Recherche fondamentale

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intradermique puis, cinq jours plus tard, une injection dans la voûte plantaire des deux pattes arrière pour déclencher une réaction inflammatoire, sans analgésique afin de ne pas interférer avec l'inflammation. Le porteur teste des cellules stromales mésenchymateuses censées réduire cette inflammation, en vue de traitements de l'arthrose et de la polyarthrite. Il affirme que les modèles in vitro ne suffisent pas à évaluer l'efficacité dans un contexte inflammatoire complexe.

Objectifs

Dans le cadre du traitement des pathologies ostéo-articulaires telles que l’arthrose ou la polyarthrite rhumatoïde, ldifféretnes approches de thérapies cellulaires sont en cours d’évaluation. Notre projet de recherche consiste à étudier les capacités thérapeutiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) pour diminuer l’inflammation associée à ces maladies. L’évaluation des propriétés anti-inflammatoires des CSM (ou de molécules thérapeutiques libérées par ces cellules) peut être effectuée dans un modèle inflammatoire simple, avant d’avoir recours à des modèles plus complexes et plus lourds à mettre en œuvre. Le modèle que nous utiliserons est le modèle d’hypersensibilité retardée (DTH) chez la souris. Le projet repose sur l’utilisation des cellules stromales mésenchymateuses murines ou humaines. La voie d’injection des cellules est locale. En parallèle, nous évaluerons les mécanismes moléculaires mis en place par ces cellules en utilisant des cellules souches mésenchymateuses déficientes pour l’expression de certains gènes et nous déterminerons l’impact de ces molécules sur l’effet thérapeutique des cellules.

Bénéfices attendus

Le modèle d’hypersensibilité retardée est un modèle rapide, simple et reproductible d’inflammation permettant d’évaluer l’efficacité d’un traitement immunomodulateur médié par les cellules stromales mésenchymateuses et des molécules ou des vésicules extracellulaires qu’elles libèrent. Grâce à ce modèle, nous pourrons valider in vivo une molécule identifiée in vitro ou un nouveau médicament cellulaire plus efficace sur l’inflammation que les approches thérapeutiques déjà en cours d’évualuation clinique chez les patients souffrant de pathologies ostéo-articulaires avec notamment des atteintes inflammatoires importantes. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement efficace des pathologies ostéo-articulaires. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire en identifiant des traitements plus efficaces aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge de l’inflammation des patients touchés par ces pathologies

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intra-dermique puis 5 jours plus tard, à une injection au niveau de la voûte plantaire des deux pattes arrière. Toutes les injections se feront sous anesthésie générale gazeuse (maximum 5 min/animal) au moment de l’intervention.

Impact sur les animaux

Nuisance et effets indésirables : la douleur induite par les injections de BSA méthylée en intradermique puis dans la voûte plantaire des souris sera de degré modéré et ne nécessitera pas l’administration d’analgésique qui pourrait interférer avec les mécanismes d’inflammation. Un stress lié à l’anesthésie peut être présent mais sans impact sur le comportement des animaux. Concernant les molécules qui seront testées : elles auront été sélectionnées et validées in vitro auparavant pour leur effet anti-inflammatoire. Il n’est donc pas attendu qu’elles puissent générer un effet indésirable

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de la procédure.

Remplacement

Avant de proposer une thérapie cellulaire ou acellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des traitements proposés dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte complexe d’inflammation rencontré in vivo.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et une analyse statistique afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour chaque expérience. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe expérimental afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux.

Raffinement

Enrichissement du milieu : Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle quotidien. L’injection des traitements est réalisée sous anesthésie gazeuse générale. Surveillance liée aux procédures : Les souris seront observées quotidiennement et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés et consignés dans une grille de score. Les points d’injection seront désinfectés à la vétédine avant et après injection et surveillés quotidiennement. Jusqu’à présent, nous n’avons jamais mis en évidence de signes d’irritation aux sites d’injection. La durée très courte de l’expérience garantit également une limitation de la douleur dans le temps.

Choix des espèces

Le modèle murin d’hypersensibilité retardée a été choisi parce qu’il présente l’avantage d’être simple, rapide et qu’il permet d’évaluer rapidement l’effet anti-inflammatoire d’un traitement avant d’avoir recours à des modèles in vivo plus complexes. Les animaux sont utilisés à semaine 7, âge recommandé pour ce modèle murin.

8 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort, toutes réintégrant ensuite le troupeau. On leur injecte dans un quartier de la mamelle un composé inflammatoire qui provoque une fièvre brève et une douleur à la palpation entre quatre et douze heures, avec des prélèvements de lait et de sang. Le porteur indique qu'aucun analgésique n'est administré car il fausserait l'inflammation étudiée. Il affirme que cette approche évite une infection bactérienne expérimentale qui condamnerait les animaux à l'équarrissage.

Objectifs

Ce protocole s’inscrit dans le cadre de travaux visant à améliorer la résistance des animaux aux mammites, ces dernières représentant une des maladies majeures à ce jour en élevage bovin. Notre but est de mieux connaître les globules blancs, et plus particulièrement les neutrophiles qui ont un rôle essentiel dans la défense des vaches contre les mammites. Les neutrophiles sont les premières cellules immunitaires à arriver sur le site de l'inflammation mammaire lors des mammites bovines, d’où l’importance de la connaissance précise de ces cellules. Parmi les globules blancs des bovins, ces neutrophiles se répartissent en deux sous-groupes, chacun possédant des propriétés spécifiques soit d'activation ou de diminution de la réponse inflammatoire. L'objet de la présente demande est de nous permettre de caractériser finement les neutrophiles de la glande mammaires lors d'une inflammation et d’étudier comment les proportions et les activités biologiques respectives de différents types de neutrophiles évoluent, à la fois dans le sang et dans le lait, lors d'une inflammation mammaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration de la résistance des vaches laitières aux mammites. Il contribuera à une meilleure connaissance des neutrophiles recrutés dans le lait lors d'une inflammation et de leur rôle dans le contrôle de cette inflammation. Les données préalables recueillies dans le cadre du projet Masticells suggèrent que la proportion des neutrophiles régulateurs parmi les neutrophiles du lait à différents temps après déclenchement d'une mammite sont variables. Ces neutrophiles régulateurs ayant des capacités de modulation de la réponse immunitaire de l'hôte, ils pourraient intervenir dans les processus de contrôle de l'inflammation et potentiellement de réparation tissulaire après inflammation. A termes, cette meilleure caractérisation des neutrophiles du lait pourrait être introduite dans les critères d’amélioration génétique de la résistance des vaches laitières aux mammites.

Procédures

Une inflammation mammaire sera induite par injection, via le canal du trayon, d'un composé inducteur d'inflammation dans un des 4 quartiers de la glande mammaire des 8 vaches recrutées. Des prélèvements de lait (2x40ml) et de sang (à la jugulaire) sont prévus à 4 temps (t=0h, 4h, 72h et 144h post-injection de LPS).

Impact sur les animaux

Compte-tenu des travaux antérieurs et des données de la littérature, l'injection du composé inflammatoire (LPS) induira une inflammation locale de courte durée (plus de signes locaux d'inflammation 12h après injection) accompagnée d’une fièvre de courte durée (pic de température rectale à 8h post-injection et retour à une température normale 12h post-injection). Le quartier injecté est douloureux à la palpation entre 4h et 12h post-injection. L’état général, l’intensité de l’inflammation locale et la douleur sont évalués à l’aide d’une grille de notation. L’utilisation d’un médicament pour limiter la douleur (analgésique) n ‘est pas possible en raison de son impact sur le déroulement de l’inflammation. Les prises de sang ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à la contention lors de la distribution des aliments. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.

Devenir

Les animaux réintègreront le troupeau de l’unité expérimentale sur décision de la personne responsable du bien-être des animaux. La réponse inflammatoire consécutive à l'injection de LPS est de courte durée. Ce traitement n’engendre classiquement que peu d’inconfort et, par ailleurs, les animaux seront dans tous les cas soignés en cas de pathologie.

Remplacement

Les informations collectées lors de ce protocole porteront sur l'espèce concernée par les mammites (vache). L'approche proposée permet de remplacer une infection bactérienne expérimentale qui condamnerait les animaux à l'équarissage. Cette méthode alternative permet l'évaluation globale des premières étapes de la réponse au niveau de l’animal entier. Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de modèle in vitro permettant de reproduire le recrutement des neutrophiles sanguins dans la glande mammaire suite à une infection mammaire.

Réduction

Huit vaches laitières en lactation seront incluses dans le projet. Ce nombre permet d'obtenir une valeur médiane des proportions de neutrophiles régulateurs dans le lait lors d'une inflammation mammaire. Nous comparerons l'évolution de ce pourcentage à différents points au cours de l'inflammation (t=4h, t=72h, t=144h). Les proportions des neutrophiles régulateurs aux différents temps seront analysées statistiquement par des approches de statistiques adaptées aux petits échantillons. Ce nombre a été déterminé pour satisfaire une condition de validité du test statistique qui sera utilisé (effectif d'au moins 5 animaux) et prendre en compte la possibilité d'une non-réponse de certains animaux (situation rencontrée lors de tests précédents à une fréquence de 5%). La capacité maximale de l'installation est de 8 animaux traités simultanément. Ce nombre d'animaux permettra de traiter tous les animaux en une seule série et ainsi contrôler des variations qui auraient été liées à plusieurs séries espacées dans le temps. Les variables contrôlées seront la race des animaux et le stade de lactation : les animaux seront de la même race (Prim'Holstein) et seront en milieu de lactation (entre 3 et 7 mois).

Raffinement

L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité et la durée de l’inflammation et permet de mimer les premières étapes d’une vraie infection. Les animaux seront gardés à proximité des bâtiments le jour de l’injection afin de pouvoir les surveiller de façon suivie. Tout signe d’une dégradation de l’état de santé d’un des animaux entraînera l’intervention du vétérinaire praticien de l’unité. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être pris au cornadis pour la distribution des aliments. Elles sont réalisées par du personnel expérimenté. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le bovin. Il s’agit de vaches laitières de race Prim’Holstein en lactation. Les travaux sont réalisés sur la vache laitière car c'est une des espèces sujette aux mammites. Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Il s'agit de vaches adultes (âgées de 3 à 6 ans) en lactation (stade de lactation entre 3 et 7 mois) non mises en reproduction.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux âgés de 2 à 30 jours subissent une chirurgie d'injection intra-cochléaire de vecteurs, sont séparés de leur mère le temps de l'intervention, puis tués par dislocation cervicale quinze jours plus tard pour étudier leur cochlée. Le porteur indique qu'aucun modèle in vitro d'oreille interne ne permet de tester la diffusion des vecteurs dans le temps. Une éventuelle application aux surdités humaines est renvoyée à une dizaine d'années, après des tests sur des porcs.

Objectifs

Notre projet a pour objectif de corriger certaines surdités d’origine génétique, grâce au développement de nouveaux transporteurs (vecteurs) non viraux permettant d’acheminer l’information génétique corrigée aux cellules de l’organe de l’audition, la cochlée, afin de restaurer les capacités auditives. Ces tests seront réalisés sur des souris C57/Bl6, dont l'oreille interne est bien caractérisée et proche de celle de l’homme. Objectif : Optimiser les conditions d’utilisation (efficacité, localisation) de vecteurs non viraux au sein de la cochlée.

Bénéfices attendus

Le développement de vecteurs non viraux efficaces au niveau de l’oreille interne pourrait permettre leur utilisation pour corriger les surdités congénitales humaines. Celles-ci sont actuellement traités par appareillage auditif ou implantation cochléaire en fonction de l’intensité de la perte auditive. Bien que ces traitements soient dans la majorité des cas efficaces, les résultats sont imparfaits dans certaines conditions, notamment pour la compréhension de la parole en milieu bruyant. Le développement d’alternatives permettrait d’optimiser la correction apportée, et améliorer la qualité de vie des individus ayant une surdité congénitale. Le temps estimé du projet est de 2 ans. En fonction des résultats, notamment de l’efficacité et de la localisation, nous pourrons cibler au mieux certaines anomalies génétiques provoquant une surdité. Nous testerons l’efficacité de la thérapie génique sur des modèles murins, pour une durée estimée de 4 ans, car nécessitant un suivi plus prolongé. Si l’efficacité est confirmée, des tests sur modèles porcins seront nécessaires avant une potentielle utilisation chez l’homme, dans une dizaine d’années.

Procédures

180 souris auront une injection intra cochléaire (chirurgie d'une durée de 5 à 8 minutes sous anesthésie générale) à 2 ou 15 ou 21 ou 30 jours après la naissance et seront mises à mort 15 jours après l'injection.

Impact sur les animaux

Les procédures d’injection intra cochléaire peuvent être source d’inconfort pour les animaux (douleur, risque d’infection), pendant environ une semaine. Les pesées réalisées quotidiennement après injection seront source de stress, les 3 premiers jours, puis tous les 3 à 4 jours, soit 5 à 6 pesées par animal. Les souris à un âge précoce seront séparés de leur mère pendant une dizaine de minutes le temps de l'injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par dislocation des vertèbres cervicales, pour étude des cochlées.

Remplacement

La conformation 3D des explants utilisés in vitro est incomplète, et ne permet pas de refléter la diffusion in vivo. De plus, ces explants ont une durée de vie limitée de 3 à 5 jours. Il n’existe pas actuellement de modèle d’oreille interne utilisable in vitro permettant de tester la transfection au cours du temps, et dans les mêmes conditions 3D qu’in vivo, et il n’existe pas non plus de lignées de cellules ciliées de cochlées , ou de culture primaire de cellules ciliées à partir de prélèvement, qui permettraient de cibler spécifiquement les cellules d’intérêt. Le remplacement est donc impossible.

Réduction

Des explants d’oreille interne ont été utilisés in vitro permettant de sélectionner les 2 vecteurs les plus efficaces, à partir de prélèvements réalisés sur animaux mis à mort hors champ réglementaire et autorisés par la structure bien-être de l'établissement. Après utilisation de 36 animaux, si l'analyse statistique intermédiaire (Test de Mann-Whitney) montre des résultats significatifs, le projet sera poursuivi sur 144 animaux.

Raffinement

En complément de l'anesthésie générale, des anesthésiques locaux seront utilisés pour gérer la douleur post-opératoire générée par l’injection de vecteurs et l’incision réalisée au niveau de l’oreille interne. Concernant le suivi journalier des animaux, des grilles de soin adaptées à notre procédure ont été établies afin d’identifier pour chaque animal les points limites et points limites terminaux permettant de prendre en charge immédiatement les signes de stress, d’angoisse ou de douleur.

Choix des espèces

L'utilisation de souris pour étudier de nouveaux transporteurs (vecteurs) au sein de l’oreille interne est pertinente car : -L’oreille interne de souris est morphologiquement proche de celle de l’homme -Nous maîtrisons la technique chirurgicale nécessaire à la mise en place de ce modèle, qui ne provoque pas de baisse d'audition. Les injections seront réalisées 2 ou 3 jours après la naissance, équivalent du stade embryonnaire chez l’homme, en termes de développement de l’oreille interne. Les souris étant sourdes à cet âge, à 15 jours de vie, au début du développement de l’oreille interne, à 21 jours de vie en cours de développement de l’oreille interne et à 30 jours de vie à la fin du développement de l’oreille interne. Différentes études ont montré des différences en termes de répartition des transporteurs (vecteurs) en fonction de l’âge des souris.

960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de sept jours, chaque raton subit une chirurgie du cerveau pour léser l'hippocampe, 320 recevant plus tard un implant d'électrodes, puis les animaux sont exposés à l'alcool et isolés durant l'adolescence avant d'être tués pour vérification histologique. Le porteur justifie le rat par l'auto-administration d'alcool, plus difficile à observer chez la souris, et par la reprise d'un modèle déjà utilisé au laboratoire. Il indique utiliser mâles et femelles pour ne pas avoir à éliminer d'animaux surnuméraires.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact à l'adolescence d'expositions précoces aux drogues sur les troubles du comportement et sur la transmission dopaminergique au sein du noyau accumbens dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'alcool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agents cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission dopaminergique. En effet la dérégulation de ce système de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la consommation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie. A ce jour, aucune étude ne s'est intéressée aux effets à court terme des expositions précoces aux drogues dans les modèles de schizophrénie.

Bénéfices attendus

Il a déjà été montré que l'exposition précoce à l'alcool durant l'adolescence est nécessaire pour l'observation à l'âge adulte d'une consommation exagérée d'alcool. Néanmoins, nous n'avons pour le moment aucune information concernant la co-exposition avec des agents cannabinoides, drogues très fréquemment consommées par les adolescents et les jeunes adultes atteints de schizophrénie ou non. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques précoces qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact à l'adolescence d'une exposition précoce à des drogues couramment utilisées sur les systèmes dopaminergiques.

Procédures

Tous les animaux du projet (soit 960 ratons mâles et femelles) subiront une chirurgie à l'âge de 7 jours. Cette opération ne dure jamais plus de 20 minutes et se fera sous anesthésie générale et sous anesthésie locale. Par la suite à l'adolescence 320 rats subiront une seconde chirurgie qui ne durera pas plus de 30 minutes. De plus, les animaux auront la possibilité d'avoir accés à de l'alcool (10% à l'adolescence pendant 15 jours et 20% pendant 4 semaines à l'âge adulte). Cette exposition à l'alcool se fera de manière volontaire par les animaux puisqu'ils seront soumis à un protocole de libre choix à 2 bouteilles, une bouteille contenant la solution d'alcool et une bouteille d'eau.

Impact sur les animaux

Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à J7 suite à la lésion de l'hippocampe ventral par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à environ J50 - J60 suite à l'implantation d'électrodes d'enregistrement par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. Isolement des animaux pendant la période d'exposition à l'alcool à l'adolescence pendant 14 jours.

Devenir

Les procédures initiales ne sont que des étapes qui nous permettent de générer nos animaux modèles de comorbidité. Tous les animaux issus de ces procédures seront répartis en différents groupes expérimentaux avant d'être euthanasiés en fin de protocole pour vérification histologiques des sites de lésions et d'implantations.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant le même modèle NVHL en prenant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet. De plus nous réaliserons les expériences aussi bien sur les mâles que sur les femelles pour ne pas avoir à éliminer les animaux surnuméraires mais également, dans le but d'une réduction, ne pas à avoir à refaire tout ce projet ultérieurement uniquement sur les femelles (et donc euthanasier les ratons mâles surnuméraires à ce moment).

Raffinement

Pour chacune des procédures nous avons mis en place un série de points limites ainsi qu'une grille de scoring du bien-être animal. Une action thérapeutique adaptée sera déclenchée dès q'un point limite sera atteint. « En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe tout au long du projet sauf pendant les périodes d'évaluation de la consommation d'alcool. Ces périodes seront limitées au strict minimum nécessaire et l'isolement sera contrebalancé par une manipulation accrue par les expérimentateurs (enrichissement inter-espèce).

Choix des espèces

Le modèle NVHL est un modèle décrit chez le rat. Pour poursuivre nos études nous devons utiliser le même modèle que précédemment. Le rat est un modèle idéal pour l'étude de la comorbidité troubles de la consommation d'alcool/schizophrénie en particulier en ce qui concerne certaines études comportementales comme l'auto-administration d'alcool qu'il est plus difficile d'observer chez les souris. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. Le modèle de schizophrénie que nous allons utiliser nécessite une lésion de l'hippocampe ventral au 7ème jour de vie. Tous les petits seront ensuite soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle préexposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.

795 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes, elles sont irradiées puis greffées avec des cellules leucémiques humaines, subissent des prélèvements de sang à la joue et des ponctions de moelle osseuse au fémur, avant d'être tuées pour analyse. Le porteur indique que la maladie peut provoquer perte de poids, baisse de mobilité et, rarement, paralysie des membres. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet de cultiver ces cellules leucémiques, trop fragiles hors d'un organisme vivant.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une forme de cancer qui touche les cellules de la moelle osseuse, qui produisent normalement les globules rouges, les plaquettes et les globules blancs. La leucémie est caractérisée par la prolifération excessive et le blocage de la maturation de ces cellules immatures. Les leucémies affectent enfants et adultes, et bien que, ces dernières décennies, de nombreux progrès ont été fait du point de vue thérapeutique, des rechutes fatales sont observées dans 20 % des cas pédiatriques ; chez l’adulte, la survie globale à 5 ans est seulement de 30-40% chez les patients de moins de 60 ans, et de 20% pour les plus de 60 ans. Un sous type particulier de cancers du sang affectant les cellules myéloïdes (les leucémies aiguës à mégacaryoblastes) sont généralement observées chez l’enfant et sont de très mauvais pronostic. Elles résultent d’une prolifération accrue des cellules à l’origine des plaquettes, bloquant ainsi leur maturation en plaquette. Il est donc essentiel de poursuivre la compréhension des mécanismes conduisant à ces pathologies pour concevoir des thérapies ciblées afin d’améliorer la survie des patients leucémiques. L’objectif de notre projet est d’identifier des régions du génome humain qui régulent l’expression de gènes favorisant les cancers. Afin de réaliser cet objectif nous utiliserons un modèle de cancers du sang affectant les cellules myéloide humaine se développant dans des souris dépourvues de système immunitaire et ne pouvant rejeter la greffe, seule façon de modéliser cette maladie.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes conduisant au cancer doit nous conduire à concevoir des thérapies ciblées. Au terme de notre projet, les résultats obtenus devraient contribuer à l’amélioration des traitements proposés aux patients.

Procédures

Nous utiliserons des souris dépourvues de système immunitaire permettant ainsi l'amplification (absence de rejet de la greffe) des cellules tumorales de patients atteints de LAM. Les souris seront irradiées avec une dose suffisamment faible pour ne pas induire leur mort mais permettant la greffe de cellules humaines (durée de l'irradiation: moins de 2 min). Ces cellules seront injectées quelques heures après l’irradiation dans la veine de la queue, aucune anesthésie ou analgésie ne sera nécessaire (durée de l'injection: 30 s). Les souris recevront un traitement antibiotique dilué dans l’eau de boisson durant les 2 semaines suivantes afin d’éviter tout risque d’infection liée à la perte de leur système immunitaire. Des échantillons de sang seront prélevés sur souris éveillée de manière bi-mensuelle dans la veine de la joue, la durée d’un prélèvement est inférieure à une minute. Ces prélèvements seront effectués pendant 3 mois et demi suivant l’injection de cellules. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins deux semaines. Des prélèvements de moelle osseuse réalisés au niveau du fémur pourront être réalisés deux fois maximum à 2 semaines d’intervalle. Pour cela, une anesthésie gazeuse sera effectuée, la durée d’un prélèvement est inférieure à 5 minutes. Une analgésie est prévue afin d’éviter la douleur.

Impact sur les animaux

Une perte de poids, une réduction de la mobilité et une négligence du toilettage pourraient être observés chez les animaux lors de la progression de la leucémie. Une paralysie des membres inférieurs peut être observé dans de très rares cas. L’irradiation sublétale des animaux, conduisant à l’ablation des cellules immunitaires, peut rendre les animaux plus susceptibles aux infections. Les prélèvements sanguins itératifs et les biopsies de moelle osseuse peuvent représenter un risque hémorragique.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à différents temps et les organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode alternative permettant de cultiver les cellules leucémiques primaires de patients in vitro. En effet, ces cellules sont extrêmement fragiles et ne peuvent pas être maintenues en vie en dehors d'un organisme vivant. En outre, la culture cellulaire ne permet pas de modéliser les différentes interactions entre les cellules tumorales et l’environnement dans lequel elles prolifèrent. Ces interactions ne sont possibles que dans un organisme entier vivant afin de conserver les interactions des cellules leucémiques avec les cellules des organes environnants.

Réduction

Grâce à des analyses statistiques, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements, ...etc.). De plus, un suivi clinique des souris sera également entrepris 2 fois par semaine pour détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. L'administration d'un antalgique sera réalisée en cas de douleur légère avant l'euthanasie de l'animal si son état se dégrade soudainement. Enfin, les cages où sont maintenus les animaux feront l’objet d’un change hebdomadaire, et nous nous assurerons d’y apporter le maximum d’enrichissements (Social : les souris seront en groupe de 5 pour favoriser les interactions sociales entre elles. Matériel : bûchettes en bois, papier kraft, tunnels, ...etc.).

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Les souris seront des souris adultes afin de maximiser la prise de greffe comme cela a été décrit auparavant dans la littérature scientifique.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, jusqu'à sept par animal, et du LPS qui provoque un état de type septique avec fièvre, diarrhée et tremblements, ces derniers servant de point limite, ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le porteur affirme que l'étude de la protéine visée ne s'envisage que dans un "organisme complet" et non sur un modèle cellulaire. Les débouchés annoncés pour l'aplasie fébrile de l'enfant restent formulés comme des perspectives.

Objectifs

Le traitement des cancers de l’enfant utilise la chimiothérapie, qui peut transitoirement entrainer un déficit d’immunité appelé aplasie. Durant cette période, les enfants présentent souvent des épisodes de fièvre, pouvant être sévères et entraîner la mort. Devant ce risque, des mesures importantes sont mises en place avec hospitalisation en urgence et utilisation d’antibiotiques. Les infections en cours d’aplasie fébrile restent une réelle complication avec risque de décès chez ces enfants malades. Onze à 24 % vont présenter une bactériémie (présence d’une bactérie dans la circulation sanguine), facteur de risque de décès en contexte d’aplasie fébrile. En effet, la mortalité au cours des aplasies fébriles chez l’enfant est estimée entre 0,2 et 3 %, pouvant s’élever jusqu’à 10% chez les patients avec une bactériémie. Les infections à Pseudomonas aeruginosa gardent une place majeure tant par leur fréquence que par leur sévérité. A ce jour, il n’existe pas de marqueur biologique pouvant prévenir la gravité d’une aplasie fébrile. Il existe des molécules de danger, libérées dans le corps en période d’infection, et qui sont néfastes pour l’organisme (inflammation majorée, formation de caillots sanguins). Des études publiées montrent que neutraliser ces molécules de danger peut avoir un effet protecteur, améliorant le pronostic au cours d’une infection sévère. Des travaux préliminaires réalisés chez l’adulte présentant une infection sévère et généralisée, suggèrent que la protéine X, naturellement produite par l’organisme, est capable d’inhiber les effets délétères de certaines molécules de danger. Notre projet repose sur l’hypothèse que, chez l’enfant présentant une aplasie fébrile, le taux sanguin de X peut prédire la sévérité de l’infection. Notre étude s’articule en 2 axes : (1) une étude clinique portant sur l’intérêt du dosage de X dans une population pédiatrique suivie en oncologie et (2) une étude chez la souris mesurant la synthèse et l’élimination de X au cours de l’infection et évaluant son potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les débouchés cliniques sont multiples : (i) évaluation de nouveaux marqueurs permettant de prédire la gravité d’un épisode d’aplasie fébrile, (ii) orientation vers le type de pathogène (bactérien, fongique, viral), (iii) proposition d’escalade ou de désescalade de la prise en charge anti-infectieuse, notamment dans le contexte des tumeurs solides pédiatriques et enfin (iiii) un potentiel impact thérapeutique.

Procédures

Dans les quatre procédures de l’étude, les animaux seront traités par des injections intrapéritonéales. Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Dans les quatre procédures de l’étude, des prises de sang seront réalisées. Sous anesthésie gazeuse (moins de 5 minutes), la prise de sang rétro orbitaire permet la récolte de 50 à 100µL de sang en moins de 2 minutes, sans traumatisme et sans douleur. Lorsqu’un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement (avec réveil). Procédure 1 : pour chaque animal • 1 injection intra péritonéale • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 2 : pour chaque animal • 2 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie • • Procédure 3 : • 3 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 4 : • 7 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’administration de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux des procédures 1, 3 et 4. Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre de sous-cutanées qu’un un animal pourra recevoir. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Impact sur les animaux

Ce projet étudie le sepsis, c’est-à-dire une inflammation systémique déclenchée par le LPS (lipopolysaccharide = endotoxine), mimant ainsi une infection bactérienne, chez le sujet soumis à une chimiothérapie aplasiante. Une inflammation systémique donne classiquement de la fièvre. Les souris pourront présenter, suivant la dose reçue (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une fatigue et une douleur potentielle. Une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une diarrhée transitoire, une modification de comportement par l’absence de mobilité pourront être observées. A une dose plus importante de LPS, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés. Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. 1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle concerne tous les animaux du projet. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle permet, sous anesthésie gazeuse, une récolte de sang rapide, sans traumatisme et sans douleur. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’injection de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Devenir

Nous souhaitons doser la molécule X ainsi que diverses molécules pro-inflammatoires dans le sang des animaux mais aussi dans des organes comme la rate, le foie, les poumons et les reins qui sont très touchés par l’orage cytokinique déclenché par le sepsis. Les animaux seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Le métabolisme de la protéine X est mal connu à ce jour. Sa synthèse est probablement mixte, avec une production (i) par les cellules sanguines), mais également (ii) par d’autres tissus, dont les endothéliums vasculaires (=vaisseaux sanguins). L’étude de cette protéine ne peut donc s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. Un modèle murin parait être le plus adapté à l’étude de cette protéine.

Réduction

Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre de contrôles internes obligatoires en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre minimal d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 40% d’écart type intra lot est de 10 (Berndston et al. J ANIM SCI 1991). La cinétique des réponses immunitaires pouvant varier d'une expérience à l'autre, celles-ci seront répétées au minimum deux fois pour renforcer l'approche statistique (Cf. chronogramme associé au dossier).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, selon l’annexe III de la directive 2010/63/CE, les souris seront hébergées en cages collectives (5 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général selon les critères de Lloyd et al. (Lab animal management and welfare, 1994). Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la facilité d'introduire une modification génétique chez ces espèces, à la grande taille des portées, au temps de génération court et à la relative facilité d'hébergement et de soins. De plus, la littérature scientifique décrit de nombreux modèles murins de sepsis. Nous disposons au laboratoire, d’une lignée de souris de fond génétique C57BL/6 chez laquelle le gène de la protéine X, étudiée dans ce projet, est rendu non fonctionnel. Cette technique couramment utilisée en recherche pré-clinique permet de démontrer l’importance d’une protéine dans un modèle donné. Notre étude porte sur l’aplasie fébrile pédiatrique. Nous utiliserons donc des animaux de 4 à 5 semaines, sevrés mais n’ayant pas atteint la maturité sexuelle.

576 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un composé par gavage oral répété pendant 13 à 19 jours, 180 d'entre eux subissant en plus une perfusion intracardiaque sous anesthésie sans réveil, et tous sont tués pour analyser leur cerveau et leurs tissus. Le porteur mesure les capacités d'apprentissage par le test de la piscine de Morris et justifie le rat par l'absence de modèle spontané de trisomie 21 et sa proximité génétique avec l'espèce humaine. Le bénéfice annoncé, déplacer de quelques points le quotient intellectuel des patients, reste un objectif lointain avant tout passage en clinique.

Objectifs

Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement crânio-facial et le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent des anomalies crânio-faciales ainsi qu’une une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observée dans la T21. Des collaborateurs proposent des composés ayant la propriété d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons tester l’un de ces composés sur nos modèles rats de la trisomie 21. Ce composé est synthétisé et testé pour l’ADME pharmacologique (administration, distribution, métabolisation et excrétion) par nos collaborateurs. Divers dérivés de ce composé ont été préalablement testés au sein de notre laboratoire sur des modèles souris de la T21, permettant ainsi une amélioration des fonctions cognitives de ce modèle sans aucun effet toxique observé. Sachant que le métabolisme des souris et des rats sont différents, ici nous souhaitons optimiser le traitement sur le modèle rat. Dans ce projet, le composé testé sera administré par notre équipe à des rats modèles de la T21 et à des rats contrôles dans le but de s’assurer qu’ils n’ont pas d’effet toxique. Les rats feront l’objet d’une étude comportementale afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives. Le composé sera testé à différents temps et différentes doses afin d’identifier la durée et la dose minimales nécessaires pour obtenir un rétablissement des fonctions cognitives des rats trisomiques.

Bénéfices attendus

Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la Trisomie 21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la trisomie 21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. De plus, dans le cadre de cette étude, réussir à reproduire sur le modèle rat, les résultats obtenus sur les modèles souris de la Trisomie 21, nous permettra une généralisation des résultats avant le passage en phase clinique du candidat-médicament.

Procédures

Dans le cadre de cette étude, un gavage oral répété sera réalisé sur un total de 576 rats. Ce gavage sera effectué sur un même rat soit 19 fois (étude sur 19 jours), soit 13 fois (étude sur 13 jours). La réalisation du gavage prend 1 à 2min pour un rat par jour. De plus, au cours de ce projet nous réaliserons une perfusion par voie intracardiaque sur 180 rats des 576. La procédure qui est sans réveil sera réalisée une seule fois par rat et elle dure 30min par rat. Pour cela il nous faudra anesthésier l’animal via une administration d’anesthésiant par voie intrapéritonéale. Ce geste nécessaire pour réaliser l’exsanguination de l’animal sous anesthésie générale profonde est réalisé en 1 à 2min par rat.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, un gavage oral répété sera réalisé sur un total de 576 rats. Ce gavage sera effectué sur un même rat soit 19 fois (étude sur 19 jours), soit 13 fois (étude sur 13 jours). La réalisation du gavage prend 1 à 2min pour un rat par jour. Ce geste technique peut entraîner un stress non négligeable, une irritation de l’œsophage et un risque de fausse route existe. De plus, au cours de ce projet nous réaliserons une perfusion par voie intracardiaque sur 180 rats des 576. La procédure qui est sans réveil sera réalisée une seule fois par rat et elle dure 30min par rat. Pour cela il nous faudra anesthésier l’animal via une administration d'anesthésiant par voie intrapéritonéale qui réalisé en 1 à 2min par rat. L’anesthésie de l’animal via l’introduction d’une aiguille par voie intrapéritonéale peut entraîner un stress à l’animal.

Devenir

A l’issu de la procédure expérimentale : Gavage oral d’inhibiteurs de Dyrk1A dans des rats modèles de la trisomie 21, l’ensemble des 576 rats seront mis à mort. 180 rats sont mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques sur le cerveau des animaux, et les 396 autres rats seront euthanasiés selon les bonnes pratiques de laboratoires, les tissus prélevés sur ces derniers seront utilisés pour des analyses moléculaires.

Remplacement

Le rat est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique de cette espèce sont bien connues. Son génome aisément manipulable permet de multiples applications telles que la création de modèles de pathologies humaines. De plus, la nécessité d’utiliser des animaux transgéniques est liée à l’absence de tout modèle spontané de trisomie 21 dans une espèce mammifère autre que l’Homme. De plus, l’intérêt d’utiliser le rat est de pouvoir comparer les résultats obtenus à ceux de la souris. En effet, comme on le sait, il peut exister des différences inter-espèces et il est donc important de comparer les résultats entre deux organismes-modèles. Si des résultats similaires sont obtenus entre les deux espèces, cela permettra une généralisation de ces résultats.

Réduction

Pour ces tests, des rats mâles et femelles seront utilisés à partir de 10-12 semaines, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons le composé sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. De plus, le traitement sera aussi effectué sur des animaux contrôles dans le but de vérifier qu’il n’y ait pas d’effet toxique. La variabilité inter-individu observée dans les études comportementales nécessite de tester 12 à 16 animaux par groupe pour avoir un résultat significatif avec une puissance statistique suffisante. C’est pourquoi nos expériences sont construites sur des groupes de 16 mâles et 16 femelles au maximum par condition. Il nous faudra donc un total de 576 rats dans ce projet (16 rats x 6 groupes x 2 sexes x 3 conditions = 576 rats).

Raffinement

Préalablement aux études des analyses de pré-tox ont été réalisé par nos collaborateurs, pour s’assurer que les molécules n’ont pas d’impact majeur sur les animaux après administration. L’administration des composés sera réalisée par gavage oral durant 19 et 13 jours continus comme expliqué précédemment. Au cours du traitement nous procéderons aux études du comportement : le test de la piscine de Morris. Durant toute l’étude, les animaux feront l’objet d’un contrôle journalier pour vérifier leur bien-être. Les animaux présentant des signes de douleurs seront évalués suivant l’échelle de l’expression faciale et seront exclus des tests puis soignés ou euthanasiés selon la situation et l’avis du vétérinaire. Concernant la procédure de perfusion intracardiaque, elle est effectuée sous anesthésie générale pour éviter tout stress et limiter la douleur de l'animal.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. N’existant pas de modèle spontané de la trisomie 21, le rat avec la souris, sont les seules espèces physiologiquement et génétiquement proches de l’Homme dans lesquelles nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que ces modèles permettent d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes lors de l’optimisation de composé pharmacologique. En outre, le génome du rat étant aisément manipulable, permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du syndrome de Down. De plus, l’intérêt d’utiliser le rat est de pouvoir comparer les résultats obtenus à ceux de la souris. En effet, sachant qu’il existe des différences inter-espèces il est intéressant de comparer les résultats entre les modèles souris et rats afin de généraliser les résultats si ces derniers sont similaires. Enfin, le rat ayant des capacités d’apprentissage plus performantes que la souris, il est un meilleur modèle pour l’étude des déficiences cognitives associées à la trisomie 21. Les rats seront étudiés à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 10-12 semaines, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes d’apprentissage et de mémorisation sont présents.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules de mélanome pour développer une tumeur et des métastases, puis sont tuées par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever tumeur et organes. Le porteur indique que la tumeur peut atteindre 1 500 mm3, seuil déclenchant l'arrêt de l'expérience. Il affirme que la formation de métastases ne peut être modélisée qu'in vivo et conclut que l'étude sur animal est inévitable.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche CPER FEDER destiné à étudier le rôle des cellules stromales mésenchymateuses et à identifier l’expression des micro-ARN (miARN) lors du développement de tumeurs métastatiques. Les métastases sont une cause majeure de décès chez les patients atteints de tumeurs malignes. Les miARN sont des petits ARN régulateurs de l'expression génique. Une modification de l’expression de ces miARN peut contribuer au développement tumoral et à la dissémination métastatique par dérégulation de l’expression de gènes impliqués dans des processus clés du cancer. Le système du complément a démontré des rôles dans la régulation de la croissance tumorale, bien que ceux-ci puissent différer selon les types de tumeurs. C3a a une fonction prépondérante de médiateur dans les phénomènes inflammatoires au sein des tissus. Le ciblage spécifique du système du complément peut être d'une grande importance et valeur dans le futur traitement des tumeurs. Nous utiliserons le modèle de tumeurs induites par l’administration sous cutané de cellules B16-F10 chez les souris C57BL/6. Ce modèle permet le développement de tumeurs primaires et de métastases dites « spontanées », ce qui correspond étroitement à celles développées par les humains. Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée et seront réalisées dans les conditions les moins stressantes possibles pour les animaux. Dans un souci permanent du bien-être animal et afin de minimiser l’emploi des animaux de laboratoire, l’évaluation de l’expression des miARN dans un contexte cancéreux sera réalisée en priorité dans des modèles in vitro. Ce projet engagera des souris dans un nombre estimé à 45 individus pour la durée que couvrira ce projet. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque lot de chaque procédure est réduit, il correspond au seuil minimal qui puisse nous permettre d’apprécier, avec nos moyens techniques et en fonction de la variabilité inter-individus, les effets désirés. Par ailleurs, l’hébergement des animaux pendant la phase d’acclimatation et pendant l’expérimentation sera faite avec enrichissement du milieu afin d’améliorer leur bien-être. A terme, nos travaux permettront d’identifier les miARN impliqués dans l’angiogenèse et annonciateurs de formation tumorale et de dissémination métastatique. Ainsi les cancers pourraient être pris en charge à un stade précoce.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront l’identification des miARN annonciateurs de développement tumorale et ainsi permettre une prise en charge plus précoce des patients atteint de cancer, ainsi que de comprendre le mécanisme et l'implication du système du complément dans la tumorigenèse.

Procédures

Induction de tumeurs métastatiques par injection de cellules B16-F10 ou B16-F10/C3a par voie sous cutanée une seule fois à J1. - Prélèvement sanguin (1mL) par ponction cardiaque après anesthésie volatile des souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont des douleurs légères suite aux injections IP des cellules tumorales et le développement de tumeurs métastatiques.

Devenir

Après l'injection sous cutanée, les souris seront maintenues en vie jusqu'à la fin de l'étude. Les indivisus seront mis à mort à la fin de l'étude par ponction cardiaque précédée d’une anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d'une dislocation cervicale. Les organes prélevés seront scindés en 5 : 1/5 protéine (analyse par western blot), 1/5 ARN, 1/5 miARN (quantification, qRTPCR), 1/5 isopentane, 1/5 paraffine (analyse immunohistologique). La tumeur sera récupérée.

Remplacement

Remplacement: Nos études in vitro avec les cellules stromales mésenchymateuses pulmonaire et un modèle de cellules cancéreuses apportent quelques résultats sur les miARN impliqués dans cette pathologie. Néanmoins, ce modèle cellulaire ne suffit pas a modéliser le processus de développement tumoral dans son ensemble. La formation de métastases est un processus complexe et ne peut être modélisé que in vivo. L’étude in-vivo est inévitable pour comprendre le rôle des cellules stromales mésenchymateuses dans le développement de tumeurs métastatiques, identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans cette pathogenèse et étudier la capacité du c3a à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression du développement tumoral.

Réduction

Réduction du nombre : Pour chaque condition testée, nous utiliserons un nombre minimal de souris pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Nous utiliserons pour l’étude statistique le test one way ANOVA suivi d’un un test de Bonferroni pour comparer les trois groupes d’animaux entre eux, ainsi qu'un t-test suivi d'un test de Student.

Raffinement

Raffinement : La ponction cardiaque sera réalisée sous anesthésie volatile (isoflurane). Le prélèvement des organes se fera après la mise à mort des animaux. L’évaluation de la qualité de l’anesthésie se fera en vérifiant les 4 étapes suivantes : -l’absence de douleur et/ou de réponse réflexe en exerçant une pression au niveau des doigts de l’animal -L’immobilisation de l’animal -La relaxation musculaire -L’état d’inconscience en vérifiant les mouvements respiratoires. Les souris seront observées 3 fois par jour pendant les 10 premiers jours, puis 1 fois par jour pour le reste de l’expérimentation, dans le but de déceler le plus rapidement possible des signes cliniques critiques dus à l’expérimentation (prostration, température trop élevée, perte de poids, …). Ceci sera basé sur une grille de scoring définie. Chaque situation d’animal montrant des signes d’inconfort ou de souffrance liés ou non à l’expérience sera rapporté au vétérinaire responsable de l’animalerie pour que l’animal soit pris en charge de manière individuelle afin d’améliorer son bien-être. Si l'état ne s'améliore pas au-delà de 24h, il sera euthanasié par ponction cardiaque sous anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d’une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés.. De plus, si la taille de la tumeur arrive à 1500mm3 avant J30, l’expérimentation s’arrêtera dès lors, afin d’éviter des expérimentations en durée « non-nécessaires » sur les animaux. La durée de l’étude principale sera de ce fait réduite d’autant. La mesure des tumeurs se fera mécaniquement à l’aide d’un pied à coulisse Caliper. Pour respecter le principe des 3R, un nombre réduit d’animaux a été choisi.

Choix des espèces

Les C57BL/6 sont des souris robustes, et sont déjà utilisées pour la formation de tumeurs métastatiques induites par les cellules B16-F10. Souris adultes de 6 à 8 semaines