Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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- Système immunitaire
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- Système urogénital
Etude des effets de la progastrine sur le développement des métastases dans le cancer colorectal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour étudier le rôle d'une protéine dans les métastases du cancer colorectal, 1 148 souris vont être utilisées, 1 042 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 106 opérées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des injections répétées de molécules, subissent une chirurgie et des prélèvements sanguins, la formation de métastases pouvant induire un mal-être ou des souffrances de l'aveu du porteur. Les organes d'intérêt sont récupérés après la mise à mort pour analyse histologique. Le porteur écarte les modèles in vitro au motif qu'aucun ne reproduit la formation de métastases dans les organes.
Objectifs
Le cancer colorectal, troisième cancer le plus fréquent en France, se propage au foie ou au poumon (métastases) dans 15 % des cas, ce qui aggrave considérablement le pronostic des patients. Une molécule appelée progastrine, présente en grande quantité dans leur sang, favorise la croissance de la tumeur initiale, mais son rôle dans la formation des métastases reste inconnu. Ce projet vise à démontrer que la progastrine pourrait faciliter la survie de certaines cellules immunitaires (neutrophiles) et ainsi favoriser l’apparition de métastases au foie et aux poumons. Pour cela, des expériences sur des souris permettront d’abord d’identifier les mécanismes cellulaires puis de tester si le blocage de la progastrine réduit effectivement la formation de métastases. Ces recherches, essentielles pour développer de nouveaux traitements, justifient l’utilisation de modèles animaux, dans le strict respect des règles éthiques et de bien-être animal.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont d’ordre translationnel (applicable en clinique) puisque ce projet permettra de mettre en évidence la progastrine comme une nouvelle cible thérapeutique afin de bloquer la formation de métastases hépatiques et/ou pulmonaires chez les patients atteints de cancer colorectal avancé de mauvais pronostic. A court terme, ce projet nous permettra de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles thérapies pour traiter les patients et améliorer leur espérance de vie.
Procédures
Pour la première procédure, les animaux auront une injection d’anesthésique/analgésique (1 injection/animal, 10sec). Pour la deuxième et la troisième procédure : Les animaux auront des injections en intra-péritonéale de molécules 48h avant la chirurgie (1 injection/souris, 10sec), des injections en intra-péritonéale de molécules 24h avant la chirurgie (1 injection/souris, 10sec), tous les jours la première semaine après la chirurgie (1 injection /souris, 10sec) puis tous les 3 jours pendant 3 semaines (1 injection/souris, 10sec). Une chirurgie avec couverture analgésique sur 48h (2 injections par jour), injections d’anti-inflammatoires sur les deux jours suivants (2 fois par jour). Deux prélèvements sanguins espacés de deux semaines après la chirurgie. Une injection d’anesthésique/analgésique léthale (1 injection/animal, 10sec)
Impact sur les animaux
Les injections peuvent générer du stress à la manipulation et une légère et rapide douleur au site d’injection. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales et/ou de l’inconfort au réveil, pris en charge par des analgésiques. La formation de métastases peut induire un mal-être ou des souffrances. La collecte de sang sous anesthésie peut induire un léger inconfort localisé au réveil. Une infection oculaire peut apparaître.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les organes d’intérêts seront récupérés pour une analyse histologique post mortem.
Remplacement
L’objectif 1 de notre projet utilise les cellules immunitaires issues du sang frais de souris car il n’y a aucune lignée cellulaire qui peut les remplacer. Aussi, pour l’objectif 2, il n’y a aucun modèle in vitro qui permet l’étude de la formation de métastases dans les organes périphériques. Nous avons donc recours aux modèles métastatiques chez la souris.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaires en utilisant les données préliminaires.
Raffinement
En plus des bonnes conditions d'hébergement, nous éviterons les animaux isolés et si un mâle doit être isolé, une femelle de compagnie âgée sera rajoutée dans la cage. Les souris seront préalablement acclimatées aux manipulations et à l’induction anesthésique afin de limiter les réactions de stress. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Pour la chirurgie abdominale (procédure 2), les animaux seront habitués au chirurgien pendant quelques jours avant la chirurgie et des conditions d'asepsies seront rigoureusement appliquées pour éviter la perte d'animaux due à des infections post-chirurgies. Les prises en charge avant les chirurgies sont une analgésie locale, une analgésie générale et un traitement anti-inflammatoire. Après la chirurgie, les animaux recevront pendant 2j consécutifs un analgésique et un anti-inflammatoire. Les prélèvements sanguins seront réalisés selon des modalités visant à minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Chaque prélèvement sera effectué sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, permettant une induction et un réveil rapides, et réduisant la contrainte liée à l’immobilisation. Les volumes prélevés respecteront strictement les recommandations en vigueur pour des prélèvements répétés sur une période de quatre semaines, avec un espacement adéquat entre les prélèvements afin de préserver l’état physiologique des animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive après chaque procédure (comportement, reprise de l’activité, état général), et tout signe de mal être conduira à une prise en charge adaptée ou à la mise à mort.
Choix des espèces
Les souris présentent l’avantage d’être un très bon modèle pour l'étude des métastases hépatiques et pulmonaires. Les modèles sont bien établis et décrits dans la littérature et les cellules tumorales sont du même statut génétique, il n’y a donc pas de rejet et le système immunitaire peut donc être étudié. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 15 semaines, lorsque le système digestif est à maturité.
Effets individuels et combinés des checkpoints immunitaires sur les réponses neuroinflammatoires des lymphocytes T
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rendues paralysées par l'induction d'une encéphalomyélite auto-immune, 3 180 souris vont être utilisées comme modèle de sclérose en plaques, 2 460 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 720 opérées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des injections par voies rétro-orbitale, intradermique, intrapéritonéale et intracardiaque, et développent une dégradation de l'état général avec déshydratation, dénutrition et paralysie. Le porteur indique que les animaux ne peuvent être ni réutilisés ni adoptés du fait de la maladie induite, ce qui justifie leur mise à mort. Une partie des corps sert ensuite à des prélèvements d'organes pour des analyses complémentaires.
Objectifs
Les lymphocytes T sont des cellules clés de notre système immunitaire, mais lorsqu’ils sont mal régulés, ils peuvent attaquer nos propres tissus et provoquer des maladies auto-immunes. Ces cellules sont contrôlées par des « points de contrôle immunitaires » qui agissent comme des freins pour limiter leur activité. La sclérose en plaques est une maladie auto-immune du système nerveux central, touchant environ 2,8 millions de personnes dans le monde, où des lymphocytes T hyperactifs provoquent inflammation et destruction des neurones. Nous étudions deux points de contrôle immunitaires identifiés comme régulateurs de cette maladie dans des modèles animaux, qui permettent de reproduire rapidement la progression de la maladie et de tester de nouvelles interventions plus efficacement que chez l’humain. Ce projet vise à comprendre comment ces récepteurs modulent l’activité des lymphocytes T, en étudiant les effets de leur absence, seule ou combinée, sur l’évolution de la maladie et le comportement de ces cellules. Ces travaux devraient apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes fondamentaux des maladies auto-immunes et orienter le développement de thérapies ciblées.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de mieux comprendre les fonctions et mécanismes d’action des points de contrôle immunitaires BTLA et PD1 dans la régulation des pathologies auto-immunes du système nerveux central. Ce projet vise également à découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de pathologie telle que la Sclérose en Plaques. Les connaissances générées par ce projet pourront être transposées à d’autres contextes de maladies auto-immunes.
Procédures
1 – Injection rétro-orbitale. Injection par voie rétro-orbitaire à J0 et J2, 4-5 secondes/injection. Les animaux seront anesthésiés par isoflurane pendant 30 secondes. 2 – Injection intradermique. Injection par voie intradermique à la base de la queue à J0, 10-15 secondes/injection.Les animaux seront anesthésiés par isoflurane pendant 30 secondes. 3 – Injection intrapéritonéale Injection par voie intrapéritonéale, 4-5 secondes/injection. 4 – Injection intracardiaque Injection par voie intracardiaque, 30-45 secondes/injection. Les animaux seront anesthésiés avec une injection de kétamine/xylasine par voie intrapéritonéale (4-5 secondes/injection)
Impact sur les animaux
L’injection d’anticorps déplétants (anti LT CD8) par voie intra-péritonéale peut engendrer une douleur liée à la piqûre, ainsi qu’un stress dû à la contention (animaux vigiles), sur une durée de 10 secondes. Le développement de l’EAE entraîne une altération de l’état général des souris (déshydratation, dénutrition, anémie, perte de poids) ainsi qu’une paralysie. Les souris sont suivies quotidiennement et évaluées selon la grille de scoring clinique.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être éthiquement réutilisées, remplacées ou adoptées, du fait de l’induction de l'EAE. Toutefois, une partie des souris mises à mort permettra d’effectuer des prélèvements d’organes post-mortem, et ainsi mener des expériences ex vivo en plus des données pré-cliniques qu’elles fourniront.
Remplacement
L’étude des réponses cellulaires impliquées dans la physiopathologie de la sclérose en plaque nécessite l’utilisation du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) permettant d’intégrer à la fois activation, différenciation immunitaire, migration cellulaire, migration et activation dans le système nerveux central. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes alternatives à ce modèle permettant l’obtention de résultats scientifiques exploitables et se rapprochant au maximum des réponses cellulaires attendues chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet a été déterminé en se basant sur l’expérience de l’équipe mais également sur la base des connaissances issues d’études publiées dans des journaux de références et utilisant le modèle d’EAE. Le nombre de 10 souris par groupe pour l’étude clinique et 10 souris par groupe pour l’étude phénotypique devrait nous permettre d’obtenir des résultats robustes en termes de statistique. Etant donné que nos modèles sont susceptibles d’exacerber la sévérité de la maladie, des groupes restreints d’animaux seront initialement utilisés pour la mise au point et l’optimisation des différents protocoles expérimentaux, visant à induire des maladies de différente sévérité. Cette approche permettra alors la validation des différents protocoles et le renforcement de nos différentes procédures. Ces protocoles optimisés seront ensuite appliqués à l’ensemble des expérimentations, limitant ainsi les répétitions supplémentaires (sur un grand nombre d’animaux) pouvant être liées à des problèmes méthodologiques. Tout ceci contribue donc à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
En arrivant au service de zootechnie d’expérimentation, les souris sont soumises à une semaine d’acclimatation sans manipulation par l’utilisateur. Une deuxième semaine d’acclimatation aux manipulateurs et aux gestes de manipulation est ensuite mise en place. Cette deuxième semaine d’acclimatation permet de réduire le stress au cours de l’expérimentation. Quatre types d’enrichissements sont ajoutés aux cages des animaux (igloo, sisal, batonnet bois, coton). Comme indiqué précédemment, les modèles d’animaux que nous utilisons sont susceptibles de développer des pathologies sévères. L’utilisation de souris visant à l’optimisation de nos protocoles expérimentaux nous permettra de moduler la sévérité de la maladie et ainsi de limiter au maximum la souffrance des animaux immunisés.
Choix des espèces
Le modèle d’étude choisi est le modèle murin, dont la physiologie, notamment du point de vue du système immunitaire, permet la transposabilité des résultats précliniques à la médecine humaine. Les souris seront incluses en procédure à partir de l’âge de 7 semaines, à partir duquel leur système immunitaire est considéré comme mature.
MODIFICATION : Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Immunodéprimées puis dotées d'un système immunitaire humain, 14 400 souris vont être utilisées pour produire un modèle dit humanisé, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une irradiation, des greffes de tumeurs ou de tissus humains, des infections par le VIH ou d'autres pathogènes, et jusqu'à huit prélèvements ou injections chacune. Leur immunodéficience les rend très sensibles aux infections, et l'irradiation peut provoquer des tumeurs. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non humain, jusque-là "modèle de choix" pour ces études.
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines telles que le VIH (virus de l'Immunodéficience humaine) et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité anti-infectieuse ou anti-tumorale et/ou leur impact sur le système immunitaire humain et/ou d’autres tissus humains.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie luminescente intravitale (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois) - greffe de tissus humain (1 par animal, durée 20min)
Impact sur les animaux
Du fait de leur degré d’immunodéficience et après infection par le VIH, ces animaux sont très sensibles aux infections. Après irradiation certaines souris transgéniques peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. De potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection hydrodynamique. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort. Après injection cellules tumorales humaines les souris développeront des tumeurs.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain(HIS), générés dans la procédure « génération de souris HIS » pourront être inclus dans des procédures permettant de stimuler les cellules immunitaires humaines et/ou de valider l’activité d’immuno-modulateurs. Les souris HIS dont la population de cellules immunitaires aura été augmentée, pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme dans les procédures permettant de greffer des tumeurs ou des tissus humains et/ou d’infecter les souris par des pathogènes afin d’étudier in vivo la réponse immunitaire humaine contre des pathogènes humains ou des tumeurs humaines. Ces animaux pourront également être inclus dans la procédure permettant de valider l’activité d’immuno-modulateurs ou dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet. Certaines souris issues de la procédure « génération de souris HIS » pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris HIS issues de la procédure permettant de valider, dans ce modèle de souris, l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort par analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
MODIFICATION texte en majuscules Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 938 souris (75SOURIS/UTILISATEUR X10UTILISATEURS X1.25 car la greffe ne prend que dans 80% de cas) par an soit un total de 4690 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme. 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé en moyenne à 10 par an. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an). LE BESOIN DE NOS UTILISATEURS EN SOURIS IMMUNODEFICIENTES A 840 CHAQUE ANNEE, EST DE 4200 SUR 5 ANS EN TENANT COMPTE DE 1. NOMBRE D’OPERATEURS DE LA PLATEFORME. 2. NOMBRE D’UTILISATEURS INTERESSES PAR LES MODELES ESTIME A 8 PAR AN. 3. CE QUE LA PLATEFORME FOURNIRA 105 SOURIS IMMUNODEFICIENTES PAR UTILISATEUR ET PAR AN (15 POUR ETUDE PILOTE 30 POUR EXPERIENCE PRINCIPALE, 1 ETUDE PILOTE ET 3 EXPERIENCES PRINCIPALES /UTILISATEUR/AN). Pour produire ces souris POUR NOS COLLABORATEURS, nous maintenons, en continu, un élevage de 8 LIGNEES DE SOURIS immuno-déficientes. Les souris immunodéficientes seront hébergées en groupe dans un environnement protégé pour assurer leur bien-être, NOUS ESTIMONS POUVOIR FOURNIR 4690 SOURIS HIS ET 4200 SOURIS IMMUNO-DEFICIENTES ET MAINTENIR LES LIGNEES. NOUS UTILISERONS UN TOTAL DE 14400. Nous aurons 3 trios reproducteurs de chaque lignée en continu pendant les 5 années. Ce nombre est le minimum possible pour maintenir un élevage sans croiser les frères/sœurs EN TENANT COMPTE QUE CES LIGNEES PRODUISENT PEU DE PETITS. En partant du fait que chaque femelle d’un trio produit 5 petits par mois, chaque trio produit 10 petits/mois soit 10x12 = 120 petits/an. Ainsi pour chaque lignée, 120x3trios= 360 animaux seront produits chaque année. Pour chaque lignée, il y aura donc une production de 360x5ans = 1800 animaux/lignée sur 5 ans. Nous produirons donc, pour les 8 lignées, 1800x8 = 14400 animaux produits en 5ans. Parmi ces 14400 animaux produits en 5 ans, environ 3600 animaux (25%) seront sacrifiés pour mauvais génotype, 4690 seront humanisés, 4200 SERONT UTILISES POUR TESTER LES NOUVEAUX TRAITEMENTS DE NOS COLLABORATEURS, les 1910 animaux restants assureront le maintien des colonies.
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Un outil informatique de randomisation sera utilisé en amont des expériences pour garantir la répartition équilibrée entre les groupes de souris de variables susceptibles d'interférer (biais) avec la mesure ou l'analyse des résultats de l'essai. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de dermatite, les animaux seront placés sur une litière à base de cellulose et les lésions traitées avec un désinfectant. Après chaque intervention chirurgicale, les animaux seront placés dans des cages chauffées pendant la phase de réveil, et auront du gel hydrique à disposition pendant plusieurs jours. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. MODIFICATION texte en majuscules Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines dans des souriceaux nouveau-nés (
Modélisation et caractérisation de modèles murins précliniques d’infection par les virus respiratoire syncytial (VRS) : étude des mécanismes physiopathologiques et évaluation de candidats thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 700 souris, toutes classées en souffrance sévère et toutes tuées à l'issue, vont être infectées par le virus respiratoire syncytial puis traitées par des molécules candidates administrées par voie orale, nasale, intraveineuse ou dans le muscle. Les manipulations répétées incluent gavages, injections et prélèvements sanguins, le gavage comportant un risque d'étouffement en cas de fausse route. Les fonctions respiratoires sont mesurées sur l'animal éveillé, et les organes prélevés après la mise à mort. Le porteur justifie le recours à la souris par l'incapacité des modèles in vitro à reproduire la complexité des réponses immunitaires d'un organisme vivant.
Objectifs
Ce projet a pour but de mieux comprendre les infections causées par le virus respiratoire syncytial (VRS), un virus responsable notamment de bronchiolites chez les nourrissons, et de développer de nouveaux traitements ou moyens de prévention. Pour cela, nous utilisons des modèles chez la souris qui permettent de reproduire la maladie observée chez l’être humain. Nous étudions comment le virus se développe dans l’organisme, comment il se propage et comment la maladie évolue au fil du temps. Nous analysons aussi la manière dont le corps réagit face à l’infection, en particulier au niveau des poumons, mais aussi dans d’autres organes. Cela nous aide à comprendre pourquoi certaines personnes développent des formes plus graves ou plus longues de la maladie. Le projet permet également de tester de nouveaux traitements et des vaccins potentiels afin de vérifier s’ils peuvent diminuer la gravité de l’infection, réduire les symptômes et éviter les complications. Enfin, nous appliquons les principes des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer), qui visent à limiter l’utilisation des animaux et à réduire leur inconfort. Avant toute étude chez l’animal, les traitements sont d’abord testés en laboratoire sur des cellules. Nous adaptons également nos méthodes pour utiliser le moins d’animaux possible et assurer leur bien-être.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre l’évolution de la maladie provoquée par les VRS et d’identifier les facteurs qui rendent certains individus plus sensibles à l’infection. Ces modèles permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches de traitement et de prévention contre ces virus. Les résultats attendus de ce projet visent à améliorer les modèles utilisés avant les essais chez l’Homme ainsi qu’à valider des stratégies médicales prometteuses, contribuant ainsi au devéloppement de solutions plus efficaces pour la santé humaine.
Procédures
Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies : -Par la bouche : Une à deux fois par jour pendant quelques jours, -Par injection dans le ventre : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, -Par injection sous la peau : Une à plusieurs reprises selon le calendrier prévu, -Par le muscle, -Par le nez, -Par voie intraveineuse. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger à l’intérieur de la chambre. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Dans certains cas, un antidouleur (buprénorphine) sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement attendus dans le cadre de nos projets et procédures expérimentales sont principalement liés à la répétition des manipulations : gavage oral, injections (intramusculaire, intraveineuse, intranasale), prélèvements sanguins et mesures physiologiques. Ces interventions peuvent entraîner des effets transitoires, essentiellement dûs à la douleur locale, au stress de contention ou à des réactions tissulaires passagères. - Gavage oral : Un risque d’étouffement existe en cas de fausse route. Dans ce cas l’animal sera placé en position verticale et frictionné afin de dégager les voies respiratoires. Si ces mesures ne rétablissent pas la respiration de l'animal, une mise à mort immédiate sera réalisée. - Injection intramusculaire : La mise en place d’une réaction inflammatoire locale peut provoquer une sensibilité à la palpation, un léger gonflement ou une réduction temporaire de la mobilité des membres postérieurs. - Injection intraveineuse : L’injection par voie rétro-orbitaire peut entrainer un saignement localisé au niveau de l’œil. Une compression douce suite à l’injection est exercée afin de stopper le saignement et limiter la formation d’un hématome. - Injection intranasale : Une irritation locale transitoire peut être provoquée avec un écoulement nasal ou une respiration plus rapide suite à l’administration. Si une détresse respiratoire ou une fausse route surviennent l’animal sera placé en position verticale et frictionné pour dégager les voies respiratoires. Si ces mesures ne rétablissent pas la respiration de l'animal, une mise à mort immédiate est réalisée. - Equipement d'analyse des fonctions respiratoires : La restriction temporaire de mouvement et l’isolement de l’animal peut induire un léger stress pendant la mesure. Afin de limiter cet inconfort une période d’entrainement préalable est mise en place : par une habituation une à deux fois pendant 30 minutes, dans un délai de deux à trois jours avant les mesures. - Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin par voie submandibulaire est une procédure rapide. Le volume de sang prélevé est adapté au poids de l’animal. La ponction peut induire une douleur brève, une compression douce et immédiate est alors appliquée afin de stopper le saignement et limiter la formation d’un hématome.
Devenir
Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront euthanasiés conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet pas de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi, il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 6 à 20 semaines et répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin ainsi qu’un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 2 à 5 souris afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Pour tous les actes nécessitant une anesthésie, nous privilégions une anesthésie chimique par voie intrapéritonéale. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique et un suivi pondéral quotidien permettront de détecter rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les actions nécessaires pour la soulager. Étant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d'anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l'expression des marqueurs d’intérêt, ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’Homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l’étude du système immunitaire dans les conditions d’infection grâce aux connaissances acquises et à l’arsenal d’outils existants. En effet, un vaste répertoire d’anticorps ciblant des marqueurs murrins sont disponibles, permettant de caractériser finement la réponse immunitaire par des méthodes à très haut contenu. Les lignées murines utilisées dans ce projet incluent des animaux génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de certaines mutations sur la susceptibilité à l’infection virale et sur les mécanismes de la réponse immunitaire. Ces modifications génétiques sont utilisées exclusivement dans un objectif de compréhension fonctionnelle des voies impliquées dans l’infection et la pathologie respiratoire. Il est important de préciser que ces lignées ne présentent pas, en conditions d’élevage standard, de phénotype dommageable spontané associé à la modification génétique. Elles possèdent un système immunitaire globalement fonctionnel et ne développent pas d’altération physiologique ou comportementale en dehors du contexte expérimental. L’utilisation de ces modèles permet néanmoins de reproduire ou de moduler spécifiquement des voies biologiques d’intérêt (par exemple des récepteurs ou voies de signalisation impliquée dans l’entrée virale ou la réponse immunitaire), afin d’évaluer leur rôle dans la susceptibilité à l’infection et dans la sévérité de la maladie. Ces approches sont indispensables pour établir un lien causal entre une fonction génique donnée et la réponse à l’infection. Ainsi, les lignées génétiquement modifiées sont utilisées non pas en raison d’un phénotype dommageable intrinsèque, mais comme outils expérimentaux permettant de disséquer les mécanismes de l’infection virale et de la réponse de l’hôte. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes âgés de 6 à 20 semaines, présentant un système immunitaire mature.
Rôle des enképhalines produites par les lymphocytes T dans la douleur chronique induite par le cancer et la chimiothérapie dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 644 souris vont être utilisées pour étudier la douleur chronique liée au cancer et à la chimiothérapie, 1 350 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 294 sévère, toutes tuées à l'issue. Les animaux reçoivent des greffes de tumeurs, une chimiothérapie et une batterie de tests répétés de sensibilité, dont un test mécanique jusqu'à trente-trois fois sur la durée du projet et un test thermique entre 8 et 55 degrés. Le porteur qualifie ces tests de sensibilité de non douloureux, alors que les inductions tumorales peuvent provoquer une douleur modérée à sévère selon la localisation. À la fin, les souris sont tuées pour prélever leur rate, leurs ganglions, leur peau et les tumeurs.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment des molécules naturelles produites par certaines cellules du système immunitaire peuvent influencer la douleur chez la souris. Notre hypothèse est que ces cellules masquent la douleur directement par leur capacité à sécréter des analgésiques naturels. Nous utiliserons des lignées de souris mutantes et des tests de sensibilité à la douleur dans différentes conditions. Nous évaluerons particulièrement la douleur ressentie dans des modèles de cancers et de chimiothérapies. Nous mesurerons l'intensité de la douleur perçue par stimulation mécanique ou par des observations comportementales. L'ensemble des résultats de ce projet permettra de proposer un nouveau mécanisme de régulation de la douleur chez la souris avec de possibles implications cliniques chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Les cancers représentent un enjeu majeur de santé publique. En France, environ 433 000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année et plusieurs centaines de milliers de patients reçoivent une chimiothérapie. Au niveau mondial, près de 20 millions de nouveaux cas par an sont estimés. Les douleurs chroniques constituent une séquelle fréquente des traitements anticancéreux (30 pourcents des patients traités). Au-delà de leur impact sur la qualité de vie, les cancers représentent également un poids économique considérable, avec plus de 20 milliards d’euros de coûts directs pour le système de soins en France et un coût sociétal mondial estimé à plus de 500 milliards d’euros par an. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les douleurs chroniques associées au cancer et aux traitements par chimiothérapie, afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Pour moduler la génétique, certains animaux seront soumis à des administrations en début de projet (sur animal vigile, 2 fois maximum, 1 minute par geste OU sur animal anesthésié, 3 fois maximum, 3 minutes par geste). Afin de mesurer la sensibilité à la douleur, les animaux suivront tous une série de test sur animal vigile : un test de sensibilité à la température entre 8 et 55 degrés sans risque de brûlure (3 fois maximum avec 2 semaines de récupération minimum entre chaque test, 5 minutes maxmim), un test de sensibilité mécanique (33 fois maximum à raison de 3 fois par semaine pendant toute la durée du projet, 5 minutes maximum), un test de démarche (3 traversées maximum avec 2 semaines de récupération minimum entre chaque test, 5 minutes maximum) et un test d'observation (3 fois maximum avec 2 semaines de récupération entre chaque test, 8 minutes). Ces tests ne sont pas douloureux. Certains animaux auront une greffe tumorale sous anesthésie et analgésie suivant le type de tumeur (1 fois, 30 minutes maximum) ou un traitement de chimiothérapie sur animal vigile (30 fois maximum sur 1 mois, 1 minute). Le suivi tumoral sera réalisé par imagerie sur animal anesthésié (3 fois par semaine pendant 2 mois maximum, 5 minutes). Certains groupes pourront recevoir un traitement sur animal anesthésié (1 fois, 5minutes) ou sur animal vigile (30 fois sur 1 mois maximum, 1 minute).
Impact sur les animaux
L'administration d'un médicament pour activer un gène pourra engendrer une irritation de l'oesophage ou une douleur légère de courte durée au point d'injection. Les tests réalisés pour évaluer la sensibilité à la douleur pourront engendrer une gêne et un stress de courte durée. Les inductions de tumeurs pourront engendrer une douleur et une gêne modérée à sévère selon la localisation et la progression tumorale. L'administration de chimiothérapie pourra engendrer une douleur légère de courte durée ainsi qu'un risque d'inflammation au site d'injection et des effets secondaires comme la modification du transit intestinal. Les injections répétées pourront induire un risque de péritonite. L'administration d'une analgésie de récupération ou d'un anticorps pourra engendrer une douleur légère de courte durée au site d'injection. Enfin, l'anesthésie pour certains actes techniques pourraient engrendrer une hypothermie et un risque de détresse cardio-respiratoire. Les animaux immunodéprimés seront plus sensibles aux infections.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire car les organes (rate, ganglions, peau) et les tumeurs doivent être prélevés pour être analysés.
Remplacement
Le but de ce projet est d'évaluer la sensibilité à la douleur dans différentes conditions de cancers et de chimiothéapies. Il est par conséquent impossible de palier à l’utilisation d’animaux vivants car ce projet est basé sur la perception de la douleur chez l'animal. Il n'est pas possivle de remplacer cette utilisation par des expérimentations in vitro et la sensibilité à la douleur n'est pas quantifiable par des paramètres biochimiques connus.
Réduction
Ce projet nécessite l'utilisation de 1644 animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des analyses des résultats. Nous utiliserons 6 animaux par groupe pour toutes les procédures, sauf pour certains des groupes d'animaux témoins où 3 animaux seront suffisants. Des tests statistiques fiables et robustes seront utilisés pour analyser les résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Lorsque cela est nécessaire les animaux seront sous anesthésie et analgésie. Les animaux sous anesthésie de plusieurs minutes auront une application de gel occulaire pour éviter l'assèchement des yeux. Ils seront également maintenus sur tapis chauffant afin d'éviter une hypothermie. Afin de faciliter la prise alimentaire des animaux, des croquettes seront toujours disponibles au fond de la cage. Pour les tests, les animaux seront habitués à leur environnement. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris représente un très bon modèle pour réaliser des expériences de comportement, des études de neuroanatomie, de physiologie et de biologie cellulaire et moléculaire, de plus la disponiblité de souris génétiquement manipulées pour les gènes d'intérêt rend aussi l'utilisation de cette espèce indispensable à la réalisation de ce projet. Les souris pourront être utilisées à partir de l'âge de 8 semaines car le statut immunitaire doit être mature avec un niveau stable de cellules immunitaires.
Développement d’anticorps thérapeutiques contre les orthoflavivirus.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Inoculées avec un virus sous anesthésie, 294 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 216 d'entre elles et sévère pour 78, toutes tuées à l'issue. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une maladie virale avec des atteintes neuro-musculaires modérées à sévères, pour mettre au point des anticorps contre les orthoflavivirus. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la réponse immunitaire complète d'un organisme vivant et en conclut que le modèle animal est "essentiel". À la fin de chaque procédure, les souris sont tuées afin de prélever leur sang, leur cerveau et leur rate.
Objectifs
Dans un contexte d’émergence croissante de virus transmis par les moustiques et de la multiplication des épidémies associées, ce projet vise à développer des anticorps thérapeutiques, c’est-à dire des protéines capables de neutraliser ces virus. L’objectif est double : d’une part, répondre au besoin de contre-mesures médicales efficaces ; d’autre part, étudier la réponse immunitaire antivirale. L’étude se concentre sur le virus West Nile (WNV), un virus pathogène pour l’Homme responsable notamment d’affections neurologiques sévères et ne disposant à ce jour en Europe d’aucune option thérapeutique spécifique et efficace. Plusieurs versions de ce virus seront testées afin d’étudier les anticorps neutralisants produits associés et de les caractériser.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à produire des données essentielles pour le développement de nouvelles immunothérapies antivirales. Elles permettront : -De valider un modèle d’infection murin non létal pour le virus West Nile (WNV), c’est-à-dire déterminer les conditions d’infection qui garantit la survie des animaux, tout en induisant une réponse immunitaire efficace -De générer des anticorps capables de neutraliser le WNV et identifier de nouveaux candidats thérapeutiques ; -De mieux comprendre les déterminants clés de la neutralisation virale lors de la réponse immunitaire ; -De proposer une nouvelle stratégie de développement rapide d’anticorps thérapeutiques applicable à des virus similaires. Plus généralement, ce projet apportera des connaissances fondamentales sur les mécanismes de la réponse immunitaire antivirale, tout en soutenant l’effort de préparation faces aux futures épidémies virales.
Procédures
L’ensemble des animaux seront soumis à une inoculation (infectieuse ou non) sous anesthésie, une unique fois : 3 à 5 minutes par animal, incluant l’induction anesthésique, l’injection et le réveil.
Impact sur les animaux
La pesée des animaux ainsi que les injections de véhicule ou du virus faites sous anesthésie peuvent provoquer un stress de courte intensité. Le virus injecté peut entrainer le développement d’une maladie virale avec des atteintes neuro-musculaires modérées à sévères.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes (sang, cerveau et rate) afin d’en isoler les cellules immunitaires et étudier la réplication virale.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative fiable pour reproduire la réponse immunitaire complète d’un organisme vivant. L’utilisation du modèle animal est donc ici essentielle pour notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été calculé pour correspondre au minimum requis pour une statistique de base, à l’aide d’une analyse réalisée avec un logiciel de calcul de puissance statistique. Les résultats obtenus lors de la première phase du projet serviront directement à limiter le nombre d’animaux engagés lors de la seconde phase.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés dès réception et hébergés en groupe avec de l’enrichissement. Ils bénéficieront d’un suivi clinique quotidien afin de détecter et prendre en charge tout signe de souffrance à l’aide de points limites prédictifs et d’analgésique. Toutes les manipulations se feront sous anesthésie et la totalité des prélèvements seront réalisés en post-mortem. Les données obtenues lors de la première procédure permettront d’établir un modèle d’étude, réduisant les atteintes cliniques des animaux par la suite.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de référence pour l’étude des maladies virales et la génération d’anticorps neutralisants. Les animaux seront adultes, commandés à 6 semaines et inoculés entre 7 et 8 semaines. Les modèles animaux décrits dans la littérature pour ce type d’expérience utilisent des animaux de cet âge.
Développement d’une thérapie innovante afin d’améliorer les conditions de conservation et la fonction des greffons marginaux hépatiques–Etude chez le modèle porcin-Modification
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Quinze cochons vont être utilisés dans une chirurgie de prélèvement du foie de trois heures, menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. L'opération sert à récupérer un greffon hépatique entier pour tester un anticorps, le NP-137, censé réduire l'inflammation des greffons dits marginaux avant transplantation chez l'humain. Le porteur écarte tout modèle cellulaire au motif qu'il faut un "organe entier" de taille comparable à celle de l'humain, et justifie la mise à mort par le prélèvement d'organe. Les bénéfices annoncés pour les patients en attente de greffe restent à distance de cette procédure, qui vise d'abord à évaluer le traitement sur l'animal.
Objectifs
Ce projet vise à améliorer la qualité des greffons de foie disponibles, afin d’augmenter le nombre d’organes utilisables et sauver plus de vies. En France, 1 342 transplantations hépatiques curatives ont été réalisées en 2023, avec un taux de survie à un an de 88 % et 76% à 5 ans. Au 1er janvier 2024, 1332 patients étaient en attente de greffe soit 2,4 candidats pour un greffon. Cette pénurie de greffons conduit à des décès sur liste d’attente. Certains greffons sont de qualité insuffisante pour être transplantés. La technique de perfusion hypothermique oxygénée (HOPE), développée à Lyon, permet de mieux conserver les greffons de qualité dite « marginale », mais des problèmes d’inflammation persistent. Le principal défi est de diminuer ces lésions pour améliorer le pronostic des greffons marginaux et des patients transplantés. Un traitement par un anticorps nommé NP-137 sera testé pour réduire cette inflammation en bloquant une protéine spécifique : la nétrine-1. La nétrine-1 joue un rôle dans les maladies chroniques du foie et l’inflammation. Ceci permettra d’améliorer la qualité et la quantité des greffons disponibles et ainsi de réduire le nombre de patients en attente de greffe.
Bénéfices attendus
Cette étude de preuve de concept est la première étape indispensable à l’utilisation chez l’humain. Elle explore l’utilisation de l’anticorps NP-137 pour dépléter la nétrine-1, afin de réduire les lésions inflammatoires des greffons dues aux différentes phases d’ischémie-reperfusion. Grâce à l’homologation clinique du NP-137 en oncologie et l’utilisation de la machine de perfusion en clinique et de notre modèle pré-clinique, cette approche pourrait être testée chez les patients dans des délais très raisonnables. Si les résultats sont positifs, cette stratégie pourrait alors être testée et étendue à d’autres greffons d’organes solides impactés par l’ischémie-reperfusion et l’inflammation.
Procédures
Le premier et seul acte invasif réalisé vigile concerne la réalisation d’une prémédication, réalisée très rapidement en une injection (5 min), permettant ensuite le transport (20 min) et la réalisation de l’anesthésie générale (30 min) dans de bonnes conditions. La période d’acclimatation préalable permet de réalisér cette prémédication dans des conditions moins stressantes pour l’animal. Par la suite, il s'agit d'une procédure chirurgicale sans réveil (3 heures) au cours de laquelle l'animal sera anesthésié et analgésié en continu sans réveil. La chirurgie consiste en la réalisation d’un prélèvement hépatique, qui dure environ 180 minutes. Lors de la procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, des prélèvements sanguins sont prévus afin de contrôler l’état physiologique de l’animal toutes les heures (pendant 3 heures). Une biopsie hépatique (1 min) sera réalisée en début de procédure pour avoir un examen des tissus du foie de référence avant toute manipulation mais sera là encore réalisée sous anesthésie générale. Tous ces prélèvements ne durent que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Il s’agit dans le contexte de ce projet, d’une procédure sans réveil, réalisée sous anesthésie générale, avec un monitoring de l’analgésie per opératoire. Par ailleurs, le déroulé des sessions respecte la période d’acclimatation de ces animaux et les séances se déroulent dans le respect du bien-être animal. Les nuisances habituellement rencontrées dans ce type de modèle comprennent le choc anesthésique et le risque hémorragique, plus rarement le risque de reprise de conscience généralement couvert par un monitorage approprié de l'anesthésie/analgésie et des administrations médicamenteuses adaptées. La procédure étant sans réveil, il n’y a par ailleurs pas de nuisances ou effets secondaires attendus après la procédure.
Devenir
Il s’agit d’une procédure chirurgicale sans réveil qui est principalement motivée par des raisons scientifiques qui justifient l’utilisation du modèle décrit. En effet, dans le respect du bien-être animal, par soucis de standardisation, mais aussi pour permettre une analyse pertinente et exhaustive du greffon hépatique, seule la première partie nécessitant le prélèvement d’un greffon hépatique est réalisé chez l’animal. Dans la mesure où il s’agit d’un prélèvement d’organe la mise à mort de l’animal est indispensable en fin de procédure.
Remplacement
Pour limiter au maximum, le nombre de biais, il est important que la procédure expérimentale reflète au plus près les conditions réelles d'une procédure de transplantation hépatique chez l'humain. C'est pourquoi un modèle uniquement cellulaire n'est pas envisageable pour cette étude. De plus pour se servir des machines de perfusion, il est d'indispensable d'obtenir un organe entier à perfuser de taille comparable à l'humain, éliminant le modèle murin. Il n'est pas possible de récupérer cet organe en abattoir car nous devons contrôler le décès de l'animal pour que celui-ci soit semblable aux conditions d'obtention des greffons issues de donneur à cœur arrêté en transplantation hépatique chez l'humain.
Réduction
L’utilisation de ce modèle expérimental permet ensuite de s’intégrer dans une dynamique de réduction, n’utilisant qu’un seul animal au lieu de deux. Nous n’avons en effet pas recours à un second animal pour une transplantation (un animal donneur et un animal receveur) ou pour utiliser du sang lors de la reperfusion puisqu’il s’agit du sang provenant du même animal. Sur le plan statistique, le nombre d’animaux par groupe est le nombre minimal afin d’obtenir une puissance statistique significative. Enfin, les greffons ainsi que les prélèvements d’organes et tissus seront utilisés ultérieurement pour les formations et recherches. [Modif.03/06/26 : À la suite d’une optimisation du protocole par rapport à l’ensemble de la cohorte, nous avons besoin de rajouter 3 animaux au projet. Ce point augmente l’effectif total mais nous restons dans un modèle de réduction en utilisant un seul animal au lieu de deux ]
Raffinement
Durant toute la période d’acclimatation, les animaux sont hébergés sur de la litière. Nous leur donnons en complément des briques de litières compactées avec du pop-corn ce qui leur permet de faire de la recherche de nourriture et réduit les bagarres entre individus liées au stress du voyage et de leur arrivée. Quotidiennement, le personnel passe les voir pour donner à manger et interagir avec les individus permettant leur socialisation avec l’homme. Cette socialisation est faite par un enrichissement positif avec de la banane qui est très appréciée par le porc. Afin de détecter tout mal-être, nous utilisons une grille de suivi individuel durant la période d’acclimatation. Durant la chirurgie, l’enregistrement des paramètres vitaux en continu, associé à des alarmes sonores, est complété par une vérification humaine toutes les 30 minutes, effectuée par le personnel compétent dédié. Ce suivi permet de s’assurer du stade anesthésique et de son maintien pendant toute la durée de la procédure. Pour lutter contre l’hypothermie (baisse de la température corporelle), les animaux sont installés sur une table chauffante à 37°C et sont perfusés avec du liquide de perfusion chaud (37°C). La présence d’un vétérinaire sur le site permet d’intervenir rapidement et à tous moments durant la période de présence de l’animal dans nos locaux. Pour toutes les chirurgies, l’animal est intubé puis placé sous ventilation avec un anesthésique gazeux et sur une table chauffante pour maintenir la température corporelle. Un anti-douleur (analgésique) d'action longue sera injecté à l’animal pour prévenir la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un hypnotique couplé à un analgésique.
Choix des espèces
Le foie de porc présente une taille, un poids et une microstructure similaire au foie humain. Ces caractéristiques anatomiques et histologiques permettent d’effectuer un prélèvement d’organe standardisé et reproductible, ainsi que d’utiliser des machines de perfusion d’organes identiques à celles utilisées en pratique clinique. Un argument supplémentaire est l’utilisation et la validation de ce modèle animal dans la littérature scientifique sur la préservation des greffons hépatiques.
Etude de l’efficacité des nouvelles cellules porteuses d’un récepteur antigénique chimérique dans le traitement des tumeurs hématologiques et solides dans un modèle murin immunodéficient. Établissement utilisateur 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
200 souris immunodéprimées se voient greffer des tumeurs humaines puis injecter des cellules CAR-T, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, y compris celles dont la tumeur a régressé, une reprise de croissance étant jugée toujours possible. Elles peuvent développer une gêne respiratoire ou une paralysie des membres arrière selon la tumeur implantée. Le porteur présente le passage in vivo comme "incontournable" après des essais sur cellules.
Objectifs
L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Malgré son efficacité dans le traitement de cancers sanguins comme la leucémie, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Ce projet vise donc à étudier l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient contribuer à améliorer les immunothérapies dans le traitement du cancer. . Le projet se déroule dans 2 EU différents.
Bénéfices attendus
La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du sein et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d’accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.
Procédures
Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue (EU1). Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions (EU1). Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Des imageries par bioluminescence nécessiteront des injections de luciférine qui se feront en IP sur animal vigile (EU2). Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse. À la fin de l’expérimentation, les animaux seront mis à mort après anesthésie générale à l’isoflurane (EU2).
Impact sur les animaux
L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peut occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisances comme une nécrose pourrait apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 1500 mm3 pour les tumeurs sous cutanées). L’apparition de gêne respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une parésie des membres arrière peuvent être observées (pour la tumeur Raji).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle ainsi que son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons utiliser un modèle murin afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.
Réduction
Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une puissance statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.
Raffinement
Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées trois fois par semaine pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur. De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.
Choix des espèces
Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.
Évaluation préclinique de l’efficacité et de la sécurité d’un patch libérateur de monoxyde d’azote dans la cicatrisation de plaies chroniques.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Dix-huit rats rendus diabétiques subissent deux chirurgies pour créer une plaie chronique sur le dos, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélever leur peau. Le pansement est changé deux fois par semaine sous anesthésie et les rats restent isolés en cage jusqu'à cicatrisation. Le projet teste un patch libérant du monoxyde d'azote, déjà essayé sur des plaies aiguës, avant un éventuel passage chez l'humain. Le porteur écarte tout remplacement, la cicatrisation mettant en jeu des mécanismes qu'il juge impossibles à reproduire en laboratoire.
Objectifs
Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec, en France, près de 500 000 patients concernés dont les pathologies principales sont des ulcères de jambe, des plaies du pied chez les diabétiques et des escarres. Une plaie est considérée comme chronique si elle n'a pas cicatrisé après 4 à 8 semaines malgré un traitement adapté. Ces plaies entraînent des impacts négatifs sur la qualité de vie du patient, et leur prise en charge induit des coûts importants. Il est connu que le monoxyde d’azote, molécule naturellement présente dans l’organisme, joue un rôle essentiel dans la cicatrisation. Aucun patch cicatrisant libérant du monoxyde d’azote n’est actuellement disponible sur le marché car sa mise en place est complexe. Pour répondre à cette problématique, un nouveau matériau a été développé. Afin d'être représentatif de la réalité clinique, ce projet consiste à tester ce patch sur un modèle animal de plaie chronique, avant d’envisager une évaluation clinique chez l’humain. Les objectifs sont donc d'abord d'évaluer la sécurité et l’efficacité des patchs libérateurs de monoxyde d’azote sur la cicatrisation d’une plaie chronique sur un modèle animal, puis par la suite d'évaluer les effets sur les cellules de la peau.
Bénéfices attendus
La cicatrisation des plaies est un processus naturel qui permet à la peau de se réparer mais une plaie mal soignée peut entraîner des complications (par exemple les plaies chirurgicales ou les ulcères du pied chez les personnes diabétiques). Ces plaies augmentent aussi le risque de mortalité des patients, pouvant atteindre jusqu’à 20 % selon les cas. Pour améliorer leur prise en charge, il est essentiel de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements et dispositifs médicaux. Les travaux menés dans le cadre de cette demande d'autorisation de projet viendront renforcer les résultats et les données de sécurité déjà obtenues sur l’efficacité et la sécurité des patchs développés dans le cas de plaies aigues. Ces données permettront d’initier une démarche pour aboutir à la mise en place d’une étude chez l'humain sur la plaie chronique du diabétique et l’escarre. A terme, ces dispositifs pourraient être utilisés chez l’Homme pour aider à guérir des plaies chroniques difficiles à cicatriser.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale évaluées à 30 minutes maximum chacune, pour l’induction d’une plaie cutanée au niveau du dos. Puis le pansement sera changé deux fois par semaine sous anesthésie générale (15 min environ). Un prélèvement sanguin par semaine (30 secondes) sera réalisé lors de cette anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux seront placés en cages individuelles juste après l'intervention et jusqu'à la cicatrisation, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le pansement et surtout les patchs placés dans les plaies cutanées, ce qui pourra conduire à un stress à cause de la limitation des interactions sociales directes. Par ailleurs, la plaie elle-même pourra entraîner une douleur, qui nécessitera un traitement antidouleur injectable. La répétition de l'ensemble des gestes pour changer le pansement et réaliser les prélèvements pourra altérer légèrement le bien-être des animaux.
Devenir
Les animaux ne pourront pas être gardés vivants car des prélèvements de peau seront réalisés à la fin de la procédure, pour étudier les effets des patchs au niveau microscopique. C'est pourquoi tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Le processus de cicatrisation met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire en laboratoire (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être évalué que sur un organisme vivant et entier. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles autres pour réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée. Le remplacement de ce modèle par des méthodes alternatives n'est donc pas envisageable dans le cadre de cette étude.
Réduction
Le choix de 6 rats par groupe, soit un total de 18 animaux répartis en trois groupes, repose sur les recommandations usuelles pour ce type d'étude. Ce nombre permet de disposer d’un effectif suffisant pour une évaluation descriptive de l’efficacité et de la sécurité du patch libérateur de monoxyde d’azote, tout en respectant le principe éthique de réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux utilisés sont des rats diabétiques, ce qui peut entraîner une plus grande production d’urine et une soif augmentée. Pour garantir leur confort, leur habitat sera particulièrement surveillé : beaucoup de litière pour absorber l’urine, litière changée au moins trois fois par semaine (ou plus si besoin), et biberons renouvelés aussi trois fois par semaine. Chaque jour leur état général, leur comportement et leur poids seront attentivement surveillés et ces informations seront notées sur une fiche de suivi. Après l'intervention chirurgicale, chaque rat sera placé seul dans une cage pour éviter l'arrachement du pansement par ses congénères. Cependant, pour qu’il garde un contact social, les cages seront transparentes et ouvertes, permettant de voir, sentir et entendre les autres animaux. Toutes les interventions (création de la plaie, changement des pansements, prélèvements) seront réalisées sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Un médicament antidouleur sera donné avant la création de la plaie, puis régulièrement après si nécessaire. Les opérations seront courtes, réalisées dans un environnement propre, et la température corporelle des animaux sera surveillée. Les plaies seront protégées par un pansement, et leur cicatrisation sera suivie grâce à un système de notation. Si certains signes inquiétants apparaissent (comme une perte de poids importante ou une infection), les mesures prévues dans la fiche de suivi seront appliquées, pouvant aller jusqu’à l’euthanasie pour éviter toute souffrance supplémentaire.
Choix des espèces
Le rat est souvent utilisé dans les études sur la cicatrisation, car c’est un modèle fiable et bien connu. Dans ce projet, on utilise des rats diabétiques,car leur maladie entraîne deux problèmes qui ralentissent la guérison des plaies : une mauvaise circulation sanguine (comme chez les patients diabétiques) et un manque d’apport en oxygène dans les tissus, comme dans le cas des escarres. Cela permet donc d’étudier un modèle de plaie qui ressemble réellement à une plaie chronique chez l’être humain. De plus, un précédent test du patch a déjà été réalisé chez le rat dans un modèle de plaie aiguë, ce qui rend pertinent d’utiliser la même espèce pour pouvoir comparer les résultats. Les animaux choisis auront environ 10 semaines au début de l’étude. À cet âge, ils présentent déjà une glycémie élevée et stable, ce qui reproduit assez fidèlement le métabolisme d’une personne diabétique. C’est aussi un moment où la cicatrisation de la peau commence à être ralentie, sans que la santé générale du rat ne soit trop affectée. Ce choix permet donc d’étudier les mécanismes qui retardent la guérison des plaies et de tester des traitements dans des conditions réalistes, tout en garantissant des résultats fiables et comparables.
Effets de la restriction alimentaire sur l’organisation de l’ADN et le vieillissement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Isolées en cage individuelle pendant dix mois, dont une partie nourrie à 70 % de sa ration, 420 souris vont être utilisées pour étudier le vieillissement de l'ADN, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées au terme des dix mois pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît que ce logement individuel prolongé, qu'il juge nécessaire pour mesurer précisément les apports, induit un stress. Les enseignements espérés sur le vieillissement humain restent une projection.
Objectifs
Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons comprendre comment les protéines qui contribuent à l'empaquetage de l'ADN dans les cellules évoluent à mesure que les humains vieillissent. Nous nous intéressons également à la manière dont l'alimentation et les habitudes alimentaires, comme le fait de manger moins ou uniquement à certaines heures, peuvent influencer ces protéines. Pour étudier cette question, nous comparerons des groupes de souris qui s'alimentent normalement à des groupes soumis à un régime alimentaire restrictif et à des horaires de repas limités. En observant ces différences, nous espérons en apprendre davantage sur la manière dont le vieillissement et le mode de vie affectent l'organisation de l'ADN dans notre corps.
Bénéfices attendus
Ce projet nous aidera à comprendre comment les protéines qui organisent l'ADN dans les cellules changent à mesure que les souris vieillissent, et comment ces changements affectent l'activation ou la désactivation des gènes. Nous étudierons également comment deux interventions connues pour favoriser la santé et la longévité, à savoir manger moins et seulement durant la phase active, peuvent influencer ces protéines. Les résultats pourraient fournir des informations sur le processus de vieillissement chez l'homme, identifier des marqueurs permettant de suivre un vieillissement en bonne santé et suggérer des moyens de ralentir les changements liés à l'âge en ciblant l'organisation de l'ADN.
Procédures
Toutes les souris seront hébergées en cage individuelle pendant 10 mois. Une partie des souris seront soumises pendant 10 mois à une restriction calorique associée à une alimentation à durée limitée, recevant 70 % de l’apport calorique individuel de référence, administré une fois par jour au début de la phase active.
Impact sur les animaux
Le logement individuel, nécessaire pour mesurer avec précision la consommation alimentaire et imposer une restriction calorique, peut induire un stress modéré chez les animaux. La pesée des animaux tous les 3 jours provoque un stress bref lié à la manipulation. Le régime alimentaire à restriction calorique et temporelle peut également induire un stress léger.
Devenir
Les animaux feront l’objet d’une mise à mort à la fin des 10 mois afin de prélever leurs organes et de réaliser les analyses ultérieures.
Remplacement
Cette étude examine comment l'organisme dans son ensemble réagit à une alimentation réduite et limitée dans le temps. De telles réponses complexes ne peuvent être reproduites dans des cellules ou dans de petites parties du corps seules, il est donc nécessaire de les étudier chez des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum tout en permettant une analyse statistiquement significative des résultats et en tenant compte de la variabilité interindividuelle des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en prenant en compte la puissance statistique souhaitée (80 %), la différence attendue entre les moyennes des groupes et l’écart type attendu d’après les données publiées. Dans une perspective de réduction, à la fin de l’étude, nous collecterons tous les organes d’intérêt (par exemple, cerveau, foie, poumons, cœur), y compris ceux que nous ne prévoyons pas d’analyser actuellement, et les conserverons au congélateur pour d’éventuelles analyses futures.
Raffinement
Pour limiter l’inconfort et garantir le bien-être des souris tout au long de l’étude, tout animal pesant moins de 20 g au début du protocole ne sera pas inclus. Les souris seront pesées tous les trois jours et leur consommation alimentaire sera surveillée afin de détecter tout signe de détresse. Les animaux seront logés individuellement dans des cages permettant un contact visuel avec les autres souris. Leur environnement sera enrichi afin de favoriser l’expression de comportements naturels, avec la mise à disposition de matériel de nidification et d’éléments d’enrichissement adaptés. Des points limites précis ont été définis, basés notamment sur la surveillance du comportement, de l’apparence physique et du poids corporel des souris.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères présentant de nombreuses similarités avec l’humain, notamment dans leur réponse physiologique à l’alimentation et aux rythmes alimentaires, ce qui en fait un modèle approprié pour étudier les effets d’une alimentation réduite et limitée dans le temps. Pour cette étude, des souris adultes, âgées de 8 semaines au début de l’expérimentation, seront utilisées, car nous souhaitons étudier les effets de la restriction calorique et de l’alimentation à durée limitée chez des animaux adultes.
Etude des mécanismes moléculaires lors de la division de la cellule sexuelle chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Pour étudier la séparation des chromosomes lors de la formation des spermatozoïdes, 314 souris mâles prépubères reçoivent un produit par voie orale pendant dix jours et des injections sous-cutanées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le choix d'animaux prépubères sert à synchroniser le développement des cellules et à réduire les effectifs. Toutes sont tuées pour prélever leurs cellules sexuelles. Le porteur précise que les petits rejetés par leur mère ou dont la croissance décroche seront eux aussi euthanasiés.
Objectifs
Pour former des spermatozoïdes et ovocytes fonctionnels, les chromosomes d’origine maternelle et paternelle des cellules sexuelles se séparent lors d’une division cellulaire spécifique appelée méiose. Cette étape est cruciale : si les chromosomes ne se séparent pas correctement, cela aboutit à la stérilité ou à la transmission d’anomalies génétiques aux enfants. Ce projet vise à élucider les mécanismes qui contrôlent la séparation des chromosomes au cours de la méiose chez les mammifères, spécifiquement en étudiant le phénomène chez la souris. Ce projet permet de marquer les chromosomes d’une manière qui permet d’étudier comment chaque chromosome se positionne et interagit avec les autres durant la méiose. Grace à cette approche, il sera possible de mieux comprendre le mécanisme en jeu et d’identifier des gènes importants qui permettent de former des spermatozoïdes fonctionnels, qui contrôlent la fertilité et évitent la transmission d’anomalies génétiques.
Bénéfices attendus
A court terme : méthodologie novatrice pour analyser le rapprochement des chromosomes et la réparation de l’ADN dans les cellules sexuelles mâle (spermatocytes). A moyen terme : identification de mécanismes moléculaires, et de gènes, qui conduisent à l’infertilité ou à la transmission d’anomalies génétiques pathogènes, telles que les trisomies. A long terme : identification et compréhension du rôle de facteurs importants pour la fertilité et la stabilité du génome, qui peuvent être impliqué dans la fertilité, la transmission d’anomalies génétiques et la stabilité du génome en général.
Procédures
Les animaux recevront quotidiennement par voie orale (à la pipette) une goutte d’un produit non toxique pendant 10 jours, et deux ou trois injections à quelques jours d’intervalle, dans des conditions de contention destinées à rendre les manipulations rapides et à limiter le stress des animaux.
Impact sur les animaux
Contention de l’animal suivie de l’administration par voie orale (à la pipette) de quelques gouttes d’un produit non toxique, ce qui entraine un stress léger. Contention de l’animal suivie d’une injection sous la peau avec une seringue, ce qui entraine un stress léger et une douleur légère de courte durée, répétée 2 fois à quelques jours d’intervalle.
Devenir
La raison d’être de ce projet consiste en l’analyse post-mortem des cellules des individus traités. Nous devons donc euthanasier l’ensemble des animaux traités pour prélever le tissu d’intérêt et l’analyser.
Remplacement
La reproduction sexuée est un processus universel étudié chez des organismes non-mammifères (levures, plantes, invertébrés), mais de nombreux aspects sont spécifiques au contexte du développement des cellules sexuelles chez les mammifères, ce qui justifie l’étude chez ceux-ci, en prenant en compte les connaissances acquises chez d’autres organismes. Pour ce projet d’étude fine de l’organisation des chromosomes, qui nécessite un grand nombre de cellules sexuelles synchronisées à des stades précis, les systèmes de culture de cellules existants sont insuffisants parce que la synchronisation, l’efficacité et la similarité avec les propriétés in vivo ne sont pas suffisantes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ramené au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables et de vérifier leur reproductibilité. Il sera réduit autant que possible par une première phase de d’optimisation technique. La procédure de synchronisation en elle-même est conçue pour réduire d’un facteur 2 le nombre d’animaux, par rapport à l’utilisation d’animaux non traités, avec une meilleure qualité de résultat qui permet également de réduire le nombre de répétitions des expériences. La gestion de l’élevage des souris sera optimisée pour réduire autant que possible le nombre d’animaux surnuméraires.
Raffinement
Durant les procédures, les animaux non sevrés seront surveillés quotidiennement afin de vérifier en particulier l’absence de rejet par leur mère (absence de lait visible 2 jours de suite) et leur croissance normale. En particulier, lors de l’administration d’un produit non toxique par voie orale (jour post-natal 1 à 10) les animaux seront pesés quotidiennement, et les animaux qui sont rejetés par leur mère, qui ne prennent pas du tout de poids, ou dont la prise de poids est inférieure de 80% à la prise de poids attendue, seront sortis de l’expérimentation et euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal chez lequel le protocole permettant de synchroniser le développement des cellules sexuelles est au point, chez lequel les aspects de l’organisation des chromosomes lors du développement des cellules sexuelles (spermatozoïdes) est le mieux connu, ce qui est essentiel pour contextualiser nos résultats, et pour lequel des modèles génétiques appropriés (mutations des gènes impliqués) sont disponibles. La taille de cet organisme est appropriée, puisqu’un nombre réduit d’animaux est nécessaire pour chaque expérience. Des souris mâles prépubères seront utilisées, parce que le projet nécessite des cellules sexuelles à un stade de développement précis (à quelques heures près), alors que le développement des cellules sexuelles est continue et non synchrone chez le mâle adulte. La synchronisation du développement des cellules sexuelles chez des souris mâles prépubères permet d’obtenir le plus grand nombre possible de cellules sexuelles synchronisées, et donc de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Etude chez la souris du rôle pubertaire de l’estradiol dans l’organisation et la plasticité des régions hypothalamiques contrôlant la fonction de reproduction.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 474 souris vont être utilisées pour étudier le rôle de l'œstradiol à la puberté, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité tuée pour prélèvement du cerveau. Une partie subit une chirurgie cérébrale stéréotaxique, d'autres femelles une ablation des ovaires avec pose d'un implant hormonal. Le comportement sexuel des mâles est observé sur des sessions d'accouplement de neuf heures. Le porteur reconnaît que certaines femelles seront tuées sans même être prélevées, une fois leurs implants périmés.
Objectifs
L’infertilité est aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique dont les causes et les mécanismes d’action demeurent mal compris. La fertilité repose sur une régulation adéquate par le cerveau des régions impliquées dans les fonctions de reproduction. L'organisation de ces structures cérébrales, en particulier dans l’hypothalamus, est contrôlée par les hormones stéroïdes sexuelles, testostérone et estradiol, pendant des périodes critiques de développement, de la naissance à la puberté. Le but de ce projet de recherche est de comprendre le rôle de l’œstradiol au cours du développement pubertaire dans les changements de plasticité de l’hypothalamus. Des souris seront utilisées afin d’investiguer les mécanismes d’action de l’œstradiol dans l’organisation pubertaire des réseaux neuraux sous-jacents la régulation des fonctions de reproduction. Les données issues de ce projet aideront à mieux comprendre les troubles pubertaires et contribueront à élucider les mécanismes d’actions impliquées dans le contrôle des fonctions de reproduction mâle et femelle. Cela pourrait ainsi conduire à développer des stratégies thérapeutiques spécifiques au sexe et à l’âge pour remédier aux troubles de la fertilité.
Bénéfices attendus
La puberté est une période critique de la vie qui permet d’atteindre la maturité sexuelle et ainsi permettre la reproduction. C’est une période cruciale de transition entre l’enfance et l’âge adulte qui, en plus de l’apparition des caractères sexuels secondaires, s’accompagne d’importants changements psychiques et comportementaux. Néanmoins de manière surprenante les mécanismes cérébraux sous-tendant ces changements sont aujourd’hui encore mal compris. Les données obtenues dans ce projet contribueront à déterminer les mécanismes d’action qui contrôlent l’organisation pubertaire du cerveau par les hormones stéroïdes sexuelles. Ceci est particulièrement pertinent si nous voulons développer de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.
Procédures
Une partie des souris mâles et femelles subiront une chirurgie intracérébrale stéréotaxique sous anesthésie générale avec réveil qui durera entre 30 et 45 minutes maximum. Celle-ci sera réalisée avec analgésie pré et post-opératoire. Un lot de souris femelles subira un acte de chirurgie afin d’induire la réceptivité par retrait chirurgical des ovaires et pose d’un implant hormonal : procédure chirurgicale d’une durée maximale de 10 minutes sur animaux anesthésiés et recevant une analgésie pré et post-opératoire. Ces femelles subiront également 2 injections sous-cutanées d’hormones avant les tests de comportement sexuels. Le comportement des mâles et femelles sera analysé à l’âge adulte : - comportement spontané d’accouplement (2 tests séparés de 15 jours, d’une durée 9h pour les mâles ; 3 tests séparés de 10 jours d’un durée de 30 minutes pour les femelles, sur animaux vigiles). - test d’activité locomotrice spontanée (durée de 120 minutes sur animaux vigiles) et test d’anxiété spontanée (durée de 9 minutes sur animaux vigiles). Une partie des animaux subiront un acte unique de chirurgie terminale effectuée sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes. Les animaux restants seront anesthésiés profondément et euthanasiés. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.
Impact sur les animaux
Dans le cadre des injections de vecteurs viraux, les chirurgies sur les animaux se feront sous anesthésie générale pendant lesquelles une injection stéréotaxique d’un vecteur viral sera réalisée. Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont une hypothermie, un arrêt cardio-respiratoire liée à l’anesthésie, une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux ainsi qu’une perte de poids rapide. Les injections d’anesthésiques et d’antalgiques peuvent générer une douleur légère au point de piqure. Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs liés aux tests comportementaux. Un stress peut être lié à l’hébergement individuel des mâles avant les tests de comportements. L’anesthésie effectuée pour les ovariectomies est également associée à certains risques (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire…). De plus, un stress peut être lié à la chirurgie effectuée chez les femelles. Cette chirurgie peut également entrainer des douleurs.
Devenir
La majorité des animaux seront euthanasiées afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses histologiques et fonctionnelles. Une faible partie des animaux seront euthanasiés sans prélèvement à la fin des expériences de comportement car ces souris femelles ne peuvent être réutilisées au-delà de la période de validité des implants délivrant des hormones pour étudier le comportement sexuel des mâles.
Remplacement
L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.
Réduction
Le nombre total d'animaux utilisé est de 4474, ce qui permet une analyse combinée des mâles et des femelles et cela à différents stades du développement pubertaire. Des protocoles biologiques différents ne permettent pas d’effectuer toutes les analyses sur les mêmes échantillons. L’expertise scientifique de l’équipe dans l’étude neuroanatomique des fonctions de reproduction permet de connaitre le nombre d’animaux nécessaire par groupe afin d’obtenir des résultats fiables. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, nous déterminerons avec une première cohorte d’animaux les meilleures conditions d’injection des vecteurs viraux. Les effectifs utilisés ont été calculés au plus juste afin d'obtenir une analyse statistique significative le cas échéant, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs régions du cerveau seront analysées en même temps pour le même animal. Les autres organes seront proposés aux collaborateurs de l'équipe comme cela est fait habituellement. Par ailleurs, les résultats obtenus au fil de la réalisation de ce projet nous permettront d’affiner nos besoins et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires. En effet, nous envisageons de sélectionner les conditions induisant une perturbation du comportement sexuel à l’âge adulte, lors des premières expérimentations, afin de conserver uniquement celles-ci dans les expérimentations suivantes. Le nombre d’animaux indiqué dans cette demande correspond au nombre maximal d’animaux pouvant être utilisés dans cette étude.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Pour les mâles hébergés individuellement, un enrichissement avec du nid végétal et des buchettes en bois seront mis en œuvre pour réduire la contrainte de l’hébergement individuel. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées quotidiennement en post-opératoire, puis hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Pour gérer la douleur post-opératoire, un analgésique sera administré pendant les 3 jours suivant l’opération. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Des souris mâles et femelles adultes seront utilisées. De plus, des souris mâles et femelles seront utilisées à différents âges prépubertaires et pubertaires. Ce projet vise à étudier le rôle des hormones pendant le développement pubertaire, l’utilisation de ces différents âges permettra d’étudier le plus précisément possible les mécanismes au niveau du cerveau pendant cette période.