Recherche fondamentale

634 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 510 d'entre elles subissent une ovariectomie pour induire une ostéoporose, d'autres reçoivent des injections sous-cutanées ou intrapéritonéales répétées, et toutes une ponction intracardiaque au moment de la mise à mort pour prélever le sang et les organes. Le porteur affirme que l'ovariectomie n'affecte pas le bien-être des animaux non-humains hormis un stress chirurgical transitoire, et fixe un point limite de mise à mort à 15 % de perte de poids. Sur le remplacement, il décrit les rares lignées cellulaires disponibles comme incapables de reproduire la diversité des ostéoclastes et conclut que le recours à la souris reste "indispensable".

Objectifs

L'ostéoporose est une pathologie liée à la chute des estrogènes à la ménopause ou à certaines maladies inflammatoires. Elle est caractérisée par une diminution de la masse osseuse due à une différenciation accrue des ostéoclastes, cellules responsables de la dégradation de la matrice osseuse. Ces cellules ont été longtemps considérées comme une population unique de cellules et les thérapies actuelles bloquent de façon globale l'activité des ostéoclastes. Elles sont efficaces, mais à long terme, elles ont des effets néfastes (os de mauvaise qualité, risque accru de fracture). De nouvelles approches thérapeutiques sont donc nécessaires. Il a été récemment démontré qu’il existe plusieurs populations d'ostéoclastes qui ont des propriétés et des fonctions différentes. Notre but est donc de caractériser ces différentes populations d'ostéoclastes en condition normale ou ostéoporotique pour déterminer quels ostéoclastes sont responsables de la destruction osseuse pathologique associée à l’ostéoporose. Cela pourrait conduire à des thérapies ciblées sur ces ostéoclastes pathologiques, sans affecter les autres. Ce projet aura donc des retombées importantes pour l’ostéoporose et les maladies inflammatoires associées à une perte osseuse. Nous travaillerons sur 2 modèles bien caractérisés et largement étudiés, l'ostéoporose post-ménopausique induite chez la souris femelle par ovariectomie, et la destruction osseuse inflammatoire induite par injection sous-cutanée au niveau de la calvaria (os supérieur du crâne) de facteurs stimulant la formation des ostéoclastes. Ces 2 modèles ont déjà permis de caractériser certaines propriétés des ostéoclastes conservées chez l'Homme. Nous utiliserons des souris normales commerciales et des souris génétiquement modifiées, déficientes pour le métabolisme du glucose (pfkb3) car nos résultats in vitro suggèrent que les populations d'ostéoclastes diffèrent dans leur capacité à utiliser et métaboliser le glucose, ce qui peut impacter leur fonction. Cela nous permettra de déterminer si la modulation du métabolisme du glucose peut réduire les ostéoclastes pathologiques in vivo dans le contexte de la destruction osseuse.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre la diversité des ostéoclastes chez un individu normal ou ayant une destruction osseuse. Cette diversité a été identifiée très récemmment et est très peu documentée dans la litérature. C'est donc un projet original qui apportera des connaissances très nouvelles sur la biologie des ostéoclastes. Identifier les sous-populations d'ostéoclastes qui sont spécifiquement impliquées dans la destruction osseuse pourra à terme permettre d'améliorer les traitements des pertes osseuses en ciblant de façon spécifique ces ostéoclastes pathologiques sans affecter ceux responsables du remodelage osseux physiologique. Enfin, de nombreuses maladies sont associées à une destruction osseuse (rhumatismes inflammatoires, tumeurs osseusesn et autres maladies inflammatoires). Nos résultats pourront donc avoir des conséquences plus larges que l'ostéoporose post-ménauposique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale pour induire une ostéoporose par ovariectomie. L’intervention (temps d’anesthésie) dure environ 15 minutes. Cela concerne 510 animaux qui seront opérés une seule fois. Les animaux recevront également des injections sous-cutanées de quelques secondes, soit 1 seule fois pour 96 animaux, soit 2 fois par jour pendant 3 jours consécutifs pour 48 animaux. Tous les animaux recevront des injections intrapéritonéales, soit une seule fois au moment de la mise à mort pour 144 animaux, soit 2 fois (une au moment de la chirurgie et une au moment de la mise à mort) pour les 510 animaux soumis à la procédure de chirurgie. Enfin ils seront également soumis une seule fois à une ponction intracardiaque de 2-3 minutes après anesthésie pour collecter le sang. Cela concerne tous les animaux au moment de la mise à mort.

Impact sur les animaux

L'ovariectomie est le modèle standard d'ostéoporose utilisé en recherche. En dehors de l'acte chirurgical qui peut induire un stress transitoire, elle n'affecte pas le bien-être des animaux. La perte osseuse résultante n'induit pas de souffrance et est observable après 3 semaines. Dans quelques cas, il peut y avoir une mauvaise cicatrisation de la plaie. La perte osseuse locale induite par injection sous-cutanée au niveau de la calvaria de facteurs stimulant les ostéoclastes est aussi un modèle validé. En dehors de l'injection sous-cutanée elle-même qui peut induire un stress très transitoire, elle n'affecte pas le bien-être des animaux et la perte osseuse résultante n'induit pas de souffrance. Elle est observée 5 jours après l'injection et est localisée à la calvaria. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons n'ont pas de phénotype dommageable (viabilité, poids, comportement et reproduction normaux). Nos résultats préliminaires montrent que les ostéoclastes pathologiques sont présents en très faible proportion chez les souris normales. Leur phénotype n'a donc pas d'incidence sur les animaux

Devenir

Tous les animaux dans chacune des procédures seront mis à mort pour permettre le prélèvement des organes pour l'analyse du phénotype et de la fonction des ostéoclastes et de leurs progéniteurs, ainsi que pour la mise en culture de cellules primaires.

Remplacement

L’existence de plusieurs populations d’ostéoclastes n’a été mise en évidence que très récemment et les rares lignées de cellules disponbles pour étudier les ostéoclastes ne reproduisent pas leur diversité et ne permettent pas d'analyser leur interaction avec leur environnement. Elles ne reproduisent pas non plus le phénotype des ostéoclastes pathologiques. L'utilisation d'ostéoclastes primaires issus de souris saines ou ayant une destruction osseuse reste donc indispensable. De plus, étant donné la complexité des mécanismes impliqués, aborder ce problème seulement par des analyses in vitro n'est pas suffisant et le recours à des modèles animaux est lui aussi indispensable. Pour l’instant, aucune méthode alternative in vitro n’est adaptée afin de remplacer totalement le modèle murin. Cependant, nos résultats pourraient permettre à terme d’améliorer ces modèles in vitro en les modifiant génétiquement grâce aux marqueurs et autres caractéristiques que nous identifierons pour qu'ils reproduisent les différentes sous-populations d'ostéoclastes. Si cela est possible, cela permettrait à terme de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de ces cellules en condition normale et pathologique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé au plus juste en fonction du nombre de cellules nécessaire aux différentes analyses et d'une évaluation statistique, en tenant compte de pertes éventuelles afin de ne pas avoir à répéter inutilement les procédures, et avec le nombre de souris minimum par groupe. Pour l'évaluation statistique, nous avons utilisé le test G*power qui permet d'estimer le nombre d'animaux nécessaires en fonction des différences attendues sur la base de nos expériences antérieures et des résultats de la littérature. Chaque animal inclus dans l'analyse est utilisé de façon optimale pour permettre l'analyse simultanée d'un maximum de paramètres et réduire encore le nombre d'animaux. Nous ne produisons ni ne commandons plus d'animaux que ceux nécessaires à chaque expérience. Enfin, l’excédent de cellules sera congelé pour utilisation ultérieure ce qui nous permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux

Raffinement

Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Pour réduire au maximum la souffrance des animaux, une grille de score a été établie pour le suivi des animaux avec des critères bien définis pour détecter tout signe de souffrance et des points limites bien définis. La procédure d'ovariectomie inclut un traitement pré-opératoire par un analgésique (buprénorphine), et un suivi post-opératoire selon la grille de score présentée en annexe. Un antalgique sera administré si les animaux présentent des signes de souffrance. Si ces signes ne disparaissent pas, comme indiqué dans la grille de score, ils seront mis à mort par dislocation cervicale. Si le score atteint la limite de 6 (point limite) les animaux seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale. Les animaux ovariectomisés seront pesés toutes les semaines car l'ovariectomie est caractérisée par une prise de poids modérée (environ 10%). Si au contraire une diminution du poids est observée, les animaux seront pesés 2 fois par semaine et s’ils présentent une perte de 15% par rapport à leur poids au jour 0, ils seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale (point limite).

Choix des espèces

Nos résultats précédents, ainsi que la majorité des données de la littérature sur lesquelles nous nous appuyons, ont été obtenus chez la souris. Nous allons travailler par analogie avec ces résultats dans la continuation de nos travaux précédents. Les données de la littérature montrent que les deux modèles utilisés (ovariectomie et modèle calvaria) ont permis de générer des données qui ont ensuite été validées chez les patients (sur d'autres questions touchant les ostéoclastes). Enfin, il existe déjà des modèles de souris génétiquement modifiées dont l'utilisation permettra de répondre à certaines de nos questions. Pour toutes les procédures, nous utiliserons des animaux au stade adulte, entre 6 et 12 semaines. A ce stade le système osseux des souris est mature et c'est le stade auquel nous avons déjà travaillé dans nos études précédentes.

240 crapauds communs vont être capturés dans la nature, prélevés puis relâchés sur place, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu subit sous anesthésie locale une ponction de sang directement dans le cœur, avec deux tentatives au maximum, avant d'être surveillé au réveil puis relâché en moins d'une heure. Le porteur étudie l'effet de la pollution lumineuse nocturne sur leurs défenses immunitaires le long d'un gradient d'éclairage, et présente les retombées pour la conservation des amphibiens. Il affirme que ces traits immunitaires ne sont "pas modélisables" et qu'aucune expérience in vitro ou in silico ne peut y donner accès.

Objectifs

Dans les dernières décennies, la lumière artificielle nocturne a considérablement augmenté et est maintenant considérée comme une source de pollution. Le halo lumineux généré par les villes s’étend jusqu’à des zones naturelles pourtant éloignées de plusieurs dizaines de kilomètres des centres urbains. Du fait de l’urbanisation croissante, les zones humides, qui concentrent une part considérable de la biodiversité, se retrouvent fréquemment dans des aires urbaines et péri-urbaines exposées à la pollution lumineuse. Les amphibiens, qui sont le groupe de vertébrés le plus menacé à l’échelle mondiale, dépendent de ces zones humides en raison de leur cycle de vie complexe à l’interface entre les milieux aquatiques et terrestres. Leur rythme d’activité, principalement nocturne, les exposent particulièrement à la pollution lumineuse. Nous avons montré, à l’aide d’une approche transcriptomique, que des têtards de crapaud commun Bufo bufo soumis à de la lumière nocturne durant leur développement présentent une sous-expression de nombreux gènes liés à l’immunité innée, et une sur-expression de gènes impliqués dans l’inflammation par rapport aux animaux témoins. Or, en milieu naturel, la capacité du système immunitaire à lutter contre les agents pathogènes est une fonction cruciale pour ces espèces très sensibles aux infections virales et fongiques. Il est donc nécessaire de déterminer si les modifications transcriptomiques observées chez les têtards exposés à cette pollution se traduisent bien par des capacités immunitaires altérées à l’échelle de l’organisme. Afin de répondre à cette question, le projet proposé a pour but de caractériser fonctionnellement l’impact de la pollution lumineuse nocturne sur le phénotype immunitaire du crapaud commun. Pour cela, nous allons mesurer les capacités immunitaires et l’état de santé de différentes populations de crapauds en fonction d’un gradient de pollution lumineuse. Cela permettra de tester si la modification de l’expression des gènes liés à l’immunité a bien des conséquences fonctionnelles au niveau des capacités immunitaires des adultes, leur permettant de lutter contre les agents pathogènes. Ce type d’étude, bien que primordiale en biologie de la conservation et en éco-immunologie, est très rarement menée dans la nature compte tenu de la complexité des variables immunitaires mise en jeu. Les résultats attendus seront directement utilisables en biologie de la conservation par les gestionnaires des territoires.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de cette expérimentation seront valorisables à la fois au niveau fondamental en Eco-immunologie et à un niveau plus appliqué en Biologie de la Conservation. En effet, dans le cadre du concept de Santé Unique, comprendre les dynamiques d’interactions entre les sources de pollutions anthropiques et les espèces en milieu naturel est indispensable au contrôle des épidémies futures. Ce projet va permettre, pour la première fois, de caractériser de manière précise les réponses immunitaires chez un amphibien dans des conditions de lumière nocturne réalistes présentes sur le terrain. Nous allons utiliser une combinaison de mesure de traits immunitaires qui permettent de mieux appréhender la complexité des effecteurs (innés, acquis, cellulaires et humoraux) caractérisant la fonction immunitaire. Cette étude pionnière donnera des indications sur la pertinence et la

Procédures

Pour les 240 crapauds prélevés (nombre maximum), nous prévoyons un prélèvement sanguin par cardiocentèse après anesthésie des individus par application cutanée de la crème EMLA 5% lidocaïne + prilocaïne (voie percutanée). Le prélèvement sera réalisé en quelques minutes. Pas plus de deux tentatives ne seront réalisées chez le même individu. En comptant l’induction de l’anesthésie (environ 10 min) et le temps de réveil monitoré par un opérateur (de 5 à 30 min selon les individus), nous évaluons le temps total de la procédure à partir de la capture à un maximum de 1 heure. Après la procédure, les individus seront relâchés et ne seront donc échantillonné qu’une seule fois au cours de ce projet.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention peut induire un stress chez les crapauds, qui sera minimisé par une limitation de la durée de la contention entre 3 et 5 minutes. La prise de sang par cardiocentèse représente un effet traumatique mais modéré car se fera sous anesthésie (application locale crème EMLA, dosage standardisé).

Devenir

Après la capture et la prise de sang effectué sous narcose, suivie de la surveillance des individus lors de la période de réveil, tous les individus vigiles présentant un comportement actif normal seront relâchés en milieu naturel sur le lieu exact de leur capture dans un délai évalué à 1 heure. Une seule session de capture sera organisée sur chacun des sites, les individus ne seront donc capturés qu’une seule fois pour ce projet.

Remplacement

La réponse immunitaire est une fonction physiologique complexe, composée de multiples effecteurs (innés et adaptatifs, cellulaires et humoraux) qui est modulée en miroir des conditions environnementales locales. Les traits immunitaires des individus, notamment en milieu naturel, ne sont pas modélisables et leur mesure nécessite le prélèvement sanguin sur organisme vivant et sain. Aucune expérience in vitro ou in silico ne peut permettre d’accéder à ce type de données.

Réduction

La capture et l’échantillonnage réalisés sur les individus adultes ont été optimisés statistiquement, de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et prélevés dans la nature tout en obtenant des résultats significatifs. Quinze individus par site seront capturés. Cela représente le nombre minimal d’individus nous permettant d’avoir une information réaliste et exploitable sur l’état de santé des crapauds du site. Une autorisation préfectorale a été obtenue pour les sites concernés, le nombre d’individus et les prélèvements réalisés. Enfin, la quantité de sang prélevée sera utilisée dans son entièreté. Les culots de globules rouges restants des prélèvements sanguins seront conservés à -80° pour des mesures ultérieures de longueur de télomères, mesure possible chez les amphibiens qui présentent la particularité d’avoir des globules rouges nucléés. Cette mesure permettra une évaluation du stress environnemental.

Raffinement

Le bien-être et la minimisation du stress infligé aux animaux est une condition sine qua non de cet échantillonnage en milieu naturel et fera l’objet de toute notre vigilance et notre adaptation à chaque individu échantillonné. Les crapauds seront délicatement prélevés sur le terrain à la main avec port de gants à usage unique. Chaque individu sera essuyé délicatement avant pesée nous permettant

Choix des espèces

Les amphibiens sont un taxa très menacé mondialement. En dehors des chiroptères, les amphibiens contiennent la plus grande proportion d’espèces nocturnes (93%) susceptibles d’être affectés par la pollution lumineuse. Le crapaud commun, espèce sentinelle, est présent dans les zones péri-urbaines et urbaines régulièrement soumise à la pollution nocturne. Ainsi, dans son environnement naturel, cette espèce est soumise à des éclairements bien supérieurs aux éclairements de la photopériode naturelle, pouvant affecter sa physiologie et son comportement. Le choix de cette espèce est donc particulièrement adapté à l’étude des effets de la pollution lumineuse. De plus, la pollution lumineuse semble avoir d’importants effets sur le système immunitaire de cette espèce, la fonction physiologique de défense des individus en milieu naturel. Ce taxa étant particulièrement sensible aux épidémies bactériennes et fongiques, les résultats obtenus seront susceptibles d’avoir une grande portée de conservation et pour la gestion des territoires. Nous avons choisi de travailler sur les adultes car ce stade est particulièrement impacté par la pollution lumineuse nocturne, notamment au moment de la reproduction (sortie de l’hiver – début du printemps) où ils doivent se déplacer pour rejoindre les sites de ponte. De plus, des perturbations physiologiques à ce stade auraient directement des impacts sur le succès reproducteur des individus, et donc sur les dynamiques des populations. Enfin, le système immunitaire des individus adultes étant complètement développé, les résultats obtenus seront plus généralisables qu’à des stades plus juvéniles.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour dans le nez, sous anesthésie, un condensat de fumée de cigarette pendant huit semaines, puis une bactérie ou un champignon respiratoires, avant d'être tuées pour prélever leur sang et leurs poumons. Le porteur décrit une perte de poids initiale et des troubles respiratoires possibles, et indique que l'infection bactérienne rend les souris fébriles sans les tuer. Il étudie ainsi les mécanismes de la bronchopneumopathie chronique obstructive et affirme nécessaire de prendre en compte l'"organisme en entier" après des travaux in vitro.

Objectifs

La Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) est une maladie inflammatoire chronique des bronches, se caractérisant par un rétrécissement progressif et une obstruction permanente des voies aériennes dont le facteur de risque principal est la fumée de cigarette. Nous savons maintenant que la progression et la sévérité de la BPCO est accentuée suite à des exacerbations provoquées essentiellement par des infections respiratoires. Malheureusement, les mécanismes qui gouvernent la pathogenèse des exacerbations de BPCO sont encore obscurs à ce jour et les thérapies demeurent inefficaces. Cela est dû à une mauvaise compréhension des mécanismes sous-jacents de la genèse de la maladie. Dans ce projet, nous nous intéressons aux pathogènes fréquemment isolés au cours de l’exacerbation des BPCO, la bactérie Haemophilus influenzae et le champignon Aspergillus fumigatus. Ce projet vise à déterminer les mécanismes impliqués dans l’inflammation pulmonaire causée par la cigarette et les pathogènes grâce à des modèles murins.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre d’en apprendre davantage sur les mécanismes impliqués dans l’inflammation chronique au cours de la BPCO et notamment dans l’exacerbation de BPCO par Haemophilus influenzae et/ou Aspergillus fumigatus. Une première expérience sur modèle murin avec Aspergillus fumigatus nous a permis d’identifier des médiateurs inflammatoires clés impliqués dans le recrutement de cellules immunitaires dans l’exacerbation de BPCO médiée par le champignon Aspergillus fumigatus et nous souhaiterions étudier plus en détail les mécanismes permettant cette augmentation d’inflammation. Nous utilisons des souris sauvages et une lignée de souris génétiquement modifiée permettant d’invalider des enzymes du neutrophile car ce sont des enzymes qui vont dégrader le tissu pulmonaire et conduire à une perte des fonctions respiratoires.

Procédures

Instillation intranasale de solution saline (souris contrôles) ou de fumée de cigarette en solution (souris cigarettes et Cigarettes+pathogènes) 1 fois/jour, 5 jours/semaine et pendant 8 semaines. Instillation intranasale de solution saline (souris contrôles et souris cigarettes) ou de pathogènes (souris pathogènes et Cigarettes+pathogènes) additionné de solution saline ou de fumée de cigarette en solution : cette instillation aura lieu 4 semaines après le début de l’expérimentation et 24h avant la mise à mort des animaux, à la place de l’instillation effectuée les autres jours, afin de ne réaliser qu’une anesthésie et une instillation ces 2 jours. Toutes les instillations se feront après anesthésie (1 à 3min en fonction de la vérification de l’immobilité et absence de réflexe de retrait de la patte arrière des animaux en appuyant sur celle-ci). L’instillation intranasale dure moins de 2 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont une perte de poids au démarrage de l’exposition mais le poids devrait se stabiliser au cours des semaines, un stress notamment lié à l’anesthésie et qui ne devrait pas durer après l’exposition, possibilité de troubles respiratoires après exposition aux pathogènes ou à la fumée de cigarette en solution ou la combinaison exposition aux pathogènes et à la fumée de cigarette en solution. Concernant l’infection intranasale bactérienne, elle rend les souris fébriles indépendamment de leurs génotypes 24h post-challenge sans engendrer de mortalité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les prélèvements sanguins et pulmonaires.

Remplacement

Afin de mener à bien ces investigations, des études in vitro ont été menées en amont. Il s’agit à présent de prendre en considération l’organisme en entier pour un cadre plus complexe et réel. De plus, la souris est un modèle éprouvé et fiable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour ne garder que le nombre nécessaire aux analyses statistiques. L’utilisation de 8 souris (4 mâles et 4 femelles = ratio équivalent) par groupe permettra d’obtenir des résultats statistiquement significatifs à cause des variabilités de réponse qui peuvent exister entre souris et pouvoir regarder les biais sexuels éventuels (4 mâles et 4 femelles/groupe). Lors de notre précédente expérimentation, l’utilisation de 8 souris par groupe a permis d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe, dans des conditions d’hébergement optimisées pour assurer leur confort (enrichissement, soins et suivi post-instillation). Une anesthésie générale sera réalisée avant toute instillation pour limiter tout risque de douleur et d’angoisse pouvant résulter de l’intervention. Les animaux seront observés 2 fois par jour et pesés 2 fois par semaine pour suivre leur prise de poids. Les expérimentateurs sont formés aux gestes impliquant un contact avec l’animal et à l’observation des signes cliniques fondamentaux. La connaissance des modèles animaux a permis de définir des points limites précis.

Choix des espèces

La souris est utilisée dans cette procédure plutôt que la drosophile car il s’agit d’un modèle proche de l’Homme et qui est adapté pour étudier la réponse inflammatoire ou immunitaire avec des mécanismes similaires à ceux présents chez l’Homme. La souris peut être modifiée génétiquement pour définir l’importance relative du gène d’intérêt en condition physiologique ou physiopathologique Les souris utilisées auront entre 8-10 semaines, soit environ 25-30 grs, afin d'utiliser des animaux à maturation pulmonaire.

32 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis transférés vivants vers un autre établissement pour une étude en cages métaboliques. Ils reçoivent chaque jour pendant quarante-deux jours une injection d'ORY-1001 ou d'un placebo, avec des prises de sang hebdomadaires et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur indique que les injections peuvent être douloureuses, prévenues par une anesthésie locale, et que le traitement pourrait réduire de 10 à 20 % la prise de poids. Il présente cette molécule comme une piste contre le diabète et l'obésité, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace l'étude du métabolisme sur l'animal vivant.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier une nouvelle stratégie thérapeutique dans le traitement des pathologies comme l'obésité ou le diabète de type 2. Actuellement, les enjeux actuels de la prise en charge de ces maladies sont de trouver de nouveaux traitements pouvant agir sur la perte de poids et sur le contrôle glycémique. De nombreuses études se sont penchées sur la régulation des hormones secretée par l'estomac qui stimulent la sécrétion d'insuline après le repas. Le traitement qui sera étudié peut augmenter la secretion d'insuline après le repas en augmentant la sensibilité à ces hormones secretées par l'estomac. L’objectif de notre étude est d'étudier ce nouveau traitement en vue de l'utiliser comme un traitement du diabète ou de l'obésité.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra d’étudier dans un premier temps les effets de ce nouveau traitement sur la glycémie, le poids et différents marqueurs des maladies métaboliques comme le diabète et l'obésité. Au décours de cette première étude sur des animaux sains, une étude similaire sur des animaux diabètique pourra être réalisée. Ainsi l'ensemble de ce travail pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques dans les maladies métaboliques telles que le diabète et l'obésité.

Procédures

A l’âge de 8 semaines, les animaux seront divisés en deux sous-groupes : "Traitement" et "Placebo". Les animaux traités recevront le traitement 7 jours sur 7. Le groupe placebo recevra un soluté salé isotonique. Ces traitements seront administrés par injection pendant 42 jours. Le poids des animaux sera relevé et un prélèvement biologique sera réalisé tous les 7 jours. Avant l’arrêt du traitement, un test de tolérance glucidique et un test de sensibilité à l’insuline espacés de 72h incluant différents prelevements tous les 15 minutes pendant 120 seront réalisés.

Impact sur les animaux

L'administration du traitement et les prises de sang pourront être source de douleur au moment de l'injection qui sera prevenu par l'utilisation d'une anesthésie locale avant les injections et avant les prises de sang. Le traitement pourra entrainer une prise de poids en fonction de l'âge moins importante dans le groupe recevant le traitement (nous estimons cette différence entre 10 et 20 % par rapport à un animal recevant un placebo).

Devenir

Les animaux seront transferés dans un autre etablissement à l'issu de la dernière procédure pour étude phénotypique dans des cages métaboliques.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux dans l’étude du métabolisme est nécessaire pour reproduire au mieux le métabolisme humain. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive qui permette un remplacement in vitro et l’étude de nouvelles stratégies thérapeutiques doit nécessairement être faite in vivo. Le métabolisme et l’homéostasie glucidique représentent des systèmes intégrés qui ne peuvent être étudié uniquement in vitro : en effet, l’utilisation d’animaux permettra d’étudier de manière simultanée les conséquences de l’inhibition pharmacologiques sur différents tissus essentiels à l’homéostasie métabolique comme le pancréas, le tissu adipeux, et le foie.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un test statistique utilisant les études de faisabilité du traitement afin de garantir l'observation d'un effet du traitement. Grâce à ce test, nous obtenons n = 16 animaux par groupe. Les animaux seront suivis de manière longitudinale et les mesures répétées au cours du temps permettant de diminuer le nombre d'animaux à inclure.

Raffinement

La prise de poids des animaux et les prélèvements biologiques qui auront lieu tous les 7 jours seront réalisés simultanément pour limiter au maximum le stress des animaux. La tolérance des animaux sera évaluée quotidiennement. Les injections et les prelevements seront précédés d'une anesthesie locale afin de diminuer au maximum la douleur pouvant être engendrée par la procédure. Les cages sont pourvues de tubes ainsi que du coton de nidation et des bâtonnets de bois raffinant ainsi les conditions de vie des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats Wistars Han largement disponibles et dont le métabolisme se rapproche du métabolisme humain. Ces animaux représentent un modèle d'étude polyvalent. Les procédures seront débutées à l’âge de 8 semaines (âge adulte des animaux)

94 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie des injections d'infliximab agrégé ou non à la base de la queue, subissent des biopsies de peau et des prises de sang, puis sont tuées au dioxyde de carbone pour prélever leurs ganglions et organes lymphoïdes. Le porteur décrit une douleur au point d'injection et un état inflammatoire de type fébrile qu'il juge transitoire, sans perte de poids attendue. Il veut suivre le trajet des agrégats d'anticorps dans l'"organisme entier" et affirme que les cultures de cellules ne suffisent pas à trancher.

Objectifs

Lorsque les patients sont traités avec des anticorps thérapeutiques, ces derniers peuvent s’associer pour former des agrégats pouvant produire des effets secondaires délétères pour les patients. Notre équipe étudie la façon dont les agrégats d’anticorps sont perçus par notre système immunitaire. Nous avons déjà montré qu’ils peuvent activer différents types de cellules immunitaires humaines en culture. Toutefois, ces données in vitro ne nous permettent pas d’évaluer la prise en charge des agrégats par les différentes cellules au sein de l’organisme entier, ni d’étudier le transport des formes agrégées d’anticorps depuis le site d’injection vers les organes où se développe la réponse immunitaire. Pour cette raison, un modèle d’étude animal est nécessaire, afin de disposer de données concernant la dynamique de prise en charge des agrégats dans l’organisme entier, et d’identifier les cellules immunitaires activées au niveau des organes lymphoïdes, où ont lieu les interactions entre cellules immunitaires. Cette étude sera menée chez la souris et est dimensionnée pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, en garantissant la possibilité de dégager des conclusions robustes. Les aspects de raffinement des procédures de maintien et manipulation des animaux ont été également optimisés.

Bénéfices attendus

L’immunogénicité des anticorps thérapeutiques est suivie par la mesure de différents paramètres chez les patients en cours de traitement, cependant l’effet particulier des agrégats d’anticorps ne peut être distingué lors de ce suivi. Afin de prédire et d’évaluer la réponse immunitaire due spécifiquement aux agrégats, ces études doivent être complétées par un modèle intégré, permettant de suivre la migration des cellules immunitaires prenant en charge les agrégats au site d’injection, leur activation, ainsi que leurs interactions avec un environnement cellulaire complexe au sein de l’organisme. C’est en cela que le modèle animal est pertinent. Ce projet permettra d’apporter des réponses précises quant à la prise en charge des agrégats d’anticorps au site de l’injection, de suivre les populations cellulaires permettant leur migration vers les organes lymphoïdes, et d’étudier de manière approfondie les populations de cellules recrutées dans ces organes. A notre connaissance, une telle étude n’a jamais été réalisée. Elle apportera des éléments scientifiques nouveaux quant au rôle des agrégats dans l’immunisation contre les anticorps thérapeutiques et la mobilisation des cellules immunitaires impliquées. Ces données sont importantes pour comprendre comment les patients s’immunisent contre leur traitement et quelle est la contribution des agrégats protéiques dans ce processus.

Procédures

Il s’agit d’administrer un anticorps thérapeutique sous forme agrégée ou non à différents groupes de souris, afin d’analyser les réponses cellulaires induites, ainsi que le cheminement des agrégats dans les organes lymphoïdes. Pour cela les souris seront sous anesthésie gazeuse et l’anticorps sera administré sous forme agrégée ou non, par voie sous cutanée à la base de la queue. Pour 3 groupes, les souris seront euthanasiées par inhalation de dioxyde de carbone 2h, 4h et 24 heures après l’injection, puis des biopsies de la peau seront réalisées au site d’injection, pour en extraire les cellules cutanées pour analyse. Les ganglions lymphatiques inguinaux seront également prélevés pour également y analyser les populations de cellules. Pour 3 autres groupes, des prélèvements sanguins seront effectués à 3 temps (J7, J14 et J28), afin de réaliser des dosages dans le sang. Pour limiter l’anxiété et la douleur, les animaux seront prélevés sous anesthésie gazeuse. Puis les souris seront euthanasiées au 28ème jour, par inhalation de dioxyde de carbone, et les organes lymphoïdes seront prélevés pour analyser les populations de cellules immunitaires qui s’y trouvent.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration des différents produits, la viscosité des préparations va probablement engendrer une douleur au point d’injection et un état général inflammatoire des animaux (fièvre), comme lors d’une vaccination. Cet état devrait être transitoire cependant, et nous n’anticipons pas de perte de poids ou de dégradation de l’état général des animaux. L’effet de ces injections répétées sera la mise en place d’une réponse immunitaire chez l’animal, sans dégradation de l’état général attendue. Pour limiter le stress des souris lors des immunisations et des prélèvements sanguins, elles seront anesthésiées par inhalation gazeuse.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélèvements de tissus et analyses post-mortem.

Remplacement

Chez les patients en cours de traitement, l’immunogénicité des anticorps thérapeutiques est suivie par la mesure de différents paramètres cependant l’effet particulier des agrégats d’anticorps ne peut être distingué lors de ce suivi. Il faut donc prévoir des modèles alternatifs permettant l’étude de l’impact des agrégats d’anticorps dans l’immunogénicité globale. On peut ainsi utiliser des cellules en culture issues de donneurs sains ou de patients. Mais ces études doivent être complétées par un modèle intégré, permettant de suivre au sein d’un organisme entier la migration des cellules immunitaires prenant en charge les agrégats au site d’injection, leur activation, ainsi que leurs interactions avec un environnement cellulaire complexe au sein des organes lymphoïdes. Ce type d’étude ne peut être directement réalisé chez l’homme, c’est pourquoi le modèle animal reste encore pertinent, et en particulier la souris.

Réduction

Notre protocole a été conçu pour minimiser le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la possibilité de dégager des conclusions robustes de nos travaux, pour les deux axes du projet : 1) Etude des réponses immunitaires chez des souris immunisées par l’infliximab agrégé ou non Sur la base des travaux antérieurs réalisés sur l’animal dans notre laboratoire, nous avons calculé que ces expériences nécessiteront 8 animaux par groupe afin de pouvoir réaliser des tests statistiques adaptés aux groupes de petits effectifs. Donc au total en nombre d’animaux est restreint à 40 animaux. Cette première procédure constitue une étude pilote de manière à vérifier que les souris sont capables de monter une réponse immunitaire contre l’infliximab et/ou les agrégats. Autrement dit elle est un pré-requis avant d’initier le second volet du travail. 2) Etude de la prise en charge et du transport des agrégats d’anticorps thérapeutiques par les sous-populations de DC La réalisation de l’ensemble de cette procédure, tenant compte des groupes de souris nécessitera 54 souris en tout. En effet, comme expliqué pour la première procédure nous avons calculé que 8 souris par groupe (traitées par infliximab non agrégé et agrégé) seront nécessaires afin de garantir l’interprétation des résultats et la possibilité de générer des conclusions statistiquement étayées.

Raffinement

Les souris seront hébergées selon les règles en vigueur en termes de densité de population et surveillées quotidiennement. Leur entretien sera réalisé par la même personne. Le temps de manipulation des souris sera minimisé afin de limiter le stress. Il sera réalisé par le même manipulateur, tout au long des protocoles. Les manipulations susceptibles d’induire de la douleur chez les animaux (injections et prélèvements sanguins) seront réalisées sous anesthésie gazeuse et une attention particulière de l’état général des souris sera apportée, pour déceler un comportement anormal. Une souris dont le comportement se modifie (prostration, poils mal entretenus et/ou hérissés) sera surveillée de façon accrue. Toute souris ayant perdu 20 % de son poids depuis le début du protocole ou 10% en 24h sera ainsi retirée du protocole. Les souris blessées au cours d’éventuelles bagarres seront isolées et les plaies désinfectées. Si les plaies perdurent, la souris sera retirée du protocole et euthanasiée. Le jour du sacrifice, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées.

Choix des espèces

Les expériences réalisées étudient la mobilisation des cellules du système immunitaire suite à l’immunisation par un anticorps thérapeutique natif ou agrégé. Classiquement ce type d’expérience se fait chez la souris car les mécanismes immunitaires sont comparables à ceux observés chez l’homme, et que de nombreux outils d’analyse sont disponibles pour suivre les cellules immunitaires et leurs réponses. C’est également le principal modèle animal utilisé dans la littérature pour les études d’immunogénicité chez le petit animal. Les souris utilisées pour ce type d’étude auront 7 semaines, et commenceront le protocole après deux semaines d’adaptation à leur nouvelle animalerie, afin d’atteindre le poids de 20g.

512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit l'ablation chirurgicale du ménisque du genou, l'autre une injection de monoïodoacétate dans l'articulation pour provoquer une arthrose, puis toutes marchent sur un tapis tous les quinze jours pendant quatre-vingt-dix jours afin de mesurer leur douleur. Le porteur précise qu'aucun traitement anti-inflammatoire n'est possible, l'objectif étant justement d'induire l'inflammation, avant la mise à mort pour prélever les articulations. Il teste un complément à base de peptides de collagène marin et de polyphénols, et présente le recours à la souris par ses "faibles coûts" et sa facilité de manipulation.

Objectifs

Les peptides de collagène marin ainsi que les extraits poly-phénoliques de pépins de raisin et d’olive possèdent des bénéfices démontrés et décrits dans la littérature sur l’arthrose. Le but de cette étude est d’évaluer l’effet d’un ingrédient Santé d’origine naturelle, associant peptides de collagène et polyphénols, pour les sujets sportifs et âgés susceptibles de développer une arthrose.

Bénéfices attendus

Trouver un traitement efficace à la diminution du développement de l’arthrose.

Procédures

Dans ce projet, nous évaluerons l’impact de l’association de nutraceutiques, peptides de collagènes et polyphénol, dans la progression de l’arthrose. Les souris recevront dans l'eau de boisson le traitement durant les 90 jours de l'étude. Un modèle d’arthrose post-traumatique, en ôtant le ménisque interne, sera réalisé sur des souris jeunes et âgées. Cette interventions sous anesthésie nécessite 20min par animaux. Un modèle d’arthrose par dégradation des cellules de l’articulation (les chondrocytes) sera également réalisé par injection de monoïodoacétate au niveau de l’articulation choisie du genou. Cette injection necessite la contention de l'animal pendant 1min. Afin d’évaluer les douleurs engendrées par les 2 modèles, les souris seront amenées à se déplacer librement sur un tapis de marche tous les 15 jours durant les 90 jours de l'étude. A la fin de l'étude, un prélevement de sang sera effectué.

Impact sur les animaux

Dans ces modèles murins d’arthrose, le geste chirurgical peut entrainer dans les jours suivants des difficultés chez les souris à se déplacer. Afin d’éviter la déshydratation des animaux, des biberons avec des embouts longs seront disposés au-dessus des cages. La prise hydrique est évaluée journalièrement. Des mangeoires et igloos seront disposés au fond de la cage.

Devenir

Une mise à mort sera effectuée afin de prélevé les tissus arthrosiques (articulation du genou) chez les souris

Remplacement

Dans un premier temps, une validation objective de l’efficacité biologique sera réalisée sur les différentes formulations de cette association entre peptides de collagène et extraits poly-phénoliques. Pour cela, la toxicité des produits développés seront déterminées in vitro par l’évaluation de leur cytotoxicité sur des chondrocytes (cellules du cartilage présentes dans les articulations), fibroblastes (cellules de la membrane synoviales de l’articulation) et macrophages (cellules de la membrane synoviale de l’articulation, mais également cellules immunitaires recrutées sur les sites inflammatoires dont les articulations arthrosiques). Les études in vivo complémentaires permettront de valider l’efficacité du produit choisi in vitro (seuls ou en association).

Réduction

Nous limitons la répétition inutile des expériences grâce à un échange permanant entre les membres de l’équipe. Nous essayons d’effectuer le maximum d’analyses réalisables sur les mêmes animaux sans altérer la qualité de l’expérience et le bien-être des animaux. Chaque animal sera son propre contrôle. L’arthrose induite sera effectuée sur une seule patte et les résultats seront comparées avec la patte saine, ce qui permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaire pour l’étude. Enfin, tous les protocoles expérimentaux sont, une fois validés, mis à disposition de l’ensemble des membres de l’équipe. Le nombre d’animaux utilisé correspond au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Les groupes d’animaux constitués de 6 individus permettront une étude statistique

Raffinement

En dehors de la visite quotidienne habituelle des animaux, les souris seront surveillées quotidiennement pendant 15 jours suite à l’intervention au niveau de l’articulation et puis 1 fois /semaine . Dans ces modèles murins d’arthrose, le geste chirurgical peut entrainer dans les jours suivants des difficultés chez les souris à se déplacer. Afin d’éviter la déshydratation des animaux, des biberons avec des embouts longs seront disposés au-dessus des cages. La prise hydrique est évaluée journalièrement. Des igloos et des croquettes seront disposés au fond de la cage pour l’enrichissement et pour faciliter la prise alimentaire. Il n’y a pas de possibilité de réaliser un traitement anti-inflammatoire car le but du modèle est d’induire une inflammation.

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc.) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Souris adultes car l’arthrose se développent majoritairement chez l’adulte : - Souris âgées de 8 à 10 semaines, afin de mimer l’adulte jeune sportif - Souris âgées de 12 à 18 mois, afin de mimer la personne âgée Ces deux populations, adulte jeune sportif et personnes âgées, sont celles les plus susceptibles de développer une arthrose.