Recherche fondamentale

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des antiviraux anti-VIH par gavage ou injection dans l'abdomen cinq jours par semaine, pendant huit à seize semaines, pour créer un modèle de vieillissement accéléré qui n'existe pas encore. Le porteur indique que le protocole peut provoquer perte de poids, chute de poils, lésions au site d'injection et altération de l'état général, et que les animaux trop atteints sont mis à mort. Il affirme que le vieillissement de l'organisme ne peut se réduire à des études in vitro et justifie ainsi le développement du modèle murin.

Objectifs

Le vieillissement est responsable de nombreuses pathologies (Cancer, diabète). De nombreux stimuli sont responsable d'un vieillissement accéléré. Plusieurs études ont montré que certains traitements médicamenteux peuvent induire des effets secondaires induisant un vieillissement accéléré. C'est le cas des antiviraux (notamment utilisées chez les patients atteints du VIH), qui en plus d'avoir des effets secondaires à court terme, accélèrent le vieillissement du sujet (niveau cardiovasculaire, osseux, ...). Toutefois aucun modèle animal de vieillissement accéléré via l'administration de ce type de molécules anti-VIH n'a alors été mis au point. Or cela permettrait de proposer des solutions thérapeutiques pour lutter contre ce vieillissement accéléré. Le but de ce protocole est (1) de mettre au point un modèle de vieillissement accéléré via l'administration d'antiviraux de type antiprotéase utilisés par les personnes atteintes notamment du VIH et (2) dans un second temps de tester des solutions pour éviter ce vieillissement accéléré. Dans cette seconde partie il y a un premier axe dans lequel l'effet de l'induction de la mort des cellules sénescentes sur le phénotype de vieillissement accéléré sera testé. Deux nouvelles molécules induisant la mort de cellules vieillissantes seront testées. Dans un second axe le rôle de gènes pro-vieillissement dans ce modèle sera testé. Cela permettrait alors de proposer des solutions thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra dans un premier temps de mettre au point un nouveau modèle de vieillissement accéléré par administration d'antiviraux anti-VIH, modèle qui n'existe pas à l'heure actuelle et qui mimera ce qui se passe chez l'Homme. Cela permettra également de tester de nouvelles molécules pour voir si elles permettent la réversion de ce vieillissement accéléré et apporter des solutions thérapeutiques à ces patients afin d'améliorer leur confort de vie. De plus l'implication potentiel de gènes pro-vieillissement dans ce modèle pourra être mise en évidence. Les bénéfices attendus sont (1) la création d'un nouveau modèle animal qui n'a pas encore développer et (2) potentiellement l'identification de solutions thérapeutiques pour palier les effets secondaires du traitement du VIH avec les antiviraux.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à différents traitements, administrés soit par gavage (1 gavage par jour, pendant 5 jours, pour une durée de protocole pouvant aller de 8 semaines à 16 semaines maximum. La durée du geste par souris est estimé au maximum à une minute à chaque gavage) soit par injection intra-péritonéale (1 injection par jour, pendant 5 jours, pour une durée de protocole pouvant aller de 8 semaines à 16 semaines maximum. Depuis l'anesthésie locale à base de pommade à la lidocaïne à l'injection en elle-même, le temps est estimé à 5 minutes par souris à chaque fois. Cette durée tient compte du temps entre la pose de la pommade et l'injection pour que l'anesthésie soit effective). Un prélèvement d'urine pourra également être réalisé lors de la mise au point du protocole. Lors de la préhension de la souris on peut récolter de l'urine dans un tube. Le temps maximum entre la prise de l'animal et l'arrêt du prélèvement d'urine est estimé à 1 minute.

Impact sur les animaux

Nous allons développer un nouveau modèle de vieillissement accéléré, et de ce fait cela peut amener des phénotypes de type perte de poids, alopésie, altération de l'état général. C'est pour cela que les animaux inclus dans ce projet seront suivi très fréquemment afin de rapidement identifier ces effets indésirables et apporter des solutions pour les atténuer, et dans le cas où cela n'est pas possible les animaux seront alors mis à mort et sortis du protocole. Des nuisances peuvent également dues à la fréquence de traitement et/ou au mode d'injection. Nous testerons l'injection intra-péritonéale avec une fréquence d'injection de 5 fois par semaine. Nous serons alors vigilant sur la possible apparition de lésion au niveau de la zone d'injection. En cas d'apparition de ce type de lésion le traitement sera stoppé pendant 3 jours, la zone sera alors traitée avec de la Vétédine. En cas d'amélioration le traitement sera repris. En absence d'amélioration l'animal sera mis à mort. Pour palier à l'apparition de lésion au niveau du site d'injection nous chercherons à alterner tous les jours les sites d'injection. Il faut également noter que notre équipe a une expérience importante sur le suivi du vieillissement des animaux, que ce soit du vieillissement "physiologique" ou bien du vieillissement induit par un stress métabolique. Cela permettra une très bonne prise en charge des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes d'intérêt et réaliser les analyses nécessaires à l'étude.

Remplacement

La sénescence à l'échelle de la cellule peut être bien étudiée via des modèles in vitro. Ainsi des études préliminaires in vitro ont été réalisées en traitant des cellules primaires humaines de type fibroblastiques ou épithéliales avec des antiprotéases, à savoir le mélange Atazanavir et ritonavir (noté ATV/r). Nous avons alors pu montrer l'entrée en sénescence de ces cellules via les tests classiques comme la mise en évidence de l'activité de la Béta-Galactosidase à pH 6 (coloration bleue) dans les cellules sénescentes, l'arrêt de prolifération (comptage cellulaire), la forme des cellules, l'expression de marqueurs de sénescences comme p16, p21 par qRT-PCR et également la sécrétion de molécules dans le milieu de culture (dosage ELISA), spécifique des cellules sénescentes. Le vieillissement au niveau d'un organisme, qu'il soit du à l'âge ou à l'exposition à différents stress comme un stress métabolique, un stress chimique (ingestion de molécules ayant un effet à long terme), est le résultat d'un processus complexe. Son étude ne pouvant malheureusement pas se résumer à des études in vitro et être modélisé, elle nécessite donc l'utilisation de modèles animaux, comme le modèle murin, dans lesquels l'impact global pourra être visualisé. C'est pour cela que nous avons choisi de développer le modèle murin qui est l'objet de ce protocole expérimental.

Réduction

Pour minimiser le nombre d'animaux utilisés dans ce protocole la mise au point du modèle (procédure 1) sera réalisée séquentiellement. Plusieurs voies d'administration, plusieurs doses, deux temps seront testés. Si les premiers tests se révèlent concluant toutes les conditions ne seront pas testées. De plus si la procédure 1 ne permet pas de mettre au point le modèle de vieillissement accéléré alors les procédures 2 et 3 ne seront pas réalisées. C'est pour cela que c'est le nombre maximal d'animaux qui est donné et le nombre d'animaux réellement utilisés pourra être inférieur. Dans la procédure 1 la mise au point du modèle ne nécessite pas d'étude statistique, c'est pour cela qu'il y aura 5 souris par groupe. Dans les procédures 2 et 3 des tests statistiques seront réalisés, c'est pour cela qu'il y a 10 souris par groupe. Enfin pour visualiser l'effet sexe des mâles et des femelles seront utilisées. Cela permettra d'éviter de relancer d'autres protocoles pour vérifier le biais lié au sexe et cela renforcera l'analyse statistique de cette étude.

Raffinement

La grande expérience des équipes qui gèrent les protocoles de vieillissement est un gage quant à la garantie du suivi du bien-être animal. Une surveillance adaptée et individuelle des animauix afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance est mise en place. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (traitement antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné. En cas de traitement avec un antalgique de la brupénorphine à la dose de 0,05 mg/Kg sera administrée quotidiennement, pendant 3 jours. En absence d'amélioration après 3 jours de traitement l'animal concerné sera mis à mort. Pour les injections intra-péritonéales, pour éviter le stress d'une anesthésie générale à l'animal, une anesthésie locale du site d'injection avec une pommade à base de lidocaïne quelques secondes avant l'injection sera réalisée. Pour éviter également d'injecter plusieurs jours de suite au même niveau sur l'abdomen de la souris le site d'injection sera modifié tous les jours en alternant entre le haut et le bas de l'abdomen et entre le côté droit et le côté gauche de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans les modèles de vieillissement induit par des stress comme le stress métabolique notamment. En effet on peut alors voir l'impact de ce vieillissement au niveau des différents organes de la souris. De plus la souris est un modèle de prédilection dans la réalisation de modèle transgénique avec notamment la perte d'expression de nombreux gènes. Nous pourrons alors utiliser ces modèles transgéniques au sein de notre protocole de vieillissement accéléré et valider ou non l'implication de gènes d'intérêt dans le phénotype observé. Les expérimentations seront réalisées chez des souris adultes d'environ 5 mois. Chez l'Homme les observations initiales à l'origine de notre protocole ont été faites avec des patients âgés en moyenne de 30 à 40 ans. De plus à 5 mois la prise de poids des souris n'est plus très importante, ce qui permet d'avoir un poids plus stable en début d'expérimentation. Cela sera plus simple pour évaluer la perte de poids en cas de douleur chez la souris. Enfin ces animaux auront atteint la maturité, notamment au niveau du système immunitaire et hormonal.

100 chèvres vont être utilisées, réutilisées ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant sous-cutané et une injection de lipopolysaccharide dans la jugulaire pour déclencher une inflammation qui imite une mammite, avec une fièvre attendue d'environ deux degrés, suivie de onze prises de sang. Le porteur relie ces travaux à la "capacité d'adaptation" dégradée par la sélection sur la production et vise à terme des animaux "plus résilients, productifs et en bonne santé". Il affirme que la réponse inflammatoire du ruminant ne peut être étudiée qu'in vivo.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’évaluer les capacités d’adaptation des chèvres à une épreuve inflammatoire, en lien avec leur génotype. Dans le cadre du projet nous produisons et utilisons des chèvres laitières de race Alpine, issues d’une sélection divergente sur le caractère de longévité fonctionnelle (chèvres de génotype Longévité élevée (LGV+) et chèvres de génotype Longévité faible (LGV-). L'ensemble des chèvres est génotypé et caractérisé sur des caractères de croissance, de métabolisme énergétique, de production de lait, de santé et de réponse à des épreuves nutritionnelles afin de mieux comprendre les déterminants de la capacité d'adaptation des chèvres à une épreuve transitoire nutritionnelle. Dans cet avenant, nous proposons de réaliser une épreuve inflammatoire transitoire sur un sous ensemble de 2 groupes chèvres LGV+ et LGV- de ce dispositif afin d’élargir le concept d’adaptation à la réponse anti-infectieuse en relation avec le génotype. En effet, la santé des animaux d’élevage fait partie intégrante de leur capacité d’adaptation et de leur bien-être. Les mammites, en particulier, représentent la maladie infectieuse majeure chez les ruminants laitiers. Pour ce faire, nous proposons une épreuve inflammatoire par voie générale à base de Lipopolysaccharide (LPS), un composé non infectieux d’origine bactérienne permettant de mimer une inflammation de type mammite afin de doser les cytokines circulantes et caractériser la cinétique de réponse suite à cette stimulation.

Bénéfices attendus

La capacité d'adaptation est une caractéristique qui a été dégradée, chez les animaux de rente, par la sélection pour des niveaux de production élevés. Ce qui a eu des conséquences négatives sur la santé, la reproduction, et la longévité de ces animaux et par conséquent a impacté l'efficacité de production. Les causes du déclin de la capacité d'adaptation sont majoritairement inconnues. La capacité d'adaptation d'un animal est due à des mécanismes adaptatifs opérant à différents niveaux d'organisation physiologique. Ils sont en partie sous le contrôle des conditions d’élevage et de nutrition, du statut physiologique de l’animal, mais aussi de son patrimoine génétique. Nous savons, en particulier, que la longévité fonctionnelle, qui traduit des mécanismes d’adaptation des adultes, est partiellement contrôlé par la génétique. Ce projet doit permettre de mieux comprendre le rôle de la génétique sur les capacités d'adaptation des chèvres adultes. A court terme (durée du projet), il doit permettre de valider l’utilisation d’un ensemble de cytokines sanguines pour caractériser la résilience de la chèvre, dans le cadre d’une épreuve in vivo par du LPS (mimant une mammite). Si cette étape est concluante, cela permettra de tester une procédure équivalente, in vitro, à partir de simples prélèvements sanguins (sans épreuve LPS). A plus long terme, ce phénotypage pourra être utilisé, le cas échéant, pour sélèctionner des animaux plus résilients, productifs et en bonne santé, afin de garantir la durabilité de l’élevage caprin.

Procédures

Les animaux seront soumis à la pose d’un implant sous cutané après contention pour la mesure de la température interne de l’animal. Réalisée une seule fois sur chacune des 100 chèvres du projet. Utilisation d’une seringue à usage unique qui contient l’implant à injecter (de la grosseur d’un grain de riz). Ensuite les chèvres se verront injecter des lipopolysaccharide (LPS : Escherichia coli ultrapur) réalisée au niveau du cou dans la veine jugulaire. Réalisée une seule fois sur chacune des 100 chèvres du projet. Enfin des prélèvements de sang seront effectués à l’aide d’une aiguille montée sur un prolongateur à partir de ponctions à la veine jugulaire. Pour la collecte de 11 tubes (volumes de 4ml) maximum pour chacune des 100 chèvres du projet : 1 prélèvement de 4 ml toutes les deux heures avant l’épreuve (J-1), puis toutes les deux heures entre l’injection de LPS et jusqu’à 12h, et ensuite une fois par jour jusqu’à 72heures. Soit un volume total inférieur à 50mL correspondant à moins de 1% du volume sanguin total de l’animal.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous réalisons des prises de sang et la pose d’un implant sous cutané pour le suivi de la température. Les chèvres peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang et la pose de l’implant. Une douleur et une inflammation transitoires peuvent apparaitre lors de la pose des implants sous cutanés. Une eventuelle nuisance serait l'apparition d'hematome suite aux prises de sang. Par ailleurs, nous proposons dans ce projet une épreuve inflammatoire par voie générale à base de Lipopolysaccharide (LPS), un composé non infectieux d’origine bactérienne permettant de mimer une inflammation de type mammite, s. Dans une expérience préalable réalisée sur un petit effectif, l’injection par voie générale (0,5 µg/kg poids vif), de LPS a permis de déclencher une réaction inflammatoire des chèvres qui s'est accompagnée d’une élévation de température réctale moyenne de +1,9°C entre +3 et +6 heures après l'épreuve. Le retour à l’état normal (température et fréquence respiratoire) s’observe entre 12 et 48 heures après l’injection. Ainsi il est attendu que les chèvres impliquées dans cette procédure auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Les nuisances eventuellles en lien avec l'injection de LPS pourraient être une fièvre >40°C, un décubitus prolongé, une perte de poids et efin impliquer une prostration, une cachexie ou alopecie.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie Aucune mise à mort n’est prévue, car les chèvres auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Dans le cas, peu probable, d’atteinte des points limites, la mise à mort sera opérée par le vétérinaire sanitaire soit en urgence par un opérateur expérimenté et habilité de la structure, à l’aide d’un matador et suivi d’une saignée. Les animaux pourront être réutilisés selon l’avis du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

La réponse anti inflammatoire du ruminant laitier implique des modifications biologiques complexes, qui incluent également leur impact sur la production de lait et le métabolisme énergétique qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo.

Réduction

Le nombre d’individus a été défini afin de pouvoir évaluer la réponse à l’épreuve inflammatoire en interaction avec le génotype de la chèvre. Dans l'esprit des 3R, nous avions proposé initialement d’évaluer 80 chèvres primipares, car les données d’héritabilité (h²) des réponses immunitaires etaient élevées dans la littérature . Ces heritabilités sont en moyenne plus de 3 fois supérieures à celle de la longévité (h²=0.08 en race Alpine). Les analyses préliminaires (n = 96 chèvres des cohortes 1 et 2) du projet ont montré que le Beta Hydroxy Butyrate plasmatique du sang discrimine les génotypes longévité. Toutefois, une étude récente dans l’espèce bovine, utilisant le dosage de cytokines après stimulation par LPS montre des héritabilités plus faibles (0.07 à 0.15 dans de nombreux cas, et aucune h²>0.15). Ainsi, afin d’atteindre la puissance statistique espérée, nous proposons donc d’augmenter l’effectif total de 20 chèvres, soit 100 chèvres évaluées au total.

Raffinement

Les chèvres seront hébergées en groupe, sur litière paillée. L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité de l’inflammation et permet de mimer les premières étapes d’une vraie infection. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention manuelle minimale, les animaux étant habitués à être manipulés par les opérateurs de la structure. Les chèvres feront l’objet d’une surveillance accrue pendant toute la durée du protocole, selon une grille permettant d’évaluer la température, le poids, le comportement alimentaire, l’anorexie, la présence d’un décubitus latéral et l’apparition de comportements anormaux. Un score sera donné par animal et si il est superieur à 2 alors il est sorti de l'experimentation. La mise en place des implants sous cutané pour le suivi de la température sera réalisée par des opérateurs expérimentés et habilités (animaliers), qui côtoient ces animaux quotidiennement. Un baume décongestionnant, antiseptique et cicatrisant sera appliqué en massage sur la zone concernée après mise en place de l’implant. Ces implants permettent donc de relever automatiquement la température et de supprimer les prises de température par voie transrectale. Un traitement en cas d'hyperthermie prolongée est administré. En cas de non recouvrement de l'etat , une euthanasie sera realisée.

Choix des espèces

L’espèce caprine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse immunitaire des ruminants sont particulières à ces espèces. Le choix est d'étudier des chèvres primipares non gestantes en lactation.

1 430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent des régimes gras ou déficients pendant une à seize semaines, des prélèvements répétés, un gavage ou une injection, pour étudier une protéine des macrophages dans l'obésité et le diabète de type 2. Le porteur indique que les souris privées de la protéine peuvent développer des lésions cutanées et que celles au régime déficient sont surveillées pour ne pas dépasser 20 % de perte de poids. Il conclut que les cultures cellulaires ne donnent pas un modèle physiologique d'obésité et que la souris est "nécessaire", en vue d'une éventuelle approche thérapeutique chez l'humain.

Objectifs

Le diabète ainsi que l’accumulation de graisse dans un organisme peuvent provoquer une cascade de réactions immunitaires. Ces dernières sont connues comme étant déterminantes dans la survenue d’un diabète de type 2 et les nombreuses complications associées à cette maladie. Les mécanismes impliqués commencent à être connus. Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un modulateur du système immunitaire susceptible d’être impliqué.

Bénéfices attendus

Nous devrions démontrer l'importance de ce modulateur dans la maladie du diabète de type 2 et dans ses complications. Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir les conséquences que pourrait provoquer l'absence de cette protéine, uniquement dans les macrophages, et donc de comprendre son rôle dans l’inflammation et la régulation du glucose chez des souris. A terme, influencer l'activité de cette protéine pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique chez l'Homme pour contrôler l'inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type 2 et de stéatose hépatique.

Procédures

Selon les groupes, les animaux seront soumis à différents types d'alimentation sur des durées comprises entre 1 et 16 semaines et à des prélèvements répétés (entre 2 et 9 prélèvements par souris) espacés de 2 semaines et qui durent chacun 30 secondes. En fin d’expérience, les animaux subiront une mise à jeun de 16h ou 6h et un gavage ou une injection (10 secondes chacun) suivi de 6 prélèvements de sang. Un groupe d’animaux recevra l’injection d’une molécule pour pouvoir accumuler et récupérer les cellules d’intérêts pour le projet. Cette injection aura lieu une seule fois et durera 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux ne possédant pas la protéine étudiée (uniquement dans les macrophages) peuvent être amenés à développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Pour cette raison aucun animal ne sera étudié au delà de l'âge de 6 mois, de cette façon nous évitons l'apparition éventuelle de ces plaies. Les animaux placés sous régimes enrichis en lipides vont prendre du poids tout au long des semaines de régime et vont devenir un peu moins actifs. Les souris placées sous régime décifient vont perdre du poids, elles seront surveillées de près pour ne pas qu'elles dépassent une perte de poids de 20%.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur procédure afin de prélever différents organes pour les analyser. Nous pourrons ainsi étudier les altérations du foie, des tissus graisseux, et du pancréas par différentes techniques permettant des observations précises au niveau cellulaire, génomique ou protéique et ce afin de bien décrire le processus de la maladie et notamment le rôle de la protéine que nous étudions.

Remplacement

Ce sont des études in vitro, elles même appuyées sur des données issues de cohortes de patients, qui ont déterminé le choix de cette protéine à étudier. Cependant, les études in vitro seules, comme les cultures cellulaires, ne permettent pas d'obtenir un modèle physiologique d'obésité, d'homéostasie glucidique et de stéatose hépatique. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour évaluer in vivo l’effet de l'absence de notre protéine d'intérêt au niveau des macrophages, mais également pour définir la réponse globale d’un animal face à la maladie (obésité, diabète, athérosclérose, stéatose hépathique modérée ou majeure).

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est de 1430. Afin de limiter le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé́ des protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple l'évaluation de la tolérance au glucose et l’évaluation de la sensibilité à l’insuline successivement. De plus afin de réduire le nombre d'animaux, le groupe contrôle (régime non enrichi ou déficient) servira de comparaison aux cinq types d'alimentation. Pour chaque condition (type d'alimentation et durée), des groupes de 80 souris seront générés (40 qui possèdent la protéine étudiée et 40 qui n'en possèdent pas dans les macrophages), il s'agit du nombre minimal d'individus nécessaire pour analyser correctement les résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés sur des portoirs ventilés et ont un accès libre et illimité à l'eau et la nourriture. Les conditions de température et d'humidité sont contrôlées et monitorées tous les jours pour qu'elles soient optimales pour les souris. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h), les souris étant des animaux nocturnes une période importante d'obscurité est indispensable à leur bien-être. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum, en effet la souris est un animal grégaire, la vie en groupe est un facteur important pour son bien-être. Si, pour des raisons de protocole, une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté. Pour s’assurer du confort des souris, elles bénéficieront de coton et de «maisons» afin de les occuper et qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l'équipe professionnelle de zootechnie. En ce qui concerne les procédures expérimentales nous avons mis en place des fiches de suivi permettant la prise en compte de différents facteurs visibles chez l'animal révélant son bien-être (évolution du poids, comportement, aspect physique). Nous avons également veillé à ce que le matériel soit adapté pour les prélèvement ou l'administration. Nous avons également mis en place des mesures en vue de réduire au maximum les douleurs pouvant être dues aux prélèvements (mise sous anesthésie ou application d'une solution antiseptique).

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète, en effet les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète (dont les gènes de l'inflammation chronique) jusqu’à présent identifiés sont très proches chez la souris et chez l’Homme. De plus la souris est un modèle permettant l'obtention relativement rapide du nombre d'individus suffisant et que nous sommes en capacité d'héberger dans des conditions (surface, température, luminosité) nécessaires à son bien-être. La souris est également un modèle pour lequel il existe beaucoup d’outils disponibles : modification du génome pour créer les meilleurs modèles d'études possible, méthodes n'analyses des tissus prélevés, etc. L'ensemble de ces critères font de la souris le modèle optimal pour répondre aux questions du présent projet. Nous avons choisi de commencer les études sur des souris qui ont entre 8 et 10 semaines. Cela correspond à la maturité sexuelle (stabilisation hormonale) et équivaut à l'entrée dans l'âge adulte chez l'Homme.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué par injection puis maintenu huit semaines, avec jusqu'à seize séances d'imagerie de l'œil sous anesthésie, pour étudier l'atteinte des nerfs de la cornée. Le porteur indique que les souris présentent une hyperglycémie et une production d'urine excessive durant tout le projet, et qu'elles sont tuées pour prélever leurs cornées, une glycémie dépassant 500 mg/dl entraînant une euthanasie. Il affirme que la complexité de l'innervation cornéenne rend l'animal "indispensable" et qu'il n'existe pas d'alternative in vitro.

Objectifs

Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'œil sec en passant par la kératite neurotrophique et la perforation cornéenne. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier comment l’innervation cornéenne est affectée par le diabète de type 1. Grâce à des techniques d’imagerie en temps réel combinés à l’utilisation de souris transgéniques, nous sommes capables de suivre l’innervation de la cornée des souris au cours du temps.

Bénéfices attendus

La bonne compréhension des mécanismes de dégénérescence de l’innervation de la cornée ainsi que les interactions se produisant entre les nerfs et les cellules immunitaires pourront servir de base pour développer et tester des traitements contre la dégénérescence de l’innervation cornéenne chez des patients diabétiques.

Procédures

Nous allons induire un diabète de Type-1 chez des souris (par injection IP d'une molécule ou d'une solution contrôle, injection sur animal vigile, réalisée par du personnel qualifié, le geste est rapide et prends moins d'une minute par animal), et les maintenir pour une durée de 8 semaines. Une partie des animaux recevront également une injection IP de tamoxifène (injection sur animal vigile, réalisée par du personnel qualifié, le geste est rapide et prends moins d'une minute par animal). Tout au long du projet (1 à 2 fois par semaine), nous réaliserons des sessions d'imagerie (maximum 16 session par animal, chaque session durera environ 40min) sur les animaux anesthésiés (anesthésie gazeuse, non invasive) afin d'étudier l'évolution de l'innervation cornéenne au cours de la pathologie. Nous pèserons les animaux une fois par semaine pour surveiller leur poids et nous mesurerons également la glycémie une fois par semaine par prélèvement d'une goutte de sang à l'extrémité de la queue.

Impact sur les animaux

Pour réaliser ce projet, nous allons induire un diabète chez les souris et les maintenir pendant 8 semaines pour étudier la dégénérescence de l’innervation cornéenne. Ces animaux présenteront une activité hyperdurièse et une hyperglycémie tout au long du projet, due à la pathologie. Les injections IP qui seront réalisées sur les animaux peuvent être sources de stress mais le geste est rapide et réalisée par du personnel qualifié afin de limiter le stress des animaux.

Devenir

A l'issue de la dernière session d'imagerie 8 semaines après l'induction de la pathologie, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire. Cela se justifie par le fait que les animaux seront diabétiques et ne pourront pas être utilisés par un autre projet. De plus, nous prélèverons les cornées des souris pour réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Du fait de la complexité de la complexité de l’innervation cornéenne et des interactions avec les cellules immunitaires et le tissu épithélial de la cornée, l’utilisation de l’animal nous est indispensable. Il n’y a pas d’alternative par des modèles in vitro.

Réduction

Ce projet impliquera au maximum 90 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Un test de puissance a été réalisé pour determiner le nombre minimal d'animaux requis.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température des cages (20-24°C) et l’hygrométrie (45-55%) sont contrôlées, le cycle jour-nuit est de 12h. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Pour les sessions d'imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) complémenté par une anesthésie locale de la cornée (chlorhydrate d'oxybuprocaïne). Des points limites ont été défini du fait de l'induction du diabète de type 1. Nous mesurerons la glycémie des animaux 1 fois par semaine et les pèserons à chaque session d'imagerie, soit 1 à 2 fois par semaine. De plus, à cause de l’activité hyperdurièse des animaux diabétiques, un change des cages plus régulier sera effectué. La glycémie des animaux sera mesurée une fois par semaine, les animaux présentant une glycémie supérieure à 500mg/dl seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle animal est requis pour ce projet car seule l'utilisation d'animaux transgéniques permet de visualiser les interactions entre les neurones et les cellules immunitaires. L’innervation de la cornée se développe en post-natal jusqu’au 45ème jour de vie des animaux. Nous utiliserons donc des jeunes adultes à partir de 7 semaines, une fois le développement de l'innervation cornéene finie.

1 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des distensions colorectales répétées d'une heure dix, associées à un stress destiné à provoquer une hypersensibilité viscérale, pour étudier des protéases impliquées dans la douleur du syndrome du côlon irritable. Le porteur indique que la distension peut entraîner une perforation du côlon conduisant à une mise à mort précoce, et que toutes les souris sont tuées pour prélever des tissus. Il affirme que la douleur et le stress sont des réactions de "l'organisme entier" impossibles à reproduire in vitro, ce qui rendrait le recours aux animaux "incontournable".

Objectifs

Le syndrome du côlon irritable (IBS) est un trouble fonctionnel du tube digestif responsable de symptômes variables selon les individus, incluant des douleurs abdominales récurrentes, des épisodes de constipation et/ou de diarrhée altérant de façon conséquente la vie quotidienne. La prévalence mondiale des troubles fonctionnels liés au tractus digestif est en perpétuelle augmentation, notamment comme conséquence du mode de vie actuel (stress chronique/dépression ; alimentation occidental riche en graisses/sucres…). La sensibilité́ viscérale est une douleur nociceptive déclenchée suite à l'activation des récepteurs sensoriels au niveau des viscères (incluant les neurones innervant le colon). Elle peut être classiquement adressée chez les patients IBS ainsi que dans des modèles IBS de laboratoire (rat, souris), suite à la stimulation des nocicepteurs par distension colorectale. Dans le cas d’une hypersensibilité́ due à une suractivation/hyperexcitabilité́ des neurones, on distingue une douleur de type allodynique (douleur ressentie suite à un stimulus normalement indolore), d'une hyperalgésie (douleur à un stimulus plus intense que la normal). Il a été reporté qu’une dérégulation de la production/activation de facteurs solubles par les cellules de la muqueuse intestinale peut être à l’origine de l’activation des neurones causant une hypersensibilité́. Parmi ces molécules, les protéases sont des médiateurs importants pouvant signaler aux neurones via leurs récepteurs qui sont les “protease-activated receptor” (PAR). Notre équipe de recherche a contribué́ à d’importants travaux mettant en évidence qu’une altération fonctionnelle des cellules épithéliales intestinales à produire des protéases, incluant la trypsine III, conduit à une hypersensibilité́ viscérale. Cependant, l’exact mécanisme de régulation de la balance protéolytique (protéases/ inhibiteurs de protéases), reste à être élucidé. Ici, notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation des protéases épithéliales (et de leurs inhibiteurs) et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler l’activité protéolytique par i/ l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés (surexprimant des protéases ou inactivés pour l’expression de PAR ou de protéases), et par ii/ l’utilisation d’inhibiteurs (de protéases) afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale.

Bénéfices attendus

Les méthodes alternatives permettant l’évaluation de la sensibilité́ viscérale de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. De plus, l'implication du stress entrainant une augmentation de la douleur est une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro en intégralité́. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre la régulation de l’équilibre protéolytique intestinal et de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.

Procédures

- distension colorectale 3 fois par souris étalé sur 1 semaine (la distension colorectale dure 1h10)- Administration i.p, i.c ou p.o de molécules ou bactéries - prélèvement de sang à la veine mandibulaire 1 fois par semaine sous anesthésie gazeuse. La

Impact sur les animaux

Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Si une présence de sang est décelée en fin de distension, les animaux sont surveillés dans les heures qui suivent ainsi que le lendemain pour vérifier une éventuelle perforation du colon, dans ce cas un mise à mort précoce par dislocation cervicale sera réalisée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés

Remplacement

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut douloureux de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales. De plus, la douleur et la tumorigenèse induites par le stress sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossibles à reproduire in vitro dans leur intégralité.

Réduction

Tout au long du projet, les animaux seront suivis régulièrement au cours du temps (au minimum 1 fois par semaine) par des techniques non invasives comme le suivi du poids, la consistance des fèces et la présence de sang dans les fèces évaluée par le test Hémoccult II® et de de façon plus spécifique par l'observation grâce à un endoscope pour la tumorigenèse. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude, permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, dans un premier temps, des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Selon la durée de l’étude, un deuxième enrichissement pourra être introduit dans l’environnement, tel que des aspen Brick, des tunnels en polycarbonate ou des igloos. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons également de souris déficientes pour l'expression de certains gènes cibles que nous utiliserons dans ce projet. Les souris seront âgées d'au moins 7 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 20g.