Recherche fondamentale

310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines au flanc, puis un traitement quotidien cinq jours par semaine pendant trois à quatre semaines, avec un suivi total de quatre à six mois avant le prélèvement des tumeurs. Le projet teste une molécule censée sensibiliser les cellules souches cancéreuses aux chimiothérapies, avec un bénéfice pour les patients situé "à plus long terme". Le porteur affirme que la validation in vivo est "nécessaire" pour prendre en compte le métabolisme et le microenvironnement.

Objectifs

Dans le cadre de ce projet de recherche, nous voulons évaluer l'efficacité in vivo d'une nouvelle molécule ciblant un facteur de transcription impliqué dans la survie des cellules souches cancéreuses des cancers colorectaux.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet devrait permettre dans une premier temps de tester et d'obtimiser l'efficacité in vivo de nouvelles molécules ciblant une protéine impliquée dans la résistance aux chimiothérapies dans un modèle préclinique murin. A plus long terme, si ces résultats sont concluants, ils pourront potentiellement bénéficier aux patients comme stratégies adjuvantes afin d'améliorer l'efficacité des traitement actuels

Procédures

À l’âge de 7 semaines, les souris dépourvues de système immunitaire (immunodéprimées) seront dans un premier temps greffées avec des cellules tumorales humaines (injection sous-cutanée, durée de contention

Impact sur les animaux

Nous anticipons de légères douleurs provoquées par la piqure avec une aiguille (injection de cellules en sous-cutanée ou de molécules en intrapéritonéales), une possible perte de poids durant les traitements par chimiothérapie. En outre, le développement d'une masse tumorale sur le flanc droit pourrait entrainer une altération de la locomotion de l'animal.

Devenir

A l'issue des procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélevéer et d'analyser les tumeurs résiduelles: analyse moléculaires et histologiques.

Remplacement

In vitro, le PXR PROTAC diminue la population de cellules souches cancéreuses ainsi que l’expression de PXR. La validation in vivo de ces données s’avère nécessaire afin de prendre en compte le rôle du métabolisme et du microenvironnement dans le processus de chimiorésistance et de récidive.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux requis pour ces expériences originales qui ne peuvent pas être réalisées autrement que sur la souris immunodéprimée, sans que cela se traduise par l’obtention de résultats moins fiables. Le nombres d’animaux a été déterminé au minimum après calcul de l’échantillonnage nécessaire afin d’obtenir une puissance statistique satisfaisante compte-tenu de nos études antérieures (Planque 2016 et Bansard 2022)

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux et nerveux, nous avons prévu de les maintenir en groupes de 5/cage avec un environnement enrichi (maison carton, copeaux, cotons) afin qu'elles puissent se fabriquer des nids. Les injections intraveineuses seront réalisées sous anesthésie rapide afin de limiter la souffrance des animaux. Compte tenu de la répétition des traitements, nous allons évaluer au moins deux fois par semaine leur état de santé (poids, taille des tumeurs, locomotion, posture) afin de déceler toute douleur subie. Nous avons ainsi identifié des points limites justifiant l’euthanasie des animaux si nécessaire.

Choix des espèces

Les souris dépourvues de système immunitaire sont les modèles utilisés internationalement pour étudier la sensibilité des cellules tumorales humaines aux chimiothérapies et leur capacité à former des tumeurs. Ne possédant de lymphocytes (cellules immunitaires), elles acceptent la greffe de tissus, de tumeurs ou de cellules humaines sans présenter de phénomène de rejet. Age 6 semaines, âge où l’on observe une bonne prise de greffe, et suffisamment âgées pour permettre une récupération dans les meilleures conditions après l'injection de cellules tumorales.

126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, six injections d'un anticorps et sept prélèvements sanguins, la mise à mort intervenant quand la tumeur atteint 2 000 mm³ ou en cas de nécrose. Le projet compare un anticorps humanisé à sa version murine déjà testée, pour un bénéfice que le porteur situe "à long terme". Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de tester ces anticorps sur un "système mammifère vivant entier" et écrit devoir "malheureusement" utiliser à nouveau des souris.

Objectifs

Le système TRAIL (récepteur membranaire) est très prometteur en oncologie car il induit préférentiellement la mort des cellules cancéreuses, épargnant les cellules saines. De nombreux efforts ont été mis en place pour développer des molécules capables d’activer cette voie. Dans une précédente publication nous avons validé l’efficacité antitumoral d’un anticorps monoclonal murin ciblant le récepteur DR4 (récepteur membranaire). Ce dernier a été humanisé et doit être comparé à l’anticorps murin, avec un effet dose, pour validation préclinique. Nous utiliserons donc la lignée de référence publiée en 2019 (BL2)

Bénéfices attendus

Le bénéfice à long terme est la mise au point d’un nouveau traitement immunothérapie pour les cancers chez l’Homme.

Procédures

- Une injection en sous-cutané (environ 4-5 secondes) sous anesthésie à l’isoflurane - Injections en intra-péritonéal (environ 2 secondes), tous les quatre jours, six injections - Prélèvements sanguins sous anesthésie, 100µl de sang par prélèvement maximum, toutes les semaines, sept prélèvements. - Mesure des volumes tumoraux

Impact sur les animaux

Nous attendons une très légère gêne de la motricité à cause de la croissance tumoral, afin de limiter cela, les souris seront mises à mort lorsque les tumeurs auront atteint la taille de 2000 mm3. Nous ne nous attendons pas à des atteintes pulmonaires, mais nous serons vigilants aux éventuelles détresses respiratoires, qui donneront lieu à une mise à mort. Les prélèvements sanguins et les injections de cellules seront effectués sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane afin de réduire le stress et de permettre la contention des animaux. Des nécroses pourraient apparaitre sur les tumeurs (cela est peu probable), si une nécrose dépasse les 2 mm de diamètre la souris sera mise à mort.

Devenir

La croissance tumorale, ainsi que le prélèvement de sang final justifient la mise à mort des animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est disponible pour tester l’effet des anticorps thérapeutiques sur un système mammifère vivant entier. L’utilisation de souris est donc nécessaire afin d’évaluer la pertinence pré-clinique des traitements antitumoraux. C’est cette approche que nous avions utilisée pour tester notre anticorps murin. Nous devrons malheureusement l’utiliser à nouveau pour tester la version humanisée

Réduction

Nous avons choisi le nombre d’animaux par groupe après étude de la variabilité de la croissance tumorale et de l’effet du traitement obtenue lors de nos précédentes études. Un test statistique sera utilisé afin d’évaluer la significativité des résultats obtenus. Comme indiqué précédemment, si les effets mesurés sont fiables d’un point de vue statistique au deuxième essai, nous n’en feront pas un troisième, ce qui permettra de limiter d’au moins 30% le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

La croissance tumorale sera mesurée trois fois par semaine pour éviter l’apparition de tumeurs de taille excessives. Les animaux seront anesthésiés lors des prélèvements de sang et lors de l’injection des cellules tumorales. Les animaux auront un enrichissement dans les cages sous forme de tunnels.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris NUDE. Cette lignée présente une mutation génétique causant un thymus absent ou détérioré, ce qui résulte en un système immunitaire déficient dû au nombre grandement réduit de lymphocytes T mais conserve les autres cellules du système immunitaires comme les macrophages et cellules dendritiques. Ce modèle permet la greffe de cellules tumorales humaines et garde la capacité des macrophages et des cellules dendritiques à entrainer une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). L’évolution de ces xénogreffes sont ensuite évaluées en fonction des différents traitements testés. Les modèles syngéniques ne peuvent être utilisés car l’anticorps reconnait la forme humaine du récepteur TRAIL. Souris de 6-8 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie sous anesthésie pour injecter un produit dégradant un réseau de molécules cérébrales, un isolement individuel pendant toute l'étude, une contention en tube pour mesurer la composition corporelle et un test de glycémie, avant le prélèvement de leur cerveau. Le projet vise à comprendre le rôle de ce réseau dans l'obésité et le diabète, dans une perspective thérapeutique que le porteur renvoie au "plus long terme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal pour ces interactions complexes.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 sont des problèmes majeurs de santé publique. Le poids corporel d’un individu est fortement influencé par l’activité de différents neurones, qui agissent sur la prise alimentaire, le stockage de graisse, la dépense d’énergie et participent à la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang). Certains de ces neurones sont entourés d’un réseau de molécules qui forment comme un filet autour d’eux. Ce filet est appelé filet périneuronal (FPN), et participe à la fonction et la maturation des neurones qu’il enveloppe. Dans le contexte de l’obésité, le rôle de ce FPN est encore mal connu. Notre objectif dans cette étude est de dégrader le FPN dans une région cérébrale impliquée dans le contrôle du poids, de la prise alimentaire et de la régulation de la glycémie, afin d’en étudier les conséquences, en particulier en situation d’alimentation hypercalorique. Nous souhaitons notamment connaître le rôle joué par le FPN dans la susceptibilité à développer une obésité et à dérégler le contrôle glycémique. Pour ce faire, nous utiliserons au total 80 souris mâles et femelles, chez lesquelles nous injecterons un produit qui dégrade le FPN par neuro-chirurgie. Certaines de ces souris seront nourries avec une alimentation hypercalorique pour rongeur et comparées à celles qui resteront sous une alimentation standard. Nous mesurerons l’évolution du poids, de la prise alimentaire, de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre), ainsi que le contrôle glycémique. À la fin de l’étude, nous récupèrerons les cerveaux de ces souris pour des analyses in vitro complémentaires.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle du filet périneuronal dans le développement de l'obésité et du diabète de type II, en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements moléculaires associés au niveau cérébral. De plus, le FPN est présent aussi bien chez la souris que chez l’Homme, ce qui renforce la portée translationnelle de ces résultats. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de restauration du FPN, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. Tous les animaux de cette étude (80) sont concernés par l’ensemble des gestes suivants : 1) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées de 3 semaines. 2) Neuro-chirurgie : cette technique est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 1 heure. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée durant toute l’étude. 3) Test de régulation de la glycémie : ce test nécessite de réaliser sur les souris une injection après un jeûne de 5 heures, puis de mesurer leur glycémie à 7 temps différents temps post-injection, par pélèvement d'une goutte de sang. Ce test est réalisé sur souris vigiles, avec un intervalle de temps d’au moins 15 minutes entre chaque mesure. Un seul test sera réalisé durant toute l’étude. 4) Hébergement : les souris de cette étude seront hébergées de manière individuelle, pour nous permettre de mesurer la prise alimentaire de chaque animal. L’isolement débutera dès l’arrivée des souris et jusqu’à la fin du projet.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte. Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal. Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Pour réduire au maximum le stress ressenti par les animaux, nous avons prévu une période d’habituation d’une semaine à l’expérimentateur. De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement ou de façon hebdomadaire, nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale. Au-delà de du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. Notre protocole d’analgésie le jour de la chirurgie et les jours suivants permet cependant une prise en charge efficace des douleurs post-opératoires liées à l’incision de la peau du crâne. Les animaux seront suivis quotidiennement la semaine suivant la chirurgie et toute aggravation de leur état fera l’objet d’une évaluation, avec des points limites précoces qui déclencheront une prise en charge analgésique supplémentaire et des points limites terminaux qui entraîneront la mise à mort immédiate de l’animal pour éviter toute souffrance inutile.

Devenir

À l’issue de l’unique procédure de cette étude, tous les animaux (80) seront mis à mort par une injection d’euthanasiant. Nous récupérerons par la suite leur cerveau, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les changements neuro-moléculaires associés à la dégradation du filet périneuronal.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre l’effet de la dégradation du filet périneuronal sur un ensemble de phénomènes, tels que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre tous ces acteurs. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différentes expériences sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique, qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une neuro-chirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 3 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de mofication de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le contrôle de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, le filet périneuronal est présent à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront à l’âge de 7 semaines dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.

4 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de cellules cancéreuses sous la peau du dos, puis des chimiothérapies par voie intra-péritonéale et des molécules par gavage pendant quatre semaines, avec des effets attendus de fatigue, diarrhées, troubles cognitifs et perte de poids. Les souris sont tuées après un prélèvement de sang par ponction cardiaque, pour étudier le rôle de certains lipides dans la résistance des tumeurs aux traitements. Le porteur affirme que des études précliniques sur animaux sont "incontournables" pour saisir la pharmacocinétique des molécules.

Objectifs

Dans la lutte contre le cancer, des échecs thérapeutiques persistent à cause de mécanismes de résistance des tumeurs aux traitements en partie dû à une production accrue de lipides qui constituent la matière grasse du vivant. Dans le cadre des cancers colorectaux (CCR), les travaux de notre équipe ont montré que la résistance des cellules coliques aux traitements des CCR est associée à une augmentation de la quantité de gouttelettes lipidiques (GL), réservoirs de lipides régulant les besoins énergétiques de la cellule, ainsi qu’à la surexpression de l’enzyme lysophosphatidylcholine acyltransferase 2 (LPCAT2), impliquée dans la production de la phosphatidylcholine (PC). La PC est un lipide majeur des membranes cellulaires, séparant l’intérieur des cellules de leur environnement extérieur. Ainsi, l’utilisation de molécules capables de réduire et/ou moduler les taux de PC et GL semble être une approche prometteuse afin de restaurer une sensibilité des cellules résistantes aux agents anticancéreux. La 1ère partie de ce projet s’attachera donc à confirmer chez la souris la capacité de 4 composés candidats à agir comme modulateurs de la production de PC et des GL et sensibiliser les cellules tumorales coliques aux chimiothérapies utilisées en clinique. Nous utiliserons des modèles de souris greffés par des cellules coliques murines surexprimant ou non LPCAT2 et des souris dépourvues de système immunitaire greffées par des cellules coliques humaines résistantes et sensibles aux traitements. La 2ème partie de ce projet concerne l’étude d’autres lipides que sont les cardiolipines (CL), dans la progression et résistance aux chimiothérapies. Les résultats de l’équipe ont montré que des cellules du cancer du col de l’utérus résistantes à un agent anticancéreux, l’Aplidine®, présentent des teneurs en CL supérieures à celles des cellules sensibles. De plus, ces altérations sont associées à une modulation de la composition des CL, corrélée à une altération des enzymes de production dont la cardiolipin synthase 1 (CRLS1) et la tafazzin (TAZ), contribuant à diminuer la sensibilité des cellules à la mort cellulaire induite par l’Aplidine®. Ainsi, il s’agira de confirmer l’implication des enzymes de production des CL dans la résistance à l’Aplidine®. Nous utiliserons des modèles de souris immunodéficientes greffés par 2 modèles cellulaires humains de cancer du col de l’utérus, des cellules sensibles et résistantes génétiquement modifiées pour CRLS1 et TAZ.

Bénéfices attendus

La première partie de ce projet de recherche devrait permettre d’approfondir les relations existantes entre les altérations des voies de biosynthèse des lipides complexes, en particulier, celles de la phosphatidylcholine (PC) et les phénotypes de résistance des cancers colorectaux (CCR). Ce projet viendrait également soutenir le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à augmenter l’efficacité des traitements chimiothérapeutiques notamment grâce à l’identification de nouvelles molécules bioactives/d’origine naturelles ou de formulations capables de cibler/d’inhiber la production de PC des tumeurs coliques et d’agir en synergie avec les chimiothérapies conventionnelles, réduisant la toxicité et les effets secondaires de ces dernières. Ainsi, ces travaux conforteraient l’utilisation potentielle en clinique de certaines de ces molécules en complément des traitements conventionnels des CCR. De plus, cette étude devrait mettre en exergue le potentiel de l’analyse des teneurs plasmatique en PC en tant que nouveau biomarqueur pronostique non invasif des CCR. La seconde partie de ce projet viendra renforcer les quelques données de la littérature suggérant qu’une dérégulation de la quantité et de la qualité (composition) des cardiolipines (CL) pourrait influencer la sensibilité des cellules tumorales aux drogues de chimiothérapie. Par ailleurs, à ce jour, la contribution d’une production exacerbée des CL via l’enzyme cardiolipin synthase 1 (CRLS1) dans la résistance tumorale a été montré uniquement dans un contexte de carcinome hépatocellulaire résistant à la radiothérapie. De plus, ce projet permettrait, à plus long terme, d’étendre ces observations à d’autres agents chimiothérapeutiques, ainsi qu’à d’autres types de cancers tels que le cancer colorectal, un cancer récidivant et agressif, ce qui permettrait d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de contrecarrer les mécanismes de résistance.

Procédures

Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses sur le bas du dos à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A partir de ce moment-là, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Les traitements par 2 chimiothérapies et 4 molécules naturelles/chimiques seront administrés respectivement par voie intra-péritonéale (ip) à raison d’1 à 5 fois par semaine pendant 1-3 semaines , et par voie orale (gavage) quotidiennement pendant 4 semaines, et à raison de 1 à 3 concentrations par molécule. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Sur une partie des animaux sera réalisé un prélèvement sanguin par ponction intra-cardiaque sous anesthésie préalable. Ce prélèvement se réalise en 20 secondes environ pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Bien que la croissance et la masse tumorale puissent entrainer une potentielle gêne pour l’animal au cours du temps, la gêne au mouvement pouvant contribuer à une diminution de la mobilité dans la cage devrait être minime compte tenu de notre choix de localiser la greffe de cellules cancéreuses sur la région dorsale de l’animal. Des effets secondaires associées au traitement chimiothérapeutique pourront être observés tels que des signes de fatigue, des diarrhées, des troubles cognitifs et une perte de poids. Afin de prévenir ou diminuer toutes nuisances qui pourraient survenir suite à la répétition des injections en intrapéritonéal (inconfort lié au volume et à la température des solutions injectés, risque de contamination qui peut causer une infection et irritation au site de l’injection), nous veillerons à respecter les règles décrites dans la partie Raffinement (5.10.3).

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés. Pour les expériences de mise au point des doses de traitement, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, même si des régressions tumorales pourront être observées en fonction des traitements, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite le sacrifice de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter. Concernant les expériences avec la dose adéquate de traitement, des analyses des teneurs et composition en lipides plasmatiques seront réalisées à partir du sang des souris. De ce fait, les souris seront mises à mort après prélèvement sanguin.

Remplacement

Les travaux réalisés jusqu’à présent sur différents modèles cellulaires ont pu montrer d’une part, que des molécules d’origine chimique ou naturelle sont capables de chimiosensibiliser les cellules résistantes aux chimiothérapies conventionnelles au travers l’inhibition du métabolisme lipidique, en particulier celui de la phosphatidylcholine (PC), et d’autre part, que des lipides complexes tels que les cardiolipines (CL) peuvent constituer des cibles thérapeutiques prometteuses pour contrecarrer les mécanismes de résistance. Des études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier les effets indésirables potentiels des traitements utilisés ou non en combinaison, mais également de considérer l’aspect pharmacocinétique et pharmacodynamique des molécules incluant le processus de transformation de ces molécules par l’organisme (pouvant conduire à une augmentation de leur efficacité ou bien une perte de leur efficacité). En outre, l’utilisation de souris immunocompétentes et au système immunitaire déficient, permettra d’évaluer si le système immunitaire joue un rôle clé dans le processus de chimiosensibilisation des molécules.

Réduction

Les différents modèles cellulaires utilisés au cours de ce projet chez des souris présentant un système immunitaire déficient ou non est parfaitement maitrisée au sein de notre équipe, évitant ainsi de réaliser des étapes de mise au point de greffes de cellules tumorales et réduisant le nombre d’animaux. Pour chacune des expériences, nous utiliserons des groupes de 10 souris maximum, ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à la réalisation de tests statistiques.

Raffinement

Afin de prendre les mesures nécessaires pour améliorer le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie et lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées, mesures de tumeurs…). Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Des antalgiques seront utilisés en cas de douleur observée. Si les points limites que nous avons établis sont atteints, les souris seront euthanasiées selon la méthode choisie. Les souris seront hébergées en groupe pour favoriser les contacts sociaux, avec un enrichissement du milieu approprié. Un contenant sera placé dans chaque cage leur permettant de se cacher et de développer leur répertoire comportemental. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum.

Choix des espèces

Étant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité de nos molécules d'intérêt en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Par ailleurs, les études antérieures pré-cliniques de notre équipe ont été réalisées chez la souris, dont les résultats ont pu être transposés chez des patients. L’injection de cellules cancéreuses humaines nécessite l’utilisation d’animaux NSG qui sont des modèles génétiquement modifiés présentant un système immunitaire déficient. Les souris d’espèces BALB/c (immunocompétente) seront également utilisées afin de se rapprocher au maximum des conditions physiologiques en présence d’un système immunitaire compétent. De plus, le modèle cellulaire de cancer du côlon murin CT26 que nous utilisons présente le même fond génétique que la souris d’espèce BALB/c. Nous utiliserons des souris âgées de 8- 12 semaines car elles sont considérées comme adultes. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et, en ce qui concerne les modèles de souris immunocompétentes, soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel.

60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par leur alimentation, elles reçoivent une supplémentation en poudre de baie de goji et subissent des prises de sang par incision de la queue, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline par gavage et injection, et des isolements temporaires que le porteur relie à un stress social. Les souris sont ensuite tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur affirme que l'effet d'une telle supplémentation ne peut s'étudier qu'in vivo.

Objectifs

Les effets santé des baies de goji ont été partiellement étudiés et plusieurs travaux rapportent un effet protecteur vis-à-vis de l’homéostasie glucidique qui semble en partie lié aux polysaccharides, et est très probablement imputable à un effet sur le microbiote. La baie de goji est également riche en phytomicronutriments comme les caroténoïdes ou les composés phénoliques. Cependant, le rôle de ce cocktail de phytomicronutriments dans les effets santé de la baie de goji reste mal compris. En particulier, les interactions entre phytomicronutriments et fibres pourraient jouer un rôle majeur sur la bioaccessibilité et la métabolisation des phytomicronutriments par le microbiote. De plus, les baies en provenance de la Chine sont essentiellement consommées sèches, et les modalités de séchage induisent sans doute des modifications de l’état d’oxydation des phytomicronutriments, de la structure physique et chimique des polysaccharides ainsi que des interactions phytomicronutriments-polysaccharides.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux évaluer l’impact des conditions de culture et des traitements post-récolte sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la baie de goji avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Ces tests necéssitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage (dans le cas du test de tolérence au glucose), et une injection intrapéritonéale (test de tolerance à l'insuline). Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en isolement des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie apres micro-incision du bout de la queue. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution de FITC-dextran. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors du test de tolérance à l'insuline, du test de tolérance au glucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors du gavage avec une dose de glucose (test de tolerance au glucose), ou une dose de FITC-dextran (perméabilité intestinale) et lors des injections intrapéritonéales d'insuline (test de tolérance à l'insuline). Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles.

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de baie de goji.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de baie de goji sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'applicatiob des points limites et la mise en application de critères d'arret.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

917 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de fragment de tumeur humaine ou une injection de cellules tumorales, suivies de jusqu'à quatre injections de virus dans la tumeur, pour tester des virus dits oncolytiques contre le cancer. Le porteur indique que la tumeur peut évoluer vers l'ulcération ou la nécrose et entraîner une perte de poids. Il qualifie les tumeurs de patients greffées à la souris de "modèle incontournable" et renvoie les essais cliniques au conditionnel.

Objectifs

Les virus oncolytiques (virus naturels ou modifiés capables d'infecter et d'éliminer sélectivement les cellules cancéreuses), sont des alternatives prometteuses aux traitements anti-cancéreux classiques. Néanmoins leur efficacité et leur sécurité doivent être améliorées. Nous avons développé des virus oncolytiques optimisés qui n'infectent pas les cellules saines. Les tests réalisés in vitro nous ont montré que ces rOVs sont capables d'infecter et de lyser des cellules tumorales en culture et des modèles tumoraux 3D (organoïdes tumoraux pancréatiques). L'étape suivante du projet nécessite de tester l'efficacité de virus modifiés, sur des modèles tumoraux provenant de patients ou des lignées cellulaires, qui reproduisent plus fidèlement les caractéristiques biologiques des cancers. Dans un premier temps, les tumeurs PDX amplifiées chez la souris seront testées ex vivo par 5 virus différents, ciblant 3 marqueurs tumoraux distincts. Cette étape permettra de sélectionner les tumeurs et les virus les plus appropriés, ainsi que la dose virale optimale en utilisant un minimum d'animaux. Dans un deuxième temps, les meilleurs virus seront injectés dans les tumeurs de patients sélectionnées pour tester leur capacité d'infection puis leur capacité à inhiber la croissance tumorale. Plusieurs types de tumeurs de patients seront testées pour augmenter la probabilité de trouver un candidat adéquat, et seuls 2 à 3 seront selectionnées pour la suite, afin de réduire le nombre d'animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet est l'étape finale pour apporter la preuve de concept de l'intéret des virus oncolytiques modifiés développés comme traitement dans des pathologies tumorales. Les modèles de tumeurs humaines greffées aux souris (tumeurs de patients) sont maintenant un outil incontournable et exigé pour l'évaluation préclinique de nouveaux agents. Si nous apportons la démonstration de l'efficacité de ces virus sur l'inhibition de la croissance tumorale de tumeurs humaines, nous pourrons envisager de démarrer des essais cliniques, dont nous espérons qu'ils aboutissent à une meilleure prise en charge des cancers pour lesquels il n'existe encore que peu de solutions thérapeutiques.

Procédures

les souris seront soumises aux interventions suivantes: i) greffes de fragments de tumeurs humaines: 1 greffe par souris; acte chirurgical de 5 minutes, sous anesthésie générale ou ii) injection de cellules tumorale: 1 injection par souris; sous anesthésie générale , durée: 5 minutes . Certaines souris recevront également une ou plusieurs injections de virus oncolytiques en intra-tumoral (4 maximum); sous anesthésie générale ; durée 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les virus développés ne sont pas capables d'infecter des cellules de souris (données de la littérature et de notre laboratoire). Il est donc attendu que le virus injecté ne se propage que dans la tumeur humaine greffée et pas dans la souris. La croissance de la tumeur implantée ne gêne pas les animaux sauf si elle évolue (rare) vers l'ulcération/la nécrose, et entraîne une gêne ou une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience pour mettre en oeuvre des analyses post-mortems sur certains organes et tissus.

Remplacement

Le projet fait suite à des études préalables que nous avons conduites sur des systèmes ex vivo de remplacement cellulaires: cellules primaires et cultures de cellules 2D et 3D (organoïdes). Celles-ci ont démontré l'efficacité des virus oncolytiques recombinants produits à i) infecter les cellules tumorales, ii) se propager au sein d'une structure 3D tumorale, iii) lyser les cellules infectées et iv) à épargner les cellules saines humaines (différents ypes cellulaires) comme attendu. Ces analyses in vitro ne peuvent être que partielles et ne reproduisent pas la croissance de la tumeur et sa guérison dans le contexte d'un organisme entier. Les tumeurs PDX dérivées directement d'échantillons de patients et greffées en souris immunodéficientes fournissent une représentation très précise des caractéristiques des tumeurs humaines. De plus, la possibilité de les greffer en parallèle dans un grand nombre de souris permet d'évaluer fiablement de nouvelles thérapies anti-tumorales en tests précliniques. Notre projet prévoit donc de tester maintenant sur des modèles de tumeurs de patients greffées les virus modifiés qui ont déjà été sélectionnés et validés sur modèles cellulaires sophistiqués. Notons que cess expériences réalisées au préalable sur modèles cellulaires ont permis de sélectionner 5 virus sur les 15 développés, et donc de réduire fortement le nombre de souris utilisées.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, le projet est conçu en étapes successives. Chacune permettra de sélectionner les meilleurs candidats de virus qui seront utilisés à l'étape suivante. Ainsi, l'efficacité d'infection et la dose optimale des différents virus sera d'abord mesurée ex vivo sur des tranches de tumeurs établies sur animaux, puis in vivo sur un nombre plus limité de tumeurs et de virus . Au final, seuls les meilleurs virus et tumeurs seront testés dans les expériences de mesure de la croissance tumorale. Dans chaque procédure, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum sans mettre en péril la validité statistique des résultats. Le calendrier expérimental sera basé sur des expériences séquentielles. Cela permettra d'analyser les résultats et de modifier le protocole si besoin, afin de réduire le nombre d'expériences et d'animaux.

Raffinement

Les animaux bénéficient d'une période d'acclimatation d'une durée de 7 jours avant toute intervention. Ils seront suivis quotidiennement pour vérifier leur bien-être. Un suivi clinique quotidien sera fait. Si les souris commencent à présenter une perte de poids, même minime, de la nourriture en gel sera ajoutée. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions au cours des procédures expérimentales seront effectuées sous anesthésie locale ou générale.En cas de besoins, les animaux recevront un analgésique.

Choix des espèces

Des tumeurs de patients greffées directement dans des souris immunodéficientes s'avèrent actuellement le modèle tumoral incontournable pour de les études pré-cliniques en oncologie. Ils fournissent une représentation très précise des caractéristiques des tumeurs humaines. Nous avons donc choisi la souris en raison de la possibilité offerte d'utiliser ce modèle, en appliquant à ce projet les exigences de remplacement, de réduction et de raffinement nécessaires. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines, dans la phase de jeune adulte qui permettra un développement optimal de la tumeur.

890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie pour introduire de l'ADN dans le cerveau des embryons, geste qui peut provoquer un avortement, ou reçoivent du tamoxifène par gavage, tandis que des souriceaux sont opérés à la naissance sous anesthésie sur glace. Les mères comme les petits sont ensuite tués pour prélever les cerveaux, le porteur jugeant les femelles non réutilisables après ces interventions. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'architecture de la région cérébrale étudiée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer si les différents types de neurones dans une structure du cerveau appelée gyrus denté sont générés à partir des mêmes cellules ou de populations distinctes et à quel moment de la vie ils sont générés. Pour se faire, nous utiliserons une souris particulière qui permet l'expression de multiples protéines fluorescentes (les cellules d'une même couleur sont issues d'une même cellule).

Bénéfices attendus

Ce projet devrait contribuer à terme à élargir nos connaissances fondamentales sur le développement du gyrus denté, une structure du cerveau particulièrement impliquée dans la mémoire. Aussi cette compréhension sur l'origine des cellules du gyrus denté, permettra à terme de mieux les cibler pour éventuellement les manipuler et étudier leurs fonctions spécifiques.

Procédures

Les animaux seront soumis soit 1) à une chirurgie pendant la gestation pour faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des embryons et ainsi induire l'expression des multiples protéines fluorescentes pendant la vie embryonnaire (30 min maximum), 2) soit à une chirurgie à la naissance pour faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des souriceaux et ainsi induire l'expression des multiples protéines fluorescentes à la naissance (5 min), 3) soit à une injection pendant la gestation (1 injection, mois d'une minute) ou 4) après la naissance (1 injection, mois d'une minute)

Impact sur les animaux

La chirurgie sur souris gestante pour faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des embryons peut conduire à un avortement si l’intégrité des vaisseaux sanguins ou de la paroi utérine est altérée lors de la procédure. Aussi, cette procédure sera effectuée par une spécialiste de ce type de chirurgie, ce qui garantit des gestes précis respectant l'intégrité de l'animal. Les sutures de la peau et des muscles peuvent s’ouvrir à la suite de cette procédure. Si les sutures de la peau ne se sont pas maintenues le jour suivant la chirurgie, de nouvelles sutures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Si les sutures de l'abdomen ne sont à nouveau pas maintenues le jour suivant, l'animal sera mis à mort. L’anesthésie sur glace, nécessaire à faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des souriceaux à la naissance, pourrait entraîner la mort des animaux si prolongée. Cependant, dans notre procédure, l’acte à réaliser pendant cette anesthésie est très court (moins de 1 minute) ce qui diminue très fortement cette éventualité. L’injection de tamoxifène par gavage chez les souris gestantes peut conduire à un stress des animaux. Pour réduire au maximum l’angoisse liée à cette injection, celle-ci sera effectuée par une personne expérimentée pour ce type d'approche. Chez la souris gestante, l'injection de tamoxifène peut conduire à un avortement ou à un problème de mise bas. Les femelles seront maintenues sous surveillance par l’expérimentateur jusqu’à la naissance. En cas de fausse couche, la mère sera mise à mort par dislocation de même en cas de problème de mise bas. Dans ce dernier cas, les souriceaux seront adoptés par des souris CD1/Swiss, préalablement gestantes au même stade. Les souriceaux seront sous surveillance lors de leur première semaine de vie. A la suite ce chaque procédure, nous réaliserons un suivi systématique quotidien des animaux. Nous utilisons des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l’animal par la mesure de son poids et l’évaluation de son apparence et de son comportement. A partir d’un score de 2, nous administrerons un analgésique (buprénorphine, 0.1mg/kg, sc, toutes les 6 à 12h jusqu'à amélioration) et à partir de 5, les animaux sont mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car les cerveaux des animaux sont récupérés pour des analyses anatomiques. De plus les mères initialement gestantes seront également sacrifiées car elles auront déjà subi une incision de la peau et des muscles abdominaux ou une injection de tamoxifène. L’injection de tamoxifène peut engendrer des effets secondaires non compatibles avec la réutilisation de ces femelles quel que soit le protocole expérimental (reproduction ou autre).

Remplacement

N'existant pas de modèle in vitro ou in silico permettant de reproduire l'environnement complexe (multiples types cellulaires, architecture complexe…) caractéristique de la structure cérébrale d'intérêt (le gyrus denté), cette étude ne peut être réalisée que chez l'animal in vivo.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes, nombre dépendant de la technique utilisée. De plus, mâles et femelles seront utilisés. La taille de nos groupes expérimentaux est définie sur la base de nos expériences antérieures et en respectant des conditions statistiques précises. Pour les études anatomiques, notre expérience nous a permis de déterminer qu'un effectif de 8 animaux par groupe est nécessaire pour effectuer des analyses statistiques cohérentes.

Raffinement

Un soin particulier sera accordé à l’observation des animaux, en particulier lors des périodes post-chirurgie et post-injection. Pendant ces périodes, nous utiliserons des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence et du comportement. A partir d’un score de 2, nous administrerons un analgésique (buprénorphine, 0.1mg/kg, sc, toutes les 6 à 12h jusqu'à amélioration) et à partir de 5, les animaux seront mis à mort. En cas de fausse couche des souris gestantes, la mère sera mise à mort par dislocation. Si les sutures de l'abdomen ne sont pas maintenues 2 j après la chirurgie, l'animal sera mis à mort. En cas de problème de mise bas suite à l'injection de tamoxifène, la souris gestante sera mise à mort par disolocation et les souriceaux seront adoptés par des souris CD1/Swiss, préalablement gestantes au même stade. En dehors de ces périodes, les points limites reposent sur des critères généraux de bien être qui seront évalués à travers la surveillance quotidienne effectuée par les zootechniciens. De plus, des traitements appropriés (anesthésie, anti-douleur) seront utilisés pour pallier à la douleur associée aux opérations chirurgicales. Concernant l’hébergement, les animaux seront hébergés dans des cages en présence de litière favorisant l’absorption des liquides vers le bas (par conséquent, la surface de la litière reste saine plus longtemps). Ces cages sont transparentes afin de favoriser le contact visuel. Ils auront également à leur disposition des formes d’enrichissement (carrés de coton) afin de réduire l’ennui et le stress. Les souris seront hébergées en cage collective. Seules les souris gestantes seront isolées sur une courte période, à partir de l'injection de tamoxifène ou le jour de la chirurgie (donc à E12.5, E13.5 ou E14.5). Cet hébergement permet d'identifier correctement les portées, ce qui est difficilement possible dans le cas d'un hébergement collectif de femelles gestantes.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris car il fait appel à une lignée génétiquement modifiée développée uniquement chez la souris. Dans la structure cérébrale étudiée, différents types de neurones sont générés de la vie embryonnaire à l'âge adulte. Nous ciblerons les cellules à l'origine de ces neurones et ce à différents moments de la vie de l'animal: 1) pendant la vie embryonnaire, 2) à la naissance , 3) en période juvénile (à 3 semaines de vie) et à 4) l'âge adulte (à 12 semaines de vie). Ces temps précis d'analyse ont été choisi en fonction de la littérature et de nos études précédentes.