Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Fructose-sensing 3: Rôle des microglies dans la sensibilité cérébrale au fructose
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'au modéré. Elles reçoivent une alimentation enrichie en fructose, des prélèvements de sang à la queue et une injection de LPS qui déclenche fièvre, perte d'appétit et perte de poids, avant d'être tuées pour analyser leur cerveau. Le porteur décrit des tests comportementaux censés mesurer les émotions sans préciser lesquels, et affirme que l'étude des comportements émotionnels ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les retombées annoncées, mieux cerner les risques d'une consommation excessive de fructose, restent renvoyées à un questionnement de sécurité nutritionnelle.
Objectifs
La consommation de fructose, qui a fortement augmenté ces dernières années notamment par l’utilisation de sirop riche en fructose dans les produits transformés, est parallèle à celle du nombre de patients atteints d’obésité. Ces données suggèrent un rôle de ce sucre dans le développement des désordres métaboliques et ont conduit l’Anses à émettre des recommandations pour développer des recherches plus approfondies sur « le lien entre consommation de sucres et pathologies associées ». Une question qui n’a jamais été adressée directement est la capacité du cerveau à détecter le fructose. Cette question est justifiée par le nombre croissant d’études montrant que la consommation de fructose peut, chez l’Homme et/ou dans des modèles animaux, moduler le comportement alimentaire, l’état émotionnel ou la mémoire. Néanmoins, aucune étude n’a testé l’effet direct du fructose sur l’activité des cellules microgliales du cerveau qui seraient les seules cellules cérébrales capables d'utiliser le fructose. Ainsi, le but de ce projet est de déterminer si le fructose joue le rôle de molécule signal au niveau cérébral, module l’activité des microglies et participe au contrôle des émotions. Pour cela, nous déterminerons par immunohistochimie si l'administration orale de fructose active des régions cérébrales et lesquelles; et si l'alimentation de souris avec du fructose (dans l'eau de boisson ou avec des croquettes enrichie en fructose) favorise une inflammation cérébrale et altère les émotions grâce à l'utilisation de tests comportementaux spécifiques. L'ensemble des expériences sera réalisé sur des souris sauvages contrôles ou déficientes pour le transporteur de fructose GLUT5 spécifiquement dans les microglies.
Bénéfices attendus
Notre projet est en parfaite adéquation avec les attentes des pouvoirs publics et de la communauté scientifique. Dans son dernier rapport de l’Anses de Décembre 2016, la nature des sucres ingérés, notamment le fructose, fait l’objet d’une attention particulière. De nombreuses observations ont conduit l’Anses à émettre des recommandations pour développer des projets afin, d’une part, « d’entreprendre de nouveaux travaux de recherche permettant d’éclairer la nature précise du lien entre consommation de sucres et pathologies associées » et, d’autre part, « d’explorer de nouvelles pistes dans le champ de la psychologie cognitive ou la neurophysiologie ». En identifiant des fonctions cérébrales qui peuvent être affectées par l’augmentation de la concentration cérébrale en fructose, ce projet permettra d’étayer le questionnement de sécurité nutritionnelle lié à une consommation excessive de ce sucre.lopper des projets afin d’une part, « d’entreprendre de nouveaux travaux de recherche permettant d’éclairer la nature précise du lien entre consommation de sucres et pathologies associées » et d’autre part, « d’explorer de nouvelles pistes dans le champ de la psychologie cognitive ou la neurophysiologie ». En identifiant des fonctions cérébrales qui peuvent être affectées par l’augmentation de la concentration cérébrale en fructose, ce projet permettra d’étayer le questionnement de sécurité nutritionnelle lié à une consommation excessive de ce sucre.
Procédures
Régimes alimentaires enrichis en fructose. Tests comportementaux (quelques minutes) et prélèvements de sang en vue de la mesure de la glycémie et de l'insulinémie. Un test comportemental sera réalisé en condition d'inflammation.
Impact sur les animaux
Le fructose est un sucre consommé par l'Homme. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Certaines nuisances ou effets indésirables sont néanmoins attendus comme le traitement au LPS qui induit un phénotype de maladie transitoire (fièvre, perte d'appétit et perte de poids). Les prélèvements de sang à la queue pourront également engendrer une légère douleur aux animaux. Cette douleur sera prise en charge par l'utilisation d'un anesthésique local (lidocaïne).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L'impact d'une alimentation déséquilibrée et l'étude de comportements émotionnels ne peuvent être étudiés que des animaux vivants et vigiles rendant impossible le Remplacement par l'utilisation de modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant la différence entre plusieurs groupes.
Raffinement
Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l'inconfort des animaux (manipulation régulière et hébergement avec enrichissement). Des experimentations seront réalisées sous anesthésie et avec l'utilisation d'analgésiques. Des points limites précis et précoces ainsi qu'une méthode d'évaluation pour la prise en charge des animaux ont été établis.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus étudiée avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisé. L’utilisation de tests comportementaux permettant d’apprécier les troubles emotionnels ont principalement été développés chez la souris au laboratoire. Des animaux adultes de 7-10 semaines seront utilisés au début des traitements. Cet âge est est le plus courament utilisé dans la littérature.
Comparaison des capacités de régénération musculaire chez la truite
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
120 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson subit sous anesthésie une micro-lésion musculaire à l'aiguille, avec ou sans injection de cellules souches, avant d'être tué à l'un des temps de prélèvement pour analyser le muscle. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'infection ni de mortalité et décrit une lésion sans douleur ni gêne pour la nage. Il vise à orienter les "pratiques zootechniques" de la filière truite, pour laquelle il juge le recours à l'animal vivant "incontournable".
Objectifs
La croissance musculaire nécessite l'activation et la différenciation des cellules souches musculaires aussi appelées cellules satellites. Chez les poissons, les cellules satellites maintiennent des capacités de prolifération et d'autorenouvellement qui permettent la formation continues de fibres musculaires pendant la croissance exponentielle du muscle. Néanmoins, la croissance musculaire hyperplasique diminue avec l'âge et les mécanismes cellulaires sous-jacents ne sont pas encore connus. Nous avons mis en place un protocole d'extraction de cellules souches de muscle de truite et de transplantation de cellules souches musculaires. Nos premiers résultats montrent que les capacités des cellules souches et de leur niche diminuent dès le poids de 500g. Notre objectif est de déterminer si les capacités de régénération sont également très inférieurs chez les poissons d'un poids de 1kg comparé à un muscle de truite jeune (10g).
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de montrer que les capacités de régénération musculaire et donc aussi de formation de nouvelles fibres (hyperplasie) sont fortement altérées chez les poissons de 1kg en comparaison d'un poisson de 10g. Cette connaissance devrait permettre d'orienter les pratiques zootechniques afin de maitriser plus finement la croissance musculaire et les caractéristiques du muscle de truite.
Procédures
Les animaux vont subir sous anesthésie une micro-lésion intramusculaire (blessure réalisée avec une aiguille ) avec (ou pas) injection d’un petit volume de cellules. Pour chaque prélèvement à J3, J7, J15, J30 et J60 les poissons sont euthanasiés selon la méthode §3.3.3.
Impact sur les animaux
Par le passé, nous avons déjà réalisé des expériences de transplantation et de lésion musculaire, et nous n'avons jamais observé d'infection (cutanée, interne) ou de mortalité. La zone lésée étant très petite (piqure d'aiguille), cela ne gène absolument pas la nage des poissons. Par ailleurs, l'injection de cellules souches musculaires dans le muscle ne provoque aucune douleur spécifique ni de nécrose ou infection.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasiés puisque des prélèvements de muscle sont indispensables au projet.
Remplacement
L'objectif scientifique du projet étant de déterminer si les capacités de régénération musculaire sont altérées avec l'âge chez la truite, le recours à des animaux vivants est incontournable.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous allons utilisés les mêmes animaux pour la régénération et la transplantation. En effet, un coté du poisson sera utilisé pour la transplantation et l'autre coté pour la régénération. Le nombre de point de la cinétique (6) est réduit tout en permettant une bonne caractérisation des premières étapes de régénération ainsi que la régénération complète. Ainsi nous utiliserons 60 animaux de 10g et 60 animaux d'1kg ce qui permettra de prélever que 10 animaux par point de cinétique.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, nourriture, enrichissement). Pendant la procédure, les animaux seront anesthésiés, leur manipulation sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Au cours de l'expérimentation nous réaliserons une évaluation quantitative de points limites incluant la nage, la prise alimentaire, la prostration, l'état sanitaire qui permettront d'arréter l'expérimentation si nécessaire.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. L’espèce est grégaire et supporte des densités d’élevage importantes. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). De plus, nous disposons d'une lignée de truites transgéniques mlc2-GFP qui expriment la GFP dans les cellules souches musculaires. Nous allons utiliser des poissons receveurs de 10g et 1kg. Une expérience préliminaire, nous a montré que les capacités myogéniques des cellules souches et de la niche diminuait rapidement dès 100g et atteignait un minimum autour de 500g. Ainsi pour maximiser nos chances d'observer une différence de capacité de régénération, nous allons utiliser des animaux de 10g (~3 mois) et de 1kg (~1,5 an).
Impact de la présence d’une mère sur le développement social et réactionnel de veaux laitiers
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
26 velles laitières vont être utilisées puis rendues à leur élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Elles passent deux tests comportementaux impliquant une manipulation et un isolement bref, l'un de dix minutes, l'autre de quinze. Le projet compare le développement social de veaux élevés partiellement sous leur mère à celui de veaux séparés à la naissance. Le porteur inscrit l'étude dans une visée d'amélioration du "bien-être des animaux non-humains", tout en notant que le test de rencontre sociale pourrait provoquer des agressions et des blessures légères.
Objectifs
Les génisses laitières élevées pour le renouvellement du troupeau sont majoritairement séparées de leur mère à la naissance pour être élevées en allaitement artificiel. Cette pratique est de plus en plus questionnée d’un point de vue bien-être animal ou travail pour l’éleveur. Des pratiques diverses se mettent en place afin de pouvoir laisser la velle sous la mère tout en continuant, pour l'éleveur, à produire suffisamment de lait pour vivre. Une de ces pratiques vise à laisser la velle avec sa mère de la naissance à 3 mois puis de faire une séparation progressive sous forme d'un sevrage alimentaire d'une semaine (par pose de palette anti tétée) puis d'une séparation partielle en mettant les velles dans une parcelle adjacente à celle de leur mère. Notre projet vise à déterminer quels apports cette conduite occasionne dans la relation entre la velle et sa mère et dans leur bien-être respectif. Il est rapporté empiriquement par les éleveurs que les génisses élevées sous la mère peuvent être plus difficiles à manipuler, plus stressées dans des situations nouvelles, comme la salle de traite, que des veaux élevés classiquement en allaitement artificiel. Ce projet a pour but de (1) d'étudier l'évolution du lien entre les velles et leur mère jusqu'au sevrage ; et (2) déterminer quelle influence la présence d'une mère a eu sur le développement des compétences sociales et réactionnelles des velles.
Bénéfices attendus
Nous attendons une meilleure connaissance de l’impact de ce mode d’élevage (présence partielle de la mère avec son veau) sur le développement comportemental de ces veaux, notamment si cela impacte de façon positive ou non leur capacité sociale et réactionnelle ce qui permettrait une meilleure adaptation de ces animaux à leur future condition de vie (réallotement, situations nouvelles et potentiellement anxiogènes comme la salle de traite, les transports etc.) et donc d’améliorer leur bien-être.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 tests comportementaux impliquant une manipulation et un isolement temporaire de durée brève (10 min pour l'un et 15 min pour l'autre).
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux réalisés sont de très courte durée : lors du test de rencontre social, des agressions pourraient se produire entre individus pouvant potentiellement entrainer des blessures légères et du stress, une surveillance des rencontres sera mise en place. Le test de prise de risque implique une part d’isolement des individus qui peuvent se retrouver stresser, cependant cet isolement ne serait pas plus de 10 min et n’aurait donc pas de conséquence à long termes attendues.
Devenir
Les animaux ne subissant aucun traitement lourd ou sévère avec des conséquences majeures attendues sur le long terme, ils peuvent retourner dans leur système d’élevage classique sans séquelle.
Remplacement
Le projet porte sur une étude visant à mesurer l’évolution du comportement des animaux. Les mesures se feront via, principalement, des méthodes d’observation comportementale. Seul l'animal dans son intégralité peut être utilisé pour répondre à ces objectifs.
Réduction
Cette étude prévoit une comparaison entre traitement, ainsi chaque individu sera testé de façon individuelle obtenir des données individuelles pour les analyses statistiques. Or, en comportement la variabilité individuelle est un facteur omniprésent et très influent. Pour en tenir compte, dans ce genre d’étude, il est nécessaire d’avoir un nombre d’animaux minimum de 10/traitement afin que les statistiques puissent porter. Nous montons nos effectifs à 13 (si cela s’avère possible au vu des naissances) afin de palier à tout incident pouvant réduire le nombre de nos animaux à un niveau non exploitable.
Raffinement
Le projet sera mené par du personnel compétent et l’ensemble des animaux sera élevé selon leur mode d’élevage habituel au pâturage avant sevrage puis en bâtiment durant l’hiver sur paille et groupe, puis à nouveau au pâturage. Le pâturage se fait dans des prairies qui disposent d'espaces ombragés pour le confort des animaux durant les périodes de forte chaleur. Les tests de choix, et à l’Homme qui seront réalisés en bâtiment, se feront dans une arène à laquelle les animaux auront été habitués pour limiter leur angoisse. Les veaux y seront menés via un personnel compétent et formé. La durée des tests est également réduite au minimum nécessaire afin de limiter la durée d’isolement total ou partiel des individus. La surveillance des animaux sera journalière et elle aussi réalisée par un personnel compétent. La présence de signes cliniques sera prise en compte dans la décision de l’application des critères d’arrêt mis en place pour l’expérimentation. Il en va de même lors des tests : une surveillance minutieuse des animaux sera réalisée et permettra l’arrêt à tout instant du test si la situation le nécessite. En cas de risque de blessure lors d’un test, ce dernier sera immédiatement arrêté et l’animal recevra sans attendre les premiers soins si blessure il y a. Suivant la gravité établie de la blessure, l’assistance d’un vétérinaire pourra être sollicitée.
Choix des espèces
L'objectif du projet est de déterminer l’impact sur le développement comportemental de jeunes bovins d’une pratique agricole en élevage laitier visant à élever les génisses de renouvellement sous leur mère dans une optique d'amélioration du bien-être. Un travail sur les jeunes génisses laitières s'avère donc pertinent, par définition en tant qu’espèce-cible et espèce-modèle. Nous utiliserons des veaux femelles (velles) de 5 mois (environ) (test sur jeunes sevrés) ce qui nous permettra de répondre à notre objectif de déterminer l’impact de la présence de la mère sur le développement post-sevrage des génisses. Cela nous évite d’être trop proche du sevrage ayant lieu entre 3 et 4 mois mais permet également d’être à un âge où les animaux sont confrontés à de premiers gros changement d’allotement et de pratiques.
Activation de l’axe corticotrope par injection d’un agent inflammatoire dans le système nerveux central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection intracérébrale d'un agent inflammatoire, puis des prélèvements sanguins et musculaires et une mesure des propriétés contractiles du muscle, dans un modèle de cachexie associée au cancer. Le porteur annonce peu d'effets attendus hormis une légère perte de poids musculaire, tout en classant l'ensemble en gravité sévère. Il affirme qu'un système in vitro ne reproduirait pas la complexité de ce processus multi-tissus et que seul un modèle murin le permet.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peuvent être observées dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. La cachexie associée au cancer s'accompagne d'une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien), d'une augmentation de la concentration en glucocorticoïdes dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez la souris.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope.
Procédures
Pour déterminer le temps de prélèvement tissulaire optimal et des concentrations d'IL1ß et d'activine A optimales, des animaux seront soumis aux interventions suivantes: injection intra-cérébrale centrale, prélèvements sanguins, prélèvements des tissus musculaires (durée totale d'environ 60 minutes: 45 min pour l'injection de l'agent inflammatoire dans le système nerveux central et 15 min pour les prélèvements tissulaires). Pour déterminer les effets de l'inflammation centrale sur la force musculaire et la réponse transcriptionnelle musculaire, des animaux seront soumis aux interventions suivantes: injection intra-cérébrale centrale, mesure des propriétés contractiles du muscle tibialis antérieur, prélèvements des tissus musculaires (durée totale d'environ 90 minutes: 45 min pour l'injection de l'agent inflammatoire dans le système nerveux central, 30 min pour la mesure des propriétés contractiles du muscles et 15 min pour les prélèvements tissulaires).
Impact sur les animaux
La gestion du stress est un point essentiel à la bonne réalisation de cette expérimentation puisque celui-ci active directement l'axe corticotrope et donc la production de glucocorticoïdes. Même si aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu avant la procédure d'injection de l'agent inflammatoire dans la région centrale d'intérêt, nous mettrons tout en place afin de réduire au maximum le stress éventuel que pourraient subir les animaux. Pour cela, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids, apparition de signes évocateurs de souffrance) à compter de la date de réception dans l'animalerie (12 semaines). La mesure de force et les prélèvements tissulaires seront réalisés entre 12H00 et 72H00 après l'injection centrale de l'agent inflammatoire. Nous serons donc particulièrement vigilants pendant cette période à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 12H00 après l'injection, puis toutes les 12H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort de façon éthique au terme de chaque procédure.
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base d'un critère d'évaluation principal (concentration de corticostérone circulante). Cette stratégie statistique nous permet de déterminer au mieux le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de nos analyses. En fonction des plans expérimentaux, les effets biologiques seront déterminés par comparaison de 2 moyennes ou par comparaisons de plusieurs moyennes entre elles.
Raffinement
Le bien être animal est une préocupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (dômes et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Toutefois et afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids, apparition de signes évocateurs de souffrance) dès leur réception à l'âge de 12 semaines. Les prélèvements tissulaires seront réalisés entre 12H00 et 72H00 après l'injection centrale de l'agent inflammatoire. Même si aucune complication particulière n'est attendue, l'agent inflammatoire pourra être à l'origine d'une légère perte de poids et de masse musculaire (2 à 5%). Nous serons donc particulièrement vigilants pendant cette période à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 12H00 post-injection, puis toutes les 12H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
La quasi-totalité des données dans le domaine de la cachexie associée au cancer a été obtenue chez la souris. Par ailleurs, l'ensemble des techniques nécessaires à la réalisation de ce projet a été développé chez la souris. En travaillant chez la souris, nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des données publiées dans le domaine et nous éviterons toute étape de mise au point préalable qu'aurait nécéssité l'utilisation d'un autre modèle animal. Les souris seront utilisés à l'âge de 15 semaines. Cela correspond à un stade de cachexie dans le modèle murin Apc. La mutation du gène Apc (adenomatous polyposis coli) provoque chez la souris une polypose rectocolique qui est associée à l'activation de l'axe corticotrope et au développement de la cachexie.
Manipulation transgénique des taux d’acides gras polyinsaturés dans les cellules du système nerveux central : effets spécifiques sur l’inflammation microgliale pendant le développement et conséquences à l’âge adulte
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des souriceaux reçoivent des injections de tamoxifène et un régime carencé en oméga 3 pendant leur développement, avant d'être tués par exsanguination et perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur indique que l'injection de tamoxifène à un jour de vie peut ralentir le développement des petits et diminuer leur poids. Il décrit l'approche transgénique comme la "seule" disponible pour manipuler sélectivement les taux d'oméga et affirme qu'aucune alternative n'a été identifiée.
Objectifs
Le projet porte sur l’effet d’une carence en Oméga 3 spécifiquement dans les cellules microgliales (cellules immunitaires du cerveau) ou neuronales durant la période périnatale sur la mise en place du cerveau et ses fonctions, en observant la régulation et les fonctions microgliales et neuronales, ainsi que le développement cérébral et le comportement associé. Nos résultats antérieurs ont montré que la nutrition lipidique, et plus spécifiquement une carence nutritionnelle en Oméga 3, module l'activité phagocytaire de la microglie. Nos données suggèrent que les effets des oméga 3 sur la microglie passeraient notamment par les dérivés lipidiques issues des précurseurs présents dans les régimes carencés ou enrichis en Oméga 3. Cependant, la manipulation des oméga présents dans l’alimentation ne nous permet pas de discriminer entre les effets neuronaux et microgliaux de ces changements.
Bénéfices attendus
Nos données suggèrent que les effets des Oméga 3 sur la microglie passeraient notamment par les dérivés lipidiques issues des précurseurs présent dans les régimes carencés ou enrichis en oméga3. Cependant, la manipulation des oméga présents dans l’alimentation ne nous permet pas de discriminer entre les effets neuronaux, microgliaux de ces changements. Le croisement des souris Cre avec la souris flox-Fat1 conduira à l'expression de l'enzyme Fat1 dans des types cellulaires spécifiques, ce qui permettra de manipuler les taux d'oméga sélectivement dans ces populations. Cette approche transgénique est à notre connaissance la seule actuellement disponible pour de telles manipulations. A la fin de l’expérience les animaux seront mis à mort et les cerveaux prélevés pour fournir des mesures par des techniques de biologie moléculaire, de protéomique, et de marquages morphologiques qui permettront de mesurer les effets de la manipulation des oméga sur la physiologie microgliale et l’architecture neuronale.
Procédures
Afin d'activer la Cx3cr1creER chez la descendance, ils subiront 1 injection en sous-cutané de tamoxifène à P1, ou 2 injections en intra-péritonéal de tamoxifène à P21 et P23. L'injection ne dure que de 3 à 5 secondes. A la fin des expériences, les animaux seront mis à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque, préalablement injectés avec une solution analgésique puis une solution anesthésique. Les injections d'analgésique et anesthésique ne dure que de 3 à 5 secondes ; la perfusion intracardiaque dure de 30 secondes à 1 minute.
Impact sur les animaux
L’injection de tamoxifen à P1 peut induire un ralentissement du développement de la descendance avec pour conséquence un poids diminué par rapport aux animaux non traités au tamoxifen, poids qui est retrouvé à l'âge adulte. Le temps d’injecter toute la portée, les petits sont séparés de leur mère pendant un cours moment et sont manipulés par l’Homme, ce qui peut créer un léger stress : un protocole est mis en place pour diminuer au maximum ce stress. L’injection de tamoxifen à l’âge adulte n’induit pas d’effets indésirables. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en omega-3 sur la physiologie neuronale et microgliale chez la souris pendant le développement. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence en AGPI n-3 pendant le développement sur la mise en place du système nerveux central. Pour ce faire, nous utilisons des modèles souris. Une partie de nos hypothèses ont été formulées sur la base de données obtenues in vitro. Cependant dans la cadre d’une étude faisant le lien entre la nutrition et le cerveau, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Enfin, les modèles génétiques que nous voulons utilisés pour nos études ont été construits chez la souris. Les animaux reçoivent un régime alimentaire (carencé ou équilibré en omega 3) durant toute la durée de leur développement périnatal (gestation et allaitement). Nous nous intéressons à l'effet de la présence du transgène Fat1 sur cette altération nutritionnelle durant le développement sur l'inflammation microgliale et la mise en place de l'architecture neuronale à la fin du développement post natal à 3 semaines (au sevrage) mais également l'impact de cette carence durant la période périnatale et la période de l'adolescence sur le jeune adulte (10 semaines).
Altération du système de récompense du cerveau dans la dépression induite par la douleur chronique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
106 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Elles subissent une chirurgie de la patte pour induire une douleur neuropathique chronique et une chirurgie stéréotaxique avec injection de virus et implantation de fibres optiques, puis des tests de von Frey une à deux fois par semaine. Le porteur écrit que cette douleur "ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude", reliant douleur chronique et dépression. Il affirme que l'observation comportementale n'est possible que sur l'animal vivant et vigile.
Objectifs
La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur telle que l’épisode dépressif majeur. En effet, environ 50% des patients présentent cette comorbidité (c’est-à-dire la présence à la fois de symptômes douloureux et anxio-dépressif). Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de cette comorbidité restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris des données de la littérature suggèrent que la dépression et la douleur altèrent le système de récompense du cerveau, mais les informations concernant la comorbidité douleur dépression manque. Notre projet permettra donc de mieux comprendre les mécanismes mis en place dans le système de récompense du cerveau lors de de l’expression de la co-morbidité douleur-dépression.
Bénéfices attendus
À l’issue de ce projet, nous serons en mesure de détailler pour la première fois des adaptations d’activité cérébrale liées au développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Ils subiront une chirurgie (d’environs 15min par animal) au niveau de la patte droite de l'animal et une chirurgie stéréotaxique avec injection de virus et implantation de fibres optiques (d’environs 1H30 par animal). Ces animaux subiront un test de Von Frey (15 à 20min/test) 1 à 2 fois par semaine après la chirurgie d’induction de la douleur chronique.
Impact sur les animaux
Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies stéréotaxique (injection de virus et implantation de canule) nécessite une semaine de récupération et d'habituation du dispositif d’enregistrement / stimulation (les canules). En cas de bagarre entre les animaux une isolation sera réaliser afin de préserver l’intégrité de l’animal et de son dispositif d’enregistrements / stimulation.
Devenir
tout les animaux seront mis à mort à l’issue du projet pour prélèvements de tissus
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse anatomo-fonctionnelle du développement des troubles anxio-dépressifs dnas un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique interindividuelle et d'une éventuelle mauvaise positions des injections virales, le nombre total d’animaux nécessaire n’excédera pas 48 souris mâles et 48 souris femelles. Un calcul statistique « power analysis » a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique (multiple ANOVA). Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations anatomiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 2 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Ils pourront être isolés si des lésions du a des bagarres apparaissent. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit inversé (lumière allumée de 21h à 9h), pour éviter les manipulations durant le temps de sommeil des animaux et ainsi diminuer le stress. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Les signes de mal-être suivants seront recherchés : perte de poids, blessure ou plaie ouverte, dégradation de l'état du pelage, dos arqué. En cas de signes de souffrance de l’animal, des soins (désinfection, suture de plaie), une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire, une séparation (blessures entre congénères) seront réalisés après concertation avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut. Enfin, des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures. Après chaque chirurgie une grille de scoring sera utilisée quotidiennement jusqu’à récupération complète de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à partir de 8 semaines, poids supérieur à 20g)
Évaluation de l’efficacité d’un dispositif implantable pour l’administration locale chez le rat porteur de glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
70 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent une injection intracérébrale de cellules tumorales par craniotomie, et trente d'entre eux subissent une seconde chirurgie pour implanter un dispositif d'administration et une pompe osmotique. Le porteur teste une voie d'administration locale de médicament contre le glioblastome, et non une molécule, ce qu'il présente comme réalisable seulement in vivo. Il fixe comme point limite une taille de tumeur qu'il décrit comme n'induisant pas encore de souffrance perceptible.
Objectifs
Bien que l'incidence du glioblastome soit faible (~6/100000) la médiane de survie post-diagnostic est de l'ordre de 15 mois malgrè un traitement agréssif associant une chirurgie et une chimio/radiothérapie. Parmi les améliorations thérapeutiques possibles, l'utilisation d'une infusion focale à flux fixe (CED) est une option. Toutefois, ce type d'infusion est limité dans le temps et possible qu'au moment de l'exèrese. L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer l'apport d'un nouveau dispositif médical permettant de délivrer localement un médicament par une infusion multifocale à flux fixe et ceci sans contrainte de temps.
Bénéfices attendus
Le bénéfice à cours terme est de proposer une approche thérapeutique innovante et modulable pour le glioblastome dont la médiane de survie reste très courte.
Procédures
Parmi les 70 animaux inclus dans cette étude, 70 recevront une injection intracerébrale de cellules tumorales. Ils subiront donc une chirurgie sous anesthèsie générale de 15-20 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 0.5mm de diamètre. Parmi les 70, 30 subiront une seconde chirurgie 8 jours après la première. Les gestes seront identiques à ceux réalisés précédement. 30 subiront une seconde chirurgie, 8 jours après la première, sous anesthèsie générale de 60 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 4mm de diamètre au niveau de la plaque pariètale, suivi par la pose du dispositif et un décollement cutané au niveau interscapulaire afin de poser une pompe osmotique. Les 10 derniers ne subiront pas de chirurgie complementaires. Tous les animaux seront suivi par IRM afin d'évaluer l'impact des thérapies mises en oeuvre sur la croissance tumorale.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont relatives aux chirurgies incluses dans le protocole. En effet, une première chirurgie consistera à injecter les cellules tumorales au travers d'un orifice de diamètre inférieur à 1mm dans le crâne du rat après incision cutanée. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post opératoire de buprénorphine (0,1mg/kg 0,1mg/mL Buprécare) et injection locale de lidocaine (16,2mg/mL, 100uL). La seconde chirurgie sera réalisée une semaine après la première, également sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post-opératoire de buprénorphine et injection locale de lidocaine. Cette chirurgie s’accompagnant d’une craniotomie de 4mm de diamètre et d’une tunnelisation pour la pose de la pompe osmotique, des doses supplémentaires de buprénorphine seront dispensées 6h et 18h post chirurgie. Enfin, après chaque chirurgie, les animaux seront isolés pour 24h afin d’éviter qu’ils ne se rongent mutuellement les sutures.
Devenir
En fin de procédure 1 (inoculation de cellules tumorales) tous les animaux seront conservés car impliqués dans la procédure 2. En fin de procédure 2 (evaluation du nouveau dispositif) tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Il existe de nombreux tests de toxicité de molécules sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous on permis de selectionner 2 molécules avec un potentiel thérapeutiques certains sur la lignée de glioblastome testée. Dans notre cas, nous ne cherchons pas à tester une nouvelle molécule mais une voie d'administration innovante et ceci ne peux être réalisé qu'in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante. en effet, une simulation en utilisant G-power montre que pour nos groupes (non traités, traités PBS avec le nouveau dispositif, traités par la molécule 1 avec le nouveau dispositif, traité en CED par la molécule 1 et traité par du PBS par CED) contenant un nombre d'individus équivalent et égal à 10, un gain de survie moyen de 2 jours pour la thérapie CED et au minimum 3 fois supérieur pour le nouveau dipositif peux être mis en evidence avec un risque alpha de 0.05 et beta 0.95.
Raffinement
Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux seront maintenus en normothermie pendant toutes les procédures chirurgicales. Ces procédures seront réalisées sous anesthèsie isoflurane et une injection locale au niveau de la zone d'inscision de lidocaine. Une analgésie pre et post operatoire par de la buprenorphine et également associée. De plus, le suivi réguliers par IRM de la croissance tumorale, là aussi en normothermie assurée par une couverture chauffante asservie à la temperature réctale, et le suivi lors de ces examens du rythme respiratoire, la production de données sériées permet de limiter le nombre d'individus nécessaire pour tester notre hypothèse de travail. De plus, le suivi de la masse tumorale permet d'arreter le protocole expérimental avant tous signes cliniques de souffrance de l'animal. En effet, notre expérience de ce type de modèle nous permet de fixer comme point limite une taille de tumeur de 100µL, taille qui n'induit pas de modifications comportementales traduisant une souffrance.
Choix des espèces
Les tumeurs 9L sont des tumeurs initialement produites chez le rat fisher et ne se developpent que chez cette souche immunocompétente. Les animaux utilisés seront des animaux adultes de 7-8 semaines au moment de la première chirurgie. A cet age, il est possible de poser le dispositif sur le crane de l'animal en ne touchant qu'une seule plaque pariètale. De plus, le dispositif faisant environ 3mm de hauteur, il est possible de suturer sans crèer de tension importante. Enfin, avec cette taille de rat, la pompe osmotique (environ 1cm de long et 0.4cm diametre) alimentant le dispositif une tubulure souple en polyurethane peut être placée entre les omoplates sans entraver la mobilité de la tête.
DETERMINATION DE L’EFFET THERAPEUTIQUE D’ANTICORPS OU CANDIDATS MEDICAMENTS A L’AIDE DE MODELES DE GREFFES DE CELLULES TUMORALES CHEZ LA SOURIS
- Recherche fondamentale
- Oncologie
29 740 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules tumorales puis des injections répétées d'anticorps ou de candidats médicaments, parfois quotidiennes pendant trente jours, avec prélèvements sanguins et microbiopsies de tumeurs. Le porteur, une société privée, décrit une perte de poids et de locomotion liées aux tumeurs ou à la toxicité des produits, et tue tous les animaux pour prélever tumeurs et organes. Il qualifie le recours à la souris d'"indispensable", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui l'environnement tumoral humain.
Objectifs
Malgré des progrès dans le traitement de nombreux cancers, les résistances aux traitements, les rechutes ou l’absence de traitements efficaces font que les cancers sont encore un problème majeur de santé publique nécessitant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce contexte, le développement et l’amélioration de la production d’anticorps permettant d’obtenir de manière rapide et efficace des traitements thérapeutiques, laissent entrevoir de réels espoirs. En effet, l’utilisation seule de ces anticorps thérapeutiques ou en combinaison avec des traitements déjà existants, ont déjà été couronnés de succès cliniques ce qui en fait une stratégie intéressante dans la lutte contre le cancer. Ce projet a pour objectif de pouvoir faciliter et accélérer le transfert de la recherche fondamentale ou industrielle vers la clinique en permettant de tester les effets thérapeutiques d’anticorps candidats médicaments in vivo chez la souris.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif de valider par des études précliniques l’efficacité thérapeutique des anticorps générés au sein de notre société. Il correspond plus précisément à la dernière phase de tests précliniques qui permettra de démontrer (ou non) chez l’animal, l’efficacité des anticorps montrant un potentiel thérapeutique et de valider ou non l’intérêt d’un transfert vers la clinique pour ces anticorps.
Procédures
Durant les experiences les animaux peuvent être soumis: - à des injections de cellules tumorales sur animaux vigiles réalisées 1 à 2 fois en 2 à 5 min par animal (16 690 animaux max). - à des injections d’anticorps/candidats médicaments sur des animaux vigiles ou sous anesthésie gazeuse réalisées 1 à 3 fois par semaine pendant 1 à 8 semaines en 2 à 5min par animal. Ces injections peuvent être quotidiennes dans certains cas (1 à 2 fois/jour) sur une durée pouvant atteindre 30 jours en 2 min max par animal. Nous envisageons d’utiliser ces différentes voies d'injections d’anticorps/candidats médicaments sur 28 420 animaux. - à des prélèvements sanguins sur animaux vigiles et à des fréquences variables (de 1 à 5 fois/semaine pendant 28 jours) d'une durée de 5 min max par animal. Nous envisageons de réaliser ces prélèvements sur 14 870 animaux. -à des microbiopsies de tumeurs sur des animaux anesthésiés réalisées 1 fois en 3 min max par animal. Nous envisageons de réaliser ce type de prélèvement sur 500 animaux max.
Impact sur les animaux
Suite aux procédures que nous réalisons dans ce projet, les animaux peuvent subir - du stress lié à la manipulation des animaux, - une perte de poids et de locomotion suite au développement de tumeur ou à un effet toxique des anticorps ou autres candidats médicaments testés, -une déshydration suite à une anesthésie gazeuse.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure pour permettre de prélever dès que cela est possible les tumeurs, et/ou organes immunitaires et/ou les organes potentiellement cibles de métastases et du sang soit pour être analysés immédiatement soit pour être stockés. Ce stockage (en cas de non nécessité d’analyses immédiates) pourra permettre d’obtenir une collection d’échantillons exploitables ultérieurement aux jours de nouvelles données bibliographiques et/ou expérimentales pouvant éviter la réalisation de nouvelles procédures expérimentales.
Remplacement
L’utilisation des animaux (souris) lors de ces dernières phases des études précliniques pour tester l’efficacité de candidats médicaments est indispensable car aucun modèle in silico (modèle mathématique, analyse bio-informatique) ou in vitro (de culture cellulaire) ne permet à l’heure actuelle de recréer un environnement assez proche de celui retrouvé chez l’homme pour le développement tumoral et les réactions immunitaires pouvant y être associées. En effet, le développement tumoral implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux (extrinsèques) et propres aux cellules cancéreuses (intrinsèques). Seuls ces derniers peuvent être appréhendés in vitro. Ainsi, seuls des modèles animaux adaptés permettent de reproduire de manière suffisamment satisfaisante la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma et du contexte cytokinien qui sont des éléments cruciaux dans la réponse thérapeutique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires par lot par expérience sera calculé en se basant à la fois sur les données de lalittérature, des expériences « pilotes » et un test statistique de puissance. Ne seront injectés aux souris que les anticorps pour lesquels un effet thérapeutique des anticorps aura été observé in vitro. Le suivi de l’effet des anticorps testés sera évalué au cours du temps par des méthodes peu invasives. Toutes les procédures expérimentales effectuées seront recensées numériquement sur le serveur permettant d’avoir une traçabilité et un suivi des expériences menées, incluant les souris utilisées, les anticorps testés, les résultats obtenus et leurs interprétations ainsi que toute observation ou information pouvant être utile par la suite.
Raffinement
Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages, maintien des animaux en groupes de 4 à 5 afin d’éviter l’isolement et une période d’acclimatation de 7 jours est respectée systématiquement avant les manipulations. Afin d'atténuer la douleur chez l'animal, nous avons recours aux analgésiques en cas de prélèvement sanguin et de microbiopsies tumorales ainsi qu'à l'anesthésie gazeuse pour certaines injections. Durant toute la durée d'une expérience, l’ensemble des animaux est observé quotidiennement pour s’assurer : des conditions adéquates de stabulation (paramètres environnementaux, litière, alimentation, boisson) et de l’état de santé des animaux (comportement, aspect physique), pesé 2 fois par semaine en temps normal et quotidiennement en cas d’apparition des premiers signes de détresse chez l’une des souris de l'expérience.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce animale de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. Sur cette base, et en adéquation avec nos objectifs le modèle souris apparaît le plus pertinent. L’utilisation de souches murines immunodéficientes permettra d’avoir un environnement permissif au développement tumoral et d’effectuer des xénogreffes utilisant un éventail de modèles cellulaires tumoraux potentiellement large pour tester l’effet cytotoxique des anticorps candidats médicaments. Les souris immunocompétentes offriront quant à elles un panel de modèles tumoraux moins larges, mais nous permettront de tester à l’aide de greffes syngéniques l’effet immunomodulateur des anticorps potentiellement thérapeutiques. Enfin, la maîtrise zootechnique (élevage/confinement), les connaissances actuelles et la diffusion d’information dans le domaine scientifique font que le modèle murin est le plus adapté à la réalisation des objectifs de ce projet. Afin d’avoir des résultats homogènes et limiter les biais dans l’expérimentation dus à des animaux à des stades de développement différents, les animaux utilisés seront des souris adultes âgées de 6 à 10 semaines. De plus, dans le cadre de l’utilisation des animaux immuno-compétents, les expériences nécessitent un système immunitaire adulte et non en cours de développement, d’où la nécessité d’utiliser également des animaux adultes.
Role des récepteurs CB1 dans la physiologie et pathologie des ganglions de la base
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection cérébrale de vecteurs viraux sous anesthésie, reçoivent du tétrahydrocannabinol, passent des tests de comportement moteur et sont isolées une semaine, avant d'être tuées pour vérification histologique. Le porteur étudie le rôle du récepteur CB1, cible des molécules du cannabis, dans le contrôle moteur et les maladies neurodégénératives. Il affirme que les simulations numériques ne sont pas fiables et que le recours à l'animal "demeure nécessaire".
Objectifs
Le « système moteur » est principalement composé par le groupe de noyaux appelé « les ganglions de la base ». Ce système fortement conservé chez les mammifères, y compris l’homme, est un système complexe des connexions entre différents noyaux fortement régulé par plusieurs mécanismes agissant en différentes étapes, et toujours ces mécanismes sont à clarifier complètement. Le système des ganglions de la base est aussi la principale cible des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. Pour nous, un possible candidat qui pourrait être important dans le control des ganglions de la base est le système endocannabinoide. Dans le cerveau, l’action du principal composé psychoactif du cannabis passe par un ensemble de molécules, appelées collectivement « système endocannabinoïde ». Ce système contrôle de très nombreuses fonctions du corps humain. Il est notamment impliqué dans le contrôle moteur et la coordination. Avec ce projet (que est un complement de un projet deja en cours) nous voulons comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes agissent sur les fonctions motrices, et leurs implications possibles dans les maladies neurodégénératives affectant ces fonctions.
Bénéfices attendus
Le récepteur CB1 est la cible endogène des molécules psycho-actives du cannabis. Au niveau endogène, ce récepteur est activé par des molécules lipidiques (endocannabinoïdes) qui jouent un rôle crucial dans les mécanismes de protection et régénération neuronales. De plus, l’administration de drogues dérivées du cannabis a été suggérée comme un outil thérapeutique pour plusieurs maladies du système nerveux centrale et des ganglions de la base. Ce projet nous aidera à mieux comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes régulent l'activité de ce circuit neuronal en visant donc au development d’outils thérapeutiques pour les troubles moteurs associé aux maladies neurodegeneratives.
Procédures
Nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées. Sur certaines souris, nous allons injecté des vecteur viraux pour reduire la signalisation du recepteur CB1 dans des regions specifiques du cerveau. Cette procédure chirurgicale se fera sous anesthésie générale, avec un traitement analgesique pour prévenir la douleur (durée total de 30 minutes). L'intervention aura une durée de 30 minutes. Dans la période postopératoire (intevention de 3 jours), une injection sous-cutanée de Buprénorphine sera administrée 6 heures apres la premiere injection et répétée une fois par jour pedant 3 jours. Trois semaines apres chirurgie, les souris seront en isolement une semaine avant injection et seront injecteé avec differentes drogues: Tetrahydrocannabinol et leur vehicule (Durée total de 45 minutes). Apres traitments, les souris seront soumis a des tests de comportement moteur (Durée de 5minutes ). Apres le comportement, les souris seront mis a mort selone les modalité decrites.
Impact sur les animaux
Il n’y a pas de risque majeur lié à l’acte chirurgical et la douleur associée est traitée par une anesthésie approprié et des analgésiques. Il n’y a pas de signe perceptible des douleur après l'opération, durant la récuperation et lieés au procedures de injection et comportement. Néanmoins, il y a des points limites bien décrit dans les procédures. Le taux d’apparition des signes d’infection de la plaie suite à la chirurgie est très faible.
Devenir
Les souris issue de la procedure de chirurgie seront en suite traité avec des drogues suivi par des tests comportamentales. En suite les animaux seront mis a mort pour fin experimentation et verification hystologique des injectiones virales.
Remplacement
A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale.
Réduction
Les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux n'excèderont pas 15 animaux, c'est à dire le nombre minimal d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine et aussi décrit dans la literature scientifique sur le sujet. Au regard du faible nombre d'individu par groupes expérimentaux, les analyses statistiques basées sur des tests non paramétriques seront privilégiées par rapport aux tests paramétriques. De cette facon, les nombres prévus permettent de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience nous montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.
Raffinement
Un protocole de surveillance et un suivi quotidien et rigoureux seront mis en place par l’experimentateur et le personnel zootechnicien. En cas de blessure légère, un protocole de soins et désinfection sera mis en place (antiseptique topique et antiinflammatoire systémique) jusqu’à la guérison. En cas d’atteinte du point limite terminal, l’animal sera mis à mort. Pour les traitments pharmacologiques, les injections IP sont bien maitrisées dans le laboratoire et ils n’induisent pas de mal-être chez l’animal. En plus les produits utilisés (et leur doses) sont bien tolérés chez les animaux. Les souris seront néanmoins bien observées suite aux injections, par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. Pour certaines experiences de comportement moteur, les souris seront isolées pedant 7 jours avant injection. Toutes les mesures pour reduire l'impact de ce type d'hébergement seront mise en place (congénères à proximité et enrichissement approprié). Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant et après manipulation, sauf pour certaines experience de comportement moteur que prevoi une semaine d'isolement. Les souris seront hébergés avec un milieu enrichi (matériel de nidification en coton et 2 tunnels par cage), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs, formés selon la règlementation en vigueur et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général et comportemental des animaux comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, pré- et post-opératoire, prévoit aussi l’utilisation d’analgésique pour la prise en charge de la douleur. Elles seront effectuées par des experimentateurs formés à la chirurgie chez les rongeurs, selon la règlementation en vigueur.
Choix des espèces
A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur CB1), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont équipées pour être destinées à l’étude des rongeurs. L'age des animaux sera de 8-12 semaines car les protocoles que nous avons établis seront développés à l'âge adulte des souris en évitant les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le terrain.
Preuve de concept de l’utilisation de la greffe de cellules souches germinales pour rétablir les fonctions reproductives de bars stériles
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 800 larves de bar vont être utilisées et gardées en vie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Chaque larve reçoit deux micro-injections sous anesthésie pour tenter une greffe de cellules souches germinales, avec une survie annoncée de 66 à 86 %, avant marquage électronique et collecte de gamètes. Le porteur présente ce projet comme une "preuve de concept" devant à terme réduire le nombre de poissons utilisés, tout en indiquant que neuf bars donneurs seront tués pour prélever leurs cellules. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale, le bar étant lui-même le sujet de l'étude.
Objectifs
L'objectif du projet et de faire la preuve de concept de l'utilisation de la greffe de cellules souches germinales pour rétablir les fonctions reproductives de bars stériles. En outre, ce projet contribuera à réduire l'utilisation de poissons expérimentaux. L'expérimentation se propose en utilisant la technique de greffe des cellules servant à produire les spermatozoïdes et les ovules, de rendre fertile des bars stériles ce qui est une étape nécessaire à la production de certaines lignées expérimentales de bars comme les lignées ayant une absence de variabilité génétique au sein du groupe.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de reproduire des bars stériles en faisant porter leurs gamètes par des poissons non stériles. Cette méthode si elle est validée permettra de: 1/ produire les lignées ayant une absence de variabilité génétique au sein d'un groupe) 2/ de régénéré des populations ou lignés de bars dont les gonades ont été cryconservées.
Procédures
Les larves de bar utilisées pour ce projet seront injectées deux fois et seront anesthésiées lors des 3 manipulations, dont les 2 injections. L'ensemble de la procédure durent moins de 9 min, 3 minutes par manipulation.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivantes: les larves âgées de 30 jours utilisées pour ce projet sont anesthésiées et micro-injectées. La survie des larves suite à cette injection varie de 66 à 86%. Il est à noter que, due à la stratégie de reproduction de type r du bar (forte prolificité), la survie d’un élevage larvaire classique de bar est aux alentours de 20% et que les mortalités interviennent massivement durant les premiers jours de l’élevage, mais perdure jusqu’à la métamorphose des larves à 80 jours. Âgés de 6 mois, les poissons seront marqués avec une puce électronique afin de les identifier. Ce marquage est classiquement utilisé en aquaculture et se fait sous anesthésie et est équivalent à une piqure, il n’entraine pas de nuisance pour l’animale (c'est la même technique que celle employée pour identifier les chiens et chats). La collecte des gamètes à l'âge de 2 ans se fait sous anesthésie et n’entraine pas de nuisance pour l’animale.
Devenir
À l'issue de la greffe, du marquage et de la collecte des gamètes, les poissons sont gardés en vie.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternatives non animales disponibles pour cette expérimentation. Le sujet de l'étude étant le bar lui-même.
Réduction
L’objet de ce projet est de produire in fine 9 lignées de bar ayant une absence de variabilité génétique au sein du groupe en faisant la preuve de concept de la reproduction de poissons stériles d’intérêt par le transfert de leurs cellules souches germinales dans des poissons-receveurs pleinement fonctionnel. 9 poissons portant très peu de variabilité génétique seront donc euthanasiés pour ce projet. Les cellules souches germinales (donnant les spermatozoïdes ou ovules) extraites des gonades de ces 9 poissons seront injectées dans 9x200 larves. Le taux de réussite du transfert de cellules souches germinales étant chez le bar de 15%, cela permettra d’avoir les 15 à 20 géniteurs porteurs des gamètes des poissons nécessaires au développement des 9 lignées de bar ayant une absence de variabilité génétique. Cela permettra d’ici 6 ans de réduire le nombre d’animaux utilisé dans de nombreux projets de recherche portant sur le bar.
Raffinement
Pour favoriser le rétablissement des larves microinjectées, celles-ci sont maintenues dans de l’eau stérile dont la salinité a été abaissée pour être à l'équilibre osmotique avec le poisson et gardées sous une surveillance particulière pendant les 4 heures suivant l’injection. Les larves ne récupérant pas rapidement leurs équilibres sont euthanasiées.
Choix des espèces
Le bar est le sujet de l’étude. Pour ce projet un total de 1800 animaux seront utilisés : 1800 larves de bar âgées de 30 jours, c'est à cet âge que les larves sont manipulables et que le transfert de cellule souche germinale donne les meilleurs résultats.
Pose et retrait d’une canule ruminale temporaire pour ovin adulte
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
2 moutons castrés vont être utilisés puis rendus au troupeau après récupération, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux interventions chirurgicales sous sédation, pour poser puis retirer une canule ruminale temporaire, avec des prélèvements sanguins répétés. Le porteur présente ce dispositif temporaire comme une alternative aux canules permanentes portées toute la carrière de l'animal. Il ouvre son résumé en évoquant un "besoin constant d'animaux" de son établissement et qualifie le recours aux ovins d'"indispensable" pour l'étude fine de la digestion.
Objectifs
L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche. Auparavant orientée vers l'augmentation des performances et l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande, aujourd'hui elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des gaz à effet de serre, polution des sols...) ou les attentes sociétales (bien être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants , les animaux modèles utilisés sont ici des moutons castrés. C'est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et pour comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (bovins, caprins, brebis et agneaux). Pour certaines études, en particulier pour la compréhension des mécanismes de digestion et de mesure de la cinétique de dégradation des aliments, le recours à des animaux porteurs de canules est indispensable. L’objectif de ce projet qui durera deux ans, est de trouver une alternative à certaines méthodes invasives sur animaux en particulier les canules permanentes sur ruminants. Ici, il s’agit premièrement de concevoir une canule ruminale temporaire pour ovin avec un diamètre d’insertion dans le rumen le plus étroit possible (= 3 cm) et pouvant être retirée quelques semaines après (max : 20 semaines). La pose de la canule se fera par chirurgie mais le retrait devra être réalisé sans chirurgie supplémentaire. Le but est que ces dispositifs ne soient positionnés sur l’animal que pour la durée de l’expérimentation et non sur la carrière de l’animal tout en permettant d'étudier les mécanismes fins de la digestion. Pour cela , nous réaliserons cette expérimentation sur deux moutons adultes afin de confirmer l'ensemble des étapes de ce protocole de mise en oeuvre.
Bénéfices attendus
Pouvoir étudier les mécanismes fins de la digestion en utilisant des animaux porteurs de canules. Les animaux ne seront équipés de ces canules que pour la durée des procédures soit quelques semaines. Les animaux ne seront plus équipés de canules permanentes durant toute leur carrière.
Procédures
Les deux animaux subiront deux interventions chirurgicales avec une sédation à la xylazine : la pose de la canule durera environ 30 minutes et le retrait de la canule durera moins de 10 minutes. Les prélévements sanguins seront réalisés sur les deux moutons vigiles et chacun durera moins d'une minute entre la contention et la réalisation de la procédure. Un volume maximum de sang de 20 ml par mouton est prélevé à la jugulaire (volume de prélèvement sans conséquence néfaste pour leur santé, inférieur à 1% du volume sanguin de l'animal), au moyen d’un vacutainer. Les prélèvements sanguins sont réalisés deux fois par jour à 3 heures d'intervalles à J-1, J0, J+1 et J+2 puis une fois par jour à J+5, J+7, J+9 et J+13 le matin à la pose et au retrait de la canule. Ces prélèvements seront réalisés par du personnel qualifié, les animaux seront préalablement habitués aux manipulations et aux prélèvements, pour que ceux-ci se passent dans le calme pour ne pas biaiser les indicateurs de bien-être animal (cortisol).
Impact sur les animaux
La présence de la canule engendre une légère gêne mécanique mais qui sera réduite à l'échelle de la procédure. De plus, au moment du retrait de la canule, un léger écoulement pourrait survenir pendant quelques heures, le temps que l'orifice ne se bouche de manière mécanique.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux retourneront dans le troupeau de mâles castrés après avoir complétement récupéré.
Remplacement
Dans certains cas de figure, notamment pour l'étude des mécanismes fin de la digestion, nous ne pouvons pas utiliser de méthodes alternatives (fermenteurs artificiels). C'est pour cela que nous avons recours à des ovins dans ce projet.
Réduction
Nous avons réduit au maximum les effectifs avec seulement deux animaux utilisés. Pour vérifier toutes les étapes, nous devons les confirmer avec au moins une répétition. Il serait vraiment très difficile de tirer des conclusions robustes avec seulement un seul animal.
Raffinement
Tout est mis en oeuvre pour le raffinement notamment les conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. La durée en case individuelle devrait correspondre à la période de cicatrisation soit une quinzaine de jours. Cependant, si des problèmes persistaient de cicatrisation ou d’étanchéité de la canule, elle pourrait durer le temps de l’expérimentation soit 6 à 8 semaines pour la sécurité de l'animal mais serait réduit au maximum. De plus, lors de la pose et du retrait le protocole médicamenteux est adapté afin que l'animal souffre le moins possible. Des antiinflammatoire ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post-opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. De plus, pour vérifier que son bien être n'est pas impacté, des grilles de suivi sont mises en oeuvre deux fois par jour de J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J5, J7, J9 et J 13 suivant les opérations et des prises de sang sont réalisées en parallèle pour vérifier l'évolution du cortisol dans le sang.
Choix des espèces
Nous étudions la digestion des ruminants et le mouton est l'un de nos modèles d'étude de ces mécanismes. C'est pour cela que nous avons choisi l'espèce ovine. Nous étudions les mécanismes de digestion d'animaux adultes et c'est pour cela que nous travaillons sur des moutons âgés d'un à deux ans.
Induction de tumeurs chez la souris par mutagenèse somatique ciblée : étude de la progression des tumeurs prostatiques primaires.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à 3 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des injections de tamoxifène déclenchent chez des souris génétiquement modifiées des lésions précancéreuses de la prostate, qui peuvent évoluer vers des tumeurs volumineuses provoquant douleur abdominale et perte de poids, la mise à mort étant prévue à 2 000 mm3 de tumeur ou à 20 % de perte de poids. Les animaux sont tués à différents temps pour prélever la prostate et d'autres organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique des lésions et conclut à la "nécessité" d'expériences in vivo.
Objectifs
Le cancer de la prostate ( CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine de l’agressivité des tumeurs est donc requise afin de d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate, développés au laboratoire, répliquent les mutations du gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines. Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme. L'objectif de ce protocole est le suivi et caractérisation des lésions précancéreuses de la prostate. Suite à l'invalidation du ou des gènes, des lésions, nommées néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), se développent. L'évolution des PIN sera suivie pendant un délai suffisant à l'apparition des formes agressives. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes d'apparition des formes agressives du cancer de la prostate afin d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et des outils diagnostiques.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des gènes étudiés dans cette évolution. Les prélèvements de fluides (urines et sang) nous aideront à mettre en évidence des biomarqueurs du cancer de la prostate permettant un diagnostic précoce de la maladie.
Procédures
Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène réalisés au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, 100 µL du sang sera prélevé sur 20 animaux à chaque point de la cinétique ( 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12 et 15 mois après injections du tamoxifène), un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Une injection en intra péritonéale prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris.
Impact sur les animaux
Suite à l'injection du tamoxifène, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. La taille de tumeur sera donc un point limite clé(2000 mm3). Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement.
Devenir
Les animaux seront sacrifiés à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
L’effectif demandé a été calculé afin d’obtenir les groupes des souris mutantes à différents points cinétiques de taille suffisante pour réaliser les tests statistiques de sorte à pouvoir tirer des conclusions pertinentes de nos expériences. Pour un type de souris donné et un point cinétique donné, 20 souris seront utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction de nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. En revanche, sur les points clés, des expériences supplémentaires pourront être réalisées, toujours dans la limite de 3200 souris maximum.
Raffinement
Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Après injection, les souris seront observées pour détecter les éventuels signes de douleur ou de souffrance, à savoir la posture inhabituelle, le dos vouté, le poil hérissé, les grimaces, les vocalisations. Si ces signes persistent dans la journée suivant l'injection, les souris seront sorties de l'étude. De plus, lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, elles seront observées par l'expérimentateurs et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler la taille de la prostate par palpation et l’apparence générale de la souris. Les points limites de l’expérience seront le volume de la prostate et le poids de la souris. Si le volume de la prostate est supérieur à 2000 mm3, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est supérieure à 20% et/ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Après chaque prélèvement sanguin, un volume équivalent au prélèvement de sérum physiologique sera injecté en sous-cutanée. De plus, le lieu de l'injection sera surveillé dans les journées suivantes afin de détecter des signes d'une éventuelle inflammation (rougeur, gonflement).
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans des gènes Pten et Trp53 le plus fréquemment mutés dans les cancers de la prostate humain pour générer nos modèles. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte. Les animaux utilisés seront adultes, les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.