Recherche fondamentale

9 moutons et 9 bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur indiquant qu'ils peuvent ensuite retourner dans le troupeau expérimental. De jeunes agneaux et veaux non faunés sont inoculés avec un protozoaire puis subissent, sur quatre mois, des prélèvements répétés de contenu ruminal par sonde œsophagienne, de sang et de fèces. Il décrit un léger inconfort lié surtout à la contention et une douleur légère lors des prises de sang. Il affirme que la culture in vitro de ces protozoaires reste trop limitée, l'objectif étant d'étudier leur rôle dans la digestion et la production de méthane.

Objectifs

Ce projet propose d'utiliser des jeunes ruminants (ovin, bovin) naturellement dépourvus de protozoaires (non-faunés) qui seront ensuite inoculés par une seule espèce de protozoaire provenant de la cryobanque ERCULE (projet EU) avec l’objectif d’effectuer des études génomiques et fonctionnelles car les protozoaires du rumen ne peuvent pas être cultivés de manière axénique et en quantité suffisante in vitro.

Bénéfices attendus

A l’issue du projet, nous aurons des données génomiques et fonctionnelles pour appréhender le rôle des protozoaires dans l’écosystème digestif du ruminant qui reste mal connu. Les données alimenteront la base de données publique du projet HoloRuminant. Les informations obtenues dans ce projet serviront à évaluer le rôle des certains protozoaires dans la digestion des aliments et leur effet sur la production de méthane dans le rumen.

Procédures

Les animaux feront l'objet de 3 types de prélèvements : Contenu ruminal : Le volume prélevé sera adapté à la taille et au développement de l'animal : jusqu’à 100 ml pour un agneau de 20 kg ou 200 ml pour un veau, 6 fois au cours de toute la période de 4 mois et sera réalisé en moins de 3 minutes (entre le début de la contention et la fin du prélèvement). Sang : Les animaux seront prélevés 2-3 fois pendant la période de "mono-faunation". Les quantités prélevées sont de 10-15 ml et largement inférieures à 10% du volume sanguin total afin d’éviter tout risque d'hypovolémie, anémie ou stress physiologiques et durera moins d'une minute. Fèces : Les agneaux et les veaux seront prélevés 6 fois au cours de toute la période de 4 mois. Le volume prélevé sera d'environ 5-10 g et durera moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les techniques des prélèvements sont des pratiques couramment appliquées. Le contenu ruminal sera prélevé par sonde oesophagienne. La procédure génère un léger inconfort, surtout du à la contention de l’animal mais aucune douleur ni souffrance n’est attendue. Si nécessaire, des prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire. La prise de sang génère une douleur légère.

Devenir

Les procédures appliquées aux animaux sont peu invasives et la fréquence des prélèvements est faible. Les veaux et agneaux peuvent à l'issu de cette procédure retourner dans le troupeau expérimental.

Remplacement

A l’heure actuelle, la culture des protozoaires in vitro est très fastidieuse. La croissance in vitro est très limité et les cultures sont souvent perdus sans raison apparente après quelques jours. En plus, le nombre réduit des protozoaires que puissent être obtenues in vitro ne permet pas d’effectuer certaines études et il n’y pas asses d’information indiquant que les caractéristiques fonctionnelles des protozoaires cultivés in vitro sont similaires à celles des protozoaires dans son milieu naturel, le rumen.

Réduction

Le nombre des animaux tient compte surtout des aspects éthiques (compagnie des animaux grégaires). L’animal n’est pas l’unité expérimentale mais le moyen pour obtenir des protozoaires en quantité suffisante pour des études de séquençage du matériel génomique.

Raffinement

Tout signe de souffrance, se manifestant par de l’abattement, un refus de s’alimenter, ou un comportement anormal (considérés comme points limites) sera signalé, consigné dans le cahier d’expérimentation et pourra entrainer l’arrêt des prélèvements et la fin de l’expérimentation pour un individu donné voire l’euthanasie si nécessaire. Néanmoins, les prélèvements ne devraient pas induire de douleur car ils sont réalisés rapidement par du personnel expérimenté.

Choix des espèces

L'objectif est de comprendre les déterminants microbiens déclancheurs des diarrhées chez le jeune ruminant, un travail sur les ovins et les bovins s'avère donc, par définition en tant qu’espèce-cible et espèce-modèle, plus pertinent qu'un autre modèle pour les ruminants d’élevage. L'étude de la modulation du microbiote gastrointestinal après le sevrage nécessite d'utiliser des agneaux ou veaux qui ont eu un contact limité avec des adultes pour éviter la comtamination en protozoaire.

4 932 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et de fluides, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par injection ou inhalation des molécules pharmacologiques pendant quelques jours, avec deux prélèvements sanguins, pour étudier la régulation de l'interleukine-33 dans l'inflammation allergique. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer une inflammation des bronches et une gêne respiratoire, outre un stress modéré et une irritation. Il affirme devoir travailler sur un organisme intégré tout en revendiquant un criblage in vitro pour limiter le nombre d'animaux, les bénéfices restant des avancées de connaissance sur l'asthme.

Objectifs

L'inflammation allergique joue un rôle crucial dans les maladies allergiques telles que l'asthme qui touche 30 millions d'Européens. Ce nombre a doublé au cours des dix dernières années et continue d'augmenter. De nombreuses études sur des modèles animaux et des données cliniques ont démontré de manière concluante le rôle critique de l’interleukine-33 (IL-33) dans l'inflammation allergique. L’IL-33 est une protéine présente au niveau des cellules des vaisseaux sanguins et des tissus en contact avec l’extérieur, comme l’appareil respiratoire. L’IL-33 ne joue pas véritablement de rôle à l’intérieur des cellules ; sa quantité est variable et dépend de nombreux facteurs. Elle est libérée en dehors des cellules suite à divers stimuli, notamment après exposition à des allergènes comme Alternaria alternata, un allergène clinique majeur chez les patients asthmatiques. Une fois libérée dans l'espace extracellulaire, l'IL-33 va jouer le rôle de messager et alerter le système immunitaire d’un danger, comme la présence d’un champignon, en activant rapidement les cellules immunitaires qui sont impliquées dans l'inflammation allergique. Bien que l'IL-33 constitue une cible thérapeutique prometteuse pour l'asthme et d'autres maladies humaines importantes, il existe encore plusieurs questions non résolues concernant la biologie et la biochimie de la protéine. Par exemple, on ne sait pas quels sont les facteurs importants qui régulent la présence de l’IL-33 dans les cellules et sa quantité. Ou bien, comment l’IL-33 est libérée dans le milieu extracellulaire, après exposition à des allergènes comme Alternaria alternata ? L'objectif principal du projet est de fournir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de l'expression de la protéine IL-33 et sa libération à l’extérieur de la cellule, conduisant à l'inflammation allergique.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans la régulation de l'expression et de la libération de la protéine IL-33 est essentielle étant donné ses rôles critiques dans l'immunité, l'allergie, l'inflammation et d'importantes maladies humaines, comme l'asthme. Nous pensons que ce projet permettra de mieux comprendre ces questions non résolues dans la biologie de l'IL-33, et conduira à des avancées scientifiques importantes. Nos résultats préliminaires effectués in vitro, dans des cellules en culture, indiquent qu’il est possible de moduler les niveaux d’expression de la protéine IL-33 dans les cellules productrices. Les expériences proposées ont pour but de démontrer que si l’on arrivait à diminuer l’expression de l’IL-33 in vivo, on pourrait limiter l'inflammation allergique. En outre, nous pensons que le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes biochimiques et moléculaires impliqués dans l’expression et/ou la libération rapide de l'IL-33 lors d’un stress, comme l'exposition à des allergènes environnementaux. Enfin, de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques de l’expression/libération de l'IL-33 devraient être identifiés et pourraient également contribuer au développement d'applications industrielles et thérapeutiques.

Procédures

Injection ou inhalation de molécules pharmacologiques 1 fois par jour sur un maximum de 4 jours. 2 prélèvements sanguins à 6 semaines d'intervalle. Prélèvement post-mortem d'organes et de fluides biologiques.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont un stress modéré lors de la manipulation des animaux, une légère douleur lors de l’inhalation et de l'injection des produits. Ainsi qu'une légère irritation cutanée ou de la mucqueuse nasale suite aux injections ou aux inhalations. De plus, les produits injectés ont pour but d’augmenter (ou diminuer) l’expression et/ou la libération de l’IL-33. Ainsi, les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la quantité d’IL-33 libérée par ces traitements qui peuvent induire une inflammation des bronches et une gêne respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Différents organes et fluides biologiques (lavages broncho-alvéolaires) seront prélevés post-mortem afin de pouvoir réaliser les analyses nécessaires à la compréhension de l'expression et de la libération d'IL-33 sous l'effets des différents inhibiteurs utilisés.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, ce projet nécessite de mener des expériences chez l’animal, car nous devons travailler dans des conditions intégrées permettant l’interaction de plusieurs systèmes cellulaires complexes dont le système immunitaire et le microenvironnement inflammatoire. Cependant afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons développé des expériences de screening in vitro qui nous permettent de remplacer le screening in vivo afin de sélectionner les meilleures molécules candidates capables de moduler l’expression et /ou la libération de l’IL-33, mais ces expériences in vitro ne peuvent pas à l'heure actuelle intégralement remplacer les expériences in vivo pour les raisons évoquées ci-dessus. De plus, l’IL-33 est présente uniquement chez les mammifères et ces études ne peuvent donc pas être conduites dans un organisme modèle autre qu’un mammifère. L’espèce animale choisie est la souris car notre étude nécessite l’utilisation d’animaux modifiés génétiquement et qui sont déficient pour l'IL-33.

Réduction

Le nombre d'animaux, qui sont utilisés pour répondre aux différentes questions du projet, est réduit au strict minimum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il s’agit d’un nombre maximum d’animaux qui pourra être significativement réduit; Par exemple, nous avons prévu des expériences avec plusieurs sites d'injection mais si le premier site d'injection donne des résultats satisfaisant, nous ne réaliserons pas les expériences pour les autres sites d'injection ce qui réduira automatiquement le nombre d’animaux. De même, nous avons prévu dans certaines expériences plusieurs injections si une seule injection n’était pas suffisante mais si une seule injection suffit, alors les expériences avec plusieurs injections ne seront pas réalisées. De plus, certaines procédures ne seront pas réalisées si les procédures précédentes ne sont pas concluantes. Les expériences menées in vitro avant la réalisation des expériences in vivo nous permettront de sélectionner les meilleures molécules candidates capables de moduler l’expression et /ou la libération de l’IL-33, et ainsi d’éviter de tester directement toute une panoplie de molécules chez l’animal, ce qui permet une réduction certaine du nombre d’animaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux. L’ensemble de nos procédures fera l’objet d’expériences pilotes avec un nombre très réduit d’animaux (2 maximum) par groupe de traitement. Ces expériences nous permettront de vérifier que les traitements n’entrainent pas de détresse et de douleur majeure chez les animaux pendant tout le temps de la procédure. Les expériences sur des groupes plus importants d’animaux ne seront réalisées que si les expériences pilotes montrent que les points limites adaptés au modèle sont corrects. Les inhalations auront lieu sous anesthésie gazeuse pour réduire le stress chez l’animal. Les procédures seront courtes puisqu’elles dureront de 1 à 4 jours maximum. De plus, nous procèderons à un nombre d’injections minimum (le plus souvent, une seule injection) qui ne sera augmenté (jusqu’à trois maximum) que si les résultats obtenus avec une seule injection sont insuffisants. Pour chaque procédure, le suivi des animaux sera journalier avec un suivi établi selon une grille de score. Enfin, tous les prélèvements seront effectués post-mortem.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle le plus couramment utilisé dans la littérature scientifique pour étudier la biologie de l’IL-33 et son implication dans le développement de l’inflammation allergique. De plus, il existe des souris déficientes pour l'IL-33 ce qui est capital pour étudier les mécanismes d’expression et de libération de cette cytokine. Nous utiliserons des souris femelles adultes âgées de 6 à 8 semaines car c'est un modéle validé pour l'inflammation allergique et qui est en relation avec le développement d'asthme allergique dont l'incidence est plus importante chez les femmes que chez les hommes.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever notamment le cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules sanguines anormales, subissent une ablation des ovaires, un régime gras et l'administration de L-NAME dans l'eau de boisson pour induire une insuffisance cardiaque, avec plusieurs prélèvements sanguins. Le porteur indique que ces procédures peuvent générer des douleurs modérées et transitoires, prévenues par analgésiques. Il affirme que la complexité de la maladie rend le recours à un organisme vivant "nécessaire", les bénéfices pour les patients restant hypothétiques.

Objectifs

Notre objectif est d’étudier le rôle des cellules sanguines anormales dans le développement de maladies du cœur appelées insuffisances cardiaques, caractérisées par l’incapacité du cœur à envoyer suffisamment de sang dans les vaisseaux. Nous rechercherons si ces cellules sanguines anormales accélèrent l’apparition ou aggravent ces insuffisances cardiaques. Nous étudierons également si ces cellules anormales peuvent remplacer certains facteurs participant à l’apparition ces insuffisances cardiaques. Nous déterminerons les propriétés des cellules sanguines qui participent au développement de ces insuffisances cardiaques et chercherons à empêcher leur action en testant des médicaments ciblant les phénomènes identifiés.

Bénéfices attendus

Les insuffisances cardiaques sont responsables de l’hospitalisation de nombreux patients chaque année en France et conduisent au décès de 70 000 personnes. Identifier les cellules sanguines anormales comme responsables de ces maladies permettrait d’identifier les patients les plus à risque et donc d’adapter leur suivi médical. Cela pourrait aussi conduire à la découverte de nouveaux mécanismes contre lesquels des médicaments plus efficaces pourraient être proposés afin d’éviter les décès et les hospitalisations dont les insuffisances cardiaques sont responsables.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - pour créer les cellules sanguines anormales : injections de cellules anormales (3 injections sont prévues sur 3 jours consécutifs,

Impact sur les animaux

Certaines des procédures employées peuvent générer des douleurs qui ne persisteront pas dans le temps et resteront modérées. Ceci sera prévenu par l’emploi de produit anesthésiants et antalgiques administré avant la procédure mise en cause et éventuellement après la procédure.

Devenir

A la fin des procédures, l’ensemble des animaux seront sacrifiés. Ceci est indispensable pour prélever les organes que nous étudierons, notamment le coeur.

Remplacement

L‘insuffisance cardiaque est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions de divers mécanismes, dont beaucoup restent inconnus, entre de nombreux types de cellules. Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’Homme, et dans lequel nous pouvons à la fois crée des cellules anormales et induire une insuffisance cardiaque (maladie du coeur) est donc nécessaire pour réaliser ce projet.

Réduction

Différentes lignées et modèles sont nécessaires à la réalisation de ce projet pour recréer les différents types de cellules anormales. D’après la littérature scientifique, le nombre d’animaux nécessaires par lot est de 40. Nous utiliserons donc 10 animaux par lot en reproduisant au maximum 5 fois les expériences (marge d’un lot dans le cas de mort prématurée d’animaux ne permettant pas l’aboutissement d’une ou plusieurs expériences). Des analyses de résultats à la fin de chaque expérience nous permettront éventuellement de réduire ce nombre.

Raffinement

L’hébergement des animaux permet de réduire le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement adapté avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). Les animaux seront systématiquement anesthésiés lors des administrations intraveineuses et des prélèvements sanguins et nous utiliserons des analgésiques afin de limiter la douleur. Deux fois par semaine, nous évaluerons le bien-être des animaux afin d'identifier les points limites et d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.

Choix des espèces

L'utilisation de souris comme modèle d'étude dest pertinente car : - Différentes lignées de souris sont disponibles pour reproduire les cellules anormales étudiées. - Les modèles utilisés nos permettront d'identifier ces cellules anormales. - Le modèle d'induction de l’insuffisance cardiaque chez la souris est couramment utilisé. - Nous disposons du matériel et des compétences nécessaires. Des souris adultes âgées d’au moins 6 semaines au début du protocole seront utilisées. Notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques. Pour être sûr de ne pas induire de phénotype confondant, les expériences de transfert adoptif de moelle ou l’induction des KO/KI de nos gènes d'intérêt seront réalisés chez des animaux d'au moins 6 semaines.

3 860 souris et 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever la rate et la tumeur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent une immunisation sous la peau et, pour une partie, une implantation de cellules tumorales, le porteur les mettant à mort dès que la tumeur s'ulcère, se nécrose ou dépasse un volume fixé. Il indique tester un adjuvant à base de mélanine pour un futur vaccin contre le glioblastome, tout en affirmant que la souris est l'espèce "la plus adaptée" et que le modèle de gliome implantable n'existe que chez le rat. Les retombées cliniques sont renvoyées après sélection d'un candidat et poursuite du développement pharmaceutique.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. L’induction d’une immunité contre un antigène cible par vaccination à l’aide d’adjuvants classiques (tels que ceux utilisés dans les vaccins anti-infectieux) permet d’obtenir facilement des anticorps circulants. Ces anticorps sont cependant peu efficaces pour lutter contre les tumeurs. L’obtention de lymphocytes T capables de tuer les cellules cancéreuses est plus difficile car les adjuvants disponibles actuellement donnent généralement des réponses faibles ne permettant pas d’induire une réponse antitumorale satisfaisante. Nous avons récemment découvert que la mélanine synthétique utilisée en tant qu’adjuvant vaccinal permettait de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène peptidique donné (i.e. un fragment de protéine surexprimée ou bien anormalement exprimée par les cellules cancéreuses et présenté à leur surface). Notre but est de poursuivre le développement de notre adjuvant afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Des peptides cibles issus de protéines exprimées dans les glioblastomes humains seront sélectionnés, puis validés par des tests in vitro. La capacité de ces peptides associés à notre adjuvant à base de mélanine à induire une réponse immunitaire et à contrôler la croissance tumorale, sera évaluée in vivo chez la Souris ou le Rat. L’étude chez l’animal est indispensable pour mesurer une réponse immunitaire par lymphocyte et la Souris constitue l’espèce la plus adaptée pour les études immunologiques. Comme il n'existe pas de modèle de gliome implantable en sous-cutané chez la Souris, les effets anti-tumoraux de nos formulations seront évalués chez le Rat, pour lesquels un tel modèle existe.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la sélection d’un candidat vaccin pour le traitement du glioblastome, dont nous poursuivrons le développement pharmaceutique avant d’initier les essais cliniques chez l’Homme. A l'issue de ce projet nous aurons : 1- Sélectionné deux peptides-candidats issus de protéines surexprimées ou anormalement exprimées par les gliomes humains 2- Déterminé la formulation (ratio peptide/mélanine, temps de contact) permettant d'obtenir une réponse imunitaire optimale pour chacun des deux peptides 3- Réalisé les études de stabilité de notre adjuvant à base de mélanine synthétique sur 3 ans

Procédures

Les immunisations seront réalisées par injection sous la peau sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une ou deux injections (à deux semaines d'intervalle) seront réalisées par animal. Les implantations de cellules tumorales sous la peau seront réalisées sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une seule implantation sera effectuée par animal.

Impact sur les animaux

L’injection du vaccin est susceptible de provoquer une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection, ce qui fera l'objet d'une surveillance quotidienne. Il est cependant à noter qu'aucune des expériences menées à ce jour n'a mis en évidence de tels effets indésirables. Dans les expériences impliquant l’implantation d’une tumeur sous la peau, un effet indésirable potentiel est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place et il sera procédé à leur mise à mort en cas d'ulcération ou de nécrose de la tumeur ou bien dès que celle-ci atteindra un volume déterminé à l’avance et adapté à l’espèce.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chacune des procédures afin de pouvoir obtenir le matériel biologique (rate, tumeur) nécessaire à l'évaluation de la réponse immunitaire.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués (interactions cellules présentatrices des antigènes-lymphocytes, interactions cellules immunitaires-tumeur (y compris microenvironnement tumoral)). Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et ainsi de limiter la multiplication des expériences. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs préparations vaccinales ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 3980 animaux seront utilisés dans ce projet, 3860 souris et 120 rats.

Raffinement

Les expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes. Toutes les injections sont effectuées sous anesthésie générale. Les vaccins sont formulés de façon à être bien tolérés et à ne pas induire de douleur ou de réaction indésirable au point d’injection. Chez les animaux porteurs de tumeurs, la croissance tumorale est mesurée tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

Souris : La souris est le modèle de choix pour l'étude de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souches utilisées dans ce projet est bien caractérisé et de nombreux outils immunologiques sont disponibles (bases de données et outils de prédiction in silico, réactifs et méthodes permettant d’étudier et de mesurer l’intensité la réponse immunitaire). Il existe un modèle de souris transgéniques dont le système immunitaire est capable de reconnaitre les antigènes tumoraux humains, que nous pourrons utiliser pour valider notre candidat vaccin avant passage aux essais cliniques chez l’Homme. Rat : Il n’existe pas de modèle de glioblastome implantable en sous-cutané chez la Souris. En revanche, il existe un modèle reconnu chez le Rat, que nous allons utiliser dans ce projet. Les animaux seront agés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

2 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées pour d'autres expérimentations ou confiées à une association d'adoption à l'issue. Chaque animal reçoit jusqu'à cinq injections intramusculaires et sept prélèvements sanguins à la jugulaire pour produire des anticorps dirigés contre des vésicules bactériennes. Le porteur indique que le protocole peut provoquer fatigue, douleur, hyperthermie et, dans un cas extrême, un choc anaphylactique. Il affirme que le recours à l'animal vivant est "indispensable" et qu'il n'existe "aucune alternative" non animale, seul un "organisme intégré et vivant" pouvant synthétiser ces anticorps.

Objectifs

Les vésicules de membranes externes (OMV) sont des vésicules formées à partir de la membrane externe des bactéries Escherichia coli. Ces vésicules font l’objet de nombreux projets de recherche dans des domaines variés (traitement anti-cancéreux, vaccinologie, ...). Le but de ce projet est de produire des anticorps dirigés contre ces vésicules (anticorps non disponibles à ce jour). Les anticorps fixés sur les vésicules pourront être marqués par fluorescence (immunomarquage) afin de pouvoir suivre le trajet des vésicules au niveau cellulaire et ainsi de comprendre le mécanisme d’action des OMV au niveau des cellules.

Bénéfices attendus

Le sérum des chèvres prélevées permettra de récupérer des anticorps dirigés contre les vésicules extra-cellulaires (OMV) de bactéries et de créer un stock d’anticorps pour les expérimentations en laboratoire ultérieurement (exemple : suivi des OMV par marquage fluorescent des anticorps dirigés contre les OMVs (immunomarquage)). Cela permettra de mieux étudier le mécanisme d’action encore méconnu de ces vésicules.

Procédures

5 injections intramusculaires maximum (durée de 5 secondes environ) à 2 semaines d’intervalle entre chaque injection, sur 2 chèvres vigiles. Et 7 prélèvements sanguins à la veine jugulaire (environ 10 secondes par prise de sang) sur 2 chèvres vigiles avec 2 semaines d’intervalle entre chaque prise de sang.

Impact sur les animaux

Le protocole est susceptible de générer un stress chez l'animal au moment des manipulations (injections et prises de sang) et une réaction inflammatoire et immunitaire attendue liée à la production d'anticorps en réponse à l'injection des OMV, qui pourrait entrainer un état de fatigue, de la douleur et de l'hyperthermie de manière transitoire, voire un choc anaphylactique (dans un cas extrême, non attendu). Ce protocole ne doit pas entrainer d'effet délétère à long terme, ni de souffrance et ne nécessite pas la mise à mort des animaux. De nombreuses validations in vitro et in cellulo ont déjà été réalisées de manière à garantir la qualité des vésicules utilisées à des fins vaccinales. De plus, l’innocuité chez l’animal a déjà été établie dans un modèle poussin.

Devenir

Les chèvres seront réformées pour d’autres expérimentations ou alors adoptées par une association spécialisée dans le placement d’animaux anciennement utilisés à des fins scientifiques.

Remplacement

L'absence d'anticorps disponibles nécessite de recourir à une production d'anticorps par immunisation contre les vésicules extracellulaires d'intérêt. Ce projet ne peut pas être réalisé in vitro. En effet, il n'existe aucune alternative non animale disponible permettant de produire des anticorps. A l'heure actuelle, tous les anticorps sont produits dans des organismes modèles (souris, rat, lapin, chèvre, âne ou singe le plus souvent). Le recours a l'animal vivant est ici indispensable car la production d'anticorps étant secondaire à une immunisation (ici consécutive à l'injection d'OMV) et mettant en jeu des mécanismes complexes et séquentiels, seul un organisme intégré et vivant est capable de synthétiser ces anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux minimal nécessaire pour afin de garantir la production d’anticorps est de 2 individus. En effet, une seule chèvre ne serait pas suffisante dans le cas où le système immunitaire de la chèvre ne répondrait pas à l’immunisation (pas de production d’anticorps) car il existe une variabilité de réponse immunitaire entre les animaux d’une même espèce. 2 chèvres est donc le nombre minimal nécessaire afin d’augmenter les chances de récupérer des anticorps par prélèvement sanguin sur les chèvres.

Raffinement

Les chèvres seront logées à côté d’un troupeau de chèvre (afin de répondre aux besoins sociaux intra-espèce des chèvres, car il n’existe pas de risque infectieux), en boxe intérieur sur aire paillée. Les animaux auront des abreuvoirs, du foin à volonté et une distribution de granulés quotidienne. Les densités par animal sont respectées conformément à la réglementation (directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques). Des brosses sont mises à disposition sur les murs du logement afin que les chèvres puissent se frotter contre celles-ci afin d’enrichir leur environnement. Elles auront la possibilité d’exprimer un comportement propre à leur espèce. Avant le début du protocole expérimental, les chèvres auront une longue période d’acclimatation dans leur nouvel environnement (supérieure à 1 mois).

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle chèvre car il permet de purifier une quantité importante de sérum, ce qui évitera de devoir reproduire la même expérimentation régulièrement. Par ailleurs, le modèle chèvre étant couramment utilisé pour produire des anticorps, de nombreux réactifs dirigés contre cette espèce sont disponibles dans le commerce, ce qui permettra d'utiliser les anticorps produits dans de nombreuses applications. Chèvre adulte (afin de limiter le risque d'apparition de choc anaphylactique).

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie du cerveau avec implantation de fibres optiques, puis un protocole de stress, soit un conditionnement de peur par chocs électriques, soit une limitation de litière chez le juvénile, avant des tests comportementaux d'anxiété dont le détail n'est pas précisé. Le porteur affirme que l'augmentation de l'anxiété est inhérente au "besoin" de la recherche et que la culture cellulaire ne permet pas de mesurer l'activité neuronale in vivo. Les retombées annoncées pour les patients anxieux sont renvoyées au long terme, l'objectif immédiat restant de cartographier des circuits neuronaux.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence les altérations des circuits de neurones contrôlant les émotions dans des modèles de pathologie anxieuses chez la souris. Notre recherche ciblera l'identification d'altérations structurelles (anatomiques) ainsi que fonctionnelles (activité électrique). Ensuite nous utiliserons des techniques de manipulation de l'activité de circuits de neurones pour restaurer les altérations observées, avec l'objectif de restaurer des niveaux d'anxiété normaux.

Bénéfices attendus

A long terme, les connaissances générées par notre recherche permettront de pouvoir envisager des stratégies théropeutiques innovantes chez les patients atteints de troubles anxieux.

Procédures

Chirurgies: grâce à l'utilisation de coordonnées sur la boîte crânienne, des substances permettant de visualiser les cellules sont injectées dans le cerveau et des fibres de verre de moinsn d'un demi milimetre de diamètre sont ensuite implantées afin de visulaiser les cellules. Chaque souris subira une chirurgie, sous anesthésie totale, recevra des traitements analgésiques et son bien être sera surveillé quotidiennement. Les animaux subiront une procédure de stress parmi deux modèles [1] soit un conditionnement de peur chez l'adulte impliquant de légers chocs électriques, [2] soit une limitation de litière chez le juvénile. Enfin, les souris seront ensuite exposées à des tests comportementaux pour mesurer leur niveaux d'anxiété, ce qui n'induit pas de nuisances pour l'animal car ils sont habitués à la présence de l'expérimentateur/trice de façon quotidienne pendant une semaine en amont du test (handling). Les tests durent entre 5 et 20 minutes chacuns, et un seul test par jour est réalisé, sur une durée maximale de 10 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont la douleur potentielle induite pas la chirurgie qui est traitée avec des analgésiques, et un niveau d'anxiété augmenté chez certains individus par les procédures de stress. Cette augmentation de l'anxiété est inhérente au besoin de la recherche de substrat biologiques des troubles anxieux dans des modèles pré-cliniques qui est l'objet de cette saisine (la souris dans notre étude).

Devenir

Nous devons réaliser des vérification histologiques sur tissu cérébral, donc euthanasier l'animal.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connectivité des neurones et de leurs propriétés de codage d’informations au cours du comportement. Par conséquent, cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. Des méthodes telles que la culture cellulaire ne permettent pas la quantification des connexions neuronales ou de la mesure de l’activité en réponse à une simulation sensorielle in vivo.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude et des circuits associés. Afin de limiter le nombre d'animaux, nous réalisons plusieurs test comportementaux pour chaque individus, ce qui réduits considérablement le nombre d'animaux nécessaires. Nous réalisons également toutes nos expérience sur les mâles et les femelles afin d'éviter l'euthanasie de masse inutile des femelles.

Raffinement

Avant la mise en place du modèle d’anxiété, les animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Les cages seront également enrichies de nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur. Une partie des animaux (100) subira aussi un stress plus léger que le conditionnement de peur, qui n'implique pas de chocs électriques afin d'améliorer le BEA. Ces 100 animaux seront soumis à un protocole de stress plus léger dès leur naissance, par une limitation de litière du jour 2 au jour 12 (souris non sevrées). A l'age adulte (environ 12 semaines) les souris seront alors testées dans des tests permettant d'évaluer leur niveau d'anxiété. Cette modification de procédure nous permet de tester un modèle de modélisation de l’anxiété plus éthologique et éthique car nous n’imposerons plus de de chocs électriques aux animaux.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle largement utilisé pour l’étude des circuits impliqués dans la peur et les troubles anxieux. Dans des projets futurs, nous ferons appel à des souris transgéniques. Dans un souci de continuité et de rigueur scientifique dans nos études, nous avons besoin d'utiliser le même modèle. De plus, la majorité des études se font sur la souris. Il est donc là aussi nécessaire de travailler sur la souris, pouvoir comparer nos résultats avec les publications actuelles. Par ailleurs, la souris est génétiquement très bien définie, offrant ainsi un large panel de choix dans les méthodes utilisables, non au niveau du laboratoire, mais au niveau mondial. Les animaux seront utilisés au stade adule, soit à partir de 10 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les souris adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie.

1600 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par les établissements partenaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après tonte et dépilation sous anesthésie, un produit est appliqué sur leur dos jusqu'à vingt-quatre fois pour induire un psoriasis, avec des injections sous-cutanées et des pesées répétées. Le porteur attend une perte de poids pouvant atteindre 20 %, un érythème, une desquamation et un épaississement de la peau, et précise que l'élevage préalable conduit aussi à tuer les animaux non sélectionnés. Il affirme ne pas pouvoir se passer de l'expérimentation animale pour cette maladie multifactorielle.

Objectifs

Le psoriasis est une maladie pro-inflammatoire chronique et multifactorielle de la peau (démangeaisons, plaques inflammatoires, …), touchant 2 à 4% de la population française, principalement bénigne et actuellement sans traitement curatif définitif. Dans 20% des cas, des formes sévères sont relevées montrant l’augmentation des risques cardiovasculaires et métaboliques chez ces patients. Le récepteur TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloide 1) est un acteur majeur dans la perception et l’intégration des sensations douloureuses (nociception), et est impliqué dans l’inflammation des couches superficielles de la peau (épiderme externe et derme plus profond), dans de nombreuses maladies, mais son rôle précis au niveau vasculaire local et/ou dans les échanges entre les différents types cellulaires, n’est pas clairement démontré à ce jour. Aujourd’hui, parallèlement à des études pharmacologiques en biologie cellulaire (in vitro sur cultures cellulaires) ou par des analyses biochimiques et de biologie moléculaire sur organes isolés (ex vivo, explants de peau ou prélèvements tissulaires de patient), notre objectif est de caractériser in vivo l’implication du récepteur TRPV1 dans un modèle induit de psoriasis chez des souris génétiquement modifiées. Ce projet inclus 2 procédures expérimentales. La procédure 1, de sévérité legère, est une procédure d'élevage permettant de générer 3 nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées « Knock-Out tissu-spécifique », où l’expression du gène TRPV1, soit le complexe protéique constitutif du récepteur TRPV1 exprimé à la membrane cellulaire, est spécifiquement invalidée dans l’un des 3 compartiments cellulaires suivants : vasculaire (microcirculation vasculaire locale), épidermique (relations entre les cellules constitutives de l’épiderme) ou nerveux (relations entre cellules sensitives), et de sélectionner au maximum de 1600 animaux d’intérêt. Ces animaux seront tous inclus dans la procédure 2, de sévérité modérée, permettant d’induire un modèle psoriasique selon 3 modalités : très court terme / précoce – 3 jours, court terme / aigüe – 6 jours et long terme / chronique – 9 semaines. Au terme de l’induction du modèle pathologique, des analyses fonctionnelles et biochimiques permettront de caractériser finement l’implication du récepteur TRPV1 au niveau des 3 compartiments précédents, de proposer une nouvelle approche de développement de traitements du psoriasis et/ou des pathologies dermatologiques similaires.

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif définitif, seuls des traitements symptomatiques aux résultats transitoires sont proposés aux patients étant atteint d’un psoriasis. L'idée novatrice de ce projet est d'étudier l'implication fine du récepteur TRPV1 et de le placer au centre de la dérégulation de l'équilibre homéostatique (constantes fonctionnelles régulées et maintenues à des valeurs bénéfiques pour l’organisme), incluant l'ensemble des acteurs, et d'identifier si possible le site d'inflammation privilégié (épithélial, neuronale, vasculaire) permettant d'envisager une possible nouvelle voie de développement d’un traitement diminuant le nombre et l’intensité des poussées.

Procédures

Les souris issues des 3 nouvelles lignées KO tissu-spécifique TRPV1, soit au maximum 1600 animaux, obtenues par la procédure 1 – élevage et obtention des 3 lignées de souris LoxP-Cre Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, seront incluses dans la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris et seront donc soumises à 3 types d’interventions : I – en amont du protocole d’induction (procédure 2), chaque souris sera tondue et dépilée (crème VEET « peaux sensibles »), sous anesthésie gazeuse ; intervention réalisée 1 fois et d’une durée maximale de 5 minutes, II – durant le protocole d’induction (procédure 2), chaque souris vigile recevra une application externe / topique de Vaseline® (condition contrôle) ou d’Aldara™ 5% (condition induite), sur la zone dépilée ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce – 3 jours », 5 fois pour la modalité « aigüe – 6 jours » et 24 fois pour la modalité « chronique – 9 semaines » et d’une durée de moins de 5 minutes, III – Durant la procédure 2, chaque souris vigile recevra une injection sous-cutanée préventive de NaCl 0,9% (300µL), après contention manuelle, pour limiter déshydratation générale liée à la procédure d’induction ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce », 3 fois pour la modalité « aigüe » et 6 fois pour la modalité « chronique », d’une durée d’environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont : I – du stress lors des pesées régulières (entre 2 et 7 fois par semaine, durée inférieure à 30 secondes) diminuant avec l’habituation, II – du stress lors des anesthésies gazeuses générales de préparation (tonte, dépilation) des animaux en amont de l’induction du modèle, de faible intensité (maximum 5 minutes), III – du stress et de l’inconfort lors des manipulations des animaux vigiles pour induire le modèle (application dorsale de crème, injection sous-cutanée préventive, observations comportementales, …), de faible intensité, et se réduisant avec l’habituation à la répétition journalière des opérations (5 minutes par animal et par jour), IV – une perte de poids corporel transitoire, attendue durant les premières 48 heures après début du traitement d’induction et pouvant atteindre 20% maximum, due à une déshydratation générale, soit d’une intensité modérée (maximum durant une semaine), V – L’apparition des « symptômes » induits, caractéristiques du psoriasis (rougeur / érythème, desquamation, épaississement cutané), d’intensité faible à modérée (durée totale de l’expérimentation) et VI - du stress lors de la réalisation des transferts des animaux vers nos partenaires (préparation, conditionnement, nouvel environnement transitoire, vibrations lors du transport, …), de faible intensité, sur 24-48h.

Devenir

Ce projet comporte 2 procédures expérimentales. Lors de la procédure 1 – Elevage et obtention des 3 nouvelles lignées de souris Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, l’apparition éventuelle d’un phénotype dommageable mettrait fin au projet et l’ensemble des animaux seraient mis à mort. Les animaux présentant les génotypes d’intérêt, ainsi que les géniteurs d’intérêt pour la cryoconservation de leurs gamètes, seront gardés en vie. Les animaux non-sélectionnés seront mis à mort. Les animaux sélectionnés en procédure 1, intègreront la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris, où ils seront transférés immédiatement vers nos partenaires (modalité « précoce – 3 jours » et « aigüe – 6 jours ») ou intègreront la modalité « chronique – 9 semaines », où ils débuteront le protocole d’induction du psoriasis, avant d’être transférés, à leur tour, vers nos partenaires, qui se chargeront de finaliser l’induction et de réaliser les expérimentations finales, puis mettrons à mort l’ensemble des animaux. Ils seront donc tous conservés en vie dans notre établissement.

Remplacement

Le psoriasis est une maladie multifactorielle, dont la physio-pathologie implique différents intervenants et composantes au sein de la peau (vasculaires, nerveux, barrière cellulaire, …), ne pouvant être reproduits et étudiés uniquement par le développement de modèles cellulaires et/ou l’utilisation de méthodes alternatives. Nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale et de la mise en place de protocoles in vivo pour prendre en compte l’ensemble de ces aspects.

Réduction

L’ensemble du projet a été conçu afin de réduire au maximum le nombre d’animaux sans compromettre l’interprétation statistique des résultats. De par la variabilité interindividuelle dans les tests fonctionnels finaux, nous devons inclure 20 animaux par double analyse fonctionnelle pour obtenir des résultats robustes. Si les variations des résultats expérimentaux sont « significatives », nous envisagerons de réduire le nombre d’animaux par groupe et ainsi diminuer le nombre global d’animaux nécessaire. De plus, nous limiterons le nombre de groupes « contrôle » dans les 3 modalités d’induction du modèle (précoce - 3 jours, aigüe - 6 jours, chronique - 9 semaines), en utilisant les animaux contrôles de la modalité d’induction « aigüe - 6 jours » pour la réalisation des analyses de la modalité « précoce - 3 jours ».

Raffinement

Les responsables du projet s’assureront du bien-être de l’ensemble des animaux au quotidien, par la réalisation d’observations comportementales et d’évaluations du poids corporel, au minimum 2 par semaine. Si nécessaire et en suivant une échelle de cotation adaptée, les responsables prendront en charge la gestion de la douleur ou du mal-être par une analgésie adaptée, et si un point limite est atteint, pratiqueront la mise à mort immédiate de l’animal concerné.

Choix des espèces

L’utilisation de souris comme modèle d’étude in vivo est courant en immuno-dermatologie. Son système immunitaire, humoral et cellulaire est largement décrit depuis de nombreuses années et font référence, ce qui nous permettra d’expérimenter sans avoir recourt à des espèces de mammifères plus proches de l’homme. Dans notre contexte, il nous semble d’autant plus pertinent d’induire un psoriasis sur cette espèce, car, commercialement, nous pouvons obtenir des animaux génétiquement modifiés d’intérêt (mutant KO total TRPV1, souris LoxP-TRPV1, souris Cre-tissu spécifique), et créer des souris Cre-LoxP KO spécifique TRPV1 par les méthodologies d’inactivation Cre-LoxP développées dans les années 2000. Le modèle inductible d’inflammation cutanée / psoriasis est documenté depuis plus de 10 ans, utilisé par de nombreuses équipes mondialement et nos partenaires sont rompus à son utilisation. Les 3 nouvelles lignées produites permettront de caractériser l’implication du récepteur TRPV1 au sein de 3 compartiments cellulaires impliqués dans le psoriasis induit chez la souris. Le psoriasis touche l’ensemble de la population, du jeune à l’adulte, avec un pic d’apparition de la maladie chez l’homme se situant entre 20 et 30 ans. Notre étude souhaite évaluer les phases précoces d’apparition du psoriasis, puis l’installation de la pathologie à court terme (phase aigüe) et l’évolution à long terme (phase chronique) dans un modèle induit de dermatite psoriasiforme chez la souris. Nous utiliserons donc des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et dont le poids variera entre 20 et 30g au moment de débuter le protocole d’induction du modèle.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent une injection de chlorure de baryum dans les muscles de la patte pour provoquer une lésion, après un gavage de dioxine, afin d'étudier l'effet de ce polluant sur la régénération musculaire. Le porteur reconnaît qu'une paralysie ou une nécrose de la patte reste possible, et prévoit la mise à mort au plus tard vingt-huit jours après la lésion. Il indique que l'étude d'interactions cellulaires dans l'organisme entier ne peut être qu'en partie remplacée par la culture in vitro.

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables parce qu’il possède de grandes capacités régénératrices, ce qui font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. La dioxine, un polluant organique et hautement toxique, a un impact sur les cellules souches du muscle squelettique et il a été démontré qu’il existe une différence de réponse face à la pollution au sein des sous-populations de cellules souches du muscle. Une partie d’entre elles semblent résistantes à la pollution et présentent un mécanisme de résistance unique, tandis que la majorité des cellules satellites y sont sensibles. Ceci interroge désormais sur le rôle respectif de ces deux sous-populations quant à la réparation du muscle squelettique dans un contexte de pollution. Comme la pollution est un facteur de risque important pour la santé humaine nous proposons avec ce projet et sur la base de nos résultats, de décrypter les réponses cellulaires et moléculaires spécifiques de chacune de ces deux souspopulations au cours de la régénération musculaire après une exposition à la pollution. Alerter sur les effets de la pollution dans un système biologique tel que le système musculaire permettra de comprendre quel stress cellulaire peut engendrer la pollution. Dans notre étude, nous utiliserons des modèles murins qui subiront une exposition à la dioxine ou à une molécule contrôle. Une partie des souris sera, dans un deuxième temps, soumise à une blessure musculaire. Nous pourrons ainsi étudier l’impact de la pollution par dioxine sur les cellules souches musculaires notamment au cours du processus de la régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Comme notre projet s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires nous ne pouvons pas mettre en place une méthode alternative au vivant. Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation excessif d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 15 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Notre étude fera appel à un total de 480 souris sur une procédure expérimentale.

Procédures

Pour le déroulement de ce projet les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles TA et BCPS. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux).

Impact sur les animaux

Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte du traitement de TCDD par gavage. Les animaux gavés avec TCDD ou contrôle nonane sont comparables en termes de comportement/activité motrice spontanée et de poids corporel. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. L’induction de la régénération musculaire peut entrainer des contraintes au niveau du mouvement de la patte pendant quelques heures. Dans notre expérience nous n’avons jamais observé de complications majeures liés à la régénération musculaire mais nous ne pouvons pas négliger la possibilité qu’une éventuelle paralysie ou nécrose de la patte puisse se manifester.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyse au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et/ou l’interaction entre de nombreux types cellulaires/tissus. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Pour éviter au maximum l’usage d’animaux dans l’étude et être confiant de la réussite de notre projet in vivo, nous avons fait des études préliminaires sur des lignées cellulaires musculaires avant de passer aux expériences sur les animaux. De plus, la culture cellulaire restera une technique que nous utiliserons au cours de ce projet pour des testes préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 15 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Ce nombre de souris n’a pas été calculé avec des méthodes de statistique mais basé sur notre expérience sur l’obtention de matériel biologique pour chaque technique.

Raffinement

Pour minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. En préalable à l’injection, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%). L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et profonde afin de permettre la réalisation de la procédure dans un temps relativement court et assurer un réveil rapide. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Pendant toute la procédure, les cages sont visuellement inspectées chaque jour donc tout animal présentant les points limites sera mis à mort (lordose, tremblements, prostration, paralysie, difficulté de locomotion, nécrose de la patte, perte de poids).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 6 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé et les cellules satellites sont en quiescence. L’administration de tamoxifène par gavage sera faite à tous les animaux de l’étude. La tamoxifène va permettre l’induction de la recombinase Cre dans des lignées floxées au stade d’expression du promoteur contrôlant l’expression de la recombinase dans chaque lignée. Apres l’administration de tamoxifène par gavage, les animaux seront analysés pour l’étude de l’impact de l’exposition à la TCDD et pour l’étude de la régénération musculaire.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la patte leur inflige une douleur neuropathique maintenue pendant sept semaines, avec des tests de douleur répétés et, pour certaines, une injection de naloxone déclenchant un syndrome de sevrage. Le porteur précise que l'allodynie mécanique ne peut être soulagée "car c'est l'objet de l'étude", et attend une perte de poids transitoire, pour évaluer une association méthadone-gabapentine. Il affirme le remplacement "impossible", la douleur ne pouvant être observée que chez l'animal vivant et vigile.

Objectifs

La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel, généralement chronique elle affecterait 5 à 7% de la population française. Les traitements actuels ne sont pas efficaces chez tous les patients et leurs effets secondaires conduisent de nombreux patients à arrêter le traitement. Antidépresseurs, anticonvulsivants (Gabapentine) et tramadol/tapentadol sont parmi ces traitements. En clinique, les opiacés classiques (morphine, fentanyl) sont de moins en moins prescrits pour soulager ce type de douleur du fait de leurs nombreux effets indésirables et de la crise des opiacés qui existe aux États-Unis en particulier. Les médecins se tournent alors de plus en plus vers la méthadone qui est actuellement utilisée dans de nombreux pays, mais pas encore en France, comme traitement antalgique des douleurs complexes liées au cancer. Ces douleurs complexes et chroniques mêlent des douleurs par excès de nociception ainsi que des douleurs neuropathiques, ce qui rend difficile leur évaluation et leur traitement. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de la méthadone seule mais également en association avec un traitement plus courant la Gabapentine dans le soulagement des douleurs neuropathiques périphériques dans un modèle murin. L’association de ces 2 molécules permettra de cibler des cibles moléculaires différentes, de réduire les doses efficaces et donc les effets secondaires avec une même activité antalgique. Plusieurs doses seront testées afin de trouver une association de doses idéale, c’est-à-dire provoquant un soulagement idéal de la douleur neuropathique avec les plus petites doses possibles (ce qui provoquera donc le moins d’effet indésirable possible). Le but final de ce projet sera de proposer une association présentant moins d’effet indésirable pour des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Le projet s'inscrit dans une démarche de raffinement des traitements existants chez l’Homme pour soulager les douleurs neuropathiques. L’association de méthadone et de gabapentine (anticonvulsivants déjà utilisé à plus fortes doses en clinique dans le traitement des douleurs neuropathiques) permettra de cibler des cibles moléculaires différentes, de réduire les doses efficaces et donc les effets secondaires avec une même activité antalgique. Le but final de ce projet sera de proposer une association présentant la meilleure efficacité avec le moins d’effet indésirable pour des essais cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une douleur chronique pendant 7 semaines. Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Ces animaux subiront également 6 fois le test de douleur durant une vingtaine de minutes environ avant la chirurgie neuropathique puis trois fois par semaine (délai de 5 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) pendant 5 semaines. Les animaux auront un traitement par un analgésique potentiel (méthadone, gabapentine, morphine ou 2 de ces molécules associées) dans leur eau de boisson 15 jours après l’induction de la douleur neuropathique Certains animaux seront soumis à un syndrome de sevrage modéré par une injection de naloxone.

Impact sur les animaux

Il y a présence de douleur, plus particulièrement une allodynie mécanique qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie, une perte de poids transitoire peut se produire. Le traitement par la méthadone peut produire un syndrome de tolérance, d’hyperalgésie ou de sevrage, normalement peu présents voir pas présents aux doses utilisées dans ce projet. Un effet positif, antidouleur, induit par les traitements est également attendu.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre de souris nécessaire a été calculé mathématiquement et les effets de la combinaison des deux traitements sera évalué par les tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton et de la frisure seront placés dans la cage pour favoriser la nidation pour limiter les comportements d’agressivité, et des barreaux de bois à ronger pour favoriser le comportement naturel du rongeur de ronger. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant la chirurgie d’induction de douleur neuropathique des méthodes d’anesthésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites pour limiter la souffrance de l’animal sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, ces nouvelles pratiques pourraient être intégrées au projet.

Choix des espèces

Les modèles d’animaux neuropathiques utilisés dans cette étude ont été caractérisés et validés pharmacologiquement chez la souris (travaux antérieurs de notre équipe) et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).