type de procédures autorisés que dans le projet précédent, mais, cette fois, concerne l’étude de plusieurs biomarqueurs, en utilisant des sondes d’imagerie de petite taille, à administrer par voie intraveineuse.

Bénéfices attendus

L’imagerie moléculaire, notamment le ciblage de biomarqueurs spécifiques, représente une alternative de choix pour une détection précoce de cancer étant donné que les changements physiologiques apparaissent bien avant les changements morphologiques que ces biomarqueurs engendrent et doit permettre un diagnostic précoce. Les études in vitro réalisées au préalable démontrent une affinité ou une réponse au biomarqueur de choix pour certaines des sondes développées par notre client et leur validation in vivo sur des modèles de cancer est primordiale.

Procédures

Induction de cancer mammaire : 1 injection par animal 5 minutes maximum sous anesthésie générale gazeuse. Suivi par imagerie : au maximum 3 examens non invasifs sur 24h avec 1 délai d'1h minimum entre 2 examens sous anesthésie générale. Administration de la sonde 1 seule injection par voie intraveineuse sur souris vigile. Prélèvement de sang sur animal anesthésié volume de 400μL puis mise à mort. Mesure de la tumeur au pied à coulisse: sur animal vigile, 2 minutes, 1 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Concernant la mise en place du modèle de cancer mammaire, les dommages attendus sont liés au développement d’une tumeur et nous mettrons en place un suivi ainsi que des points limites pertinents permettant d’anticiper toute douleur ou stress qui pourrait être provoqué chez l’animal. La douleur infligée par l’injection des cellules et réactifs pour l'imagerie, elle, correspond à celle d’une piqûre d’aiguille. Après ces 2 ans d’études, nous n’avons pas remarqué d’effets indésirables ou nuisances dues au développement tumoral ni à l’administration des sondes. La cinétique par imagerie scintigraphique 3D ainsi que la biodistribution ex vivo ont été réalisées 10 jours post induction. A ce stade, les tumeurs sont

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, ce projet vise à vérifier le ciblage spécifique d’un agent de contraste vers la tumeur ; et de comprendre la biodistribution de ces agents de contraste parmi les différents organes, ce qui n’est possible qu’en utilisant un animal vivant. Pour ces raisons l’utilisation du modèle animal souris est fondamental, puisque l’étude préclinique en particulier ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour chacune des sondes, pour chaque procédure et à chacun des 6 souris sont induites avec des cellules 4T1 en intramamaire. Nous en sélectionnons 3 sur les 6 de taille de tumeur identique pour effectuer les examens. L’analyse statistique sera effectuée avec le logiciel GraphPad PRISM V7 pour comparer les lots expérimentaux. Etant donné le nombre réduit de souris par lot, des tests Mann-Whitney non paramétriques avec correction de Welch seront utilisés pour déterminer les différences entre chaque lot change selon la distribution des échantillons, et le test de Kruskal-Wallis non paramétrique suivi par un post-test de Dunns ou Tukeys de comparaison de groupes multiples.

Raffinement

Les animaux seront observés scrupuleusement et des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. Les études réalisées depuis 2 ans ont montré très peu de souffrance des animaux. Les points limites n’ont jamais été atteints (pas de perte de poids observée, pas de tumeur >200mm3, pas de nécrose sévère des tumeurs mammaires. De plus, durant les examens d'imagerie et l'induction du modèle tumoral, les souris seront anesthésiées. Enfin, les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du celluron. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. La lignée de cellules 4T1 est une lignée d'origine murine. Elle est classiquement administrée au laboratoire sur la lignée de souris BALB/c By. Le fournisseur de la lignée cellulaire (ATCC) indique qu'elle provient de souris BALB/c By (Aslakson CJ, Miller FR. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52: 1399-1405, 1992). Un lot de souris BALB/c By témoin sera aussi étudié. 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.

4 000 souris, rats et hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une chirurgie de pose de cathéter vasculaire ou non vasculaire, jusqu'à 45 minutes, suivie d'un hébergement individuel de deux à six jours. Le porteur reconnaît une douleur pendant et après la chirurgie et un inconfort lié à l'isolement. Il présente cette prestation comme préparant des rongeurs cathétérisés expédiés vers d'autres laboratoires, et décrit l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'homme.

Objectifs

Les rongeurs sont les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux dans les domaines tels que l'oncologie, les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, etc. Ce projet a pour but d’avoir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans des études expérimentales. Plusieurs prestations sont réalisées chaque année sur rats, souris et hamsters concernant l'implantation de cathéters (vasculaire : 400/an et non vasculaire : 400/an).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, le projet diminue le stress car il évite les appareils de contention, allège et diminue la contention manuelle. Il empèche également la douleur provoquée par des injections ou des prélèvements, unique ou répétés.

Procédures

Chaque animal subira sous anesthésie, une chirurgie de pose de cathtéter(s) vasculaire ou/et non vasculaire, pour une durée maximum de 45 minutes. Suite à la chirurgie, l'animal sera hébergé individuellement, pour une durée comprise entre 2 et 6 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie, celle en post-opératoire, et également l'hébergement en individuel, pouvant générer inconfort et stress.

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales.

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins suivant les éléments cibles de l'organisme. Les animaux commenceront le projet à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimun) et devront peser au moins 100 g (pour les rats), 20 g (pour les souris) et 60 g pour les hamsters. L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet.