Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
AVC : Développement de nouvelles stratégies thrombolytiques chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit trois chirurgies, dont la pose d'une prothèse crânienne et une craniotomie, puis une induction d'accident vasculaire cérébral sur animal éveillé, avec habituation à la contention et imagerie par IRM. Le porteur justifie ce modèle sur animal éveillé par la volonté de supprimer l'anesthésie, qu'il juge en partie responsable de l'échec des traitements testés chez l'humain. Il précise qu'aucun animal n'est gardé vivant, invoquant le risque d'infection et l'isolement en cage individuelle, et applique un point limite de perte de poids de 20 %.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (
Bénéfices attendus
L'objectif du projet étant de proposer un protocole de modélisation de l'ischémie plus pertinent et au plus près des conditions cliniques (patient éveillé lors de la survenue de l'AVC, de l'imagerie et du traitement), les bénéfices seraient de pouvoir progressivement remplacer les protocoles existants chez l'animal anesthésié par des protocoles chez l'animal vigile, ce qui augmenterait les chances de translation des résultats précliniques vers la clinique, sans pour autant déroger au respect de l'éthique de l'animal utilisé à des fins expérimentales. Le but ici est de proposer un protocole solide et reproductible, permettant d'obtenir des résultats fiables tant sur une stratégie de traitement fibrinolytique, ou neuroprotecteur. En supprimant l'anesthésie générale des prochaines études dont l'objectif serait de tester un traitement prometteur, il sera alors possible de tester les effets du traitement seul, et non plus du traitement couplé aux anesthésiques. Cela permettrait en cas d'échec chez le petit animal d'éviter de poursuivre ces études chez le gros animal ou chez le primate non humain (où l'anesthésie est de même utilisée contrairement à la clinique), dans un soucis de Réduction du nombre d'animaux. Le bénéfice attendu concernant la deuxième partie du projet serait d'exploiter ce modèle d'ischémie vigile pour caractériser et étudier les évènements vasculaires de manière très précoce, et ainsi comprendre les mécanismes physiopathologiques entrant en jeu selon la composition du caillot et des collatérales différentes. Le fait de mieux comprendre les évènements survenant lors d'un AVC et ce le plus tôt possible pourrait ensuite orienter les futures stratégies de prise en charge et/ou de traitement de l'AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis : A 3 chirurgies : Une chirurgie de pose de prothèse crânienne sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 20 minutes. Une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 30 à 45 minutes. Une chirurgie d'induction de l'ischémie sans anesthésie générale, sous couverture analgésique et sous anesthésie locale. A 2 protocoles comportementaux : Un protocole d'habituation à la contention et à l'IRM vigiles par jour pendant 5 jours consécutifs, avec des cessions augmentant progressivement de 15 min jusqu'à 1h30 au total. Un protocole de récupération fonctionnelle sur 5 jours, avec des sessions durant moins de 5 minutes par souris au total. A 3 protocoles d'imagerie vigile : Une à 3 acquisitions à l'imagerie ultrasonore, où chaque acquisition dure 5 minutes avec une injection de produit de contraste lors de chaque acquisition. Une à 2 acquisitions à l'IRM où chaque acquisition dure 30 minutes. Une acquisition en microscopie biphotonique durant 10 minutes avec injection de produit de contraste.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'appraître chez les animaux seraient : Des douleurs post opératoires après la pose de prothèse, un ennui ou un stress dus à la solitude des animaux (placés 1 par cage afin d'éviter les arrachements de prothèse) , un stress lors des premières sessions d'habituation à la contention, une perte de masse corporelle après les anesthésies et l'induction de l'AVC,des douleurs post opératoires après la chirurgie d'accès à l'ACM, un stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC.
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (540) seront mis à mort. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n'est pas concevable pour leur bien-être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subit une procédure sévère telle qu'une ischémie. De plus, le risque d'infection au niveau de la prothèse crânienne et de la craniotomie sont trop importants pour garder les souris en vie. Enfin, ces souris vivent dans des cages individuelles, et il n'est pas souhaitable pour leur bien-être au quotidien de rester trop longtemps solitaires.
Remplacement
Dans ce projet, il n’est pas possible de remplacer le modèle animal, il s’agit d’étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires physiopathologiques associés, survenant lors d'un l'AVC. Les effets de molécules pharmacologiques sur le développement des lésions cérébrales ainsi que la récupération fonctionnelle ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux a été determiné en reprenant les données d'études antérieures testant des molécules pharmacologiques sur le devenir des lésions ischémiques à la suite d'un AVC chez la souris, et ayant montré des résultats significatifs en réduisant le plus possible les effectifs. Au cours de ce projet, chaque animal faisant l'objet d'un suivi longitudinal est son propre contrôle, grâce à l'utilisation de l'imagerie. Cela permet de ne pas faire de groupes supplémentaires pour chaque étape du projet où il est nécessaire de caractériser l'ischémie cérébrale, en plus de renforcer la validité des résultats. Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires au projet à été réduit au maximum, en se basant sur les études déjà réalisées au sein du laboratoire et dans la littérature, ainsi que sur un calcul de puissance statistique, permettant d'avoir des résultats significatifs avec un minimum d'animaux. D'après les premières données obtenues sur l'ischémie vigile chez la souris, on observe une moyenne du volume de lésion lié à l'ischémie de 14 mm3 (+/- 9 mm3) dans le groupe contrôle, et de 5 mm3 dans le groupe traité. Pour un seuil de significativité à 95 % et une puissance de 80 % (beta = 20%), 16 animaux seraient nécessaires dans chaque groupe. Cependant, il peut arriver d'avoir de la mortalité ou des exclusions durant les nombreuses étapes de l'étude (arrachements de prothèse, perte de poids, stress trop intense lors des premières habituations ...). Le nombre d'animaux a donc été augmenté à 20 par groupe, sachant qu'il sera réduit à 16 si aucun incident ne survient au cours du protocole.
Raffinement
Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. Pour la partie nécessitant la pose d'une prothèse crânienne, les souris seront placées dans des cages individuelles afin de limiter les risques d'arrachement de la prothèse. Afin de palier au mieux à la solitude induite par la séparation, les cages seront enrichies (coton en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi que paillettes). Une période de récupération de 3 jours et prévue après la pose de la prothèse crânienne, durant laquelle les souris bénéficieront de croquettes humides dans une coupelle au sol afin de favoriser la prise de nourriture et l'hydratation. Le protocole d'habituation progressif à la contention permet de réduire le stress des souris lors de l'induction de l'AVC et de l'imagerie vigiles. Durant l'induction de l'AVC, les souris sont sous analgésie (buprénorphine, injection sous cutanée avec une aiguille de 25 G, minimum 20 min avant le début de la chirurgie afin d'atteindre le pic d'activité), et sous anesthésie locale au niveau de l'ACM à la Xylocaine (nébuliseur). Les yeux de la souris sont couverts afin de ne pas l'éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire, et des bouchons d'oreilles sont prévus pour l'IRM vigile, réduisant le bruit ambiant de 27 dB (selon les informations du fabricant). Après la chirurgie d'induction de l'AVC, les souris disposent de croquettes humides dans une coupelle au sol pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Concernant l'application des point limites, les animaux seront mis à mort (anesthésie profonde à l'Isoflurane suivie d'une dislocation cervicale) dans les 24 heures dans l'une des situations suivantes : - signes de douleur extérieure indexés sur le grimace-scale souris (NC3Rs) (Score >5 plus de 48h) ; - absence de réaction ; - animal inactif dans sa cage ; - complications chirurgicales inattendues (hémorragie impossible à stoper, détresse cadiorespiratoire, échec) ; - perte de poids >20%. - décollement de la prothèse crânienne
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’influence de l’anesthésie sur le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. L'étude se déroulera sur deux souches de souris (Swiss et C57/BL6) présentant des profils de collatérales différentes, et des réponses physiologiques à l'ischémie différentes, comme observé chez l'humain. De plus, ces deux souches sont régulièrement utilisées pour la recherche, d'où l'intérêt de valider ce modèle sur ces dernières. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 6 et 10 semaines (6 semaines lors du début du protocole, et 10 semaines arrivées à la fin du protocole). Le projet est réalisé avec des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Etude du rôle d’une protéine (serine/thréonine kinase) dans le développement des lymphocytes T in vivo
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
117 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 81 d'entre elles et modéré pour 36. Elles sont irradiées puis reçoivent une greffe de cellules immunitaires par voie intraveineuse, suivie de prélèvements sanguins et d'injections intrapéritonéales répétées. Le projet étudie une protéine kinase dont l'inactivation provoque chez la souris un syndrome proche du lupus. Le porteur indique tuer les animaux pour analyses ou parce qu'ils ne portent pas le génotype recherché, et affirme que le modèle souris reste "indispensable" après une étape in vitro.
Objectifs
La réponse immunitaire résulte de l’action combinée des cellules de l’immunité innée comme les cellules dendritiques dont la mission est de patrouiller dans l’organisme à la recherche de cellules infectées ou tumorales, et des cellules de l’immunité adaptative comme les lymphocytes B et T qui reconnaissent de manière spécifique les pathogènes. L’interaction entre toutes les cellules de l'immunité est indispensable pour permettre une réponse immunitaire efficace et l’éradication des pathogènes. S’il doit nous protéger contre les agressions extérieures, le système immunitaire doit aussi apprendre à tolérer ses propres constituants, c’est-à-dire le « soi ». Cependant dans certains cas, une sur-activation des lymphocytes T et/ou un défaut de la régulation de la réponse immunitaire peuvent provoquer l’apparition de maladies auto-immunes. Dans ce cas, des lymphocytes T auto-réactifs vont s’attaquer spécifiquement à des tissus ou organes au lieu de les protéger comme dans le cas du syndrome du Lupus. Ce projet va porter sur l’étude du rôle d’une protéine importante pour l’activation du lymphocyte T et dont nous étudions le rôle in vitro et in vivo.
Bénéfices attendus
Une dérégulation du système immunitaire peut entrainer l’apparition de maladies auto-immunes chez l’homme. Nous avons identifié une protéine dont l’inactivation dans les lymphocytes T chez la souris entraine le développement d’un syndrome auto-immun ayant des caractéristiques du syndrome lupique chez l’homme. Caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette molécule dans l’apparition des symptômes lupiques et plus généralement dans l’apparition de maladie auto-immune pourrait donc de la considérer comme une éventuelle cible thérapeutique de maladies auto-immunes.
Procédures
Dans une première procédure des souris vigiles seront irradiées. Quatre heures après l’irradiation, les animaux anesthésiés seront injectés par voie intraveineuse (durée de l’anesthésie < 5 minutes). Six semaines après l’injection, un prélèvement sanguin sera réalisé sur les animaux vigiles (durée du geste 10 secondes). Un second prélèvement sanguin pourra être réalisé sur certains animaux, deux semaines après le premier prélèvement (durée du geste 10 sec). Dans une seconde procédure, un prélèvement sanguin sur animal anesthésié (anesthésie
Impact sur les animaux
Intervention subie : Irradiation et greffe. L’irradiation des animaux entrainera une éradication des cellules de la moelle osseuse des animaux. L’irradiation et l’aplasie qui en découlent ne sont pas douloureux pour les animaux. Les animaux recevront 4 heures après l’irradiation, une injection intraveineuse de cellules immunitaires (=greffe) pour reconstituer leur système immunitaire. Les nuisances attendues suite à cette administration seront celles liées à l’injection d’un produit non douloureux par voie intraveineuse. Néanmoins dans le cas, où la greffe ne prendrait pas (cas rare), les animaux pourraient présenter une altération de l’état général (perte de poids/prostration) qui conduirait à la mise à mort des animaux concernés. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements dans l’abdomen seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques en intrapéritonéale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem ou parce qu'ils ne présentent pas le génotype d'intérêt.
Remplacement
Après des premières étapes d’analyse et de validation dans des lignées cellulaires in vitro, le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle de notre molécule d’intérêt dans le système immunitaire d’un organisme vivant et intégré comme la souris. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est réduit au maximum afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un outil statistique De plus les croisements des lignées de souris ont été optimisés afin d’obtenir le maximum d’animaux avec un phénotype utilisable dans nos expériences.
Raffinement
Les souris sont manipulées par des personnes entrainées aux injections. Les injections intraveineuses seront effectuées sous anesthésie gazeuse afin d’éviter tout stress et douleur chez la souris. L’état général des souris ayant été irradiées sera suivi quotidiennement pendant les 2 premières semaines afin de détecter le mal être dû à une éventuelle non-reconstitution. Des antibiotiques pourront le cas échéant être mis dans l’eau de boisson afin de prévenir les risques d’infection. Les animaux seront suivis quotidiennement grâce à une grille de score qui permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle de choix pour étudier les mécanismes de tolérance et le développement d’auto-immunité. Enfin, la connaissance complète du génome murin permet de disposer de souches murines parfaitement définies et de modèles génétiquement modifiés. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 12 semaines afin que leur système immunitaire soit mature.
Authentification de l’origine géographique des ovins par traçage isotopique
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
98 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 91 d'entre eux et modéré pour 7. Les brebis mères rejoignent le troupeau au tarissement, tandis que les agneaux sont abattus vers quinze mois pour des prélèvements post-mortem. Le projet trace des isotopes du carbone et du strontium par prises de sang et de fèces afin d'authentifier l'origine géographique de la viande d'agneau. Le porteur écrit avoir écarté le cheval, espèce visée, au profit d'ovins "classiquement abattus à la fin du cycle de production".
Objectifs
Le projet vise à fournir une compréhension sans précédent du rôle joué par les chevaux dans les interactions entre les communautés pastorales de Mongolie à l'âge du bronze tardif (LBA).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la cinétique d’incorporation des isotopes du C et Sr dans différents tissus, ce qui permettra d’évaluer le potentiel de ces éléments chimiques comme traceurs de l’origine géographique des animaux et de leur alimentation.
Procédures
Seuls les 7 animaux du lot 7 après le changement de régime seront concernés par les prises de sang et prélévements féces à J0, J3, J7 et J14, J21, J28.
Impact sur les animaux
Les variations de régimes alimentaires pourraient entrainer des désordres digestifs pour les animaux et les prélèvements du stress. Pour palier à cela, un certain nombre d'éléments seront mises en place. Les animaux seront logés et soignés dans les conditions traditionnelles ; de même les techniques de prélèvements (sang, féces, urine, laine) sont des pratiques couramment appliquées, aucune douleur n’est attendue mais un léger stress interviendra lors de ces procédures. La contention physique des animaux s’effectuera dans les conditions habituelles d’élevage par des personnes formées et habituées à ces manipulations. Lors des changements de régime, une période de transition sera effectuée avec l’incorporation progressive du régime suivant afin de permettre aux animaux de s’adapter et de ne pas créer de stress alimentaire. Pour le régime 2 (maïs + foin) un correcteur azoté sera incorporé afin de garantir l’équilibre alimentaire de la ration. Des pesées et des mesures de l’état corporel des animaux sont réalisées chaque mois afin de surveiller le bon état de santé des animaux.
Devenir
Les brebis, mères des agneaux réintegreront le reste du troupeau au tarissement. Les agneaux élevés pour la boucherie seront abattus vers l'âge de 15 mois, afin de pouvoir effectuer des prélèvements post-mortem. La pratique d’abattage est une pratique courante dans ce type de production.
Remplacement
Les animaux devant être abattus à la fin de l'expérimentation pour les besoins scientifiques, le modèle cheval n'a pas été retenu mais plutôt celui mobilisant des ovins de production Les résultats obtenus sur le modèle ovin pourront être adaptés au modèle équin modulo la connaissance a priori des paramètres de minéralisation de l’émail dentaire chez ces deux modèles. L’intérêt est également centré sur l’authentification de l’origine géographique et alimentaire de la viande d’agneau, ce qui justifie la nécessité d’utiliser des ovins (prélèvements de muscle à l’abattage). Ces résultats seront utiles pour d'autres applications en zooarchéologie.
Réduction
Le choix du nombre d’animaux par lot (7) repose sur i) les hypothèses de différences entre lots et la possible variabilité de la réponse animale, ii) la nécessité d’avoir suffisamment d’animaux par lot pour permettre un comportement normal chez cette espèce grégaire, iii) le prise en compte de possibles pertes animales dans cette expérience qui va durer 2 ans.
Raffinement
Les agneaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les personnels animaliers et d’une pesée et notation de leur état corporel tous les mois afin de vérifier le poids, la croissance et l’état corporel. Tout signe de souffrance, se manifestant par de l’abattement, un refus de s’alimenter, ou un comportement anormal (considérés comme points limites) sera signalé, consigné dans le cahier d’expérimentation et pourra entraîner l’arrêt des prélèvements et la fin de l’expérimentation pour un individu donné, voire l’euthanasie si nécessaire. Néanmoins, les prélèvements ne devraient pas induire de douleur car ils sont réalisés par du personnel expérimenté. De plus, ils seront réalisés à une fréquence limitée et sur un faible effectif d’animaux (prélèvements de sang, urines et fèces sur le lot 7 uniquement donc 7 agneaux). Durant, l'ensemble du projet, les animaux seront élevés en lot et l'ensemble des procédures seront réalisées dans cet environnement familier ce qui permettra de limiter le stress des animaux.
Choix des espèces
Le choix a été fait de remplacer le cheval (espèce cible), par des ovins de production (espèce modèle), car ces derniers sont classiquement abattus à la fin du cycle de production. D'autre part, l’intérêt est centré sur l’authentification de l’origine géographique et alimentaire de la viande d’agneau, ce qui justifie la pertinence d’utiliser des ovins. L'étude débute dès les premiers mois de gestation des brebis, jusqu’à l’abattage des agneaux (entre 8 et 15 mois).
Impact d’un stress précoce sur le réseau neuronal traitant les informations olfactives et émotionnelles et remédiation chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 270 d'entre elles et modéré pour 60. Un stress est infligé aux souriceaux entre le quatrième et le onzième jour de vie pour reproduire un état dépressif, puis les adultes subissent des injections de BrdU et une chirurgie cérébrale avec implantation de fibres optiques. Le porteur mesure ensuite l'anxiété, l'anhédonie et l'attrait pour les odeurs par des tests comportementaux, avant de tuer les animaux pour prélever leur cerveau. Il revendique des bénéfices fondamentaux et cliniques "évidents", jusqu'à l'idée de promouvoir le bien-être humain par les odeurs.
Objectifs
Des études chez l’Homme ont montré que des stress subis à l’enfance peuvent engendrer des troubles émotionnels à l’âge adulte. De plus, les patients dépressifs peuvent présenter des troubles olfactifs. Une altération de la perception des odeurs provoque des troubles de la prise alimentaire ou de l’humeur, impactant la qualité de vie et aggravant le syndrome dépressif. Les modèles animaux de dépression induite par le stress précoce sont répandus et ont une bonne validité étiologique. Nous avons mis en évidence un impact du stress précoce sur l’état émotionnel et la perception olfactive des souris mâles adultes. En effet, en ce qui concerne la perception olfactive, une diminution de l’attractivité des souris pour les odeurs plaisantes a été révélée. Concernant l’état émotionnel des souris, des manifestations d’anxiété et d’anhédonie ont également été mis en évidence. Il s’agit maintenant de comprendre les bases neurales qui sous-tendent ce phénomène, en étudiant l’activité des structures impliquées. En parallèle, nous essayerons de contrecarrer les effets néfastes du stress précoce avec des entrainements olfactifs quotidiens et un traitement antidépresseur dont nous analyserons les corrélats neuronaux. Ainsi, dans ce projet, il va s’agir de comprendre comment l’activité de différentes régions cérébrales est altérée après un stress précoce chez les souris mâles et femelles et d’analyser les bénéfices d’un entrainement olfactif versus d’un traitement antidépresseur sur le comportement et l’activité du cerveau après un stress précoce. La valeur ajoutée de ce projet repose sur le fait qu’il étudie les effets du stress précoce à deux temps différents de la vie des mêmes animaux, avant et après un entrainement olfactif ou traitement anti-dépresseur. Cette approche, permet un suivi par animal des conséquences du stress précoce et de leurs améliorations au regard de différentes stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Nous étudions les bases neuronales des effets du stress précoce sur la perception de la valeur hédonique des odeurs, l'anxiété et les comportements de types dépressifs. D’un point de vue fondamental, ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes de codage des odeurs et ses altérations lors de la pathologie. Il s’agit d’un pan entier de la physiologie olfactive dont les processus fondamentaux restent encore mal connus. Ce travail, d’un point de vu plus appliqué, devrait fournir de nouvelles pistes thérapeutiques pour promouvoir le bien-être par les odeurs. Ainsi, ce projet permet d’envisager des bénéfices fondamentaux et cliniques évidents.
Procédures
Les animaux suivront 2 interventions différentes. Ils seront soumis à des injections intrapéritonéales de BrdU, marquant les nouveaux neurones. Une telle injection dure environ 30-45 secondes par animal. Les animaux suivront également une procédure chirugicale. La procédure chirurgicale consiste en l'injection intracérébrale de virus et implantation de fibres optiques pour modulation de l'activité cérébrale par la lumière. L'intervention à elle seule, une fois l'animal anesthésié, dure environ 45 minutes. L'intervention chirrugicale est suivie par une phase de récupération d'environ 3 semaines.
Impact sur les animaux
Notre protocole de stress altère le comportement des animaux, l’étude de ces altérations étant l’objet du projet. Le stress précoce va donc altérer l’état émotionnel des souris à l’âge adulte et est également susceptible d’avoir des effets chez les mères. De plus, les animaux implantés (procédure chirurgicale) étant remis entre congénères (pour éviter l'isolement des animaux), des disputes ou des dégradations du matériel d’implantation et donc de la zone correspondante peuvent être engendrées. Les chirurgies peuvent également induire des effets secondaires indésirables (perte de poids, douleurs, stress, apathie, stéréotypie etc). Une surveillance adaptée sera mise en place.
Devenir
Tous les animaux utilisés selon cette procédure seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et contrôler les injections ou analyser l’activité neurale.
Remplacement
L’étude de processus physiologiques et plus particulièrement l’étude des bases neuronale du comportement nécessite l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro. Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux (15 souris minimum par groupe), pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats. Ces prévisions sont basées sur les précédentes études de l’équipe et les données de la littérature. De plus, pour assurer de la fiabilité statistique nous randomiserons les animaux et les groupes, et afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous corrélerons (grâce à des statistiques adaptées) le comportement et les paramètres cellulaires sur les mêmes animaux et poursuivrons le développement d'un modèle bio-informatique.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée pour détecter les points limites de souffrance. Le poids et l’apparence physique seront vérifiés pendant toute la durée du protocole. Notre étude comportementale permettra l’analyse précise des effets du stress sur les animaux. L'impact du stress sur les animaux en hébergement sera également surveillé de près (absence de stéréotypie, signes physiques de stress). Tout animal présentant des signes non préalablement identifiés comme symptômes attendus du modèle de stress précoce sera pris en considération et sa participation au reste de la procédure sera évalué. Une perte de poids supérieure à 20% ou un signe révélateur de souffrances engendrera une évaluation et une surveillance supplémentaire jusqu’à euthanasie en cas de nécessité. Le comportement et la posture des souris seront également observés afin d’évaluer le degré de bien-être ou de douleur. Pour réduire le risque d’un impact physique et psychique, une semaine de repos sera effectuée à l’arrivée des animaux avant mise en reproduction. Une sciure avec copeaux longs sera utilisée pour permettre le nid (avec ajout de coton pour les mères et les petits). Les animaux seront maintenus en groupe (5 animaux par cage maximum). Les cages sont transparentes pour favoriser la communication. Concernant la procédure chirurgicale, les souris seront anesthésiées grâce à l’injection d’un mélange de Ketamine (100mg/kg) xylazine (10mg/kg) en ip. Un gel ophtalmique sera déposé sur les yeux et de la lidocaine sera appliquée localement avant incision et après suture. Une injection d’un antalgique (Ketoprofen ; 2mg/kg, ip) sera pratiquée avant et après chirurgie puis sera réitérée en fonction de l’état de l’animal (grille de score de douleur). En attendant un réveil partiel, les animaux seront placés sous une lampe chauffante. Le test de pli de peau sera pratiqué pour vérifier le niveau d’hydratation, en cas de déshydratation, une injection de NaCl sera faite. Les animaux seront transportés via des cages à couvercles filtrants jusqu’à une armoire ventilée en secteur conventionnel, pour y être placés dans une cage propre avec nourriture et eau à volonté. Leur poids sera contrôlé pendant 3 jours suivant la chirurgie. L’état général sera évalué régulièrement pendant la phase de récupération (3 semaines). L’injection du virus suivie de l’implantation des fibres optiques est un type de procédure déjà maitrisée dans l’équipe.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car son comportement et l’importance écologique de la fonction olfactive de cette espèce sont particulièrement adaptés à la question de recherche qui nous intéresse. De plus, l’ensemble des données antérieures a été obtenu chez cette espèce, elle est classiquement utilisée dans ce type d’étude et nos données pourront être comparées à celles de la littérature. Le stress précoce est réalisé chez des animaux entre P4 et P11 (j+4 après la naissance et j+11 après la naissance). Il sera donc nécessaire de réaliser la reproduction des animaux au laboratoire pour tester les effets du stress précoce sur la perception des odeurs ainsi que de l’enrichissement sur ce modèle de dépression. Les effets du stress seront ensuite évalués de façon comportementale chez l’animal adulte (âgé entre 2 et 4 mois : maturité sexuelle atteinte, qui se situe à 8 semaines chez les femelles et 10 chez les mâles). Les animaux y compris ceux utilisés pour la reproduction seront gardés jusqu’à l’âge maximum de 2 ans.
Evaluation du MORAb-202 dans les épendymomes pédiatriques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
64 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur dans le cerveau sous anesthésie, puis jusqu'à quatre injections intraveineuses et huit injections intrapéritonéales d'un anticorps sur trois à six mois, avant d'être tuées pour prélever sang et cerveau. Le porteur décrit des épendymomes pédiatriques sans traitement efficace et affirme qu'en l'absence de modèle cellulaire in vitro, le modèle animal est "indispensable". Il annonce espérer améliorer la survie des enfants atteints "à court terme".
Objectifs
Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les épendymomes sont des tumeurs intracrâniennes retrouvées très fréquemment chez l’enfant. Ces tumeurs sont chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes malgré les exérèses chirurgicales. Au cours des dernières décennies, leur traitement n’a connu aucun progrès. A l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles cellulaires in vitro de ces tumeurs. Il nous est donc impossible de prédire la réponse d’un médicament sans passer par un modèle animal. Nous avons développé plusieurs modèles de cette maladie à partir de tumeurs de patients que nous avons pu modifier en ajoutant un gène, qui permet un suivi de ces modèles par imagerie. Ces modèles sont très rares et sont un outil indispensable pour l'exploration de thérapies prometteuses. L'objectif de ce projet est d'étudier l'efficacité d'un anticorps monoclonal ainsi que ces propriétés de répartition dans les tissus atteints. Dans le cas où ses objectifs seraient atteints, les molécules pourront être directement transférées en clinique chez des patients pédiatriques en phase I.
Bénéfices attendus
Les épendymomes sont des tumeurs pédiatriques chimiorésistantes et responsables de nombreuses rechutes et aucun traitement à ce jour ne permet d’améliorer de façon importante la survie des patients. Le traitement par l'anticoprs monoclonal objet de ce projet est un nouvel espoir thérapeutique pour traiter ses tumeurs. Nous espérons pouvoir améliorer la survie des enfants atteints à court terme.
Procédures
Les animaux seront greffés avec des tumeurs dans le cerveau sous anesthésie générale (durée 30 minutes). Les animaux recevront au maximum 4 injections de produits en intraveineuse et 8 injections en intrapéritonéales, toutes injections seront réalisées sous anesthésie locale (lidocaïne) réparties entre 3 et 6 mois (durée pour chaque 1 minute).
Impact sur les animaux
En fin de procédure, les animaux pourront présenter des symptômes neurologiques (principalement apathie). Les doses d'anticorps monoclonal utilisée pour traiter les souris sont bien inférieures au doses maximales tolérées: aucune toxicité n'est donc à attendre du traitement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récupérer le sang et le cerveau et de pouvoir réaliser des analyses complémentaires ex vivo.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles cellulaires de ces tumeurs. Il nous est donc impossible de prédire la réponse d’un médicament sans passer par le modèle animal. Cependant, nous avons pu montrer que les épendymomes de patients présentent une très forte expression de certains récepteurs, constituant une cible thérapeutique très prometteuse. De plus, il est reconnu que la barrière hémato-enchéphalique est un réel frein quant aux passage de molécules dans les tumeurs cérébrales. Il est donc indispensable d’évaluer l'efficacité du traitement par l'anticorps monoclonal pressenti dans un modèle animal pertinent.
Réduction
Nos greffes sont suivies par imagerie. Ce suivi permet d'estimer le volume tumoral. Cela permet donc de diminuer le nombre des animaux par procédure et également d'assurer un suivi clinique précis et pertinent de l'évolution des tumeurs cérébrales. De plus, les animaux développent des tumeurs de façon homogène et reproductible. Le nombre de souris a été déterminé de façon optimale par calcul de puissance les croissances tumorales des animaux traités ou non. Des tests statistiques non paramétriques seront utilisés,en analyse de variance ou pour les comparaisons de groupes deux à deux.
Raffinement
Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un antalgique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Les procédures dureront entre 3 et 6 mois suivant la croissance tumorale du modèle et la réponse au traitement. La dose du médicament évalué est inférieure à la dose maximale tolérée et des études d’efficacité chez la souris dans d’autres types tumoraux n’ont montré aucun effet toxique à la dose quenous utiliserons. Nous n’attendons donc pas à avoir de la toxicité du médicament. Des points limite précoces spécifiques ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées permet la greffe de tumeurs humaines. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines (population cible pédiatrique).
Etude de la relation entre la réponse anti-transgène et la toxicité cardiaque dans le transfert de gène
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une pastille immunosuppressive implantée sous la peau sous anesthésie, puis une injection intraveineuse de thérapie génique et plusieurs prélèvements sanguins, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir si la toxicité cardiaque observée à forte dose de vecteur est liée à une réponse immunitaire contre le transgène. Le porteur passe en revue les méthodes in silico et in vitro puis affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier les liens entre système immunitaire et système cardiaque.
Objectifs
Les dystrophies musculaires sont un ensemble de pathologies invalidantes sans traitements présentant des signes histologiques et fonctionnels avec une réduction de la force musculaire, et parfois une atteinte cardiaque, respiratoire et cérébral. La thérapie génique est une stratégie envisagée dans ces pathologies d’origine génétique et des approches utilisant des vecteurs dérivés du virus associé à l’adénovirus sont déjà à l’étape clinique. Lors des injections des produits de thérapie génique chez l’homme, Il a été observé des réactions immunitaires contre le vecteur et contre le transgène (produit protéique exprimé à partir du gène apporté par le vecteur), ainsi qu’un certain nombre de réactions adverses. Dans ces cas, des traitements à base de produits immunosuppresseurs sont donnés aux patients et permettent une résolution des problèmes la plupart du temps. Dans nos études précliniques de transfert de gène dans un groupe de pathologies musculaires, les sarcoglycanopathies, nous avons également observé une toxicité cardiaque à des doses élevées de vecteur chez le rat. Nous avons observé de façon concomitante une réponse immune contre le transgène-médicament, sans qu’il soit possible de déterminer si cette réaction immune était en parallèle ou à l’origine de la cardiotoxicité. L’objectif de ce projet est de répondre à cette question en utilisant un régime immunosuppresseur qui va prévenir la réponse contre le transgène et de quantifier une potentielle diminution de la cardiotoxicité.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous définirons si la cardiotoxicité observée à de forte doses de vecteurs est liée ou non à une réponse anti-transgène. La réponse à cette question nous orientera vers la génération de vecteur ayant un profil de sécurité plus élevé car nous saurons si nous devons privilégier des vecteurs ne conduisant pas à une réponse anti-transgène ou au contraire rechercher l’origine de la cardiotoxicité pour définir comment générer des vecteurs.
Procédures
Le traitement immunosuppresseur se fait par injection sous-cutanée de pastilles à l’aide d’une canule une seule fois au cours du protocole sur des animaux sous anesthésie gazeuse. Le transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois sur animaux vigiles avec injection dans la veine caudale. Les prélèvements de sang se feront un jour avant l’injection de la thérapie génique, à 14 jours post-injection et à la fin (J21) du protocole. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées à la nature des actes réalisés : - Douleur de piqûres pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui sont susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie gazeuse, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. Effets immunosuppresseurs des drogues et l’effet toxique des doses élevées des injections de thérapie génique peuvent également entrainer des nuisances, comme une atteinte cardiaque et un dérèglement du système immunitaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Aucun modèle alternatif à des modèles animaux ne nous permet d’étudier les relations entre la réponse immunitaire et la toxicité cardiaque pour répondre aux questions posées. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, il n’existe à ce jour aucun modèle permettant d’étudier les relations entre le système immunitaire et les système cardiaque..
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le découpage en 2 lots va permettre de définir le meilleure traitement immunosuppresseur dans le premier lot et de ne faire que le meilleur dans le deuxième lot. Le groupe contrôle injecté avec placebo sera mutualisé entre les 2 lots. Nos données suggérant que les observations de toxicité et de réponse immune sont globalement les mêmes entre les deux sexes, nous n’évaluerons la question que sur un seul sexe, ce qui nous permet une réduction d’animaux.
Raffinement
Nous avons choisi d’administrer les molécules à l’aide de pastilles sous-cutanées qui permettent la délivrance de la molécule pendant une période de 21 jours. Cette méthode permet un contrôle de la quantité de produit administré en assurant une distribution continue et une stabilité du produit et donc une meilleure reproductibilité. Cette méthode permet de limiter la manipulation des animaux avec une seule manipulation au lieu de manipulations quotidiennes, évitant par la même du stress aux animaux. L’administration systémique des vecteurs se fera 2 à 3 jours après de l’implantation de la pastille évitant un stress supplémentaire l’animal. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telle que l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce rat car c’est sur cette espèce que nous avons observé la plus grande sensibilité à la toxicité cardiaque induite par l’injection des AAV à forte doses. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte à un âge permettant le montage d’une réponse immune.
Rôle d’HSF1 dans l’érythropoïèse.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de BrdU, puis sont tuées 24 heures plus tard pour prélever la moelle osseuse de leurs fémurs et tibias, afin d'étudier le rôle de la protéine HSF1 dans la formation des globules rouges. Le porteur indique avoir d'abord travaillé sur le poisson zèbre et des cellules humaines de sang de cordon, mais affirme que ces modèles ne permettent pas de tester son hypothèse au niveau de la moelle osseuse. La retombée annoncée reste fondamentale, définir HSF1 comme molécule clé de l'érythropoïèse.
Objectifs
L’érythropoïèse est le processus de formation de globules rouges. C’est un phénomène permanent et débute lorsqu'une cellule souche pluripotente (donnant naissance à n'importe quelle cellule sanguine) s’engage en progéniteurs érythroïde qui, par des phénomènes de prolifération et de maturation, donnera naissance à des érythrocytes. La proportion de progéniteurs érythroïdes dans la moelle osseuse est faible (-d’1 % des cellules). On estime la production moyenne de globules rouges à 10 milliards de cellules par heure. Il existe une remarquable expansion du compartiment érythroïde ainsi qu’une fine régulation de l’érythropoïèse au niveau cellulaire et moléculaire. Notre équipe a montré que les protéines de choc thermiques (HSP) sont impliquées dans l’érythropoïèse. Nos résultats préliminaires chez le poisson-zèbre montrent que la protéine HSF1 (Heat Shock Factor 1), contrôlant l’expression des HSPs, est également nécessaire à l’érythropoïèse, et de façon partiellement indépendante des HSPs. Nous avons observé une forte diminution du nombre de globules rouges dans les poissons dans lesquels l’expression d’HSF1 est inhibée. Ce phénomène s’accompagne d’une diminution de la maturation des précurseurs érythrocytaires, suggérant un blocage de l’érythropoïèse. Des travaux récents ont montré que de nombreux gènes n’appartenant pas à la famille des HSP sont régulés par HSF1 et jouent un rôle fondamental dans le cycle et la différenciation cellulaire. Notre hypothèse est que des gènes essentiels à l’érythropoïèse seraient également régulés par HSF1. Pour vérifier notre hypothèse, nous avons besoin, dans des souris déficientes en HSF1 (Hsf1-/-), de mesurer les quantités d’érythrocytes dans le sang d’une part, et d’autre part de tester la capacité des précurseurs érythrocytaires de la moelle à former des globules rouges. La formulation sanguine de nos animaux de phénotypes sauvages (WT) et déficients pour HSF1 (Hsf1-/-), sera analysée grâce à un prélèvement sanguin (veine caudale). Après anesthésie, la mise à mort permettra de récupérer leurs fémurs et tibias afin d’en extraire la moelle osseuse dans le but de déterminer : Sa capacité à réaliser l’érythropoïèse via un phénotypage par cytométrie en flux afin d’analyser la composition cellulaire relative à la voie de différenciation érythrocytaire (progéniteurs et précurseurs). Le niveau d’expression d’HSF1. L'état du cycle cellulaire des cellules en cours de différenciation érythroïde via injection intrapéritonéale de BrdU
Bénéfices attendus
Nos résultats chez le poisson-zèbre montrent une forte diminution du nombre de globules rouges dans les poissons délétés en HSF1. Ce phénomène s’accompagne d’une diminution de la maturation des précurseurs érythrocytaires, suggérant un blocage de l’érythropoïèse. La confirmation de ces résultats dans un modèle murin in vivo permettrait de définir HSF1 comme une molécule clé de la régulation de l’érythropoïèse.
Procédures
Les animaux vigiles recevront une injection par voie intrapéritonéale de BrdU (bromodésoxyuridine) (injection unique ; 3-4 secondes). 24h après injection, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés, la moelle osseuse sera extraite des fémurs et des tibias prélevés et l’analyse du cycle cellulaire réalisée par cytométrie en flux sur la base du phénotypage érythroïde précédemment mis au point.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles relatifs à l’utilisation de BrdU sur modèle murin sont les suivants : o Diarrhée o Léthargie o Agression o Perte de poids o Lésions inflammatoire cutanées o Réduction de la croissance du pelage o Atteinte hématologique (anémie, leucopénie, thrombopénie) Ces effets peuvent être observés dans le cas d’une exposition longue à la molécule (6 semaines pour une administration via l’eau de boisson ou 1 semaine par injection intrapéritonéale quotidienne). Dans notre cas de figure, nous n’excèderons pas 24h post injection ce qui, selon nous, limitera l’apparition de tels effets. Sachant cela, nous porterons toutefois une attention particulière à ces paramètres durant les 12 à 24h suivant l’injection de BrdU afin de garantir au maximum un qualité de vie optimale de nos animaux.
Devenir
A l’issue de la procédure expérimentale, nous projetons de prélever et d’utiliser les moelles osseuses issues des tibias et fémurs des animaux de type sauvages (Wild Type ; WT) et déficients pour le facteur HSF1 (Hsf1-/-). Ce mode d’analyse sera réalisé ex-vivo par cytométrie en flux afin d’analyser la composition cellulaire relative à la voie de différenciation érythrocytaire de nos souris.
Remplacement
Nos résultats préliminaires obtenus dans le modèle de poisson zèbre nous a permis à la fois de remplacer l’utilisation de petits mammifères tels que les souris (Mus musculus ; A1) et d’en réduire le nombre au regard des différents axes restant à être investigués. Toutefois, ce model ne nous permet pas de tester notre hypothèse de régulation de gènes essentiels à l’érythropoïèse par HSF1 car 1) il nous permet seulement de travailler sur l’érythropoïèse embryonnaire et 2) l’étude des gènes régulés ne peut se faire qu’au niveau du poisson entier, et non pas au niveau de la moelle osseuse (site de l’érythropoïèse).
Réduction
En plus du modèle poisson zèbre, nous avons obtenu un ensemble de données grâce à l’utilisation de cellules souches et cellules progénitrices érythroïdes humaines à partir de sang de cordon ombilical. La réalisation de telles expériences sur ce matériel cellulaire nous a permis d’affiner nos axes de recherche, d’affiner notre investigation relative aux voies de signalisation intracellulaire d’intérêts ainsi que nos cibles géniques. Ceci ayant pour répercution la réduction, in fine, du nombre d’expérience à réaliser sur le modèle murin (Mus musculus) et par extension la réduction du nombre d’animaux à utiliser afin de confirmer nos résultats. Nous estimons à 60 le nombre total d’animaux qui seront utilisés dans le cadre de la phase expérimentale (30 Wild Type ; WT (phénotype sauvage) / 30 Hsf1-/- (déficientes pour le facteur HSF1) toutes expérimentations comprises). Ce nombre d’animaux correspond au nombre minimal permettant d’obtenir des résultats significatifs avec le test statistique utilisé ainsi que les mises au point (principalement sur des souris de phénotype sauvage).
Raffinement
Dans le but de réduire, supprimer/soulager la douleur/détresse de nos animaux dans le cadre de nos expériences nécessitant une intervention (injection intrapéritonéale) sur animaux vigiles, nous avons basé notre méthodologie sur des travaux optimisés, revus et publiés dans la littérature scientifique. Pour l’ensemble de nos animaux (injectés ou non), ces derniers seront minutieusement observés lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des mesures seront prises pour améliorer le bien-être des animaux. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu sera également mis en place. Un contenant sera placé dans chaque cage permettant aux souris de se cacher et de développer leur répertoire comportemental (exploration, enfouissement…).
Choix des espèces
L’érythropoïèse murine est bien caractérisée et est proche de celle de l’homme. Les souris déficientes en HSF1 sont disponibles et viables. Nous utiliserons des souris de 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal.
Évaluation de l’activité anti-bactérienne d’un probiotique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
54 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent par instillation nasale un probiotique puis une suspension de la bactérie Pseudomonas aeruginosa sous anesthésie, avant une mise à mort à 24 heures pour analyser l'infection, l'infection pulmonaire pouvant provoquer une perte de poids, des douleurs et une mobilité réduite. Le projet vise à confirmer un effet bénéfique d'un probiotique observé lors d'une manipulation précédente. Le porteur affirme que les modèles in vitro "ne permettent pas" de conclure sur la survie à une infection pulmonaire.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de probiotique isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficace in vivo que la souche de référence sur une souche clinique de Pseudomonas aeruginosa. Il est nécessaire de réaliser une seconde manipulation pour confirmer l’effet bénéfique observée, à savoir, une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection avec la souche clinique de probiotique. L'objectif est de confirmer un potentiel effet d’un probiotique clinique vis -à- vis de PA. Dans un second temps, nous souhaitons également tester l’effet du probiotique inactivé sur deux souches de Pseudomonas aeruginosa.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de probiotique comme potentielles bactéries bénéfiques à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines étant à l’origine d’infections pulmonaires notamment dans la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront du sérum physiologique ou un probiotique potentiel puis une suspension bactérienne par instillation nasale à 18h d’écart sous anesthésie gazeuse. A la suite de quoi, une mise à mort est réalisée à 24h pour analyser l’infection.
Impact sur les animaux
Ce projet peut induire un stress chez les animaux notamment : -Préhension de l’animal : intensité faible, durée environ 1 min -Sédation par anesthésie gazeuse : intensité faible, durée entre 30 et 60 secondes -Pertes de poids, douleur et mobilité réduite voire, une inactivité après début de l’infection pulmonaire, durée 24h maximum ou mise à mort si point limite atteint
Devenir
Les 54 souris C57BL/6 mâles sont mis à mort à l’issu des 24h conformément à la règlementation en vigueur afin de réaliser des prélèvements.
Remplacement
Nous souhaitons observer dans cette demande une réduction de la charge bactérienne à une infection pulmonaire causée par Pseudomonas aeruginosa. Les modèles cellulaires et/ou autres modèles in vitro ne permettent pas à ce jour de conclure sur la survie d’un animal à une infection pulmonaire. Pour cette raison, nous faisons le choix de conserver le modèle animal.
Réduction
Le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P. aeruginosa entre le groupe recevant uniquement du P. aeruginosa et celui recevant du probiotique préalablement à l’instillation de P. aeruginosa. Afin de garantir un résultat, 9 souris sont nécessaires dans chaque groupe lorsque ce groupe est comparé au groupe contrôle P. aeruginosa. Nous avons choisi de suivre nos souris uniquement jusqu’à 24 h post-infection et non 7 jours pour limiter le nombre d’individus. Nous nous limitons à une seule espèce de probiotique alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon et une seule souche clinique parmi les 7 isolées par notre équipe.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés (isoflurane gazeux), une analgésie est mise en place en fonction de notre table de suivi de soins (de la buprénorphine pour réduire la douleur). De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante à 24h. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Analyse de la plasticité des synapses dopaminergiques chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie cérébrale d'une heure à une heure trente, d'autres reçoivent des injections répétées de cocaïne dans un test de préférence de place ou des injections intracérébrales par canule, avant le prélèvement de leur cerveau. Le projet étudie les synapses à dopamine impliquées dans la maladie de Parkinson, la dépendance et la schizophrénie. Le porteur affirme que ces dimensions ne sont pas modélisables in vitro ou in silico, tout en prévoyant de remplacer certaines validations par de la culture cellulaire.
Objectifs
Les neurones du cerveau communiquent entre eux grâce à des neurotransmetteurs au niveau de structures très petites appelées « les synapses ». Un de ces neurotransmetteurs est la dopamine. Les synapses qui libèrent de la dopamine sont impliquées dans le contrôle de nos mouvements et la sensation de « bien-être ». Elles sont affectées dans la maladie de Parkinson ainsi que dans les troubles psychiatriques comme la dépendance aux drogues et la schizophrénie. Il est donc très important de connaître cette synapse précisément afin de permettre le progrès des approches médicales à ces maladies graves. Le but de ce projet est donc d’étudier ces synapses au sein du système cérébral de la locomotion, de la récompense, et de la prise de décision (système nigrostrié et mésocorticolimbique). Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique, et/ou une approche de marquage viral. Nous utiliserons aussi une approche de manipulation pharmacologique par la cocaïne, ou une déficience en acides gras polyinsaturés de type n-3. Ces approches seront suivies de tri par fluorescence des synaptosomes, d’analyses par immuno-blot, immuno-fluorescence et spectrométrie de masse. Ces différentes approches permettront d’analyser l’impact de ces manipulations sur la structure moléculaire et la fonction de la synapse dopaminergique. Nous testerons également les processus de récompense en utilisant des tâches comportementales de conditionnement à la préférence de place. Lors de ce test la préférence de compartiment dans lesquelles des souris reçoivent une dose de cocaine ou une solution saline est analysé.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de comprendre le rôle de SynCAM 2 (molécule d’adhésion cellulaire synaptique 2) dans la formation et la maintenance des synapses dopaminergique, de comprendre quelles sont les altérations synaptiques induites par l’apprentissage conditionné par la cocaïne, et comment le statut cérébral en acides gras polyinsaturés influence la synapse dopaminergique. Ces données seront fondamentales d’un point de vue physiopathologique étant donné que : la dégénérescence des voies dopaminergiques est centrale dans la maladie de Parkinson, la plasticité des synapse striatales doit être comprise pour mieux appréhender les altérations induites par l’abus de drogues chez les patients dépendants, l’équilibre central en acides gras polyinsaturés n-3 est affecté dans les troubles psycho-affectifs. Nos données constitueront un socle de connaissances pour l’ensemble des laboratoires impliqués dans l’étude cellulaire et moléculaire de la physiopathologie du système dopaminergique central.
Procédures
Une partie des animaux subira des procédures chirurgicales (1 fois, durée de 1h à 1h30) afin d'exciser la protéine SynCAM 2, d’exprimer des protéines fluorescentes et ou de re-exprimer la protéine SynCAM 2. Une partie des animaux recevra une injection de solution saline intrapéritonéale par jour pendant 4 jours. Une partie des animaux subira quatre injections intrapéritonéales de cocaïne et/ou de solution saline. Deux injections par jour, une le matin et une le soir et sont placées à chaque fois dans une boite d’analyse de la préférence de place pendant 20 minutes. Une partie des animaux subira 2 injections intra-canules d'agents pharmacologiques. Une injection 30 minute avant chaque injection de cocaine du protocole CPP. Les injections intra-canules durent 10 minutes, 5 minutes d'injection et 5 minutes d'attente après injection pendant lesquelles l'injecteur est laissé en place pour permettre la diffusion des agents pharmacologiques. Les injections intra-péritonéales durent 5 secondes.
Impact sur les animaux
L’intervention chirurgicale peut causer une perte de poids ou une infection cutanée. Le régime alimentaire peut aussi impacter le poids de l’animal. Tous ces effets indésirables seront évités par le protocole de suivi mis en place et l’expertise de l’expérimentateur habitué à ces pratiques. Enfin une accoutumance et les effets de manque qui peuvent se produire suite aux injections de cocaïne seront évités par le sacrifice des animaux 24h après la dernière injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet, soit par dislocation après induction par isoflurane, soit par l'injection d’un euthanasiant (exagon) avec sédation préalable par méloxicam suivi d'une perfusion intracardiaque afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses protéomiques, biochimiques et histologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions non modélisables sur des modèles in-vitro ou in-silico. Nous remplacerons certaines validations par la mise en place culture cellulaire de neurones dopaminergiques.
Réduction
Le nombre d’animaux minimum pour obtenir assez de matériel biologique ainsi que le nombre de répétitions indépendantes pour éliminer les biais expérimentaux a été déterminé par nos expériences précédentes ainsi que celles de nos collaborateurs. Basé sur nos précédentes études ce nombre est aussi suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes.Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de la plupart des animaux de la descendance et utiliseront les mâles et les femelles. Les animaux restants dont le génotype n’est pas directement utilisable seront utilisés en contrôle de fluorescence lors du tri de synaptosomes. Du fait de cette stratégie, la grande majorité des animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. D’autre part nous réduiront le nombre de souris qui passeront en chirurgie stéréotaxique par l’emploi de souris génétiquement modifiées exprimant déjà une fluorescence (VGLUT1venus). Enfin la mise en place de protocoles aseptiques de chirurgie nous a permis de réduire d’un facteur deux le nombre d’animaux utilisés lors de notre précédente étude.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance des animaux, les procédures suivantes sont mise en place: les animaux sont logés dans des cages communes (3 à 5 par cage de 612,5 cm2), pourvues de litière pour leur permettre de reproduire un comportement naturel de recherche de nourriture et d'un enrichissement composé d'un nid de plantes et de tube en carton pour leur permettre de ronger. Ces cages leur donnent beaucoup d'espace pour se tenir debout. Concernant la chirurgie stéréotaxique : L’ensemble de la chirurgie sera réalisée à deux opérateurs pour maintenir l’asepsie. Prévention de l'hypothermie : l'animal sera placé sur un tapis chauffant permettant d'ajuster la température du tapis en fonction de la température corporelle de l'animal (maintien à 37°C). Prévention de la déshydratation : administration d'une solution saline chaude et stérile à la fin de l'opération. Suivi, soins et hébergement, phase d'éveil: l'animal sera placé sur un tapis chaud dans une cage de récupération (~15min), avec accès à de l'eau et à de la nourriture humide, sous observation étroite pendant au moins 1h. Suivi postopératoire: l'état de santé des animaux sera évalué quotidiennement pendant au moins 2 jours (pesée, observations, évaluation des points limites) sur un formulaire de suivi individuel. Si des signes d'infection ou de saignement apparaissent au niveau du site chirurgical, la plaie sera nettoyée et un antiseptique local sera appliqué. L'administration d'un anti-inflammatoire non stéroïdien sera également systématiquement effectuée toutes les 24h après la chirurgie afin de garantir 48h de soins pour chaque souris après la chirurgie. Si nécessaire, la douleur sera soulagée par l'administration d'une injection de de ce même anti-inflammatoire 72h après la chirurgie. Pour limiter le stress des animaux lors de la procédure de perfusion les souris recevront une sédation par un anti-inflammatoire suivie 10 minutes plus tard de l'injection d'un euthanasiant. Après vérification de l'anestésie par pincement de la patte, les animaux seront perfusés en intracardiaque. Cette procédure sera effectuée par un personnel formé et compétent, ce qui garantira la précision et limitera le stress de l'animal avant la perte de conscience.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles génétiquement modifiés disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations sur le cerveau mature
BHE-permeabilite-hypergravite
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont exposées à une hypergravité de 2G par centrifugation pendant 24 heures pour ouvrir la barrière hématoencéphalique, avec des prélèvements de glycémie, des injections d'un composé et d'un traceur fluorescent, avant une perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie. Le porteur indique que la centrifugation réduit la prise de boisson et de nourriture sur 24 à 48 heures sans induire de stress selon les taux de corticostérone mesurés. Le projet teste des composés modulant la barrière, avec des applications présentées jusqu'à la remise en forme des spationautes.
Objectifs
Aujourd’hui la barrière hématoencéphalique (BHE) est impliquée dans les mécanismes d’échange entre le compartiment sanguin et le parenchyme cérébral (neurones et cellules associées qui établissent les fonctions cérébrales). Elle est assurée par les cellules endothéliales bordant la lumière des vaisseaux et d’autres cellules comme les péricytes, les astrocytes et des macrophages. Ces cellules forment l’unité neurovasculaire qui permet le passage sélectif de molécule du sang vers le cerveau et vice-versa. Si la rupture des vaisseaux sanguins cérébraux induit des accidents vasculaires cérébraux, des défaillances plus subtiles de la BHE participent aux maladies neurodégénératives ou sont produites dans les pathologies métaboliques ou par des agents infectieux. Depuis 2-3 ans sont décrits des modulations physiologiques de l’efficacité de la BHE. Dans ce contexte la maitrise pharmacologique de l’efficacité de la BHE pourrait améliorer le fonctionnement cérébral comme suggéré dans des modèles de la maladie d’Alzheimer. Enfin, des ouvertures de la BHE de faible amplitude et temporaire pourraient améliorer la vectorisation de médicament dans le cerveau comme envisagée pour le traitement de la maladie de Parkinson. Ainsi des molécules favorisant une ouverture de la BHE, ou améliorant son efficacité sont recherchées en pharmacologie. Ces molécules une fois testées in vitro doivent passer par une étape de validation in vivo chez l’animal avant de faire l’objet d’essais précliniques. Pour cela nous proposons de tester certaines de ces molécules sur un modèle d’ouverture temporaire de la BHE chez la souris par exposition l’hypergravité. Cela permettra également de mieux comprendre comment l’efficacité de la BHE évolue dans des contextes de changement gravitaires et comment ce mécanisme peut être régulé. Le protocole consiste à exposer des souris, recevant le traitement pharmacologique, à 2G pendant 24h pour induire une ouverture de la BHE et mesurer si le traitement accentue ou diminue le passage de molécules du sang vers le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet devra nous permettre de préciser des mécanismes d’action de l’hypergravité sur la BHE et de valider des composés pharmacologiques dans ce modèle d’ouverture partiel et temporaire de la BHE. Ces composés pouvant avoir des intérêts thérapeutiques soit pour protéger le cerveau d’ouvertures non désirées de la BHE soit pour au contraire ouvrir partiellement et temporairement la BHE pour aider au passage de molécule d’intérêt thérapeutique. Enfin ce projet permettra de préciser les mécanismes de l’ouverture de la BHE lors de l’exposition au changement gravitaire ce qui peut avoir également un intérêt biomédical puisque la centrifugation est proposée comme une contre mesure pour aider à la remise en forme des spationautes.
Procédures
Les animaux seront exposés à l'hypergravité apr centrifugation à 2g pendnt 24h. prélèvement sur animaux vigiles, au maximum les animaux subiront deux prélèvements sanguins à l'extrémité de la queue pour une mesure de leur glycémie à 48h d'intervalle, il s'agit d'un acte identique à celui pratiquer pour l'automesure de glycémie par les patients diabétiques. Le volume prélevé est de 10-30 µL. dans la procédure, les animaux subiront des injections intrapéritonéales après habituation à la contention pour l'injection d'une molécule pouvant améliorer l'efficacité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et une injection rétro-orbitaire sous anesthésie générale d'un traceur fluorescent permettant de mesurer l'efficacité de la BHE . La procédure se termine par une anesthésie profonde et sans réveil pour perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables connus sont principalement les éventuels effets secondaires des composés pharmacologiques de régulation de la BHE. Ceux-ci devront être décrits et seront pris en considération, nous ne testerons que des composés dont les études in vitro et les études de toxicologie auront été réalisées et publiées. Les effets indésirables de la centrifugation sont également bien caractérisés, l’exposition à 2G n’induit pas de stress (mesuré par le taux circulant de corticostérone post-exposition) mais elle induit une baisse significative de la prise de boisson et de nourriture pendant les 24 à 48 h après le départ de la centrifugation. Ceci induit un léger retard à la prise de poids chez les animaux jeunes. Tous les animaux sont suivis par surveillance vidéo en permanence y compris au sein des nacelles de la centrifugeuse. Leurs poids sont pris régulièrement avant et après la centrifugation tout comme leur consommation de nourriture et de boisson. Après centrifugation la glycémie des animaux sera évaluée pour indexer leur statut métabolique et une mesure de corticostérone sera réalisée sur échantillon sanguin prélevé au moment de la pose de la perfusion intracardiaque. L’ensemble de ces paramètres nous permettent d’évaluer les potentielles altérations physiologiques et sont systématiquement associées à la publication des résultats.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes à des fins d 'investigations par histologie.
Remplacement
Les expériences proposées visent à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de l’ouverture de la BHE en contexte hypergravitaire et apporter la preuve de l’efficacité in vivo de composés pharmacologiques sur la perméabilité de la BHE. L’ouverture physiopathologique de la BHE ne peut être étudiée que sur un modèle in vivo car elle implique des mécanismes complexes de régulation neurovasculaire comprenant des interactions entre différents types cellulaires impossible à reproduire in vitro. Nos expériences ont pour but de proposer ou renforcer des arguments précliniques à l’utilisation de molécules d’intérêt thérapeutique. Pour ces composés des preuves expérimentales auront suggéré ou démontré une action in vitro sur des cellules endothéliales en culture et des études de toxicologie auront démontré une utilisation in vivo possible.
Réduction
Les études précédentes démontrent qu’un nombre de 12 souris par centrifugation est suffisant pour une analyse statistique (2 way ANOVA pour comparer les interactions entre l’effet du traitement et l’effet de la centrifugation). Pour une validation expérimentale, la reproduction de l’effet observée est nécessaire et nous proposons donc 3 expériences qui devront aboutir au même résultat. Afin de Réduire le nombre de souris, les résultats seront évalués statistiquement après chaque centrifugation et la composition des groupes expérimentaux ré-évaluer à la baisse si besoin.
Raffinement
Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci, afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Les animaux sont en groupe sociaux tout au long de l’expérimentation et surveillance vidéo permanente dans le dispositif de modification gravitaire afin de pouvoir intervenir si un point limite est observé. Par ailleurs, ils sont hébergés dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Ils sont placés dans la centrifugeuse dans leur cage d’hébergement. Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition « ad libitum ». Les paramètres physiologiques tels que prise alimentaire, poids sont mesurés régulièrement tout au long du protocole expérimental. Les animaux seront manipulés pendant les 3 jours qui précèdent le début du traitement pharmacologique pour les habituer à la contention nécessaire à l’injection i.p. L'ensemble des données recueillies feront l'objet de l'argumentaire expérimental de la publication issues de ces expériences.
Choix des espèces
Le choix de la souris se base principalement par l’existence de données sur ce modèle qui permettent d’établir que l’hypergravité peut altérer l’efficacité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et qu’il est le modèle le plus utiliser pour fonder des bases à la recherche préclinique. De plus si nous parvenions à identifier un composé efficace pour réduire l'ouverture de la BHE, il pourrait être testé rapidement sur d'autres modèles murins de pathologies neurodégénératives par exemple. Il s’agit de jeunes adultes arrivant dans l’établissement à l’âge de 8 semaines au moins. Ce choix se base principalement sur des expériences préliminaires et la littérature indiquant un état fonctionnel et stable de la barrière hématoencéphalique.
Mécanique du développement préimplantatoire des embryons de mammifères
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
9 170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent deux injections d'hormones pour produire de nombreux embryons puis sont mises à mort pour les récupérer, tandis que les mâles servent à la reproduction et sont tués dès la baisse de leur fertilité, une seconde procédure consistant à injecter un liquide coloré pour entraîner les expérimentateurs au geste. Le projet étudie les forces mécaniques qui façonnent l'embryon aux premiers stades. Le porteur affirme que seule l'étude de l'embryon entier permet cette compréhension et que les modèles "blastoïdes" ne reproduisent que la dernière étape.
Objectifs
La morphogenèse se définit par l’ensemble des transformations que subit l'embryon avant d'acquérir sa forme spécifique. Pendant la morphogénèse, les tissus changent de forme sous l’action de forces générées par les cellules qui les composent. Afin de mieux comprendre ces changements, nous avons développé des techniques permettant de mesurer les forces cellulaires qui façonnent l’embryon pendant le développement préimplantatoire des mammifères. La période préimplantatoire de développement s’étend de la fécondation à l’implantation de l’embryon dans l’utérus de la mère, pendant cette période l’embryon peut être cultivé in vitro. Notre modèle d’étude est la souris car c’est un mammifère, comme l’homme, qui a un temps de gestation court et des capacités de reproduction élevées. Son génome, proche du génome humain, est parfaitement connu et permet ainsi de générer des animaux génétiquement modifiés. Nous utiliserons des lignées de souris transgéniques pour différents gènes d’intérêt ce qui permettra l’étude du rôle de protéines spécifiques intervenant durant la morphogénèse. L’objectif de notre projet est d’identifier les événements moléculaires et mécaniques mis en jeu pendant la morphogenèse de l’embryon de souris. Les avancées de notre compréhension fondamentale du développement précoce de l’embryon de souris nous permettent de mieux comprendre de ce qui se passe chez l’humain et ainsi d’améliorer les technologies de procréation médicalement assistée.
Bénéfices attendus
Les morphogénèses de l’embryon de la souris et de l’embryon humain sont extrêmement proches et son étude chez la souris nous apportera par conséquent de nouvelles perspectives quant à la compréhension de notre propre développement. Ceci aura un impact direct sur la médecine reproductive qui aboutit à plus de 25 000 naissances par fécondation in vitro chaque année en France (Agence de la Biomédecine). Certaines de nos études sur la souris ont d’ailleurs permis une confirmation directe sur des embryons humains.
Procédures
Dans une première procédure visant à obtenir de nombreux embryons à partir des femelles, les animaux de ce projet recevront deux injections d’hormones à 48 heures d’intervalle directement dans l’abdomen (voie intrapéritonéale). Ces injections durent quelques secondes et seront réalisées sur animaux vigiles. Dans une deuxième procédure visant à enseigner le geste d’injection péritonéale aux expérimentateurs, les souris recevront une seule injection de liquide coloré qui permettra de valider l’efficacité du geste.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles liées à l’injection de produits non toxiques et non irritants dans l’abdomen des animaux.
Devenir
Toutes les femelles seront mises à mort pour récupération de leurs embryons. Les mâles seront mis à mort dès diminution de leur fertilité.
Remplacement
De nombreuses études ont été réalisées in vitro sur des cellules de mammifères ou encore sur des modèles de mouches drosophiles, de vers nématodes ou de poissons zèbre et ont permis de mettre en évidence les gènes impliqués dans les mécanismes en jeu dans la morphogenèse animale. Récemment, des modèles d’embryons reconstitués à partir de cellules souches de type organoïdes ont été développés. Les « blastoïdes », supposés équivalents aux blastocystes formés par l’embryon, ne permettent de modéliser que la toute dernière étape du développement préimplantatoire, ceci avec une fidélité encore mal caractérisée. Ainsi, seule l’étude de l’embryon, modèle intégré, permet la compréhension complète du développement préimplantatoire des mammifères et des forces intervenant dans ces événements.
Réduction
La superovulation permet de diminuer de manière très importante les souris qui seront utilisées pour ces expériences. La mise en commun des embryons obtenus entre les différents membres du laboratoire permet également de limiter le nombre de souris qui vont faire l’objet de cette procédure. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
La procédure de superovulation pour notre projet consiste en deux injections hormonales par voie intrapéritonéale non douloureuses espacées de 48h. Aucune douleur n’est attendue suite à ces injections, toutefois, une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux. Nous utilisons par ailleurs les injections de crisper-cas9 ou les KO conditionnels qui permettent de générer nos modèles d’études, des embryons préimplantatoires sans générer d’individus aux phénotypes potentiellement délétères.
Choix des espèces
Le choix du modèle murin repose à la fois sur la physiologie de ce mammifère, sa morphogenèse très proche de celle de l’humain et sur la connaissance du génome murin. La souris est une espèce très bien caractérisée en termes de génétique, de biologie du développement et de la reproduction, qui est de plus accessible pour l’obtention de modèles génétiquement modifiés par génie génétique. Ces critères en font donc un modèle de choix pour notre projet d’étude. De plus, le modèle murin satisfait l’exigence d’utilisation de mammifères les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. La superovulation ne concerne que des souris femelles adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. Les mâles sont utilisés pour la fécondation des leur maturité sexuelle vers 8-10 semaines à 12 mois car il y a une diminution de leur fertilité chez les animaux vieillissants.
Radiothérapie par rayons X des tumeurs cérébrales de haut grade
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 300
300 souris et 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis des séances de radiothérapie et d'IRM, la tumeur pouvant provoquer des troubles neurologiques, une perte d'appétit et des troubles du mouvement en phase terminale avant le prélèvement du cerveau. Le projet teste une source de rayons X expérimentale contre les gliomes, avec un transfert en clinique humaine présenté comme un objectif. Le porteur affirme qu'il est "impossible" d'étudier ces réponses sur des expériences in vitro.
Objectifs
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales ayant une incidence de 4 à 5 nouveaux cas par an pour 100 000 personnes. Il s’agit également du deuxième type de cancer le plus fréquent chez l’enfant. Les patients atteints de glioblastome, le plus agressif des gliomes, survivent en moyenne 14 mois après le diagnostic de la tumeur et ce malgré le traitement combinant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. C’est pourquoi il est nécessaire de chercher de nouveaux traitements. Notre projet s’inscrit dans ce contexte en utilisant une source de rayons X très particulière et encore expérimentale, de basse énergie mais de haut flux, permettant (i) de sélectionner au mieux les énergies intéressantes (ii) de faire un microfractionnement spatial de la dose. Ces deux spécificités ne sont pas techniquement possibles sur les sources classiques hospitalières à l’heure actuelle. Le potentiel de cette technique est étudié depuis une vingtaine d’années déjà, selon différentes approches expérimentale comme l'irradiation de cellules en culture ou des calculs dosimétriques. Ces approches bien qu’indispensables restent très limitées car elles ne prennent pas en compte la complexité du tissu tumoral, se développant de façon autonome, possédant sa propre vascularisation. L’objectif de notre projet vise à tester les modalités d’imagerie (diagnostique) et les modalités d’irradiation (géométrie, balistique, dose) sur des tumeurs proches des tumeurs humaines grâce à l’utilisation de modèles précliniques de rongeurs porteurs de tumeurs (souris et rats). Ce projet portant sur la physiologie tumorale, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'acquérir un ensemble de données précliniques de haute qualité sur des animaux porteurs de tumeurs cérébrales pour des protocoles de radiothérapie par rayonnements X de haute énergie. Les études réalisées pendant les 5 ans du projet permettront d’élargir nos connaissances sur les réponses biologiques du tissu tumoral et du tissu sain exposés aux microfaisceaux, d’évaluer le rôle du microenvironnement tumoral par rapport à l’efficacité du traitement, d’analyser les effets des rayonnements sur la vascularisation tumorale et saine, sur le comportement des animaux. L'objectif est également de pouvoir proposer un schéma d'irradiation optimal (nombre d'incidences, dose, géométrie) avec une préservation efficace des tissus sains pour un transfert réaliste vers un essai clinique. En effet, la radiothérapie par microfaisceaux est une méthode innovante et prometteuse, permettant de détruire efficacement le tissu tumoral tout en préservant le tissu sain environnant. Elle répresente donc une bonne alternative de la radiothérapie conventionnelle et ses effets secondaires. Ce projet est un facteur clé pour promouvoir notre méthode en clinique humaine et pour pouvoir proposer aux patients de tumeur cérébrale un meilleur rapport entre l'efficacité thérapeutique et effets secondaires, une meilleure qualité de vie et une survie prolongée.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : implantation de cellules tumorales sous anesthésie générale et locale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; radiothérapie par microfaisceaux ou par irradiation conventionnelle sous anesthésie générale, sur 500 animaux (250 rats, 250 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; imagerie par resonnance magnetique sous anesthésie générale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), 3 à 4 fois par animal, pendant environ 1 heure
Impact sur les animaux
Le changement d'environnement et le transport des animaux de l'animalerie jusqu'au lieu d'irradiation représente du stress et de l'angoisse. La procédure de radiothérapie n'induit pas de douleur mais du stress et de l'angoisse. L'inoculation tumorale répresente une douleur locale et du stress. Il peut y avoir l’apparition de troubles neurologiques dus à l'effet de masse induit par la tumeur en phase terminale, c'est-à-dire à partir de 2 semaines après l'implantation (troubles du mouvement, perte d'appétit). Dans des rares cas la radiothérapie elle-même peut induire une perte d'appétit. Une alopécie et, plus rarement, une dermatite radio-induite transitoire peuvent apparaitre dans le champ d'irradiation environ 2 semaines après l'exposition. La procédure d’imagerie implique du stress pour les animaux et l’injection de l’agent de contraste induit une douleur locale.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort pour obtenir un prélèvement cérébral. D’après les connaissances actuelles (littérature) et notre expertise, un délai de 2 semaines entre la radiothérapie et le prélèvement cérébral pour analyse histologique permet une bonne évaluation des réponses tissulaires différentielles entre l’irradiation par microfaisceaux ou champ plein auxquelles nous nous attendons. Cette analyse histologique est complémentée par la courbe de suivi long terme qui est indispensable pour évaluer l’efficacité de notre traitement et pour pouvoir proposer un protocole d’irradiation optimisé et transférable à un futur essai clinique.
Remplacement
La thérapie anticancéreuse a pour but d’éradiquer la tumeur ou de ralentir sa croissance tout en préservant au maximum les tissus sains avoisinants. La seule alternative aux études animales est l’étude in vitro (cellules). Cependant, il est impossible d'étudier la réponse tumorale et les effets secondaires sur la fonction cérébrale, l'irradiation de la peau et des os du crâne avec des expériences in vitro. En effet, l’appréciation de l’efficacité d’une technique de thérapie anticancéreuse nécessite le passage par un organisme vivant, reflétant la complexité des interactions entre le tissu sain et le tissu tumoral, la présence d’une vascularisation tumorale et d’un système immunitaire, le microenvironnement tumoral et l’index thérapeutique. Les modèles de tumeurs les plus reproductibles et à croissance rapide ont été développés chez les rongeurs. L’un des outils permettant de mesurer l’efficacité thérapeutique est l’établissement de courbes de suivi long terme permettant de calculer des moyennes et médiane de survie. Parallèlement, certains animaux sont mis à mort à temps fixes pour la réalisation d’études visant à obtenir une ‘image’ de la tumeur ou de l’organe à un moment donné afin d’appréhender les interactions rayonnement-matière spécifiques de la technique. Par ailleurs, des études ex vivo ont déjà été menées dans le passé mais elles ne correspondent pas suffisamment aux buts recherchés lors d'irradiations d'un organisme vivant comme mentionné ci-dessus. Ces études incluent des simulations informatiques pour simuler les interactions entre photons et matière et des irradiations de cellules en culture.
Réduction
Pour le calcul du nombre d'animaux, il faut prendre en considération la variabilité intra- et inter-tumorale pour une population de rongeurs implantés suivant un même protocole. Tous les groupes seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés et reconnus pour chaque étude. Nos précédentes expériences montrent qu’un nombre d’animaux de 7-8 animaux suffit à obtenir des résultats robustes. Nous prévoyons donc des groupes d’animaux n=10 du aux problèmes éventuels rencontrés durant les différentes étapes de l’expérience. Ce calcul mène à utiliser 60 animaux par expérience, 2 expériences par an, sur 5 ans, 600 animaux au total.
Raffinement
Les animaux arrivent à l’animalerie une semaine avant l’implantation tumorale pour acclimatation et seront hébergés en groupes. Ils sont hébergés dans des grandes cages. Nous utiliserons la procédure d’enrichissement définie par le SBEA et l’animalerie. Nous allons réduire le stress du transport par un enrichissement (litière de la cage d’hébergement, cachettes etc), transport groupés en cage filtrée, hydrogel. Afin de réduire le stress et la douleur des procédures chirurgicales, de l’imagerie et de la radiothérapie, ces procédures sont réalisées sous anesthésie soit (i) par inhalation (ii) soit par induction gazeuse suivie d’une injection intrapéritonéale d’un mélange d'anesthésiques/antalgiques et d’une injection sous-cutanée d'un anesthésique local au-dessus du site d’implantation des cellules tumorales. Une injection postopératoire d'antalgique sera administrée lors de l’implantation tumorale. Les animaux sont observés quotidiennement par le responsable du projet après chaque procédure et seront hébergés en cage isolée dès que les premiers signes cliniques apparaissent (perte d'appétit, perte de poids, prostration, convulsions). Les animaux disposent alors de nourriture humide à l’assiette et/ou d’un aliment riche en nutriment (« boost »). L'administration d'antalgiques sera considérée pour soulager la douleur (décision prise par le responsable du projet). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés (examen clinique (EC) 2 fois par jour après chaque procédure et en cas de symptômes cliniques, EC quotidien pendant les 3 premières semaines post irradiation en cas de bonne santé générale, ensuite EC un jour sur 2 ou 3 en cas de bonne santé générale jusqu'à la mis à mort). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux sont mis à mort quand les points limites, definis dans la grille de symptômes et basés à la fois sur le comportement et le poids, sont atteints.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur de plus petits nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez la souris et le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante des irradiations comparables à nos expériences. L'utilisation de rongeurs d'un même patrimoine génétique permet une grande réproductibilité de résultats. Les souris sont favorisées car elles sont adaptées à notre installation et peuvent être manipulées et hébergées facilement. Les rats sont importants dans notre cas, car du fait de leur taille plus importante, les irradiations et la dosimétrie sont plus faciles à mettre en oeuvre de façon fiable et reproductible. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons sont bien adaptées pour étudier les effets de la radiothérapie sur le microenvironnement tumoral. Nous validerons nos protocoles d'irradiations (les plus optimisés, efficaces, sûrs et transférables en clinique) chez 2 espèces d'animaux et plusieurs modèles tumoraux différents, permettant d'élargir et de faire progresser nos connaissances dans le domaine. Les animaux sont utilisés entre 4 à 12 semaines après la naissance (4 à 8 semaines pour les souris, 8 à 12 semaines pour les rats), ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés. Les modèles tumoraux ont été développés dans les animaux à cet âge quand le cerveau est encore en cours de développement, ce qui nous mène à choisir le même stade de développement pour rester reproductible dans nos résultats. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficile à gérer en animalerie. Enfin, les courbes de suivi long terme durent environ 6 mois (pour certains animaux seulement), justifiant aussi l’utilisation de cette tranche d’âge.