Recherche fondamentale

860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies cérébrales d'environ une heure sous anesthésie, puis sont mises à mort deux à trois semaines plus tard pour prélever leur cerveau, afin d'étudier les circuits entre le télencéphale basal et le bulbe olfactif. Le porteur décrit une perte de poids et une gêne liée aux sutures dans les jours suivant la chirurgie. Il reconnaît ne pouvoir prévoir le nombre d'expériences ni fixer une hypothèse statistique et relie ce travail exploratoire à un possible signe précoce de la maladie d'Alzheimer.

Objectifs

Des neurones localisés dans les noyaux cholinergiques du télencéphale basal projettent dans le bulbe olfactif, le premier relai de traitement de l’information sensorielle olfactive dans le cerveau. Ces neurones auraient pour fonction de moduler l’activité du bulbe olfactif, et donc les performances olfactives, en fonction du contexte comportemental (par exemple les conditions d’attention, de stress ou d’éveil) ou métabolique (par exemple l’état de satiété) de l’animal. Cependant, les projections en provenance du télencéphale basal sont massives et diverses et toutes leurs cibles et actions dans la bulbe olfactif n'ont pas été caractérisées. Il y a en outre dans le télencéphale basal plusieurs populations de neurones cholinergiques ou GABAergiques et chacune a probablement des cibles spécifiques dans le bulbe olfactif. Les objectifs de ce projet sont : 1) identifier les sous-populations de neurones du télencéphale basal qui projettent dans le bulbe olfactif, 2) déterminer leurs cibles dans le bulbe olfactif, 3) évaluer l’impact de cette innervation neuromodulatrice sur l’activité du bulbe olfactif.

Bénéfices attendus

Les voies de neuromodulation des circuits olfactifs et les conditions de leur mise en jeu in vivo ont été peu étudiées. Pourtant, la modulation de l’odorat en fonction du contexte comportemental et physiologique de l’animal a une importance considérable dans la vie des animaux qui dépendent de leur odorat pour survivre. Chez l’homme, la récente épidémie de Covid nous a rappelé combien les troubles de l'olfaction peuvent affecter la vie quotidienne des patients. Par ailleurs, les troubles de l’olfaction sont parmi les premiers symptômes de la maladie d’Alzheimer et d'autres neuropathologies dégénératives, apparaissant des années avant les symptômes cognitifs. Le lien entre odorat et Alzheimer n’est pourtant pas clairement établi. Il y a en revanche un consensus sur le fait que les voies neuromodulatrices cholinergiques dégénèrent précocement dans la maladie d’Alzheimer. Décrire chez l’animal l’organisation et l’influence des noyaux cholinergiques sur les circuits olfactifs devrait renforcer l’idée que les troubles olfactifs chez l’homme doivent être considérés comme un signe précoce annonciateur d’une possible maladie neurodégénérative.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale, d'une durée d'environ 1 h, ou deux interventions chirurgicales à deux semaines d'intervalle d'une durée d'environ 1 h chacune. Chaque chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie profonde.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et éventuellement des douleurs chez la souris, même si tout est mis en œuvre au moment de la chirurgie pour les réduire. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les fils de suture peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours.

Devenir

Tous les animaux entrant en procédure sont mis à mort 2 à 3 semaines après le début de la procédure afin de prélever leur cerveau. Des expériences d'électrophysiologie seront alors réalisées sur des tranches de bulbe olfactif ou des expériences d'immunohistochimie et/ou microscopie sur des tranches de télencéphale basal ou de bulbe olfactif.

Remplacement

Les expériences de ce projet ont pour but d'étudier les voies de modulation des circuits olfactifs chez la souris. Ces voies impliquent des aires cérébrales éloignées les une des autres qui sont semblables à celles trouvées dans le cerveau humain. Ces circuits sont impossibles à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doivent être intacts pour pouvoir être étudiéś. Ils sont impossibles à modéliser numériquement car leur organisation est encore méconnue. Nous utiliserons des souris car c'est dans cette espèce que les outils d'ingénierie génétiques sont les plus développés. De plus, de nombreux résultats démontrent que les découvertes chez la souris peuvent être utilisées comme outils précliniques chez l'homme.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base de nos études antérieures menées sur le même sujet, avec la même stratégie et les mêmes approches expérimentales. Il s’agit ici de décrire des propriétés de circuits de neurones qui n’ont jamais été étudiées auparavant. Une série de tests expérimentaux sera réalisée pour caractériser dans le détail les propriétés et fonctions de ces circuits neuronaux. La nature et le nombre de ces expériences ne peuvent pas être anticipée car ils dépendront de l'originalité de ce qui sera découvert. Par conséquent, une étude statistique prédictive pour estimer le nombre d’animaux qui sera nécessaire pour tester une hypothèse énoncée à l’avance n’est pas envisageable ici. Notre stratégie pour réduire le nombre d’animaux est: (i) de faire des expériences pilotes sur un petit nombre de souris pour sélectionner des lignées transgéniques d’intérêt (ii) d’analyser les résultats au fur et à mesure et d’arrêter les expériences dès qu’un résultat original a été établi ou observé dans un nombre suffisant de cellules (en général autour de 10), (iii) de baser notre approche expérimentale sur une manipulation sélective de neurones ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires pour identifier et caractériser des circuits synaptiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations régulières et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire, à température stable et contrôlée grâce à un tapis chauffant thermostaté. Les yeux sont protégés avec du gel pendant la chirurgie. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et des points limites ont été établis permettant de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

La diversité neuronale est telle dans le cerveau que les souris transgéniques sont nécessaires pour identifier (grâce à des marqueurs fluorescents par exemple) et manipuler (grâce à l’optogénétique par exemple) des populations neuronales spécifiques. Les lignées de souris transgéniques qui seront utilisées dans ce projet permettent toutes ces expériences sur des populations de neurones déterminées. L’utilisation de ces modèles transgéniques simplifie l’interprétation des résultats et permet in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés. Animaux utilisé à partir de 3 semaines, c'est à dire assez âgés pour pouvoir être placés sur un appareil stéréotaxique.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Injectées avec un virus dès l'âge de trois à cinq jours, ces souris transgéniques subissent des enregistrements cardiaques sous anesthésie puis une stimulation intracardiaque chirurgicale, suivie systématiquement de l'euthanasie et du prélèvement du cœur. Le porteur indique qu'il n'attend pas de phénotype sévère car les animaux ne sont pas maintenus jusqu'aux signes cliniques de la maladie. Il affirme que le cardiomyocyte adulte ne peut se cultiver et que l'efficacité de la thérapie ne peut s'évaluer que sur l'animal.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de mettre au point une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de troubles du rythme cardiaque héréditaires pouvant être mortels. Nous testerons l'effet de différents traitements (pharmacologiques et géniques) dans des lignées de souris transgéniques reproduisant la pathologie en étudiant leurs effets sur les arythmies déclenchées par stimulation électrique du cœur.

Bénéfices attendus

L'étude de ces modèles murins nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie des maladies liées à la conduction cardiaque et à ses troubles. Nous espérons définir de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de ces arythmies pouvant être mortelles chez l'Homme et pour lesquelles nous ne disposons pas de traitement efficace.

Procédures

La totalité des 220 animaux de ce projet subiront la procédure expérimentale "Étude des effets de nouveaux traitements sur la susceptibilité aux arythmies de 2 modèles murins de troubles du rythme cardiaque". Cette procédure expérimentale se déroule en 4 interventions qui se succèderont chez chaque animal: 1) Injection des virus à l'âge de 3 à 5 jours: quelques secondes par animal. 2) Enregistrement de l'échocardiographie sous anesthésie légère à l'âge de 9 semaines pour une lignée et de 23 semaines pour l'autre lignée: 10 minutes par animal. 3) Enregistrement de l'ECG de surface sous anesthésie légère à l'âge de 9 semaines pour une lignée et de 23 semaines pour l'autre lignée: 10 minutes par animal (40 minutes par animal pour le groupe recevant l'antiarythmique). 4) Stimulation endocavitaire sous anesthésie (unique procédure chirurgicale du projet): 40 minutes par animal (1 heure par animal pour les lots recevant l'antiarythmique) suivie systématiquement par l'euthanasie de l'animal.

Impact sur les animaux

Le phénotype des souris génétiquement modifiées utilisées ne sera pas considéré comme dommageable car aucune ne sera maintenue jusqu’au stade où apparaissent les signes cliniques des modèles concernés. Les potentiels effets néfastes de l'injection d'un AAV dans la circulation systémique d'une part, et de la surexpression de la GFP dans le cœur des souris d'autre part, seront évalués par comparaison des groupes recevant l'AAV-GFP avec les groupes recevant du sérum physiologique. On peut s’attendre à ce qu'il n'y ait pas de différence notable sur les paramètre ECG et échographiques entre les différents groupes au vu de résultats obtenus précédemment. L'introduction de la sonde de stimulation intra-cardiaque dans le ventricule droit de la souris via la jugulaire comporte un risque pour l'animal, risque lié à l'anesthésie et à la chirurgie.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure de ce projet, toutes les souris seront euthanasiées par une injection létale dans le but de réaliser des analyses ultérieures. Les cœurs seront alors prélevés et congelés immédiatement dans l’azote liquide pour les expériences de biochimie, de biologie moléculaire et d'immunohistologie.

Remplacement

Le myocyte cardiaque adulte ayant atteint un état de différenciation terminale, il ne se divise pas, il ne peut être conservé en culture primaire plus de quelques jours et il ne peut être transfecté par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). De ce fait, l'utilisation d'animaux ne peut être remplacée par des modèles d'expression in vitro ou ex vivo. D'autre part, les lignées murines étudiées dans ce projet constituent d'excellents modèles pour tester de nouvelles thérapies car ces lignées sont plus susceptibles aux arythmies déclenchée électriquement que les souris sauvages. Nous utiliserons cette susceptibilité pour évaluer l'efficacité de notre approche thérapeutique, ce qui ne peut être réalisé que sur des animaux.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés et nous n'utiliserons que des préparations virales dont le titre aura été évalué afin d'utiliser la dose minimum efficace dans la transduction in vivo. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux: mâles et femelles, sauvages et mutés. Les fonds génétiques des souris sauvages et transgéniques sont identiques. Nous injecterons le même virus dans l'ensemble d'une portée. Nous exploiterons toutes les naissances et nous ne ferons pas faire naître d'animaux non nécessaires au projet. En tenant compte de tous ces critères, le nombre total d'animaux de ce projet s'élève à 220 animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons ou tunnels en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe autant que possible, formation technique des utilisateurs. Afin de réduire au maximum la douleur chez les animaux utilisés, nous injecterons les virus (dilués dans une solution physiologique) par voie systémique, ce qui évite la chirurgie cardiaque lourde liée à une injection intracardiaque. Les caractéristiques physiologiques cardiaques de la maladie seront évaluées par des méthodes non invasives : enregistrements échocardiographiques et électrocardiographiques. Seul l'acte de déclenchement des arythmies nécessite quelques minutes de chirurgie qui sera effectuée sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour les raisons générales suivantes : 1) leur développement et leur physiologie sont bien connus. 2) le fonctionnement du système cardiovasculaire est proche de celui de l’Homme (échocardiographie, ECG). 3) de nombreux modèles physiopathologiques sont disponibles et caractérisés. 4) la reproduction rapide de ces rongeurs permet d’obtenir le nombre d’animaux requis pour les analyses statistiques des résultats. 5) la souris est le modèle animal le plus utilisé pour caractériser les vecteurs viraux AAV à tropisme cardiaque que nous allons utiliser. 6) les modèles pathologiques que nous souhaitons utiliser pour nos tests de thérapie génique sont murins. Les AAV seront injectés chez des animaux de quelques jours dans le but de limiter la réponse immunitaire des animaux et de limiter les volumes de virus à produire. De plus, les délais d'expression des AAV étant relativement longs, l'injection à un âge précoce, au lieu d'utiliser des animaux adultes, nous permettra de gagner beaucoup de temps et donc de place dans l'animalerie. L'étude de l'effet potentiellement thérapeutique des virus sera effectuée sur des animaux d'au minimum 9 semaines afin qu'ils aient atteint une taille adulte et que les transgènes soient exprimés.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris double knock-out sont suivies de 3 à 10 mois par des tests visuels dont un test optocinétique et un électrorétinogramme sous anesthésie, pour étudier une dégénérescence de la rétine. Le porteur indique qu'il retire délibérément tout enrichissement de la cage pendant les mois d'expérimentation, l'enrichissement modifiant la progression de la maladie. Il affirme que la fonction de la rétine ne peut s'étudier sur des cellules en culture et renvoie la thérapie envisagée à une preuve de concept.

Objectifs

L’objectif du projet est de suivre la progression du déficit de vision des souris avec des gènes doubles knock-out, y compris la fonction des photorécepteurs cône et bâtonnet, l’acuité visuelle, la structure de la rétine, etc. Les deux gènes sont paralogue et les deux knock-out existent pour chaque gène. Le phénotype de chacune de ces souris a été étudié précédemment. Elles présentent toutes deux un déficit de vision important avec une fréquence différente en terme de dégénérescence des cônes. Ceci suggère que les deux gènes ont une fonction distincte dans la protection des cônes. Nous nous attendons à un déficit de vision plus sévère chez les souris dont les deux gènes sont inactives, permettant ainsi d explorer la future stratégie de traitement de type combinatoire.

Bénéfices attendus

L’analyse des phénotypes chez les souris à double gène nous aidera à mieux comprendre l’interaction et leur effets compares à un seul gène. Nous possédons des arguments pour anticiper que l’administration des deux gènes d’intérêt aurait un effet thérapeutique synergétique. A plus long terme l’objectif est de faire la preuve de concept du bénéfice pour la vision d’une thérapie combinant les deux produits du gène comme alternative à la stratégie thérapeutique indépendante de la mutation causale de la rétinopathie pigmentaire.

Procédures

Les différents tests seront réalisés sur les mêmes animaux des quatre génotypes à 3, 6 et 10 mois. Test comportemental optocinétique (OKT, 5 min), fond d’œil grâce à une caméra de fond d'œil numérique (MICRON III, 5 min sous par gaz anesthésie), imagerie de la rétine par tomographie par cohérence optique (OCT, 5 min sous par gaz anesthésie), et électrorétinogramme (ERG, 30 min sous anesthésie par injection intrapéritonéale).

Impact sur les animaux

Nous anticipons des effets indésirables modérés dues aux paramètre suivants : absence d’enrichissement, chambre noir, test de comportement/stress, injection IP/contention/piqûre, anesthésie. Nous prévoyons un stress pour l’hébergement sans enrichissement, chambre noire ou encore comportement ; inflammation locale au site d’injection pour les IP ou encore risque anesthésique pour les actes sous anesthésie générale. Chambre noir est requis pour la mesure d’ERG scotopique. Pour l’absence d’enrichissement, tout est mis à contribution pour pouvoir reproduire le déficit visuel des souris contrôles précédemment étudiées en l’absence d’enrichissement La littérature montre que l'enrichissement affecte la progression de la dégénérescence de la rétine chez les souris rd10. Quinze jours précédant la première expérience, nous acclimatons les animaux en enlevant l'enrichissement. Nous supprimerons donc l'enrichissement uniquement durant la période d'expérimentation, commençant du 3eme mois au 10eme mois.

Devenir

Les souris seront testées à 3, 6 et 10 mois. La durée est fixée à 10 mois par des expériences publiées précédemment, mais la mesure des paramètres à 6 mois pourrait nous amener à repousser ce durée à 12 mois, ou même plus. Après la dernière mesure, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire. Les rétines des deux yeux de ces souris seront prélevées pour mesurer la densité des cônes.

Remplacement

L’étude de la fonctionnalité de la rétine d’un modèle murin au cours du vieillissement ne peut être réalisée sur des modèles de cellules en culture. Les photorécepteurs des organoïdes rétiniens obtenus par reprogrammation de cellules souches n’ont aucune fonction électrophysiologiques.

Réduction

Pour appréhender une aggravation statistiquement significative du phénotype visuel des souris analysées, il faut nécessairement répéter les mesures sur ces dernières car un design expérimental adéquat est requis. Il est aussi nécessaire de valider le déficit visuel pour ces dernières souris en le rapportant à la vision de la souris contrôle. Les quatre groupes sont donc requis scientifiquement. Le nombre de souris par groupe (n = 12), soit au total 48 souris, avec trois répétitions de cette expérience soit n=144. Ce nombre est estimé d’après des travaux antérieurs et par l’estimation du pouvoir statistique à atteindre pour obtenir une différence statistiquement et biologiquement significative. L’information extraite de chaque animal est poussée à son maximum en analysant les deux yeux de chaque souris. Chacun des quatre groupes de souris sera analysé à 3, 6 en 10 mois pour la fonction et la survie des bâtonnets et l’acuité visuelle des cônes leur fonction

Raffinement

De façon générale, les animaux seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou l’expérimentateur. Nous les considérons comme en bonne santé si leur pelage est brillant et que leur comportement est normal. S'il y a des signes de malaise, comme un comportement anormal, une perte de poids, une déshydratation, une prostration, un prolapsus rectal, etc. L'expérience sera arrêtée et le personnel qualifié de l'animalerie estimera le niveau de malaise, puis décidera d'observer, de traiter ou de les euthanasier. Toutes les expériences de chaque étape sont non invasives et l'analgésie et l'anesthésie seront utilisées pour réduire la douleur, le stress et l'inconfort des animaux. Si les risques d'anesthésie sont observés, tels que la dépression respiratoire, l’accident vasculaire cérébral, etc., l'animal sera alors, retiré du groupe et euthanasié. Les tests de comportement sont réalisés par une même personne permettant ainsi de réduire le stress des animaux et d’éviter des variations intra-individuelles.

Choix des espèces

Le phénotype visuel des souris avec inactivation d’un seul des deux gènes a été étudié précédemment. La souris est aussi une modèle pertinent d’étude des dégénérescences rétiniennes héréditaires. Les quatre cohortes seront suivies entre 3 et 10 mois, soit durant la période de perte de vision dans nos études publiées. Ces animaux seront placés dans une pièce dont l’intensité de la lumière et le cycle jour/nuit est contrôlé dès leur sevrage.

2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite est induite par injection de collagène, qui provoque un gonflement des pattes et des articulations, sans qu'aucun anti-inflammatoire puisse être administré puisqu'il interférerait avec l'expérimentation. Le projet teste des cellules souches mésenchymateuses et leurs sécrétions pour réduire les signes d'arthrite. Le porteur annonce un impact "majeur" et des "retombées énormes" en santé publique, tout en renvoyant l'application humaine à un modèle préclinique.

Objectifs

Notre groupe travaille sur la mise au point d’approches de thérapies cellulaires pour inhiber l’inflammation ou régénérer le cartilage détruit suite à des pathologies ostéo-articulaires notamment dans le cas de la polyarthrite rhumatoïde. L’inhibition de l’inflammation associée à cette pathologie consiste à injecter de manière locale ou systémique des cellules « médicaments », les mitochondries ou les vésicules extracellulaires qu’elles sécrètent capables d’inhiber la réponse immunitaire. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les capacités thérapeutiques de cellules appelées cellules stromales mésenchymateuses (CSM) non-modifiées ou modifiées (ou ce qu’elles sécrètent) pour diminuer les signes d’arthrite. Les CSM sont des cellules qui possèdent des propriétés anti-inflammatoires qui les rendent particulièrement intéressantes pour mettre en place une approche thérapeutique de l’arthrite. Le modèle utilisé couramment est le modèle d’arthrite induite au collagène (CIA).

Bénéfices attendus

En l’absence de traitement de l’arthrite chez environ 30% des patients atteints de formes sévères et résistants aux biothérapies, il est nécessaire de développer de nouvelles approches thérapeutiques. L’utilisation des cellules souches a déjà montré son intérêt dans plusieurs modèles de pathologies autoimmunes dont l’arthrite rhumatoide. Notre projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de ces cellules dans un modèle pré-clinique d’arthrite chez la souris et à comprendre les mécanismes mis en œuvre par ces cellules afin de déterminer les meilleures options thérapeutiques chez l'homme. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement de l’arthrite. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux subiront deux injections dans le tissu cutané, deux intraveineuses ainsi que des prélèvements sanguins. Tous ces gestes seront effectués sous anesthésie générale gazeuse.

Impact sur les animaux

L’immunisation des animaux et leur suivi constituent un protocole induisant des douleurs modérées et pour lequel il n’est pas possible d’administrer de traitements anti-inflammatoires qui interféreraient avec l’expérimentation. L’immunisation des animaux pour induire l’arthite se fait par des injections dans le tissu cutané après anesthésie gazeuse. Elle provoque un gonflement des pattes et des articulations. Un stress lié à l’anesthésie et une douleur au site d’injection peuvent être provoqués. Cependant, la douleur reste faible et sans impact sur le comportement des animaux.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour prélevés les organes d’intérêt

Remplacement

- Remplacement : Afin de proposer une thérapie cellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses humaines et murines dans un modèle pré-clinique pertinent chez l’animal. Des modèles in vitro ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces cellules ou des molécules ou des vésicules qui en dérivent.

Réduction

- Réduction : le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer (données préliminaires obtenues dans d’autres expériences réalisées au laboratoire)

Raffinement

- Raffinement : toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement. Le bien-être des animaux sera suivi à l’aide d’une grille de score de bien-être. Si les souris ont du mal pour se redresser ou à se nourrir, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition des souris directement dans la cage des animaux.

Choix des espèces

Les souris mâles de la souche utilisée sont susceptibles à l'arthrite au collagène qui est le modèle expérimental de référence pour la pathologie humaine. Les souris doivent être âgées d'au moins 9 semaines et posséder un système immunitaire mature. Les animaux sont utilisés à semaine 9, âge recommandé pour ces modèles d’arthrite induite

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau ou l'implantation d'une canule cérébrale reliée à une minipompe, complétées par un régime gras, des tests métaboliques, un jeûne de 24 heures et des prélèvements sanguins. Le porteur décrit une inflammation post-chirurgicale possible et l'isolement des souris en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire. Il situe l'intérêt du projet dans la recherche de cibles contre l'obésité, notant que ces médicaments sont "particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique", et affirme que cette régulation ne peut s'étudier que chez la souris.

Objectifs

L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. L'organisme doit en permanence recueillir et interpréter des signaux hormonaux, métaboliques et nerveux émis par les tissus périphériques impliqués dans l'utilisation et le stockage de l'énergie (foie, muscle, tissu adipeux). En retour, l'intégration de ces signaux par le cerveau se traduit par la mise en place d'une réponse adaptée au niveau comportemental (manger ou jeûner) et métabolique (production de sucre par le foie et libération de lipides par le tissu adipeux en période de carence, ou bien stockage d'énergie par ces mêmes tissus en période d'abondance). Au niveau du système nerveux central, une région particulière de l'hypothalamus, le noyau arqué (ARC), joue un rôle fondamental dans la signalisation et l'intégration des messages circulants de satiété et de faim. L'ARC contient deux populations neuronales clés dans la régulation du comportement alimentaire : les neurones à Agouti-Related Protein (AgRP) stimulant la prise alimentaire et les neurones à pro-opiomélanocortine (POMC) inhibant la prise alimentaire. Nous avons observé que la prise alimentaire est réduite chez des souris dans lesquelles notre gène d'interêt est invalidé dans les neurones AgRP. Nous voulons maintenant: 1. déterminer les voies de signalisation moléculaires qui sont mises en jeu dans cette population neuronale. 2. Vérifier la réversibilité du phénotype observé chez les souris dont le gène d'intérêt est invalidé. 3. Verifier si la protéine codée par le gène d'intérêt peut être une cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de Type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établie et de façon encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'un gène d'intérêt dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Des mutations du gène étudié ont été trouvées dans de nombreuses cohortes de diabétiques DT2. Nos données laissent entrevoir un rôle spécifique de ce gène dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'a pas été mise en avant jusqu'à présent. Les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage les mécanismes moléculaires reliant notre gène d'intérêt à la prise alimentaire, ce qui sera nécessaire pour déterminer si la protéine codée par ce gène est ou non une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l'obésité. Par ailleurs, l'utilisation d'inhibiteurs ciblant la famille de notre protéine d'intérêt nous permettra de fournir une première preuve de concept qui déterminera si l'inhibition pharmacologique est effectivement une voie à privilégier. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction cellulaire. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints d'obésité.

Procédures

230 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Avant et après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 4 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 90 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Ces animaux subiront, sous anesthésie générale, l’implantation par chirurgie stereotaxique d’une canule dans une zone particulière du cerveau. La canule est reliée à une minipompe implantée sous la peau du dos au cours de la même chirurgie. 1 semaine avant et 1 mois après la chirurgie, un prélèvement sanguin à la veine temporo mandibulaire (durée : 30-45 sec.) est réalisé sur les animaux vigiles. Par ailleurs, au cours du mois suivant la chirurgie, ces animaux seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le premier nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements d’une goutte de sang (2µl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le 2ième nécessitera 4 injections IP (1 inj/jour - durée 10 sec.)

Impact sur les animaux

La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post-chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim) qui, pour habituer les animaux, nécessite une injection IP de NaCl0.9% quotidienne pendant jours sans aucun effet prévu. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Un troisième test est décrit, il s'agit d'un test de tolérance au glucose. Un bolus de glucose est administré par voie IP, ce qui aura pour effet l'élévation de la glycémie (taux de glucose sanguin). La glycémie est mesurée à différents temps pour évaluer la capacité à Les animaux recevront une injection stéréotaxique qui pourra provoquer une inflammation post-chirugie. La procédure pour tester la sensibilité à la ghréline nécessite l'injection quotidienne intrapéritonéale de NaCL 0.9% afin d'habituer les souris avant le jour du test. Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche gras pour créer une environement obésogène sera mis en place chez les souris traitées avec l'inhibiteur pharmacologique, ce qui peut creer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisees dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 340 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs tests métaboliques (avec un temps de récupération adapté pour les animaux) seront réalisées sur les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Les animaux sont surveillés par le personnel qualifié tous les jours. Le stress lié aux procédures nécéssitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Chaque semaine, la prise de poids, la quantité de nourriture sont mesurées permettant ainsi un suivi hebdomadaire des souris. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour réduire tout inconfort ou douleur qui se développerait et des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Tout signe de douleur sera pris en charge en prenant les mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé, après avis vétérinaire. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formé spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Dans le domaine du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles le gène codant pour la protéine CaMK1D est invalidé. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgées de 8 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale (PE3)

200 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'un antigène et d'un adjuvant sous la peau ou dans le derme, puis des prélèvements sanguins aux oreilles sur animaux vigiles, avant un prélèvement terminal au cœur sous anesthésie, pour produire des anticorps polyclonaux destinés à la recherche ou au diagnostic. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose. Sur le remplacement, il affirme que la production d'anticorps polyclonaux ne peut être reproduite in vitro de façon satisfaisante et retient donc le lapin pour son volume sanguin et sa réponse immunitaire.

Objectifs

Produire sur lapins de grandes quantités de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigés contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic.

Bénéfices attendus

L'antigène est produit par le demandeur qui doit fournir des informations permettant d'évaluer une toxicité intrinsèque de la molécule injectée, et les possibles conséquences sur l'état général de la production d'anticorps contre cette molécule. En fonction des informations fournies et du risque évalué, il pourra être demandé de tester la toxicité de la molécule in vitro dans un modèle cellulaire avant de l'injecter au lapin.

Procédures

Injections sous-cutanées ou intra-dermiques sur animaux vigiles : 200 lapins. Durée, quelques secondes Prélèvement sanguin (oreilles) sur lapins vigiles : 200 animaux. Acte qui dure quelques secondes Prélèvement sanguin (cœur) sur lapins anesthésiés (acte terminal) animaux : Acte qui dure quelques minutes

Impact sur les animaux

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 72h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux). Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. Certains tests pour évaluer la toxicité d’antigène seront réalisés in vitro avant l’animal.

Réduction

Dans la très grande majorité des cas, un seul animal est nécessaire pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire d'utiliser 2 ou 3 animaux. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 40 animaux par an.

Raffinement

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 72h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes clinique malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce de taille intermédiaire (on peut utiliser aussi la souris, des petits ruminants ou des équidés) dont la réponse immunitaire et le volume sanguin circulant permettent d'obtenir les quantités d'anticorps nécessaires aux projets des entités de recherche Jeune adulte de 2,7 à 3 kg (âge optimal pour la réponse immune)