Recherche fondamentale

49 équidés, des juments, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés. Chaque jument subit des ponctions d'ovocytes par voie transvaginale échoguidée sous sédation et anesthésie, à raison de douze femelles par an. Le projet vise à comparer des milieux de culture commerciaux pour augmenter le taux d'embryons transférables et, selon le porteur, répondre à une demande croissante des éleveurs tout en optimisant les coûts de production. Il affirme être obligé d'utiliser cette espèce pour améliorer les rendements de la filière équine.

Objectifs

L'objectif de cette étude est donc de tester et comparer des milieux commerciaux prêts à l'emploi de développement embryonnaire in vitro. Le but étant d'augmenter le taux d'embryons transférables après la période de culture in vitro qui n'est actuellement pas plus de 30% dans les laboratoires utilisant des milieux "faits maison". Ainsi nous pourrons répondre à une demande de plus en plus importante de la part des éleveurs français tout en essayant d'optimiser un maximum les coûts de production.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont : - d'augmenter le pourcentage d'embryons transférables après la phase de développement embryonnaire in vitro - et ainsi diminuer les séances de ponction pour une jument mise à la reproduction avec cette technique

Procédures

12 femelles/an seront soumises à un prélèvement d'ovocytes par ponction transvaginale échoguidée entre les mois de mars et de juillet, période de cyclycité des juments. Les prélèvements se font sur animal debout analgésié et anesthésié. La durée de la procédure est de 30 à 45 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Très peu d'effets indésirables rapportés dans la littérature. Moins de 3% des juments présentent de la fièvre les jours suivant la ponction. La fièvre peut être traitée par un anti-inflammatoire non stéroidien. 0,8% des juments présente des saignements dans la cavité abdominale qui peuvent être traités par de l'acide tranexamique (action anti hémorragique). D'après une étude récente, il n'y a pas de complications après ponctions folliculaires chez la jument lorsque l'acte est réalisé dans des conditions d'hygiène irréprochable. L'étude a été menée sur 66 juments et les ponctions étaient réalisées par des vétérinaires non expérimentés dans la ponction folliculaire.

Devenir

Chaque jument prélevée sera ensuite placée dans un paddock en sable (à proximité de ses congénères) et surveillée jusqu'à l'absence d'effet visible de la sédation (locomotion normale, réactivité face au test de clignement à la menace). Elle pourra ensuite rejoindre le troupeau.

Remplacement

Notre objectif est de développer et améliorer une technique de production in vitro d'embryons équins par ICSI. Le développement de cette technique peut se faire en partie avec des ovocytes collectés sur des juments abattues dans des abattoirs commerciaux. Toutefois, les résultats obtenus avec des ovocytes collectés dans les abattoirs ou in vivo par ponction folliculaire sont parfois différents. Notre objectif étant de produire des embryons à partir de femelles en carrière sportive ou de femelles subfertiles, nous devons mettre au point et améliorer nos techniques sur des ovocytes collectés in vivo par ponction, sans abattage des animaux. Les embryons équins seront transférés dans des juments receveuses car il n’existe pas actuellement de système in vitro permettant le développement embryonnaire au-delà de 8 jours.

Réduction

Le lot est constitué sur le nombre minimal d'animaux nécessaires pour l'obtention d'embryons. Douze femelles seront utilisées par an pour les séances de ponctions. On peut espérer obtenir un embryon transférable, à la fin de la période de développement in vitro, par séance de ponction au début du projet. Avec l'expérience ce nombre devrait augmenter.

Raffinement

L'étude sera menée en minimisant le nombre de procédures par animal. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse, les animaux seront manipulés dans le calme, en présence du personnel qu'ils connaissent et dans leur environnement habituel. Les femelles soumises aux ponctions recevront un traitement à base de sédatifs, d'analgésiques, d'anti-inflammatoires et d'antibiotiques. Ce traitement sera précisé dans la description des procédures. Les animaux seront surveillés tout au long des procédures et après les procédures afin d'écarter tout problème avant leur remise en troupeau.

Choix des espèces

Notre objectif étant d'améliorer les rendements de production et développement in vitro d'embryons équins grâce à l'ICSI afin de répondre aux attentes de la filière équine française , nous sommes obligés d'utiliser cette espèce pour notre projet. Nous utiliserons des femelles adultes, pubères et cycliques pour collecter les ovocytes de bonne qualité, aptes à être fécondés. Nous utiliserons des femelles jeunes (moins de 10 ans), cycliques pour assumer le développement embryonnaire et la gestation jusqu'au stade 25 jours. A 25 jours l'activité cardiaque peut être visualisée lors d'un examen gynécologique. Cette activité est gage de bon développement embryonnaire et viabilité de l'embryon au départ.

192 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis replacés à l'issue sans être tués. Ils sont élevés en verger de pommiers pour tester l'association arboriculture-élevage, avec prélèvements de poil, prises de sang à l'oreille et observations de comportement. Le projet cherche à mesurer les bénéfices réciproques entre lapins et pommiers, le porteur évoquant l'amélioration du bien-être des animaux non-humains et le désherbage. Il affirme qu'il n'est pas possible de répondre aux ambitions du projet sans recourir aux animaux, la modélisation manquant de données à ce stade.

Objectifs

Il s'agit projet transdisciplinaire qui ambitionne de démontrer la faisabilité et la plus-value de l’association arboriculture-élevage « lapins en verger de pommiers » en agriculture biologique. L’hypothèse générale est que l’association entre arbres et animaux pourrait induire des bénéfices réciproques pour les différentes composantes du système (désherbage, fertilité des sols, bien-être des animaux, etc.), mais également un impact négatif de l'association lapins-pommiers : dégâts de lapin sur les pommiers, attraction de prédateurs ou maladies pour les lapins. L'objectif est de concevoir un système d'élevage de lapins au verger. Les animaux vont donc tester des conditions d'hébergement et avoir un suivi de leur comportement, bien-être, santé, croissance. Un groupe de lapins sera élevé en bâtiment pour avoir un élément de comparaison et mieux apprécier les effets de l'accès à l'extérieur.

Bénéfices attendus

Le projet doit permettre de déterminer les conditions d'hébergement au verger optimales pour les lapins et les pommiers : respect et amélioration du bien-être animal, expression des comportements, vie en groupe, valorisation et entretien de l'herbe, fertilisation des arbres, protection des lapins par le couvert du verger.

Procédures

Les animaux vont être exposés à la vie en extérieur avec une moindre maîtrise des conditions d'ambiance (aléats climatiques, température). Ils vont tester différents types de logements de façon à déterminer les hébergements optimaux. Ils vont subir un petit prélèvement de poil (carré de 5 cm de côté) au niveau du dos à l'aide d'une tondeuse pour doser le cortisol (hormone du stress). Ils subiront une prise de sang à la veine de l'oreille pour réaliser des analyses sanguines pour évaluer leur santé. Des observations de comportement seront réalisées : observations à distance ou réalisation de séquences vidéos.

Impact sur les animaux

Les prélèvements de poil seront sans incidence (pas de douleur, pas de stress) pour les animaux. Le prélèvement sanguin fait à la veine de l'oreille est peu douloureux et de faible volume (maximum 1 ml). Une compression de la veine sera réalisée pour arrêter le saignement et éviter la formation d'un petit hématome. La vie à l'extérieur peut exposer les lapins à des maladies et des aléats climatiques.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie car leur bien-être sera préservé tout au long du projet. Ils seront replacés après l'essai.

Remplacement

Le projet a pour ambition de tester la compatibilité et le caractère éventuellement cumulatif des vertus de deux élevages alternatifs : l’agriculture biologique et l’intégration culture-élevage. L’agroforesterie et en particulier l’association arboriculture-élevage est très prometteuse en termes de bénéfices réciproques, mais très peu étudiée en zone tempérée. L’association entre l'arboriculture fruitière et l'élevage de lapins est novatrice. Le projet porte donc sur l’évolution des systèmes de production d’aliment nécessaire à la transition écologique. Vu le caractère en rupture du projet et l’absence d’information scientifique sur ce sujet, il n’est pas possible de répondre aux ambitions du projet sans le recours aux animaux. La modélisation n’est pas possible à ce stade par manque de données permettant la construction des modèles.

Réduction

Le projet est structuré avec 3 phases de prototypage impliquant un petit nombre d'animaux (une vingtaine) de façon à optimiser le schéma expérimental de l'essai final et de raffiner les conditions de vie des lapins. Les tests statistiques varient en fonction de la variable étudiée. Pour l'essai final, nous utiliserons plusieurs lots d'animaux de façon à avoir suffisament d'unités statistiques pour réaliser les comparaisons entre les differentes conditions de vie (avec et sans arbres ou élevage en cage).

Raffinement

Le projet est structuré avec 3 phases de prototypage de façon à raffiner les conditions d'hébergement avant de déployer l'essai final. Seuls les animaux en parfaite santé seront engagés dans l'essai en extérieur. Les animaux plus faibles ou malades pendant les essais seront hébergés dans une infirmerie chauffée, le temps d'être soignés et guéris selon les problèmes relevés. Le sevrage sera réalisé entre à 6 semaines afin d'améliorer la santé digestive des animaux. Les fratries seront préservées pour éviter des stress de séparation. Lors du transport (5h de voyage), les animaux auront du foin à disposition pour ingérer des fibres longues et éviter un impact négatif du stress de transport sur le transit intestinal (ex: arrêt de transit). Chaque groupe sera placé dans l'hébergement extérieur après quelques heures de repos : abreuvement, nourissage, vérification que les animaux s'alimentent et éliminent. Chaque hébergement sera doté d'une épaisse litière en paille pour permettre aux animaux d'être confortables et isolés de la fraîcheur. L'accès à l'enclos sera libre, les animaux pouvant entrer et sortir à leur guise dans l'enclos de 25 m2. Des relevés de température seront réalisés quotidiennement pour vérifier que les animaux ont suffisament chaud. En cas d'accident climatique extrême (alerte rouge ou vague de froid intense), les animaux seront rentrés dans un bâtiment. La santé des lapereaux sera controlée quotidiennement. Chaque semaine, les animaux seront pesés et auront un examen clinique complet ainsi qu'un controle du niveau de parasitisme (examen des crottes au microscope). Les animaux seront protégés des prédateurs par une double clôture électrique qui entoure la zone de l'essai. Toutes les manipulations des animaux seront faites avec calme et bienveillance. Les animaux seront sociabilisés à l'homme. Lors de la prise de sang à l'oreille, une petite compression sera réalisée sur le lieu de la ponction pour arrêter le saignement et éviter la formation d'un hématome. Lors des traitements des arbres, les animaux seront déplacés sur une autre parcelle.

Choix des espèces

L’hypothèse générale est que l'accès à l'extérieur peut apporter une amélioration du bien-être des lapins et être utile pour la culture des arbres (désherbage, fertilisation). Pour tester cette hypothèse le choix du lapin présente des avantages techniques et éthiques. Herbivore de petite taille (entre 1 et 5 kg), le lapin est capable de tolérer des niveaux élevés de cuivre (utilisé en traitement phytosanitaire en arboriculture biologique) par rapport aux ovins tout en étant capable d’apporter la même aide au déherbage et à la fertilisation. Le projet concerne l'élevage des lapins du sevrage à l'âge de la commercialisation (soit 10-12 semaines) Nous utiliserons 192 lapereaux de 42 jours (sevrage) mâles et femelles élevés au champ.

3 640 souris, dont des femelles gestantes et leurs souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les nouveau-nés sont colonisés par une bactérie E. coli puis gavés quotidiennement pendant trois à six semaines avec une suspension bactérienne, pour tester des souches probiotiques contre des bactéries résistantes aux antibiotiques. Le porteur indique que le gavage provoque un stress mais qu'il n'entraîne qu'extrêmement rarement une réponse délétère, et prévoit un surplus de souriceaux dont seuls les mieux colonisés sont conservés. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune expérience in vitro ne peut reproduire la colonisation intestinale in vivo.

Objectifs

Escherichia coli est une bactérie qui colonise le tube digestif de l’Homme et des animaux à sang chaud, dès les premières heures qui suivent la naissance. Un sous-groupe d’E. coli est responsable de maladies telles que les méningites néonatales, les septicémies et les infections urinaires. Le traitement de ces infections passe par l’administration d’antibiotiques. Cependant, dans un contexte de multiplication de résistance bactérienne aux antibiotiques, la recherche d’autres voies de lutte contre ces agents infectieux est nécessaire. Parmi plusieurs stratégies, l’usages de bactéries issues d’un autre sous-groupes de E. coli possèdant des propriétés bénéfiques, notamment la capacité de combattre les souches potentiellement pathogènes, est décrit.

Bénéfices attendus

Le projet vise à amorcer le développement d'une stratégie de lutte contre les bactéries pathogènes multirésistantes aux antibiotiques trouvant leur réservoir dans le tube digestif des mammifères sans utiliser d'antibiotique.

Procédures

- Récolte de fèces sur animaux vigiles - Gavage oral qutodiein pendant 3 à 6 semaines avec 100 uL d'une suspension bactérienne (non visqueuse, non irritante) ou du PBS Administration antibiotique dans l'eau de boisson. Contamination par contact des nouveau-nés par la souche d'intérêt.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale, basée sur un gavage oral des souris avec une suspension bactérienne, implique une nuisance (stress) pour l'animal. Cependant, le gavage oral des souris par des E. coli commensales et pathogènes n’occasionne qu’extrêmement rarement une réponse délétère pour l’animal. Lors de l'expérimentation pilote, aucun individu n'a présenté de signe imputable à la colonisation bactérienne initiale ni aux gavages quotidiens. Le prélèvement de féces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur. Cependant un léger stress peut être provoqué par la préhension de l'animal avant le prélèvement, il sera limité par l'habituation et dure 1 à 2 minutes le temps du prélèvement.

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié par dislocation cervicale à l'issu de la procédure expérimentale.

Remplacement

Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet. Des expérimentations in vitro de diminution du nombre et de la croissance de notre bactérie cible ont été effectués au laboratoire en réponse à notre souche probiotique. Différentes doses et combinaisons (mutants, souches expérimentales) ont pu être testées permettant de sélectionner la souche probiotique la plus efficace et pertinente in vitro. Cependant, l'objectif du projet étant de démontrer l'efficacité de la souche probiotique Nissle à réduire le portage intestinal d'une souche multirésistance, les systèmes in vitro (tube à essai) ne nous permet pas d'appréhender cette question. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité de l'organisme et l'effet de l'administration quotidienne par gavage de la souche probiotique sur le portage de la souche multirésistante dans l'intestin.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires est calculé au plus juste en tenant compte des éléments suivants : - Une expérimentation pilote a permis de montrer que des résultats positifs pouvaient être observés chez certains animaux (n= 4 animaux par groupe dans cette expérience obtenus à partir de différentes femelles gestantes) pour deux souches probiotiques sélectionnées après 28 jours de gavage. Les résultats obtenus ont permis de sélectionner une souche probiotique pertinente à tester sur un plus grand nombre d'animaux pour conclure sur son efficacité. - Notre expérience montre que les femelles Swiss font des portées comprenant en moyenne 12 souriceaux. Afin de garantir 10 mâles et 10 femelles colonisés par groupe, 7 femelles gestantes sont nécessaires, avec un attendu de 84 souriceaux. Le surplus de souriceaux permettra de ne conserver que les animaux dont la colonisation est suffisament élevé (au moins 10^8 log(CFU/g de fèces)) et stable entre les 2 points initiaux de mesure, ainsi que de compenser un sexe-ratio différent de 1 (données imprévisibles). L'expérimentation pilote a permis de montrer que pour constituer notre effectif final de 64 souris, 7 mères gestantes étaient nécessaires. 91 individus seront nécessaires par expérimentation (7 femelles gestantes + 84 souriceaux). Nous serons amenés à reproduire ce protocole pour valider nos données (répétition) et utiliser différents probioiques (nombre estimé à 6) contre différents variants de E. coli pathogènes (nombre estimé à 10). Ainsi, nous pensons sur la période de 5 ans utiliser 3640 souris (dont 280 femelles gestantes). - Les résultats obtenus sont comparés avec le logiciel Prism GraphPad 8, en utiliant le test du Chi-2 (comapraison des moyennes de charges bactériennes dans les fèces en CFU/g de fèces) ou le test exact de Fischer (comparaison des proportions de souris toujours excrétrices de bactéries pathogènse par rapport au nombre total de souris).

Raffinement

Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives. Le prélèvement de fèces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur mais une habituation à la contention par l'expérimentateur sera réalisée avant les prélèvements. La contention des animaux lors des gavages oraux et des récoltes de selles s'effectue par du personnel qualifié et expérimenté dans la manipulation des souris. Les gavages sont réalisés avec des sondes souples. La solution de gavage est de volume limité (100 uL maximum par administration). Celle-ci n'est ni visqueuse, ni irritante. Compte-tenu de la fréquence des gavages, ceux-ci sont réalisés uniquement par du personnel qualifié, en veillant à ne pas placer la sonde trop profondément dans l'oesophage, et l'administration se fait lentement. Durant cette phase, les souris sont évaluées individuellement à l'aide de critères cliniques et pesées 2 fois par semaine, opérations effectuées par des personnels formés et habitués à la manipulation de souris notamment dans le cadre de ce modèle expérimental. Nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et mettrons en place une grille d'évaluation. La grille d'évaluation comprendra les points suivants: - qualité du poil (lisse/hérissé; propre/sale), - perte de poids éventuelle (supérieure ou pas à 15%), prostration: l'animal sera mis sur la main de l'expérimentateur (mesure de la vivacité: curieux (redresse la tête, sens en alerte) / prostré (mise en boule, recroquevillé), mesure de la mobilité: mouvement exploratoire se déplaçant sur la main / pas de mouvement), qualité et aspect des selles (normales, molles, présence de diarrhées ou sang). Si un point limite est atteint alors la procédure s'arrêtera et l'animal sera euthanasié. Les animaux seront hébergés en présence d'un enrichissement (même quantité de coton dans toutes les cages) en présence d'une petite maison en plastique rouge transparente pour leur permettre de se faire un nid tout en nous permettant de les observer sans les déranger.

Choix des espèces

La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude de l’établissement de la colonisation intestinale. Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet. L'administration de bactéries à effet probiotique s'effectue par gavage quotidien. Une administration par voie orale d'une culture fraîche à cette fréquence offre toutes les chances d'une efficacité rapide. L'expérimentation pilote a permis de montrer que des résultats positifs pouvaient être observés chez certains gavage. Femelles reproductrices et souriceaux agés de moins de 2 jours pour la colonisation via l'environnement de la souche pathogène (absence de contact). Souriceaux âgés de J21 à J70 pour le suivi de la colonisation dans les selles et gavages avec le probiotique

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus cérébraux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces souriceaux reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen à partir du 14e jour après la naissance et pendant quinze jours, avant une anesthésie sans réveil, pour étudier un transporteur dans un modèle de maladie d'Alzheimer. Le porteur indique qu'une souffrance liée aux injections répétées peut apparaître et que la mère peut perturber le nid ou refuser de nourrir ses petits. Sur le remplacement, il affirme que le modèle ne peut pas être remplacé par des cultures cellulaires et justifie le recours à des souris transgéniques développant des plaques amyloïdes.

Objectifs

L'objectif de notre projet de recherche est de corriger les perturbations de la neurotransmission dans l'hippocampe d'une souris modèle de la maladie d'Alzheimer

Bénéfices attendus

Il n’existe à l’heure actuelle, aucun traitement capable de guérir la maladie d’Alzheimer ou de ralentir son évolution dans le cerveau. Toutefois quatre médicaments sont actuellement sur le marché. Ces traitements ont pour but de traiter les problèmes d'apprentissage et de mémorisation de la personne malade. Ils n’empêchent cependant pas la progression de la maladie et l’efficacité varie largement d’un patient à l’autre. De plus, ils présentent de nombreux effets indésirables. Il semble donc important non seulement de traiter les symptômes mais également et surtout, d’empêcher l’initiation et la progression de la maladie. Notre objectif de cibler la maladie à ses débuts devrait offrir de nouvelles perspectives de traitement.

Procédures

Les animaux seront injectés quotidiennement dans l'abdomen à partir du 14ème jour post-natal et ceci pendant 15 jours. Les animaux subiront une anesthésie sans réveil pour effectuer des prélèvements.

Impact sur les animaux

Une souffrance liée à la répétition des injections peut être mise en évidence. Nous pourrions également observer une perturbation du nid et un éventuel refus de la mère de nourrir ses petits.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux afin de mieux comprendre les mécanismes du traitement concerné dans ce projet

Remplacement

Ce modèle ne peut pas être remplacé par des modèles de culture cellulaire. Ce choix du modèle souris est également justifié par le fait que nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer. Ces souris transgéniques développent des plaques amyloïdes au niveau du cerveau et manifestent les mêmes troubles touchant la mémoire et la cognition que l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum tout en garantissant la validité statistique des résultats obtenus.

Raffinement

Nous serons particulièrement attentifs au bien-être animal et nous surveillerons les animaux quotidiennement. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies et dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'annexe II du 01 février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Pour limiter un éventuel refus de la mère de les nourrir, nous mettrons dans le nid le matériel utilisé pour les injections pour habituer la mère à leur odeur. Les petits abandonnés seront replacés avec une autre mère ayant une portée du même âge. Les injections seront faites avec des aiguilles très fines. Ce geste n'induit pas de saignement et correspond à une douleur légère (introduction d'une aiguille). Les seringues et aiguilles sont changées pour chaque souris. Nous surveillerons et pèserons les animaux avant chaque injection.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau anatomique et fonctionnel des circuits de l'hippocampe. De plus, l'existence de modèles de souris exprimant des mutations humaines de deux protéines permet de mimer la pathologie humaine et de les étudier dès l'âge de 1 mois à un stade précoce, sans symptômes de la maladie.