Recherche fondamentale

612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées dans leur poumon par chirurgie, puis elles reçoivent des agents d'imagerie radioactifs et subissent jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie ainsi que des prélèvements sanguins et des traitements anticancéreux. À la fin, toutes sont tuées pour prélever leurs organes. Le projet cherche à valider par imagerie TEP cinq biomarqueurs prédictifs de l'efficacité de thérapies, le porteur renvoyant le bénéfice pour les patients au transfert clinique ultérieur.

Objectifs

Les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) représentent environ 75 à 80 % des cancers bronchiques. Des progrès significatifs dans la compréhension des dérèglements moléculaires sous-jacents aux CBNPC ont ouvert de nouvelles opportunités de thérapies ciblées et plus personnalisées. Celles-ci nécessitent d’utiliser des indicateurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique, quantifiables au cours du temps, ce que l’on appelle des biomarqueurs (ce peut être un gène, une protéine, un mécanisme cellulaire…). Ces biomarqueurs prédictifs permettront de cibler au mieux le choix thérapeutique en fonction des patients et de leur pathologie. L’une des méthodes employées pour évaluer un biomarqueur d’une tumeur consiste à effectuer des prélèvements de tissus tumoraux (biopsie) et/ou sanguins et à y quantifier le biomarqueur. La méthode est invasive et complique la prise en charge du patient. De plus, les prélèvements effectués ne sont pas nécessairement représentatifs ni de l’intégralité du volume tumoral, ni de l’évolution au cours du temps de la tumeur. L’imagerie moléculaire, notamment l’imagerie hautement quantitative par tomographie par émissions de positon (TEP) permet une visualisation corps entier, au cours du temps de ces biomarqueurs d’intérêt. L’objectif du projet est d’évaluer par imagerie TEP couplée avec l’imagerie IRM ou optique cinq nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité de thérapies ciblées antitumorales, particulièrement les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (tels que des immunothérapies associés à des chimiothérapies et/ou à de la radiothérapie interne ou externe). Cette évaluation se fera en utilisant des modèles de cancers pulmonaires chez la souris. Les biomarqueurs évalués seront soit tumoraux soit liés au système immunitaire qui joue un rôle clé dans l’efficacité de ces thérapies ciblées. L’évaluation de ces nouveaux biomarqueurs en y associant des ligands spécifiques aux biomarqueurs d’intérêt en imagerie TEP permettra d’apporter des preuves suffisantes de l’importance de ce couple biomarqueur et imagerie TEP pour un transfert chez l’humain. Les résultats de ce projet devraient permettre de valider cette approche pour ensuite transférer au niveau clinique la méthodologie.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider de nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique d’un traitement donné, essentiels pour améliorer la prise en charge des patients. Malgré des résultats prometteurs des différents axes thérapeutiques, que ce soit l’immunothérapie, la radiothérapie et les thérapies ciblées (i.e. ciblant spécifiquement certaines protéines, afin de bloquer des mécanismes tumoraux), seulement une partie de la population bénéficie de l’efficacité de ces thérapies : de multiples facteurs liés à la tumeur elle-même (son sous-type) et au patient (le stade de sa maladie, son système immunitaire, des facteurs génétiques…) font que le pronostic d’efficacité ne sera pas le même pour deux patients. Pour soigner le plus grand nombre, il faudrait pouvoir répartir les patients en sous-groupes homogènes pour lesquels on pourrait prédire quelle thérapie est la plus adaptée. Cette meilleure stratification des patients est largement facilitée par l’utilisation de biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique. Actuellement, la quantification des biomarqueurs prédictifs repose principalement sur des techniques invasives et locales, telles que l’immunohistochimie sur des biopsies de patient. L’imagerie TEP est une technique corps entier, très faiblement invasive, dynamique et hautement quantitative. L’objectif du projet est de valider ainsi des couples biomarqueurs et radioligands à base d’anticorps ou de peptides pour de l’imagerie TEP afin de prédire l’efficacité thérapeutique, offrant ainsi un outil décisionnel complémentaire aux biopsies à l’oncologue pour mieux personnaliser le traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : La mise en place du modèle tumoral (30 minutes d’intervention, une seule injection par animaux) : des cellules tumorales seront injectées dans le poumon pour la formation de tumeurs dans l’environnement primaire de la lignée cellulaire. L’injection d’agents d’imagerie radioactifs (imagerie par tomographie par émission de positon), fluorescents (imagerie optique) et/ou IRM pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre d’injection total par souris : maximum 3). Une anesthésie lors des différentes sessions imageries (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 8 sessions d’imagerie à des dates différentes pour un suivi dynamique du traceur dans le cas de l’imagerie par tomographie). Un prélèvement sanguin sur animaux sous anesthésie (maximum 5 minutes, 2 fois maximum par session d’imagerie à des jours différents).

Impact sur les animaux

La mise en place de modèles tumoraux peut induire une gêne au niveau du site d’implantation de la tumeur. Un suivi régulier des animaux sera réalisé. Les effets indésirables prévus sur les animaux : • L’injection des radioligands en intra veineux peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (1h30 maximum) par voie gazeuse (isoflurane 1,5% à 2,5%). Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. • Le geste chirurgical induira une douleur au niveau du thorax. L’acte chirurgical durera 20min. Les traitements (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie et thérapie ciblée) peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de dose thérapeutique décrite et validée dans la littérature.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Ceci permettra de prélever les organes afin de pouvoir effectuer les analyses ex-vivo sur ceux-ci.

Remplacement

Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont testées sur des cultures cellulaires et des organoïdes afin de déterminer leur pertinence et pour certains biomarqueurs, leur surexpression au niveau des tumeurs. Les tests in vitro préliminaires mis en place permettront de définir au préalable la stratégie appliquée in vivo afin de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons pour l’évaluation sur le modèle murin. Cependant, le microenvironnement tumoral est difficilement reproductible in vitro. Afin de valider les biomarqueurs et la stratégie associée par imagerie, les tumeurs doivent être implantées dans l’organe cible, ici le poumon.

Réduction

L’imagerie permet des études longitudinales en pharmacocinétique et par conséquent ne nécessite pas l’utilisation d’animaux à chaque temps, réduisant drastiquement le nombre de groupe d’animaux nécessaires pour des études classiques en pharmacologie. Chaque donnée d’imagerie individuellement ou globalement permettra après analyses de définir la distribution des agents thérapeutiques de manière longitudinale en gardant la puissance statistique de l’étude.

Raffinement

Toutes les interventions invasives, à savoir les injections systémiques, seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse complétée par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Un suivi régulier et des points limites permettront d’éviter toute souffrance animale. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi.

Choix des espèces

Ce projet a comme objectif d’évaluer de nouveaux biomarqueurs prédictifs selon quatre axes thérapeutiques prometteurs (les immunothérapies, la radiothérapie, la chimiothérapie couplé à l’immunothérapie et les thérapies ciblées). La souris est l’animal de choix pour la mise en place de modèle tumoraux, ayant une taille adaptée pour la manipulation et l’imagerie corps entiers. Les modèles permettant une implantation de la tumeur dans son environnement d’origine sont largement utilisés pour examiner le microenvironnement tumoral essentiel pour valider les stratégies thérapeutiques et les biomarqueurs prédictifs. Les souris utilisées dans ce projet auront atteint un stade jeune adulte (5 semaines) à adulte ( 8 semaines). Cette tranche d’âge permet d’être représentative des cancers pulmonaires chez les patients majoritairement à l’âge adulte.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie abdominale de 40 minutes dont le résumé ne décrit pas le geste, passent le lendemain six heures en hypoxie hypobare ou à l'air et à la pression normaux, puis sont opérées une seconde fois sans réveil, 24 heures après la première chirurgie, pour prélever leur caillot et leur sang. Quatre doses d'antidouleur encadrent la première opération, qui peut entraîner des douleurs dans les heures suivant le réveil. Le dispositif doit reproduire l'exposition des passagers d'un vol long-courrier, et le porteur écrit que cette approche "permettrait" d'identifier les acteurs cellulaires de la thrombose et de révéler "à terme" des cibles thérapeutiques pour les personnels de bord et les grands voyageurs.

Objectifs

Evaluation en préclinique des effets de l’hypoxie sur la thrombose veineuse profonde. L'’intérêt est d'’identifier les acteurs cellulaires et protéiques impliqués dans la formation du thrombus après une exposition à un environnement hypoxique hypobare similaire à un vol d’avion long-courrier (minimum de 4 heures)

Bénéfices attendus

Ce projet d’expérimentation permet de reproduire in vivo la formation d’un thrombus sous l’effet d’une hypoxie hypobare et donc de simuler au mieux les conditions environnementales auxquelles sont exposées les passagers d’un vol long-courrier. Cette approche permettrait d’identifier les acteurs cellulaires par lesquels l'hypoxie joue son rôle pro-thrombotique et donc de révéler à terme de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant être spécifiques pour les personnels de bord et les « grands voyageurs ».

Procédures

Les animaux sont dans un premier temps soumis à une chirurgie abdominale avec réveil. 24 heures après ces mêmes animaux sont soumis à une deuxième chirurgie qui cette fois est sans réveil permettant le prélèvement du thrombus et du sang. Les deux chirurgies ainsi que les prélèvements ne sont réalisés qu'une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

Cette procédure est une procédure avec réveil et nécessite une chirurgie abdominale qui peut engendrer des douleurs post-opératoires les heures suivants le réveil des animaux. Les chirurgies ont une durée de 40 minutes et l'exposition à l'hypoxie hypobare ou normoxie normobare dure 6 heures.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure après prélèvement sanguin et prélèvement de caillot sanguin.

Remplacement

A ce jour l’étude in vitro des neutrophiles, des plaquettes et des cellules endothéliales ne permet pas à elle seule de reproduire l’intégralité du vaisseau sanguin. De plus, l'induction de l'hypoxie à l'échelle cellulaire ne reproduit pas la complexité des pathologies thrombotiques veineuses auxquelles sont exposés les passagers d’un avion.

Réduction

Dans le cas où une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant l’utilisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d’expérimentations supplémentaires. L’analyse du thrombus et des composés sanguins sera réalisée dans les mêmes animaux afin de respecter la règle des 3R (Reduction).

Raffinement

Les animaux seront utilisés 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie pour leur laisser le temps de s'acclimater. Afin de limiter le stress, les animaux seront transférés 24h avant la chirurgie dans la cage qui les hébergera tout le long de la procédure. Ceci aura pour but de les habituer à leur nouvel habitat et de les acclimater à la prise d'eau gélifiée. Au cours de la chirurgie, les animaux suivants attendront dans une pièce d’hébergement afin de ne pas être perturbé par la chirurgie en cours. Les animaux seront opérés sur un tapis chauffant (37°C) afin de maintenir leur température pendant la chirurgie. Pour améliorer les conditions de réveil, les animaux seront placés sur une bouillotte dans la cage pour les maintenir au chaud. Une surveillance accrue sera réalisée après la chirurgie toute la journée ainsi que pendant l'exposition à l'hypoxie hypobare pour le groupe concerné pour évaluer le bien-être des animaux et détecter rapidement tout signe de souffrance. Une première dose d'anti-douleur sera administrée aux animaux 30 minutes avant la chirurgie et une deuxième dès la fin de la chirurgie. Une troisième dose est injectée à la fin de la journée afin de limiter les douleurs durant la nuit. Le lendemain matin, soit 12 heures après, une dernière injection d'anti-douleur est réalisée avant de placer les souris en normoxie normobare ou en hypoxie hypobare. En cas de signes de souffrances chez un animal une nouvelle injection d'anti-douleurs lui sera administré.

Choix des espèces

Le modèle murin est un excellent modèle de thrombose à la fois artérielle et veineux et reproduit au mieux les mécanismes de thrombose présents chez l'humain. Les animaux seront utilisés entre 5 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et vasculaire fonctionnel.

360 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit vers la naissance une électroporation du cerveau sous anesthésie, puis est tué entre deux et quinze jours plus tard pour prélèvement du cerveau. Le projet étudie les mécanismes de production des cils dans les cellules du cerveau. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'effet nuisible de cette technique et juge les cultures cellulaires insuffisantes pour reproduire ce contrôle in vivo.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent la production des centrioles et des cils dans les cellules multiciliées épendymaires dans le cerveau des souris au stade postnatal. Dans ce contexte nous étudierons la fonction de protéines que nous avons préalablement sélectionnés à partir d’expériences réalisées in vitro en culture cellulaire. Des animaux de phénotype sauvage (CD1) seront utilisés pour étudier l’impact de la surexpression ou de l’inhibition de cette protéine en utilisant la technique d’électroporation in vivo de cerveaux postnataux.

Bénéfices attendus

Notre projet est d'une grande pertinence pour le domaine des cellules multiciliées (MCC) : - Un des grands défis dans ce domaine de recherche concerne le contrôle du nombre final de cils dans les MCC individuelles, qui est la clé de l'émergence de leur fonction physiologique. La réponse à cette question ne sera possible que lorsque les mécanismes de production et d'élimination des centrioles seront bien compris. Ce projet fera la lumière sur ces processus de ouvrant de nouvelles voies pour aborder la façon dont le nombre de centrioles est contrôlé. - La multiplication des centrioles dans les MCC et la duplication des centrioles au cours du cycle cellulaire font intervenir des principes de régulation communs. Ainsi, le domaine plus large de la biologie des centrioles bénéficiera à l'avenir d'études sur les MCC comme celle proposée ici. Notre projet est également pertinent pour la santé humaine : - Les maladies respiratoires chroniques, tuent plus de 4 millions de personnes chaque année. Malgré la mortalité associée à ces maladies, une compréhension de la pathogenèse reste incomplète. Nos résultats fourniront des informations importantes sur les mécanismes qui sous-tendent ces pathologies. - La compréhension des règles qui contrôlent le nombre de centrioles dans les MCCs pourrait également être tout à fait pertinente dans le domaine du cancer ou une multiplication aberrante de centrioles est parfois observé.

Procédures

Les nouveaux-nés P0-P1 anesthésiés seront soumis à une procédure d’électroporation in vivo du cerveau afin de modifier l’état génétique des précuseurs des cellules multiciliées. Cette procédure dure 1 à 2 min et sera réalisée une fois par animal sur 360 animaux.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 15 jours après. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’année et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur la santé et le bien-être des animaux. L’électropration que nous utilisons dans ce projet induit la diminution de l’ARN cible seulement dans quelques cellules du cerveau après la naissance, ce qui n’entraine aucun effet dommageable sur l’animal.

Devenir

A la fin de la procédure (P5 ou P15), les animaux seront euthanasiés pour prélèvement du cerveau et analyse des paramètres des cellules multiciliées par immunofluorescence.

Remplacement

Les modèles de lignées cellulaires de cellules multiciliées (Cellules epitheliales de trachée humaine, culture primaire de cellules épendymaires de souris, culture primaire de cellules de trachée de souris) ne récapitulent pas le contrôle sticte de production des centrioles multiples observé in vivo. Notamment le nombre de centrioles généré par les cultures de cellules ependymaires sont deux à trois plus élevé que le nombre de centriole observés in vivo. Ainsi, la production des centrioles multiples est contrôlée par des facteurs intrinsèques mais également par des facteurs extrinsèques. Ce contrôle cellulaire non autonome lié à l’environnement cellulaire ne permet pas d’utiliser des systèmes de culture cellulaire in vitro pour étudier ce processus en contexte physiologique. Il est donc nécessaire d’effectuer des approches fonctionnelles in vivo chez la souris. Avant le début des analyses fonctionnelles in vivo, la présence de nos candidats dans les structures cellulaires relevantes pour le processus de production des centrioles multiples a été évaluée par des approches biochimiques sur des lignées cellulaires.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des cellules multiciliées dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette approche par électroporation in vivo est utilisée depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et nous pouvons estimer au plus juste le nombre d’animaux suffisants à utiliser pour avoir des résultats reproductibles et tenant compte du taux d’échec des expériences réalisées par la suite sur les échantillons biologiques. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir de mêmes portées, sans distinction de sexe, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires est estimé afin d’atteindre une différence significative (p

Raffinement

Les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. 6 personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Pendant l’expérimentation, les souris sont traitées par des soins pré-opératoires (pommade lidocaïne) et la phase de réveil post-anesthésie se fait en condition de température optimale. Après l’expérimentation, les souris sont hébergées au calme dans une salle post- opératoire dédiée avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Ils font l’objet d’une surveillance quotidienne par les opérateurs pour vérifier la récupération dans les jours qui suivent l’application de la procédure. En cas de souffrance détectée (grille d’évaluation en Annexe 1), des antalgiques sont administrés (buprenorphine 0,1mg/kg, voie intra-péritonéale). Si les signes de souffrance persistent les animaux seront euthanasiés. Tout au long de l’expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété, agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, noter les observations faites et les actions entreprises.

Choix des espèces

La souris est le modèle mammifère utilisé par la communauté́ scientifique pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation des cellules multiciliées et qui sont conservés chez l’homme. De plus il permet des manipulations génétiques, soit par l’utilisation d’animaux transgéniques soit par modification ciblée de l’information génique des précurseurs des cellules multiciliées in vivo dans le cerveau. Les animaux seront utilisés au stade post-natal P0/P1 car Les précurseurs des cellules multiciliées ne sont accéssibles qu’aux stades P0-P1. Les animaux seront analysés à différents temps après électroporation de P5 à P15 correspondant aux différentes étapes de maturation des cellules multiciliées.

1 070 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposés dès l'adolescence à l'alcool et à des cannabinoïdes, ils sont soumis à des sessions de consommation d'alcool puis à une craniotomie pour implanter une électrode mesurant la dopamine. Le projet étudie la comorbidité entre schizophrénie et troubles de la consommation d'alcool sur un modèle induit dès la période embryonnaire. Le porteur affirme que ces mécanismes psychiatriques complexes ne sont pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact d'expositions précoces aux drogues sur les troubles de la consommation d'alcool à l'âge adulte dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'acool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agent cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission dopaminergique. En effet la dérégulation de ce système de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la conosmmation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie.

Bénéfices attendus

L'exposition précoce à l'alcool durant l'adolescence est nécessaire pour l'observation à l'âge adulte d'une consommation exagérée d'alcool. Nous n'avons pour le moment aucune information concernant la co-exposition avec des agents cannabinoides, drogues très fréquemment consommée par les adolescents et les jeunes adultes atteints de schizophrénie ou non. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact d'une exposition précoce à des drogues couremment utilisées sur les systèmes dopaminergiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des sessions de consommation d'alcool volontaire soit dans la cage de stabulation (24 heures 1 jour sur 2 pendant 8 à 15 semaines), soit dans des cages d'auto-administration opérante (sessions de 15 minutes, 5 jours par semaine sur une période de 4-5 mois). A l'âge adulte une partie des animaux seront soumis à une craniotomie (30 à 40 minutes) dont l'objectif est d'implanter une micro-électrode d'enregistrement de la libération de dopamine, neurotransmetteur crucial aussi bien dans les troubles observés dans la schizophrénie que dans les troubles de la consommation de drogues.

Impact sur les animaux

Douleurs post-opératoires de palier 1 l'âge adulte suite à l'implantation des canules par craniotomie. Durée prévue : 2-3 jours

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de cette procédure pour nous permettre de collecter les cerveaux pour des analyses histologiques, biochimiques ou génétiques nécessaires pour finalser le projet.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base d'expériences précédentes utilisant un autre modèle animal de schizophrénie et en prenant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet. De plus nous réaliserons les expériences aussi bien sur les mâles que sur les femelles pour ne pas avoir à éliminer les animaux surnuméraires mais également, dans le but d'une réduction, ne pas à avoir à refaire tout ce projet ultérieurement uniquement sur les femelles (et donc euthanasier les ratons mâles surnuméraires à ce moment).

Raffinement

Tout au long du projet les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites adaptés à chaque procédure expérimentale ont été établis avec une prise en charge de la douleur et de la souffrance potentielles adaptée à chaque procédure. Les animaux seront stabulés dans des cages enrichies grâce à une buchette en bois et un tunnel en carton.

Choix des espèces

Le modèle MAM est un modèle décrit chez le rat et nous développons ce projet dans le cadre d'une collaboration multicentrique qui a très largement décrit ce modèle en France. Pour poursuivre nos études en commun, nous devons utiliser le même modèle que nos collaborateurs. Le rat est un modèle idéal pour l'étude de la comorbidité troubles de la consommation d'alcool/schizophrénie en particulier en ce qui concerne certaines études comportementales comme l'auto-administration d'alcool qu'il est plus difficile d'observer chez les souris. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. La mise en place du modèle MAM se déroule au cours de la période embryonnaire et les animaux issus des cette première procédure seront utilisés jusqu'à l'âge adulte. Tous les petits seront soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle pré-exposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de streptozotocine dans les deux ventricules cérébraux sous anesthésie, puis passent une batterie de tests comportementaux évaluant activité motrice, anxiété et mémoire, avant que leur cerveau soit prélevé. Le projet compare deux souches de rats pour étudier la résilience cognitive face à la maladie d'Alzheimer. Le porteur affirme qu'aucun remplacement in vitro ou in silico n'est possible et que la mémoire ne peut s'évaluer que dans un organisme entier.

Objectifs

En vieillissant, il apparait que les patients atteints de la maladie d’Alzheimer et présentant des lésions cérébrales constituées de peptide amyloïde représentent une population très hétérogène. En effet, certains malades souffriront de troubles de la mémoire tandis que d’autres présenteront des performances mnésiques préservées, ce que l’on appelle la résilience cognitive. Une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans cette résilience cognitive permettrait d’identifier de nouvelles stratégies d’intérêt pour lutter contre la maladie d’Alzheimer. Notre projet vise donc à étudier, chez l’animal, les mécanismes cérébraux protecteurs impliqués dans la résilience cognitive face à la maladie d’Alzheimer. Notre objectif est de reproduire une situation pathologique mimant cette maladie chez deux souches de rats (Wistar et LOU/c/jall) afin d’étudier les mécanismes cérébraux protecteurs associés à la résilience cognitive. Le modèle de maladie d’Alzheimer choisi consiste en une injection, dans chaque ventricule cérébral, de streptozotocine chez le rat adulte. Ce modèle entraine une augmentation des concentrations en peptide bêta-amyloïde et en protéine tau phosphorylée dans l’hippocampe, deux marqueurs caractéristiques de la maladie d’Alzheimer. De plus, ce modèle présente une neurodégénérescence associée à l’apparition de déficits cognitifs. Ce modèle permettra d’étudier les mécanismes neuroprotecteurs impliqués dans la résilience cognitive. La maladie d’Alzheimer sera ainsi induite chez les rats de souches Wistar et LOU/c/jall (notées WIS et LOU), dont on suppose qu’elles vont présenter des niveaux de résilience cognitive faible et élevé, respectivement. Par rapport au rat WIS, le rat LOU a déjà été décrit comme présentant un vieillissement réussi et, d’après des études préliminaires, présente des performances de mémoire préservées suite à l’administration intra-cérébrale de peptide amyloïde, mimant de façon très imparfaite la maladie d’Alzheimer. Ces études nous ont amené à proposer le rat LOU comme modèle de résilience cognitive. Notre projet vise à confirmer cette hypothèse en reproduisant, par utilisation du modèle d’injection de streptozotocine, une situation neuronale pathologique plus représentative de la maladie d’Alzheimer. Après caractérisation de la résilience cognitive par une batterie de tests comportementaux, des analyses post-mortem seront réalisées pour identifier les substrats neuronaux protecteurs sous-jacents.

Bénéfices attendus

Grâce à l’utilisation de deux souches de rat dont on suppose qu’elles vont présenter des niveaux de résilience cognitive différents face à une situation mimant la maladie d’Alzheimer, cette étude permettra d’étudier les mécanismes et les processus cérébraux permettant de lutter, sur un plan cognitif, contre la maladie d’Alzheimer. Des études de corrélations entre les performances cognitives, les lésions histopathologiques et certains marqueurs de plasticité synaptique et cérébrale seront réalisées. L’identification des processus cérébraux protecteurs permettra de mettre en lumière de nouvelles stratégies à visée thérapeutique pour lutter contre le déclin cognitif associé à la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Tous les rats (n=192) subiront une injection intra-cérébro-ventriculaire bilatérale de streptozotocine ou de liquide céphalo-rachidien artificiel au cours d’une chirurgie cérébrale menée sous analgésie et anesthésie profonde. Les deux injections cérébrales (une par ventricule) seront réalisées au cours d’une seule opération chirurgicale d’une durée de 30 minutes par animal. L’analgésie sera induite par injection sous-cutanée de buprénorphine 30 min avant l’anesthésie (avant l’acte chirurgical), et renouvelée 6 heures après la procédure chirurgicale. Cette dernière injection réalisée sur animaux vigiles requiert une contention de l’animal et durera environ 1 minute par rat. L'anesthésie se fera par une induction à 5% d'isoflurane puis maintien à 2% d'isoflurane en mélange O2/N2O 30%/70%. Après une période de récupération d’un mois, les animaux seront exposés à une batterie de tests comportementaux visant à évaluer l’activité motrice, le comportement de type anxieux et les performances de mémoire des animaux en situation libre. Ces tests dureront 3 semaines. Certains rats recevront également une injection (n=32 rats) ou deux injections (une injection par jour pendant deux jours ; n=32 rats), par voie intrapéritonéale, d’un agent intercalant de l’ADN permettant de marquer les neurones en formation (étude de la prolifération et de la survie neuronale par injection de BrdU). Chaque injection intra-péritonéale, qui nécessite une contention de l’animal, durera environ une minute par rat.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux provoqués par l’induction de la maladie d’Alzheimer suite à l’administration intra-cérébro-ventriculaire de streptozotocine. D’après les données préexistantes issues de la littérature, une diminution des intéractions sociales et des performances de mémoire, ainsi qu’une élévation du comportement de type anxieux sont attendues, à l’image des symptômes cognitifs observés chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer. Nous nous attendons à observer ces effets qui représentent justement les altérations comportementales étudiées dans notre projet. D’après la littérature, ce protocole d’injection de streptozotocine ne modifie en revanche pas le poids corporel, ni l’activité motrice et exploratoire spontanée des rats traités.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure présentée dans ce projet, tous les animaux seront mis à mort (n=192). Les cerveaux de tous les animaux seront prélevés afin d’étudier les conséquences cérébrales de l’injection de streptozotocine. Ces prélèvements permettront de réaliser des études de corrélation entre le niveau de résilience cognitive des animaux (études comportementales) et leur atteinte cérébrale (études post-mortem).

Remplacement

Ce projet vise à favoriser le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de pathologies neurologiques telles que la maladie d’Alzheimer. Or la recherche de nouveaux médicaments nécessite (scientifiquement et règlementairement) l’utilisation d’espèces animales. De plus, l’évaluation des performances de mémoire ne peut être réalisée que sur un organisme capable d’effectuer une tâche cognitive. L’objectif final est de pouvoir tester de nouveaux candidat-médicaments dans le nouveau modèle animal développé. Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou "in silico" (modèles mathématiques, bio-informatique) ne peut être réalisé. De plus, l’objectif de notre projet est de caractériser différents niveaux de résilience cognitive suite à l’induction d’une situation mimant la maladie d’Alzheimer. Ceci sera réalisé chez le modèle LOU/c/Jall, connu pour représenter un modèle supposé de résilience cognitive élevée. L’existence d’un tel modèle de vieillissement réussi chez d’autres espèces telles que la souris n’a encore jamais été décrite, justifiant ainsi l’utilisation de cette souche de rat, et de la comparer au rat Wistar, dont le rat LOU/c/Jall dérive génétiquement.

Réduction

Un total de 192 rats est envisagé, soient 96 rats Wistar et 96 rats LOU/c/Jall. D’après l’expertise de l’équipe, des groupes de n=16 sont nécessaires pour assurer la puissance des analyses statistiques tout en raffinant notre nombre d’animaux utilisés. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables (Tests ANOVA à un ou deux facteur(s), selon les conditions d’expérimentation réalisées, suivis d’un test post-hoc tel que le test de Tukey ou de Bonferroni). De plus, les études comportementales et cérébrales seront réalisées chez les mêmes animaux pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, souffrance et angoisse infligées, les animaux seront maintenus dans des conditions d’hébergement optimales et stables : température, cycle de lumière, hygrométrie. Ils seront surveillés quotidiennement par un personnel qualifié et une attention particulière sera apportée à l’apparence physique externe des animaux, aux variations éventuelles de poids ainsi qu’aux changements de comportements. Les injections intra-cérébro-ventriculaires (streptozotocine) et intra-péritonéales (Buprénorphine, BrdU) seront réalisées exclusivement par un personnel qualifié. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Afin de réduire la douleur et la détresse de nos animaux, nous avons choisi un point limite précoce et compatible avec les objectifs scientifiques de notre recherche.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le rat (Rattus Norvegicus). Le rat est très utilisé en pharmacologie car il présente des caractéristiques biologiques en nombreux points comparables à l’Homme. Son comportement est bien décrit et il est possible d’en mesurer les modifications. Par ailleurs, le modèle de maladie d’Alzheimer que nous souhaitons reproduire est basé sur l’injection de streptozotocine, déjà décrit et mis au point dans la littérature chez le rat Wistar. Enfin, nous souhaitons évaluer l’influence du niveau de réserve cognitive sur la résilience suite à l’induction de la maladie d’Alzheimer. Ceci sera réalisé chez le rat LOU/c/Jall, connu pour présenter un vieillissement réussi et donc représentant un modèle supposé de résilience cognitive élevée. L’existence d’un tel modèle de vieillissement réussi chez d’autres espèces telles que la souris n’a encore jamais été décrite, justifiant ainsi l’utilisation de cette souche de rat, et de la comparer au rat Wistar, dont le rat LOU/c/Jall dérive génétiquement. Sur la base de la littérature, des rats adultes (2 mois d’âge) seront utilisés dans ce projet. C’est en effet à cet âge que le modèle d’injection à la streptozotocine est décrit et connu pour induire des déficits comportementaux chez le rat Wistar.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des examens d'imagerie sous anesthésie pouvant durer jusqu'à deux heures et demie, une partie recevant une injection abdominale déclenchant une inflammation ou une diète enrichie en gras. Le projet cherche à comprendre le rôle de l'inflammation cérébrale dans la prise alimentaire et l'obésité. Le porteur affirme s'être assuré de l'absence d'approche in vitro capable de reproduire cette interaction multicellulaire.

Objectifs

Ce projet vise à caractériser, par Imagerie par Résonance Magnétique, la réaction inflammatoire cérébrale survenant après un repas standard ou un repas enrichi en gras. Ces expériences s’inscrivent dans le cadre plus large d’un projet multidisciplinaire, où il a été suggéré par d’autres méthodes, que cette inflammation cérébrale était faible et presque indétectable après un repas standard mais exacerbée après un repas enrichi en gras. Cette inflammation apparaît en particulier dans les cellules immunitaires du cerveau, dans l’hypothalamus, structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. L’hypothèse est que cette réponse inflammatoire pourrait influencer le comportement alimentaire, en modifiant par exemple la sensation de satiété. Cependant, dans un contexte de suralimentation, d’apports trop riches en graisses, cette inflammation devient chronique et n’a plus d'effet bénéfique sur la prise alimentaire. Ce projet consistera à étudier et caractériser la réponse inflammatoire par Imagerie par Résonance Magnétique, dans le cerveau après un repas standard ou un repas enrichi en gras.

Bénéfices attendus

L'ensemble de l'étude vise à comprendre comment les cellules immunitaires du cerveau particient au contrôle de la prise de nourriture et à la perception de satiété, et, à long terme, comment ce méchanisme participe au développement de l'obésité.

Procédures

Les souris seront exposées à des tests d'imagerie médicale pour une durée maximale de 2H30, anesthésie incluse. Les souris peuvent subir un ou plusieurs tests d'imagerie. Une partie des animaux seront soumis à un traitement pharmacologique par une injection dans l'abdomen, d'une durée d'environ une minute.

Impact sur les animaux

Une partie des animaux vont subir une injection dans l'abdomen qui induira un début d'inflammation générale, mais dont les effets n'apparaitrons que lorsque les animaux seront sous anesthésie. Une partie des animaux aura une diète enrichie en gras, supposée induire une inflammation cérébrale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Nous nous sommes assurés de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre inflammation microgliale et alimentation. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.

Réduction

Plusieur mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilsés dans ce projet : - une etude préliminaire sur un nombre restreint d'animaux pour s'assurer d'un déroulement efficace des expériences et - l'utilisation de tests statistiques optimaux, pour avoir le nombre d'animaux minimal sans compromettre la validité de nos résultats.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont soumis à un cycle inversé d’alternance jour nuit 12h - 12h et ont accès à volonté à la nourriture et à l’eau. Le cycle inversé est utile pour notre étude car les animaux mangent la nuit et jeune le jour. Pour étudier la prise de nourriture, nous avons besoin que les animaux se nourrissent le jour. Une période d’acclimatation est respectée pendant laquelle ils sont habitués au cycle inversé de l'animalerie, à la préhension et à la présence de l’expérimentateur. Les souris sont stabulées dans un environnement enrichi selon le protocole défini par l'animalerie. Suivi des animaux : L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques).

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. En effet, le cerveau de souris permet une analyse neuroanatomique de haute résolution concernant les réseaux cellulaires activés en fonction de différents signaux métaboliques. Sa taille est compatible avec la microdissection d’aires cérébrales d’intérêt permettant des analyses biochimiques ou moléculaires. Cet animal nous permet également d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. La réalisation de différents tests fonctionnels permettant l’analyse des paramètres métaboliques est aussi possible chez cet animal. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les animaux seront adultes, pour travailler sur un cerveau mature et stable.