Recherche fondamentale

33 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres expériences. Ils subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter veineux central, destiné à faciliter les prélèvements et injections d'études ultérieures de pharmacocinétique, de toxicité ou d'efficacité menées en prestation pour d'autres chercheurs. Le porteur reconnaît un risque de perte importante de sang pendant l'opération mais affirme que les lapins supportent "très bien" le cathéter et le gilet, sans douleur attendue. Il justifie le recours au lapin par sa taille commode pour poser le matériel et présente le remplacement comme difficile, l'effectif pouvant augmenter selon la "demande d'industriels".

Objectifs

Un cathéter veineux central (CVC) est un tube mince et flexible, introduit dans une veine de la base du cou (jugulaire) ou du thorax (sous clavière) jusqu’à atteindre la veine cave supérieure. Ce dispositif, couramment mis en place chez l’homme en clinique, peut permettre l’injection de traitements par voie intra-veineuse (IV), la perfusion de sang ou de plaquettes, le prélèvement d’échantillons sanguins ou encore la mise en place d’une nutrition parentérale (injection d’éléments nutritifs par voie IV). Le but de ce projet est d’offrir les mêmes possibilités à notre modèle animal qu’est le lapin dans le cadre de prestations ou collaborations avec d’autres chercheurs. 33 lapins cathétérisés sont prévus pour l’année 2023.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un CVC apporte plusieurs avantages : -réduction du nombre d’injections et de piqûres d’aiguille ; -atténuation de l’endolorissement/sensation de brûlure parfois causés par un traitement IV administré par une perfusion standard périphérique ; -accroissement du confort et réduction de l’anxiété chez les lapins nécessitant un traitement IV ou des prélèvements sanguins à répétition.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 20min sous anesthésie et analgésie pour la pose d’un cathéter veineux central.

Impact sur les animaux

La nuisance la plus importante est lié à l’opération chirurgical en elle-même. Durant cette dernière, les animaux sont susceptibles de perdre une quantité importante de sang pouvant entrainer une mauvaise récupération post-opératoire. Cependant, tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur des animaux (anesthésie + analgésie pré et post-opératoire). D’après notre expérience, les animaux supportent très bien le cathéter ainsi que le gilet. Aucune douleur n’est attendue.

Devenir

Au terme de la procédure, tous les animaux seront utilisés pour des expériences nécessitant des prélèvements ou des injections qui seront facilités par le cathéter limitant ainsi les effets néfastes pour les animaux.

Remplacement

Différents types d’étude seront réalisés chez les lapins cathétérisés : analyse pharmacocinétique d’un nouveau composé, tests de toxicité, évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies. L’ensemble de ces utilisations met en jeu l’organisme dans son entièreté et rend le remplacement du modèle animal difficile.

Réduction

Dans un objectif de Réduction, le nombre d’animaux choisi correspond au minimum de lapins qui nous est habituellement commandé sur une année. Cependant il est possible que ce chiffre varie à la hausse (demande d’industriels). Dans le cas d’une demande plus importante, une nouvelle demande d’autorisation de projet sera rédigée. Le nombre de lapins sera de 33 sur 1 an.

Raffinement

Dans un objectif de Raffinement, la procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale par du personnel qualifié. Le design du gilet utilisé pour le maintien du cathéter permet la libre circulation de l’animal dans sa cage sans risque d’arrachement. Les conditions d’hébergement ont également été optimisées par l’enrichissement du milieu. Enfin, l’utilisation de l’analgésique buprénorphine a été mise en place pour réduire la douleur liée à l’opération.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle de choix pour les essais impliquant des actes chirurgicaux. Sa taille facilite la mise en place de matériel médical tels que les cathéters. De plus, le lapin est en certains points (notamment immunitaire), plus proche de l’homme que la souris, notamment pour les études s’intéressant aux infections bactériennes. Les lapins seront utilisés lorsqu’ils auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont souvent nécessaires. Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.

534 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles subissent des prélèvements mensuels de sang et de liquide céphalorachidien, ce dernier via une chirurgie stéréotaxique de pose de canules, et des tests de mémoire, labyrinthe en Y, reconnaissance d'objet et piscine de Morris. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales et un risque d'hypothermie lors du test aquatique, et n'attend qu'un stress léger des épreuves comportementales. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace ces modèles murins pour étudier ensemble les lésions d'Alzheimer et les déficits de mémoire, les retombées thérapeutiques restant hypothétiques.

Objectifs

Les personnes atteintes du syndrome de Down présentent des niveaux accrus de DYRK1A dans le tissu cérébral et de plasma. Une expression accrue des transcrits DYRK1A a été signalée dans des échantillons d'hippocampe provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, bien que les niveaux de protéine DYRK1A dans des homogénats de cortex frontal se soient avérés similaires entre les patients atteints de la maladie d'Alzheimer et les témoins. Récemment, il a été demontré que les personnes âgées souffrant de troubles de la mémoire et présentant une imagerie amyloïde positive présentaient des taux plasmatiques de DYRK1A plus faibles que celles présentant une imagerie amyloïde négative. En outre, il a éte également observé que les adultes âgés cognitivement normaux et sans dépôts amyloïdes présentaient des niveaux plasmatiques de DYRK1A plus élevés que les individus plus jeunes, ce qui pourrait suggérer que l'augmentation de DYRK1A associée à l’âge protègerait de la maladie d'Alzheimer. Dans cette étude, nous cherchons à préciser le lien entre les niveaux cérébraux et plasmatiques de DYRK1A et les deux neuropathologies de la maladie d'Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à mieux comprendre le rôle de la surexpression/downregulation de DYRK1A dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer, en particulier les pathologies amyloïdes et tau. Ce projet contribuera également à une meilleure compréhension de l'apparition précoce de la neuropathologie de la maladie d'Alzheimer chez les personnes atteintes du syndrome de Down, étant donné que le gène codant pour la DYRK1A est situé sur le chromosome 21 et qu'il est donc surexprimé dans cette population. L'étude de biomarqueurs plasmatiques capables d'identifier les individus à haut risque pour la maladie d'Alzheimer de manière rapide et efficace permettrait d'initier un traitement pré-symptomatique de cette maladie, en particulier dans les populations à haut risque. Enfin, les efforts visant à élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les pathologies amyloïdes et tau pourraient également ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques visant à modifier le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Des prélèvements sanguins et de LCR seront effectué une fois par mois entre l'âge de 2 et 6 mois. La souris sera manipulée (pour 3-5 minutes par animal) pour le prélèvement sanguin et de LCR. Les capacités cognitives des souris seront évaluées dans 3 différents tests d'apprentissage et de mémoire: Y maze (8 minutes par animal), reconnaissance de nouvel objet (4 sessions de 10 minutes – 1 session par jour - par animal) et piscine aquatique de Morris (4 sessions de 1 minute par jour pendant 7 jours et 1 session - “probe test” - de 1 minute le jour 8 par animal). 224 souris seront soumises à une injection i.p. d'un mélange d'anesthésiques (2 à 3 minutes par animal ; 1 injection i.p. par animal).

Impact sur les animaux

Pendant le prélèvement de l’échantillon de sang, l'animal est retenu avec précaution par la peau du cou et du dos afin d'immobiliser la tête. Un stress passager peut survenir en raison de l'immobilisation. Une ponction trop profonde peut entraîner la pénétration du sang dans la cavité buccale et un risque d'hémorragie. Un hématome sur le côté du visage peut se produire occasionnellement. L'anesthésie générale utilisée pour la chirurgie stéréotaxique (mise en place de canules pour le prélèvement du LCR) peut entraîner une altération de la thermorégulation, une dépression des systèmes cardiovasculaire et respiratoire, une diminution de l'activité métabolique et une vasodilatation périphérique pouvant conduire à une baisse de la température corporelle. Des douleurs et une détresse post-chirurgicales peuvent également survenir. Les tests comportementaux sont basés sur les comportements spontanés de l’animal avec une procédure graduelle d’habituation-familiarisation aux dispositifs de test. En général, les tests comportementaux utilisés dans ce projet peuvent causer un stress léger. Pour les tests dans l'eau (Labyrinthe aquatique de Morris), il y a un risque d'hypothermie. La contention et la manipulation par l'injection IP peut provoquer un léger stress à l'animal.

Devenir

Deux méthodes d'euthanasie seront utilisées pour atteindre les objectifs du projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de maladie d'Alzheimer et aux croisements avec des souris surexprimant ou sous exprimant DYRK1A, pour atteindre les objectifs du projet: analyses de la pathologie Alzheimer (amyloide et tau) ainsi que des déficits d'apprentissage et de mémoire.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment élaborées et publiées, notamment des études du laboratoire. Des groupes de 15 souris seront nécessaires afin d’atteindre un poiuvoir statistique suffisant permettant de détecter des variations significatives dans les données comportementales. Nous utiliserons sur 3 ans un total de 534 souris.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, la surveillance quotidienne, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, en accord avec le comité de bien-être animal. Un animal sera immédiatement euthanasié après atteinte de l’un des points limites. Les points limites sont définis ci-dessus. Les zootechniciens conseillent sur l’état sanitaire de l’animal identifié et suggèrent les procédures à appliquer, les soins et éventuellement le recours à l’euthanasie. Nous suivrons des recommandations de la cellule bienêtre et vétérinaire avec application de produits disponible par la plateforme. En outre, nous effectuerons un suivi par l’utilisateur journalier avec pour critère l'aspect général de l'animal, comme le poids, le pelage, l'hydratation, l'activité, etc.

Choix des espèces

Deux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer seront utilisés dans ce projet. L'un développe une pathologie amyloïde étendue, tandis que l'autre est un modèle de tauopathie, développant des enchevêtrements neurofibrillaires, une perte neuronale et une atrophie cérébrale. Les deux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer présentent des déficits cognitifs. Nous utiliserons également un modèle de souris qui porte trois copies du gène Dyrk1a de la souris, comme dans la trisomie 21. Un modèle de souris qui porte une seule copie de ce gène complète cette étude. Dans ce projet, nous analyserons les effets de la surexpression du gène Dyrk1a, ainsi que de sa sous-expression sur les pathologies amyloïdes et tau en croisant ces différentes lignées de souris. Des échantillons de sang et de LCR seront prélevés sur des souris adultes à différents âges afin de détecter différents biomarqueurs. Les performances cognitives seront évaluées à l'âge de 4 mois, et des tissus cérébraux seront prélevés sur les souris à l'âge de 6 mois.

679 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome humain, sous la peau ou dans le tibia, puis des traitements répétés par gavage, injection ou voie intraveineuse et une imagerie hebdomadaire pendant trois à six mois. Le porteur décrit une douleur aux sites d'injection, une perte de poids et une mobilité réduite à mesure que la tumeur grossit, et programme la mise à mort dès l'atteinte de points limites. Il reconnaît utiliser des lignées cellulaires in vitro mais juge le modèle murin "indispensable", les retombées pour les patients atteints de lymphome restant renvoyées "à terme".

Objectifs

Les lymphomes NK/T extraganglionnaires de type nasal sont des entités rares de lymphomes T périphériques associés au virus Epstein Barr. Ils se localisent le plus souvent au niveau de la sphère ORL mais peuvent également atteindre d’autres organes dans le cadre de formes disséminées extranasales. La survie globale à 5 ans des formes localisées est actuellement de l’ordre de 70%, alors que celle des formes disséminées ne dépasse pas les 40%. Ceci justifie le développement de nouvelles approches thérapeutiques basées sur des thérapies plus ciblées incluant des approches d’immunothérapie. Les thérapies ciblées permettent en effet une meilleure tolérance au traitement par la réduction des effets indésirables toxiques mais également une meilleure éradication de la tumeur. Elles peuvent s'utiliser seules ou en association avec la chimiothérapie conventionnelle. La compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des lymphomes NK/T est essentielle pour identifier et tester de nouvelles cibles pharmacologiques afin de compléter l’arsenal thérapeutique du clinicien et améliorer significativement les chances de guérison et de survie des patients. Plusieurs molécules candidates ont été identifiées grâce à des données préliminaires obtenues dans des modèles in vitro. Pour certaines d’entre elles, leur efficacité semble être modulée par la présence d’une mutation dans un gène d’intérêt. Ce projet a donc pour objectif de valider l’efficacité de ces molécules dans des modèles murins in vivo. Certaines molécules ont une action cytotoxique directe sur les cellules tumorales et peuvent donc être testées dans des modèles murins immunodéficients alors que d’autres ont pour mécanisme d’action une modulation de l’immunité anti-tumorale et doivent donc nécessairement être évaluées dans des modèles immunocompétents. Le projet se déroulera en deux étapes : -1ère étape : générer les modèles murins appropriés, qu’ils soient immunodéficients ou immunocompétents -2ème étape : tester l’efficacité des thérapies candidates dans ces modèles en évaluant l’impact du statut mutationnel pour notre gène d’intérêt.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité d'inhibiteurs pharmacologiques et d’immunothérapies déjà disponibles dans un modèle préclinique. L’objectif à terme sera de proposer un rationnel d’utilisation de ces médicaments dans les futurs protocoles cliniques de prise en charge des lymphomes NK/T.

Procédures

>Injection des cellules tumorales humaines (lignées) en sous-cutané : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 640 animaux >Injection des cellules tumorales humaines (cellules primaires) par voie intratibiale : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 39 souris >Prélèvement sanguin jugal : • souris vigile • bimensuelle puis hebdomadaire si présence de cellules tumorales circulantes, pendant 3 à 6 mois • durée : 1 min • 49 souris >Imagerie in vivo par bioluminescence : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • hebdomadaire pendant 3 à 6 mois • durée : 30 min • 679 souris >Administration de molécules thérapeutiques par gavage oral : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour pendant 14 jours • durée : 30 secondes • 60 souris >Administration de molécules thérapeutiques par injection intrapéritonéale : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour (ou tous les deux jours) pendant 14 jours (5 jours / semaine) • durée : 30 secondes • 450 souris >Administration de molécules thérapeutiques par voie intraveineuse caudale : • souris vigile • quotidien, à partir de J7-J10 post-injection, une fois par jour pendant 14 jours (5 jours / semaine) • durée : 30 secondes • 180 souris >Transfert adoptif de lymphocytes T OT-1 par voie rétroorbitaire : • sous anesthésie gazeuse par isoflurane • 1 seule fois par animal au cours de la procédure • durée : 1 min • 120 souris

Impact sur les animaux

Douleur aux sites d’injection des cellules tumorales (maxi : 3 jours) / Perte de poids / Mobilité réduite à cause de la croissance tumorale (1 semaine) / Stress lié à l’administration par gavage oral (14 jours)

Devenir

Mise à mort pour tous les animaux de toutes les procédures lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : • Atteinte des points limites (cf grille de score établie pour chaque procédure) • Indication à une greffe dans des receveurs secondaires • Absence de prise de greffe au-delà de 3 ou 6 mois (selon les procédures)

Remplacement

Compte tenu du coût des études cliniques chez l’homme et de la réglementation actuellement en vigueur, une étape intermédiaire de vérification des hypothèses dans un modèle préclinique est indispensable. Dans le cadre de notre projet : •Les cellules tumorales de patients (dites cellules primaires) ne peuvent pas être obtenues en quantité suffisante pour tester in vitro l’efficacité des molécules d’intérêt. De plus, ces cellules sont fragiles et ne peuvent être maintenues en culture suffisamment longtemps pour pouvoir mener des expériences pharmacologiques in vitro. •Les lignées cellulaires n’étant pas le reflet exact de la biologie des hémopathies, il est indispensable de tenter d’amplifier les cellules primaires via un modèle murin afin d’objectiver la pertinence thérapeutique d’une drogue en tenant compte de sa pharmacodynamie et pharmacocinétique. •Pour évaluer la réponse immune anti-tumorale et de sa modulation par les immunothérapies, le rôle du micro-environnement tumoral est absolument majeur dans la réponse au traitement, une dimension qui ne peut naturellement pas être appréciée dans les études in vitro / ex vivo. Pour toutes ces raisons, la souris reste le modèle préclinique indispensable pour l’étude des lymphomes NK/T et pour tester l’efficacité in vivo de nouvelles thérapeutiques, et ce, avant de pouvoir les proposer aux humains dans le cadre d’essais cliniques.

Réduction

Méthologie de réduction du nombre des animaux nécessaires à l’expérimentation : •Evaluation pharmacologique in vitro approfondie sur lignées cellulaires pour optimiser les concentrations de drogues et pour sélectionner un nombre restreint de drogues d’intérêt (déjà réalisé) •Quantification de la viabilité cellulaire avant toute injection dans les souris •Optimisation du matériel issu de xénogreffe par productions multiples •Réduction du nombre d’animaux au minimum, après estimation des effectifs afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement recevables. •Utilisation d’un même groupe de souris contrôles traitées par placebo pour évaluer l’efficacité de plusieurs drogues administrées selon la même voie •Utilisation de l’imagerie par bioluminescence : ce système d'imagerie optique préclinique permet d’évaluer la croissance tumorale. Des signaux de bioluminescence et/ou de fluorescence peuvent être suivis de manière longitudinale ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux. Un suivi quotidien des souris sera effectué dans les 3 jours suivant l’injection des cellules tumorales. En cas de signes évocateurs d’infection ou de douleurs au site d’injection, du meloxicam sera administré. Nous avons également défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi bihebdomadaire de ces points limites permettra de minimiser la douleur des animaux en programmant leur mise à mort si nécessaire. Les procédures seront par ailleurs raffinées par un enrichissement des cages d'animaux. Les cages seront enrichies à l’aide de coton et de cabanes, pour répondre aux besoins de nidification et ludiques des souris. Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Les souris NSG seront hébergées dans une zone SOPF, en portoirs ventilés et manipulées sous hotte ou PSM, leur permettant ainsi de ne pas exprimer de phénotype dommageable. Les injections de cellules en sous-cutané, rétroorbitaire ou intratibiale, les prélèvements sanguins et l’imagerie par bioluminescence nécessaires au suivi seront réalisés sous anesthésie. Concernant les traitements nécessitant un gavage oral, les souris seront habituées progressivement aux procédures de gavage avant la phase de traitement.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes ont été décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des hémopathies humaines et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Concernant l’évaluation de la réponse immune anti-tumorale, le modèle de greffe dans des souris contrôles a déjà été validé dans la littérature. Pour les souris immunodéficientes : souris adultes entre 8 et 12 semaines, âge durant lequel la probabilité de prise de greffe est maximale selon les données de la littérature et l’expérience du laboratoire. Pour les souris contrôles : souris adultes entres 6 et 8 semaines, âge conforme aux données de la littérature

1010 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime gras induisant obésité et diabète, elles subissent des injections quotidiennes, des séances de natation forcée deux fois par jour, des tests métaboliques et des échographies, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur reconnaît une perte de poids et une fatigue liées à l'exercice, et un risque de rupture de l'estomac ou de l'œsophage lors du gavage. Il indique remplacer certaines cellules primaires par des lignées in vitro mais juge l'analyse d'un cœur "entier" impossible à reproduire ainsi, les retombées thérapeutiques restant au conditionnel.

Objectifs

Dans un premier temps, il s’agit d’effectuer une analyse in vivo et histologique de modèles murins pour les tissus d’intérêt comme le cœur, le rein, le foie et le tissu adipeux dont le but est de : 1) comparer la reproductibilité des données en utilisant un protocole unique et standardisé sur les modéles murins de diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses, 2) mettre en place une bio-banque d’échantillons de sang et de tissus pour réaliser des analyses multi-translationnelles, 3) étudier le rôle des macrophages résidents du coeur dans un contexte d’obésité. Le deuxième objectif du projet est de définir des nouvelles stratégies thérapeutiques prévenant le développement de cardiomyopathie dont la formation est liée aux altérations induites par des troubles métaboliques (l’obésité et le diabète) et le vieillissement accéléré du cœur dans ce contexte d’obésité (inflammation, dommages faits à l’ADN, dysfonction mitochondriale). Etape 1) Evaluer l’effet de molécules à fin thérapeutique modulant spécifiquement l’action de molécules impliquées dans le métabolisme sur la fonction cardiaque. Etape 2) Valider et optimiser la molécule cible sur les troubles métabolliques. Etape 3) Définir les mécanismes d’action spécifiques de la molécule thérapeutique sur l’amélioration de la fonction cardiaque et sur la résolution de l’inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester la reproductibilité des données en comparant dans différents laboratoires en Europe l’impact d’un régime riche en graisses chez des souris mâles et femelles de type C57BL/6 sur la structure et la fonction cardiaque ainsi que l’évaluation métabolique et l’impact sur d’autres organes comme le foie, le rein ou le tissu adipeux. L’identification du rôle des macrophages dans le vieillissement cardiaque permettra d’identifier de nouvelles voies pathophysiologiques et donc d’envisager de nouvelles thérapies. Enfin, nous attendons une action géroprotrectrice et plus généralement une protection renforcée des tissus avec une haute tolérance du produit chez les animaux traités. De plus, de façon plus spécifique, nous attendons une amélioration des fonctions cardiaques avec une action anti-fibrotique ainsi qu’une amélioration des dommages faits à l’ADN. Ces données pourraient permettre de repositionner certaines molécules dans le traitement des cardiomyopathies métaboliques, pourvoyeuses d’insuffisance cardiaque en pathologie humaine.

Procédures

Echocardiographie : Geste non-invasif d'une durée de 3-4 minutes, permettant d’évaluer les fonctions cardiaques, réalisé au début, au milieu et à la fin de l'expérimentation sur animaux vigiles. Grip test : Test de préhension soutenue non-invasif qui permet d’évaluer la force musculaire, réalisé sur animaux vigiles pour l’ensemble des animaux en début, milieu et fin d'expérimentation. Glycémie : Mesure du taux de glucose sanguin de tous les animaux. Sur animaux vigiles, on prélève une goute de sang à la queue. Injections : Sur animaux vigiles, on effectue une injection quoitidienne en i.p. ou en sous-cutané (selon l’efficacité de distribution du produit) en utilisant de fines aiguilles afin de limiter la souffrance chez l’animal. Exercice physique : Séances biquotidiennes de natation en cuve d’eau chauffée à 33°C ± 2°C espacées de 6h et augmentant progressivement de 5 à 40 min pendant une période de 6 semaines. Insuline-tolérance test (ITT) et glucose-tolérance test (GTT) : Tests métabolliques permettant d’évaluer la résistance à l’insuline et la tolérance au glucose. Sur animaux vigiles mient à jeun pendant 6h, injection en i.p. (vol max 200µl, calculé en fonction du poids de l’animal) soit d’insuline (ITT), soit de glucose (GTT) et de suivre la glycémie à T=0, T=15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min. La moitié des animaux seront soumis à un test GTT et l’autre moitié au test ITT en début et fin de régime. Gavage : Technique non utilisée sur les animaux âgés (8 et 24 mois) et uniquement dans le contexte d’un produit ne pouvant être administré en eau de boisson. Sur animaux vigiles, on effectue un gavage quoitidien pendant 30 jours à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une sonde de gavage adaptée sans induire de souffrance ou détresse chez les souris.

Impact sur les animaux

Un effet de stress est attendu lors de la réalisation de l’échocardiographie ou du test de tolérance au glucose. L’animal sera alors sous haute surveillance jusuqu’au rétablissement d’une glycémie normale, c’est-à-dire à partir de 80 mg/dL. La pratique de l’exercice physique peut entraîner une perte de poids et une fatigue chez l’animal qui est directement lié à la pratique régulière d’une activité physique. À la suite de ces observations, les temps de pratique de l’exercice physique seront ré-évalués chez les animaux concernés. Le régime enrichi en graisse entraîne une prise de poids et peut conduire à des troubles métabloliques. Les injections quotidiennes peuvent entraîner l’apparition d’un hématome. Nous limiterons l’utilisation de la méthode de gavage pouvant entraîner un stress chez les animaux, surtout âgés et afin de limiter les désagréments chez l’animal et le dépôt de la substance dans le poumon ou la rupture de l'estomac ou de l'œsophage.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Nous remplaçons les cellules primaires par des lignées cellulaires dans nos tests "in vitro": soit en utilisant les lignées cellulaires H9C2 de cardiomyocytes, les lignées 3T3L1 d'adipocytes pour les co-cultures, soit des lignées cellulaires de macrophages murins (raw264) comme cible de l’action sénolytique des molécules thérapeutiques

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à notre étude a été calculé pour nous assurer de l’obtention de résultats concluants afin de répondre aux questions posées en tenant compte des expériences antérieures du laboratoire sur le stress métabolique induit par le régime riche en graisse ayant été étudié préalablement sur ce fond génétique: il faut entre 10 à 15 animaux par lot pour obtenir une réponse statistique fiable des expériences puisque nous n'obtenons pas de réponse équivalente chez tous les animaux en expérimentation. De même, le nombre de souris a été optimisé pour chacune de nos procédures expérimentales tout en assurant une reproductibilité et une robustesse dans nos expérimentations, mettant à profit nos connaissances sur les tranches d’âge auxquelles nous devons réaliser nos expérimentations afin d’être le plus pertinent possible dans l’établissement de nos procédures. Enfin, afin d’utiliser au mieux les animaux, nous regarderons simultanément différents tissus d’intérêt dans un même animal (réduction importante du nombre d’animaux prévus).

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime riche en graisse (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures. entraîner une hypoglycémie sévère qui pourra être détectée par mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre et qui sera immédiatement prise en charge par l’administration d’une dose de glucose. La surveillance hebdomadaire de la prise de poids puis un contrôle de la glycosurie en cas de prise de poids trop importante assurera le suivi nécessaire au bien être animale pendant le régime riche en graisse. Pour éviter l’apparition d’un hématome, les injections seront pratiquées en changeant de côté régulièrement pour laisser du temps à la résorption d’un éventuel hématome. Enfin, l’administration orale du produit se fera autant que possible dans l’eau de boisson.

Choix des espèces

La cardiomyopathie est bien caractérisée chez les mammifères avec des méthodes d’analyse facilement accessibles et reproductibles. Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisses est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. Par ailleurs, l’évaluation de l’action combinée de l’obésité et de l’âge sur les mécanismes conduisant au développement d’événements cardiovasculaires nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Le modèle expérimental choisi est donc la souris. Ce modèle murin présente l’avantage de développer un vieillissement relativement rapide et d’offrir des conditions très reproductibles de développement d’une cardiomyopathie métabolique. Enfin, la souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme sur les paramètres liés au métabolisme du glucose et la surcharge pondérale. L’étude se fera sur des souris à un stade de jeune adulte (5 mois) et à deux stades âgés (12, 18 mois) et à un stade très âgé (24 mois). Pour l’étude portant sur le vieillissement cardiaque, nous utiliserons des animaux mâles âgés de 12, 18 et 24 mois. Pour l’étude de l’obésité conjugué au viellissement, nous utiliserons des souris jeunes adultes de 5 mois dont le fonctionnement du système cardiovasculaire commence à subir les effets du vieillissement et de 12 mois d’âge dont leur système cardiovasculaire est altéré spontanément par le vieillissement.

5 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés ou rendus à l'élevage plutôt que tués. Chaque animal subit deux chirurgies crâniennes avec pose d'un plot de tête et une craniotomie de 18 mm, puis des mois d'entraînement à des tâches d'attention et des enregistrements par électrodes enfoncées dans le cerveau. Le porteur reconnaît un risque d'infection des chambres d'enregistrement et des lésions cérébrales possibles à chaque session, qu'il juge rares. Il revendique une recherche fondamentale sur l'attention, transposable à l'humain "par extension", et présente le macaque comme le modèle le plus proche, la mise à mort n'étant qu'un dernier recours.

Objectifs

La fonction attentionnelle est une fonction cognitive essentielle à l’implémentation de la plupart des autres fonctions cognitive. Elle améliore ainsi les fonctions d’apprentissage, de mémorisation, de planification, de raisonnement etc. Lorsqu’elle fait défaut, suite à un accident cérébral, une maladie neurodégénérative ou encore des troubles neurodéveloppementaux, les personnes se retrouvent en difficultés cognitives dans leur vie quotidienne et leurs apprentissages. Notre objectif est d’identifier les processus neuronaux et métaboliques qui sous-tendent cette fonction à la fois localement (c’est-à-dire comprendre comment chaque neurone et les neurones d’une même région cérébrale fonctionnent ensemble lorsqu’on utilise notre attention), et dans le réseau cérébral attentionnel (c’est-à-dire entre les différentes aires cérébrales qui sont activées lorsqu’on utilise notre attention). Nous analyserons ces réponses neuronales locales et distantes pendant l’exécution de tâches comportementales impliquant l’attention, en situation normale, ou lors de l’utilisation de molécules stimulant le système noradrénergique et ainsi l’attention, ou encore, en utilisant des approches visant à modifier l’activité corticale par le sujet lui-même et lui permettant d’apprendre à optimiser le fonctionnement de ces régions cérébrales. Le projet combine analyse du comportement, et injections pharmacologiques systémiques et intracérébrales, enregistrements électrophysiologiques, et enregistrements métaboliques. Nous ciblerons spécifiquement le cortex pariétal et le cortex préfrontal, deux régions impliquées dans la fonction attentionnelle. Il sera réalisé chez le primate non humain, le seul modèle animal doté d’un système visuel et attentionnel comparable à celui de l’Homme et capable d’effectuer des tâches aussi complexes que celles réalisées par l’Homme. Ce projet nous permettra d’atteindre une meilleure compréhension de la façon dont le cerveau met en œuvre la fonction attentionnelle, et de proposer des pistes thérapeutiques pharmacologiques ou interventionnelles (invasives ou non-invasive) pour sa réparation ou son amélioration.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et la fonction attentionnelle du primate non-humain, et de l’homme par extension. Grâce à ce projet, nous pourrons comprendre comment l’activité neuronale et métabolique du cortex pariétal et du cortex préfrontal organise la fonction attentionnelle et quel rôle la neuromodulation noradrénergique joue dans ce contexte. Nous serons également en mesure de caractériser les bénéfices des approches visant à modifier l’activité corticale par le sujet lui-même (neurofeedback) sur la dynamique cérébrale ainsi que sur la performance comportementale. Ces questions relèvent clairement du domaine des neurosciences fondamentales, et notre principale ambition est de mieux comprendre comment le cerveau met en œuvre la fonction attentionnelle chez l'homme et les primates non humains. Cependant, nous pensons que les réponses que nous apporterons pourront alimenter les neurosciences cliniques.

Procédures

Habituation à la sortie de cage (3 mois) ; 2 Chirurgie sous anesthésie générale (3h/ Chirurgie); Habituation aux tâche comportementales (6 mois); Enregistrements électrophysiologiques et métaboliques (3 mois); 2 Anesthésies générales pour examens d’imagerie anatomique (3h/ examen). La procédure dans son ensemble est considérée comme modérée.

Impact sur les animaux

La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en céramique et en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. Les chambres d’enregistrement pariétale et préfrontales donneront sur une craniotomie (circulaire 18mm de diamètre) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode (d’enregistrement neuronal ou métabolique) au moment des sessions d’expérimentation. La présence de ces chambres d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les différentes phases du projet soit délétère pour la santé de l’animal. Toutes les étapes du projet étant classées en procédure légère, à l’exception des interventions chirurgicales classées en modérée, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives. Les animaux ayant un plot implanté seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant les mêmes approches expérimentales. De ce fait, nous ne prévoyons de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole que sur les animaux pour lesquels une sortie de protocole sera décidée. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques. Les animaux sortis de protocole seront candidats à un replacement dans un sanctuaire. En dernier recours, si aucune solution alternative n’est possible, les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude de recherche fondamentale, utilisant des approches d’électrophysiologie et de pharmacologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Aucun autre modèle animal ne présente ces caractéristiques. Par ailleurs, cette approche d’électrophysiologie telle que décrite dans le projet ne peut être à ce jour réalisée chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations. Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 5 animaux dans le protocole (4 en réutilisation et 1 en nouvelle inclusion). Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques comportementales avec des méthodes d’électrophysiologie chez le primate non-humain, étant données les conditions expérimentales envisagées, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=1). Tous les protocoles seront lancés sur les mêmes animaux ce qui nous permettra de comparer différentes acquisitions sur les mêmes sujets et ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les animaux en réutilisation, pour cette étude, sont déjà entrainés aux tâches comportementales et hébergé dans le laboratoire. Deux sont déjà implantés des chambres d’enregistrements. Cette réutilisation est d’autant plus importante que ces animaux doivent être entraînés sur une longue durée de temps, avec renforcement positif, pour arriver à un comportement stable, avant de pouvoir passer à la phase de collecte de données.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bienêtre des animaux. L’expérimentation implique l’utilisation simultanées de plusieurs types d’enregistrements (neuronaux, métaboliques) avec ou sans manipulation pharamacologique, permettant ainsi de maximiser la qualité et la diversité des données recueillis permettant ainsi le recueil de données de haute valeur scientifique, habituellement recueillis dans le cadre de plusieurs protocoles indépendants. L’implantation du plot, réalisée chirurgicalement sera réalisée avec les meilleures techniques d’asepsie possible, par un neurochirurgien, afin de réduire le risque d’infection ou de désimplantation. Les animaux ne seront implantés avec les chambres d’enregistrement qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes/sondes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiquerons comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques et métaboliques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire. De plus, la mise en place de points limites précoces nous permettra un suivi régulier du stress des animaux.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Cette étude s’intéresse à des mécanismes neurobiologiques chez le macaque pour des raisons de connaissance fondamentale. - Phylogénétiquement, ce modèle animal est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle la rendant notamment plus « facilement » comparable pour des études cognitives -Toutes informations physiologiques ou physiopathologiques obtenues chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les quatre animaux réutilisés sont des animaux matures. Les animaux reçus de nos fournisseurs sont de jeunes adultes (3.5-4 ans). Ils arrivent généralement déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. L’étude portant sur des sujets adultes, les variations de maturation ou de vieillissement au sein de cette tranche d’âge restes minimes et ne devrait pas engendrer de variations significatives des réponses neuronales dans les taches étudiées

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour être dépourvues du récepteur plaquettaire G6b-B, elles reçoivent cinq injections d'un stimulant plaquettaire, jusqu'à quatre prises de sang sous anesthésie et un prélèvement terminal, la moitié subissant en plus une section de la queue pour mesurer le temps de saignement. Le porteur affirme que le traitement n'entraîne aucun effet négatif et attribue la gravité modérée au seul cumul des gestes. Il conclut que ces mécanismes doivent être étudiés dans un "organisme entier" et que la souris est la seule espèce porteuse de cette mutation.

Objectifs

La thrombocytopénie est un trouble plaquettaire fréquent dont les causes et les conséquences sont variées. Les souris dépourvues du récepteur plaquettaire G6b-B (G6B KO) naissent avec un défaut des mégacaryocytes (MK), cellules formant les plaquettes, et des plaquettes elles-même. Ces souris présentent entre autres une macrothrombocytopénie sévère (diminution du nombre de plaquettes circulantes avec augmentation de leur taille). Les mêmes caractéristiques ont été récemment signalés chez des patients présentant les mêmes mutations dans le gène codant pour le récepteur G6b-B. Pour mieux comprendre la cause et le traitement de cette pathologie, nous avons utilisé des approches génétiques et pharmacologiques pour rétablir le nombre et la fonction des plaquettes chez les souris G6b KO. Notre intérêt s’est porté sur le traitement par le romiplostim, agent stimulant la production de plaquettes sanguines, qui a permis de remédier à la thrombocytopénie. Ceci laisse penser qu'il pourrait s'agir d'une thérapie prometteuse pour les patients dépourvus de G6b-B fonctionnel. De part la similarité entre les caractéristiques souris et patients dépourvus de G6b-B, cette étude permet d’étudier le potentiel thérapeutique du romiplostim sur la thrombopénie induite. Le romiplostim étant un traitement déjà utilisé sur les patients pour d’autres pathologies. Nous avons précédemment montré que le romiplostim permettait le rétablissement de la thrombocytopénie chez les souris déficientes en G6b. Ce projet vise à étuder l’effet du traitement sur l’hémostase suite au rétablissement du nombre de plaquette. De plus, il est connu que le traitement au romiplostim peut entrainer une myélofibrose (trouble affectant la moelle osseuse). Ces analyses permettront également d’étudier l’impact de l’utilisation du romiplostim sur la moelle osseuse et ses conséquences.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est, dans la continuité de précédentes expériences, d’étudier la fonctionnalité des plaquettes sanguines des souris G6b KO après traitement au romiplostim. Bien que le traitement au romiplostim permet le rétablissement du nombre de plaquettes circulantes et de leurs propriétés, il reste à savoir si ce traitement permet de rétablir efficacement la fonctionnalité principale de plaquettes, c’est-à-dire l’arrêt de saignement. De plus, il est connu que le traitement au romiplostim peut entrainer une myélofibrose. Ces analyses permettront d’étudier l’impact de l’utilisation du romiplostim sur la moelle osseuse et ses conséquences. Les phénotypes très similaires entre les souris G6b KO et la macrothrombocytopénie et myélofibrose congénitales chez l'homme constituent un modèle intéressant pour étudier la base moléculaire de cette maladie. Ainsi l'efficacité relative des actuels et nouveaux traitements de la thrombocytopénie peut être analysée. Une telle étude est particulièrement pertinente en raison de l'émergence de mutations de G6b comme cause de thrombocytopénie héréditaire dans de multiples familles

Procédures

L’ensemble des animaux recevront le traitement romiplostim par injection (5 injections au total sur 15 jours, sur animal vigile, durée de geste environ 30 secondes). Les animaux auront également un prélèvement de sang (maximum 4 prélèvements par animal sur 15 jours, sous anesthésie générale, durée d’environ 1 minute). Tous les animaux subiront également un prélèvement de sang terminal (1 prélèvement, sous anesthésie générale, durée 5 minutes). La moitié des animaux subiront en plus un temps de saignement (sous anesthésie générale, durée de l’expérimentation 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le traitement romiplostim n'entraine aucun effet négatif, comme chez l'homme. Les nuisances sont essentiellement liées au stress de contention au moment des injections en sous-cutanée (durée de la manipulation estimée à 30 sec). Le produit injecté n’induit pas de douleur. Les injections sous-cutanés seront espacés de quelques jours et un total de 5 injections sera effectué. Nous n’attendons pas de douleur liées aux injections, et le site d’injection sera régulièrement observé pour s’en assurer. Suite au prélèvement de sang, les souris pourront présenter un saignement modéré ainsi qu’une douleur (estimée à 1h post-injection). Ces prélèvements répétés étant assez espacés (5-10 jours entre les prélèvements) nous n’attendons pas de traumatismes et douleurs importantes que pourraient engendrer des prélèvements rapprochés. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement de sang, durée de 30 secondes avant endormissement. Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 3-5min. Après le temps de saignement, les souris pourront présenter un saignement ainsi qu’une douleur au niveau de la section de la queue. Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 5-10 min. Les différents gestes pris séparement représentent des nuisances légères, mais nous considérons que le cumul des interventions induit une nuisance de type modéré pour les souris.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour analyses post-mortem.

Remplacement

Ces expériences utilisant la souris ne peuvent être remplacées par des études in vitro, d’une part car ces essais doivent être menés dans un organisme entier afin d'accéder à la complexité des mécanismes, ce qui fait l'objet de notre projet. D'autre part, la souris est la seule espèce pour laquelle nous disposons de modèles dépourvus de la protéine co-inhibitrice G6b-B, ayant un phénotype similaire à celui des patients ayant la même mutation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum afin d’obtenir des données statistiquement significatives. Les données seront traités avec des tests statistiques adaptés permettant de répondre aux questions posées. Nos études précédentes nous ont permis de définir au préalable le protocole de traitement à utiliser.

Raffinement

Les conditions du travail seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux manipulations des souris. Les prélèvements de sang pour suivi cinétique de la numération plaquettaire se feront sur des souris sous anesthésie générale gazeuse afin d’éviter la souffrance mais favoriser un réveil rapide. Dans tous les cas, les souris restent ensemble dans la même cage durant toute l'expérience. Les cages sont enrichies en jouets et coton à déchiqueter pour qu’elles y fassent leur nid, et les animaux sont manipulés avec calme et par des manipulateurs avertis pour limiter le stress de contention, dans l'intérêt du bien-être animal. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie et analgésie. L’état de santé des animaux est suivi tout au long de l’expérimentation à l’aide d’une grille intégrant des points limites, permettant d’interrompre les procédures.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce pour laquelle nous disposons de modèles dépourvus de la protéine co-inhibitrice G6b-B, ayant un phénotype similaire à celui des patients ayant la même mutation. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet, à partir de 8 semaines, âge à partir duquel la croissance se stabilise. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge, de 8 à 20 semaines environ.