Recherche fondamentale

152 souris athymiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules cancéreuses prostatiques par implantation sous-cutanée ou par chirurgie intraprostatique, pour évaluer le rôle d'une isoforme protéique dans la croissance tumorale et les métastases. Le porteur mentionne une possible perte de poids et une mobilité réduite en cas de cachexie liée aux métastases. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico ne permet d'étudier la progression tumorale dans un "organisme entier".

Objectifs

Malgré les nombreux progrès réalisés au cours des dernières années dans les domaines de la prévention, de la détection précoce et du traitement du cancer, cette maladie reste un problème majeur de santé publique. Lors de la croissance tumorale, certaines cellules cancéreuses acquièrent la capacité d’envahir les tissus environnants avant de disséminer dans des organes éloignés de la tumeur d’origine. Contrairement aux tumeurs primaires, cette capacité de dissémination n’est ciblée par aucune thérapie spécifique alors qu’elle est la cause majeure des décès par cancer. L’acquisition de la capacité d’invasion et le développement de métastases représentent donc un défi thérapeutique majeur qui nécessite d’en élucider les mécanismes moléculaires. Or, les mécanismes activés pendant la migration et l’invasion tissulaire sont complexes. Des travaux antérieurs ont pu préciser qu'une protéine structurale des jonctions communicantes intercellulaires, lorsqu’elle est localisée à la membrane plasmique, jouait un rôle important dans ces mécanismes moléculaires favorisant les capacités invasives des cellules de cancer de la prostate et dans la sensibilité au microenvironnement osseux dans le contexte des métastases. Il a également été rapporté qu’une isoforme courte particulière de cette protéine, située en intracellulaire, favorise, lorsqu’elle est surexprimée, le transit de la forme structurale longue vers la membrane des cellules cancéreuses prostatiques, les rendant alors plus agressives in vitro. Le présent projet a pour objectif d’évaluer in vivo le rôle protumoral de cette isoforme courte en étudiant l’effet de sa surexpression sur la croissance tumorale et sa capacité à induire et former des métastases.

Bénéfices attendus

Dans le domaine de recherche très peu exploré de cette isoforme courte, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à la présence membranaire de la forme longue de la protéine structurale et son rôle dans la sensibilité au microenvironnement dans le cadre des métastases osseuses. La validation in vivo de l'isoforme courte en tant facteur pro-tumorigénique permettra d’une part de la reconnaitre comme un marqueur prédictif de progression du cancer de la prostate et d’autre d’en faire une cible thérapeutique anti-cancéreuse. Ce dernier aspect nous semble particulièrement important car à l’heure actuelle aucun traitement ne cible particulièrement cette capacité métastatique.

Procédures

Pour cette validation in vivo, 3 procédures expérimentales différentes vont être mises en place mais utilisant toujours les 4 mêmes clones de cellules tumorales à des fins de comparaison. Chacune des procédures correspondra à un site d’implantation/injection différent. La procédure 1 correspondra à une implantation sous-cutanée des différents clones de cellules prostatiques à des souris anesthésiées par voie gazeuse (durée de l'intervention entre 5 et 10 min). La procédure 2 correspondra à une implantation chirurgicale intraprostatique des différents clones de cellules prostatiques à des souris anesthésiées par voie gazeuse (durée de l'intervention entre 20 et 30 min). Enfin, la procédure 3 correspondra à une injection intravasculaire des différents clones de cellules prostatiques à des souris vigiles afin d'étudier l'impact de l'isoforme courte sur leur capacité à développer des métastases dans différents sites secondaires (durée de l'intervention environ 10 min). Le suivi du développement tumoral primaire ou métastatique se fera par imagerie in vivo sur animaux anesthésiés par voie gazeuse au maximum deux fois par semaine pendant 4 semaines pour la procédure 1 et pendant 5 semaines pour les procédures 2 et 3 (durée totale de chaque mesure entre 5 et 10 min).

Impact sur les animaux

Il existe une possibilité de perte de poids et une mobilité réduite en cas de développement de métastases liées à une potentielle cachexie pour les procédures 2 et 3.

Devenir

Tous les animaux des trois procédures seront mis à mort en fin d'expérience par anesthésie gazeuse (isoflurane) puis dislocation cervicale. Les tumeurs primaires seront ensuite systématiquement récupérées lors des procédures 1 et 2. En cas de signal in vivo révélant la présence de métastases, les tissus correspondants seront prélevés. Ces animaux, ayant subi une induction tumorale et développant potentiellement des métastases, ne pourront pas être réutilisés pour un autre projet.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale sur souris par d'autres alternatives in vitro en l'absence de modèles virtuels ou in silico disponibles pour etudier la progression tumorale et la dissémination métastatique dans un organisme entier.

Réduction

Par une approche statistique (Snedecor et Cochran), la réduction au maximum du nombre d'animaux nécessaires en expérimentation a été prise en compte, tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour conduire une étude statistiquement interprétable. Le suivi de la croissance tumorale par bioluminescence par un imageur dedié au petit animal permet non seulement de suivre la croissance tumorale au cours du temps mais également de réduire le nombre d'animaux utilisés en permettant de collecter un nombre important de données par individu.

Raffinement

Ce projet fait suite à des projets antérieurs qui nous ont permis d'affiner au mieux les procédures expérimentales, notamment pour la définition de points de contrôle et limites (comportementaux et physiques). Ainsi, les modalités d'injection des cellules tumorales sont réalisées sous anesthésie générale, avec contrôle de la température corporelle, en présence d'antalgiques et d'anti-inflammatoires en péri et post phase opératoire afin de limiter au maximum la douleur. Des grilles de suivi ont été élaborées pour suivre au plus près le bien être animal. En cas d'apparition de signes de mal-être, un traitement à base de dérivés morphiniques est mis en place immédiatement. De plus, les conditions d'élevage sont optimisées au mieux (hébergement en groupe social de 4 à 5 souris, environnement enrichi avec des conditions de température et d'hygrométrie controlées) afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales et de l'absence d'interférences sur les résultats. Ce projet utilise des animaux immnodéprimés. Les conditions d'hébergement sont adaptées et compatibles pour le maintien du statut sanitaire requis pour ces animaux génétiquement altérés.

Choix des espèces

Afin de pouvoir comparer les résultats que nous obtiendrons à ceux de la littérature, l’utilisation de souris est complètement justifiée. C’est également un modèle animal où l’induction des tumeurs dans les souches Nude est rapide et le suivi de leur croissance facilité par un imageur du petit animal. Les souris athymiques Nude sont très largement usitées dans les études oncologiques qui utilisent des cellules cancéreuses humaines rendant impossible le recours à des souris non immuno-déprimées. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience pour les 3 procédures expérimentales. Cet âge correspond à des animaux matures sexuellement et dont la prostate est suffisamment développée pour permettre une injection standardisée.

148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie développe des tumeurs mammaires, d'autres reçoivent une greffe de cellules tumorales, y compris des femelles pré-pubères de trois semaines, pour étudier le rôle d'intégrines dans le cancer du sein lié à BRCA1. Le porteur renvoie les retombées thérapeutiques au long terme et au conditionnel, l'étude visant d'abord à comprendre des mécanismes. Il revendique la souris comme un "modèle incontournable" et juge "indispensable" le recours à l'expérimentation in vivo.

Objectifs

Le cancer du sein représente la première cause de décès par cancer chez la femme, principalement dû à une connaissance encore incomplète des mécanismes moléculaires et cellulaires qui induisent le développement tumoral. La glande mammaire est une structure épithéliale constituée d’un système de canaux ramifiés et d’alvéoles. L’épithélium mammaire adulte est composé de cellules luminales sécrétrices du lait et de cellules basales myoépithéliales qui, en se contractant, aident à l’expulsion du lait vers les canaux. Ces deux types de cellules dérivent de la prolifération et de la différenciation de cellules souches mammaires. Or, des études récentes ont montré que l’amplification aberrante des cellules souches est à l’origine de cancers du sein agressifs associés à des mutations du gène BRCA1 (Breast Cancer 1), un gène connu pour être un suppresseur tumoral. Ces cancers appartiennent à un groupe des tumeurs pour lesquelles les thérapies ciblées utilisées dans le traitement d’autres types de cancers du sein (par exemple, les thérapies hormonales) se sont avérées inefficaces. Les intégrines sont des protéines présentes dans la surface des cellules qui permettent leur adhésion et régulent de nombreuses fonctions. Certaines intégrines sont indispensables à la multiplication et la différenciation des cellules souches nécessaires à une gestation et lactation normales. Nous souhaitons étudier le rôle de ces intégrines dans un modèle murin connu pour développer des tumeurs mammaires dont l’origine et les caractéristiques sont très similaires aux cancers du sein avec mutation en BRCA1 chez la femme. Nos premiers résultats indiquant que la perte des intégrines dans ce modèle diminue l’apparition des tumeurs mammaires, nous projetons d’analyser les mécanismes qui expliquent cette inhibition. On déterminera en particulier l’impact de la perte des intégrines dans la glande avant l’apparition des tumeurs (statut pre-néoplasique) et sur son contenu en cellules souches tumorales, connues pour leur implication dans les récidives et la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

L’interaction des intégrines avec la matrice extracellulaire qui entoure les cellules joue un rôle important au cours des différentes étapes de la progression tumorale mammaire, du carcinome in situ (tumeur en stage initiale, souvent bénin) à l’invasion tissulaire (tumeur invasif mais encore localisé à la glande mammaire) et la métastase (invasion d’autres tissues). De façon notable, certaines intégrines sont surexprimées dans les tumeurs du sein et leur expression est associée à un mauvais pronostic et à des taux de survie réduits. Notre étude permettra de déterminer la contribution des intégrines dans le développement tumoral de la glande mammaire et la régulation des cellules souches tumorales, responsables des récidives et de la dissémination métastatique. Notre approche permettra d’évaluer la contribution de ces intégrines dans les anomalies de croissance cellulaire, différenciation et invasion observées dans les carcinomes mammaires humains. A long terme, ces informations permettront de mieux appréhender les mécanismes impliqués dans la communication entre cellules épithéliales et matrice extracellulaire et notamment d’évaluer si des signaux anormalement émis par les intégrines dans le contexte tumoral peuvent constituer des cibles thérapeutiques efficaces pour le traitement de certains cancers du sein.

Procédures

Un suivi des animaux développant spontanément des tumeurs mammaires (observation et palpation) sera réalisé pendant toute la durée de l’expérience (au maximum 4 semaines après la détection des tumeurs). Des expériences de transplantation (greffe) de cellules tumorales dans le tissu adipeux mammaire de souris receveuses seront réalisées. Cette intervention chirurgicale est peu invasive, le péritoine (membrane entourant la cavité abdominale), restant intact. Elle est de courte durée (15-20 min par animal) et s’effectue sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nos souris transgéniques sont viables et ne présentent aucun problème sévère de santé à l’âge adulte. Le modèle de tumorigenèse que nous étudions n’entraînent pas de souffrance notable. Les nuisances liées au développement tumoral sont faibles et les souris portant des tumeurs seront analysées en moyenne 2 semaines après leur détection, avec un maximum de 4 semaines pour les tumeurs à croissance lente. Les tumeurs restent localisées à la glande mammaire et ne sont pas métastatiques dans notre fenêtre expérimentale. L’apparition de tumeurs sur d’autres organes reste extrêmement rare dans ce modèle. De possibles mais rares ulcérations peuvent se produire dans les tumeurs mammaires chez certains animaux. Les animaux opérés pourront éventuellement développer des tumeurs mammaires qui, d’après la littérature, reproduiront le phénotype de la tumeur originale avec, notamment, une absence de développement métastatique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

Notre projet repose sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées (souris transgéniques) pour définir les mécanismes qui régulent les cellules souches et leur contribution dans les cancers du sein. La glande mammaire est un tissu spécifique aux mammifères dont le fonctionnement normal est contrôlé par un ensemble complexe de régulateurs hormonaux et locaux. La souris reste à ce jour le modèle le plus pertinent pour étudier la biologie des cancers du sein. Les souris transgéniques sont reconnues comme des modèles incontournables pour explorer les mécanismes de tumorigénèse et développer des thérapies. Bien que nous utilisions des méthodes alternatives réduisant l’utilisation des animaux, en particulier des cultures pour modéliser le comportement des cellules tumorales in vitro, il est indispensable d’effectuer des expériences in vivo pour comprendre la formation et la progression des tumeurs dans leur environnement physiologique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible pour maintenir une signification statistique. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements de glande mammaire, on utilise chaque glande mammaire d’une même souris donneuse, celle-ci étant pourvue de 5 paires de glandes. Des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées.

Raffinement

Les animaux seront manipulés le moins possible. Les souris seront surveillées soigneusement pour détecter tout signe de détérioration des conditions cliniques. L’apparition de tumeurs sera surveillée à partir de l’âge de 4 mois (l’âge moyen d’apparition de tumeurs dans ces souris est de 7,5 mois). Des palpations seront effectuées trois fois par semaine. Un examen complet au moins hebdomadaire (fréquence adaptée à l’évolution) des souris développant des tumeurs permettra de détecter des signes précoces de détresse et de maladie. Les points limites sont soigneusement définis avec une surveillance attentive des signes cliniques. Des fiches d'évaluation clinique sont mises en place pour ce projet spécifique. Les expériences de transplantation se font sous anesthésie générale. Pour minimiser les risques d’infection, les instruments de chirurgie sont stérilisés et les surfaces et la loupe utilisées, soigneusement lavées et rincées à l’éthanol. Pendant l’opération un gel de protection oculaire est appliqué aux animaux pour éviter le desséchement. Des analgésiques, sont administrés 20 min avant l’anesthésie (buprenorphine, carprofen), puis relais 24h après l’opération (ibuprofène). Après l’intervention, nous utilisons du fil de suture stérile résorbable pour refermer la plaie. En post-opératoire, les souris encore anesthésiées sont réhydratées et placées sur une platine chauffante pour éviter l’hypothermie. Les souris greffées sont surveillées tous les jours afin de déceler tout signe de mal-être et pour détecter l’apparition de tumeurs (palpation trois fois par semaine). Si elles présentent des signes de mal-être (amaigrissement, prostration), elles sont mises à mort avant la fin programmée de l’expérience.

Choix des espèces

Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Par ailleurs, la connaissance du génome murin, sa forte homologie avec le génome humain et l’existence de divers modèles génétiques murins rendent ce modèle puissant. Enfin, c'est un animal facile à anesthésier, ce qui permet de réduire au maximum le stress qui pourrait être provoqué chez l'animal. Ainsi, ce modèle animal est le meilleur compromis entre l’étude d'un modèle animal mammifère et l’obtention de réponses pertinentes aux questions posées. Pour l’analyse des tumeurs, les souris avec un phénotype potentiellement dommageable sont euthanasiées à l’âge adulte (à partir de 5-6 mois d’âge lors de l’apparition des tumeurs ou avant, pour analyse de la glande pre-néoplasique). Les tumeurs sont analysées avant qu’elles ne génèrent de signes de souffrance chez les souris. Les souris receveuses utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles pré-pubertaires âgées de 3 semaines. A ce stade, l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du tissue adipeux resté intact.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur provoque une inflammation du côlon par le dextran sulfate de sodium, administre par gavage un antagoniste des récepteurs cannabinoïdes pendant sept jours et prélève du sang par voie submandibulaire à plusieurs reprises. Toutes sont mises à mort par ponction intracardiaque terminale pour prélever côlon, rate et foie. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser cette inflammation in vitro et s'appuie sur une lignée transgénique fat-1.

Objectifs

L’inflammation colique correspond à une inflammation de la muqueuse du côlon se traduisant par différents troubles intestinaux. Elle est particulièrement associée à la présence de diarrhée et de douleurs abdominales. Les médicaments actuels permettent la plupart du temps leur contrôle durable. Cependant, plusieurs pistes de recherche sont actuellement explorées afin d’améliorer la prise en charge des patients. En particulier, un rééquilibrage alimentaire permettant d’améliorer le ratio acides gras oméga6/oméga3 est à l’étude. La souris transgénique fat-1 (le gène fat-1 code pour une désaturase permettant de convertir les oméga6 en oméga3) présente de fait un enrichissement tissulaire en oméga3 aux dépens des oméga6, conduisant à une diminution drastique du rapport tissulaire oméga6/oméga3 comparativement aux souris sauvages (WT) ce qui en fait un modèle d’étude tout particulièrement intéressant pour l’étude des effets bénéfiques des oméga3. Ces souris fat-1 sont protégées d’une colite induite par le Dextran Sodium Sulfate (DSS), contrairement aux WT. Ainsi, un enrichissement tissulaire en oméga3 pourrait représenter une cible potentielle dans la prévention de l’inflammation colique. Par ailleurs, le système endocannabinoïde et plus particulièrement le récepteur CB1R est impliqué dans de nombreuses pathologies présentant une composante inflammatoire comme l’obésité, le diabète, ou encore le syndrome du côlon irritable . Il a été récemment suggéré que la modulation des composants du système endocannabinoïde et de CB1R en particulier pourrait présenter certains bénéfices pour la prise en charge du syndrome du côlon irritable. Ce syndrome du côlon irritable étant associé à une inflammation colique, nous pensons que le blocage des récepteurs CB1R à l’aide d’un antagoniste pourrait avoir un effet bénéfique sur l’inflammation colique. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la contribution relative et/ou synergique des acides gras polyinsaturés en n-3 (oméga3) et des récepteurs aux endocannabinoïdes sur la prévention de l’inflammation colique dans un modèle de colite chimiquement induite par le DSS.

Bénéfices attendus

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, maladie de Crohn et rectocolite hémorragique, se caractérisent par l’inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire. S’il n’existe pas de traitement pour guérir ces maladies, les médicaments actuels permettent la plupart du temps leur contrôle durable et une qualité de vie satisfaisante en dehors des poussées. Ce projet a pour but de déterminer une éventuelle contribution relative et/ou synergique des acides gras polyinsaturés en n-3 (oméga3) et du blocage pharmacologique des CB1R sur la prévention de l’inflammation colique dans un modèle de colite chimiquement induite. Cela permettrait de mettre en évidence le potentiel d’un rééquilibrage alimentaire (supplémentation en oméga3) couplé à une nouvelle classe de composé pharmaceutique (antagonistes CB1R) en cours d’évaluation clinique pour de nombreuses pathologies présentant un profil pro-inflammatoire comme l’obésité, le diabète ou encore la néphropathie diabétique.

Procédures

Les animaux seront manipulés quotidiennement pendant toute la durée des traitements (7 jours) afin d’évaluer leur masse corporelle et leur prise alimentaire. De plus, • un prélèvement sanguin de 50 μl sera réalisé au niveau de la région submandibulaire à J0, J4 et J6 pour chaque souris. Durée 1minute • L’antagoniste aux récepteurs CB1, sera administré quotidiennement pendant une durée de 7 jours par gavage à raison de 10mg/kg de poids corporel. Durée 30 secondes un prélèvement terminal sera effectué à J7 via ponction intracardiaque. Aucune durée, procédure entraînant le décès de l’animal. Aucune procédure chirurgicale n’est prévue.

Impact sur les animaux

Les conditions expérimentales utilisées peuvent entraîner de la douleur chez l’animal. Pour cela, un scoring sera établi et pour quantifier cette douleur/souffrance une observation générale quotidienne des animaux et de leurs excréments sera réalisée. Ainsi, si une souris est en souffrance nous pourrons agir rapidement. Pour le prélèvement de sang en région submandibulaire et les gavages orogastriques, le personnel maitrise très bien ces gestes techniques et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements de différents tissus (colon, iléon, rate, foie....).

Remplacement

Le protocole vise à étudier les mécanismes impliqués au cours de l’inflammation colique. Cette pathologie faisant intervenir une interaction complexe entre le côlon et les cellules du système immunitaire, il est impossible de complètement modéliser ce processus à travers d’approches in vitro. De même, compte-tenu de la complexité de cette pathologie, l’utilisation de modèles animaux dont le système immunitaire est trop éloigné de celui des mammifères est exclus. C’est pourquoi nous utiliserons la souris, pour des raisons de facilité d’élevage et surtout de l’existence du modèle transgénique fat-1.

Réduction

Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature et les différences attendues entre les différents groupes pour les paramètres clés-de l’étude. Lors de la conception du protocole expérimental nous avons déterminé le nombre de 10 animaux par groupes nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables.

Raffinement

La souris est un animal vivant en groupe, elles seront donc plusieurs par cage pour éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher

Choix des espèces

La détermination de l’impact du DSS couplé ou non à l’administration d’un antagoniste CB1R est primordiale à notre étude. Cet aspect ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux afin de mimer au mieux un contexte d’inflammation intestinale. Bien que relativement éloignée de l’Homme, l’espèce murine est l’espèce animale de référence dans ce domaine de recherche et la plus utilisée en recherche préclinique avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le modèle de souris transgénique fat-1 est un modèle précieux qui rend cette étude unique dans l’approche de l’impact des oméga3 sur la prévention de l’inflammation colique. Stade adulte (8 semaines d’âge). La réponse inflammatoire chez la souris est affectée par l’âge ce qui se traduit par une certaine tolérance aux endotoxines, l’installation d’une inflammation chronique et une diminution de la sécrétion de cytokines proinflammatoires d’où la nécessité d’utiliser des animaux plutôt jeunes et d’âge homogène

5 070 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur greffe sous la peau des cellules de cancer du sein, puis leur administre chaque jour une à trois molécules inhibitrices, les souris étant mises à mort dès que la tumeur dépasse 2 000 mm³ ou en cas de perte de poids supérieure à 20 %. Les prélèvements sont réalisés post-mortem. Il affirme que les essais in vitro déjà menés ne suffisent pas et que l'étape chez l'animal reste "indispensable" au développement des médicaments.

Objectifs

Nous avons identifié un onco-métabolite qui stimule la prolifération des cellules mammaires expriment le récepteur des estrogènes (RE+) ou ne l’exprimant pas (triple négatif ou TN) in vitro et in vivo. In vitro, nous avons récemment caractérisé les voies de signalisation qui participent au développement tumoral induit par cet onco-métabolite et les voies métaboliques qui induisent la production de cet onco-métabolite. Nous avons caractérisé différents acteurs impliqués dans les voies de signalisation et de production cet onco-métabolite dont le ciblage par des inhibiteurs bloque la prolifération tumorale des cellules tumorales mammaires RE+ ou TN. Nous avons caractérisé un analogue phytostérol cet onco-métabolite qui cible les mêmes voies de signalisation mais qui a une activité anti-mitogène in vitro. Nous avons caractérisé une nouvelle cible thérapeutique (C1) qui médie les effets pro- et anti-prolifératifs de ces deux molécules in vitro. Les objectifs du projet consisteront i) à valider in vivo l’implication de la cible C1 dans les effets mitogènes de cet onco-métabolite et anti-mitogène de l'analogue phytostérol de cet onco-métabolite en utilisant des modèles de cellules KO pour la cible C1 (KOC1) en comparaison avec des cellules non KO (WT et mock), ii) à étudier l’effet des différents inhibiteurs ciblant différents acteurs des voies de signalisation ou production de cet onco-métabolite, seul ou en association, sur le développement de différents modèles de cancers mammaires RE+ et TN, implantées chez la souris, traités ou non par cet onco-métabolite. Nous utiliserons différentes lignées tumorales commerciales exprimant les cibles d’intérêts (WT et mock) ou déficientes pour le gène d’intérêt (KOC1).

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de valider, in vivo, le ciblage thérapeutique de deux nouvelles voies impliquées dans la signalisation et la production d’un onco-métabolite induisant la prolifération des cancers du sein RE+ et TN ainsi que l’efficacité de différents inhibiteurs ciblant différents acteurs de ces deux voies, seul ou en association, sur le développement de différents modèles de cancers mammaires RE+ et TN. Les bénéfices seront de pouvoir publier dans un article scientifique les résultats de ce projet et d’en faire bénéficier la communauté scientifique. A terme, ce projet permettra de proposer des traitements ou combinaison de traitements pour ces cancers qui représentent la première cause de mortalité chez la femme.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront : l'injection en sous cutanée des cellules tumorales pour établir une tumeur : 1 injection / expérience (Exp 1 à Exp 3), avec une durée de 1 min/ souris; Traitement avec une molécule: 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 1 min/souris. Traitement avec deux molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 2 min/souris. Traitement avec trois molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 3 min/souris. Les prélèvements se feront post-mortem.

Impact sur les animaux

L'onco-métabolite, à la dose qui sera utilisée, a été testé in vivo sur plusieurs modèles de cancers mammaires RE+ et TN et aucun effet indésirable n'a été observé. Les inhibiteurs inhS1 à inhS5 et inhP1 ont déjà été utilisés in vivo sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées. Les autres inhibiteurs n’ont pas encore été testés in vivo. Dans tous les cas, pour chaque traitement ou combinaison de traitements, nous serons vigilants et nous surveillerons de façon quotidienne les animaux afin de s’assurer que les inhibiteurs n’auront pas d’effets indésirables et ne provoquerons pas de souffrance.

Devenir

Procédure 1: garder en vie 5070 souris. Procédure 2: mise à mort à la fin des expériences

Remplacement

Des expériences in vitro sur les cellules utilisées dans ce projet ont été préalablement réalisées avec l'ONCO seul ou en association avec les inhibiteurs, qui seront testés in vivo, pour s'assurer de la pertinence d'étudier ces inhibiteurs sur la croissance tumorale chez la souris. Cependant ces expériences ne sont pas suffisantes et nous devons avoir recours à l’utilisation de souris afin de montrer l’efficacité des molécules testées dans un modèle animal. Les études précliniques chez l’animal sont des étapes indispensables dans le développement des médicaments pour démontrer leur efficacité.

Réduction

Le nombre de souris utilisées sera le nombre d’animaux qui permettra de mener à bien ce projet et d’avoir des résultats significativement exploitables pour permettre d'avoir un suivi de la réponse anti-tumorale au cours du temps et de pouvoir être publié dans un article scientifique.

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général, pesée) afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur. Si une souffrance est observée, un traitement mis dans l’eau de boisson pour éliminer la douleur sera mis en place sous prescription du vétérinaire de l’animalerie. Si des symptômes correspondants à des critères d’arrêt de l’expérience (voir ci-dessous) sont observés, Les souris seront anesthésiées en injectant un mélange de kétamine plus xylazine (50 mg + 5 mg /kg, i.p.) puis mises à mort en injectant une solution de pentobarbital (150 mg/kg, i.p.). De même, les animaux seront mis à mort si la tumeur atteint un volume supérieur à 2000 mm3. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance et procédure d’urgence en cas de dégradation rapide de l’état d’un animal : Les critères d’arrêt de l’expérimentation établis afin de minimiser la souffrance et/ou la détresse des animaux sont les suivants : Perte de poids > 20 % du poids initial ; en particulier, une maigreur extrême des animaux sera définie comme critère d’arrêt.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et permet de comparer les effets obtenus à d’autres molécules développées dans d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude de cette espèce comme les anticorps ou les microarrays. Les souris sont achetées à l’âge de 5-6 semaines et greffées après la période d’acclimatation. Les souris sont adultes lorsqu’elles sont traitées.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur implante par chirurgie un capteur d'électrocardiogramme, leur administre par gavage des molécules anticancéreuses connues pour leur cardiotoxicité et suit leur cœur par échocardiographie sous sédation. Toutes sont ensuite euthanasiées pour prélever le cœur. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne remplace l'étude du cœur dans un organisme "entier", tout en menant en parallèle des travaux sur cardiomyocytes issus de cellules humaines.

Objectifs

Le projet consistera à évaluer de nouvelles options thérapeutiques pour traiter le cancer. Il concerne le développement d’approches basées sur la nanotechnologie, en particulier l’incorporation des molécules dans des formulations nanostructurées. Il s’agira d’étudier les effets bénéfiques espérés de deux nouveaux systèmes de vectorisation pour une molécule déjà utilisée dans la maladie de Chagas et repositionnée pour traiter le cancer, et pour une autre molécule de référence très efficace mais cardiotoxique. Nous évaluerons les effets bénéfiques des deux formulations chez la souris.

Bénéfices attendus

La nanomédecine est une stratégie innovante émergente. Elle vise à mieux contrôler le niveau plasmatique de médicaments et à réduire leur toxicité tout en préservant leur efficacité. Par exemple, des molécules incorporées dans des nanostructures séjournent plus longtemps dans l´organisme ; ce qui améliore leur efficacité à dose plus faible et leur tolérance. L’un des deux médicaments testés est déjà utilisé pour traiter la maladie de Chagas. Il est actuellement évalué dans une stratégie de repositionnement comme traitement d'appoint anticancéreux. Son incorporation dans dans une formulation nanostructurée est prometteuse. Nous comparerons les effets de ce médicament nanoformulé avec ceux d’une molécule de référence, qui sera elle aussi nanoformulée pour supprimer ou atténuer sa cardiotoxicité latente. Nous déterminerons la meilleure option thérapeutique possible pour traiter le cancer. A notre connaissance, il n'y a aucune étude équivalente à l'heure actuelle.

Procédures

Les animaux auront deux à trois échocardiographies (de 15 à 20 minutes chacune) au cours des traitements et, si nécessité de suivre une évolution de leur statut cardiaque, entre une et trois échocardiographies en post-traitement. Les enregistrements se font sous anesthésie légère et sont non-invasifs. L’acquisition d’ECG se fera en ambulatoire (animal vigile, libre de mouvement, dans son environnement) avant et au cours du traitement. Il n’y a aucun intervention particulière (enregistrement neutre pour l’animal). Une chirurgie préalable est réalisée en amont (10 jours avant le premier enregistrement) pour l’implantation du capteur-émetteur de l'ECG.

Impact sur les animaux

Les traitements administrés sont une source potentielle d’effets indésirables chez les animaux. Nous limiterons ces nuisances par un traitement à une dose moyenne et de durée minimale permettant toutefois d’avoir un effet détectable, quantifiable, et actionnable avec des points limites bien définis. L’une des molécules testée est utilisée chez l’homme pour traiter la maladie de Chagas, elle-même source d’insuffisance cardiaque et d’arythmies. Sa cardiotoxicité est donc difficile à apprécier et donc peu documentée. Nous avons montré des effets cellulaires qui pourraient, possiblement, affecter la contraction cardiaque et induire des troubles du rythme. La cardiotoxicité subclinique de l’autre molécule testée, mieux connue chez l'homme, est définie par échocardiographie cardiaque. Elle est donc plus ou moins attendue chez la souris et devra être surveillée. Il est à noter que les deux formulations avec ces deux molécules sont censées diminuer toute toxicité éventuelle. Le gavage peut également une cause de stress qui peut cependant être limité (brièveté de l’acte, expertise de l’expérimentateur). L’échocardiographie est une méthode de choix pour l’exploration indolore de la morphologie et de la fonction cardiaque in-vivo. Elle est non-invasive. Elle permettra de caractériser la fonction cardiaque in-vivo et rend possible un suivi des animaux au cours du temps. Le stress subi par les animaux se limite à la manipulation (période courte, 10 min/animal). Une sédation légère permet l’obtention d’images échocardiographiques de qualité (rythme cardiaque proche de la physiologie). Concernant l'enregistrement des ECG par télémétrie, l’animal est vigile et maintenu dans son environnement habituel, sans stress. Cette approche permet de gérer de façon optimale la période post-opératoire après implantation des capteurs de télémétrie. La nuisance que représente l'étape chirurgicale au cours et après l'implantation sous-cutanée des capteurs est prise en charge par sédation/analgésie. Le bénéfice expérimental inclut l’absence d’interférence liée à une anesthésie pratiquée au cours de l’étude, sans limitation de la durée d’observation, avec un accès aux périodes diurnes et nocturnes, une qualité supérieure du signal, et une diminution des artéfacts.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin des procédures pour prélever le coeur à des fins d'études in vitro (électrophysiologie, biochimie, histologie).

Remplacement

L'une des deux molécules testées est un médicament anticancéreux de référence, mais entaché d’effets cardiotoxiques. Des approches in-vitro et in-vivo ont permis d’envisager l’utilisation d'une autre molécule déjà utilisée pour traiter la maladie de Chagas. L’évaluation d’éventuels effets cardiotoxiques est fondamentale pour poursuivre cette piste. Des études antérieures, réalisées dans notre laboratoire, ont montré des effets cellulaires pouvant être source d'arythmies cardiaques in vivo. Il n'existe actuellement aucune méthode (in-vitro ou in-silico) de substitution idéale pour l’évaluation des effets cardiaques dans un organisme « entier ». Le cœur est un organe complexe, en interaction avec de nombreux autres systèmes (systèmes nerveux autonome, neuroendocrines, etc…). L'approche in vivo est donc nécessaire pour étudier des molécules libérées à partir de nanostructures comme cela est notre cas. Nous comparerons les effets potentiels de notre molécule d'intérêt repositionnée avec ceux de notre molécule anticancéreuse de référence, après incorporation dans des nanostructures censées diminuer leur cardiotoxicité. En parallèle, nous mènerons des études mécanistiques sur des cardiomyocytes dérivés de cellules iPS humaines pour limiter les investigations chez l’animal. Les données seront replacées dans leur contexte d'utilisation et des connaissances acquises in-vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des informations fiables et robustes, nous utiliserons deux techniques de choix utilisées chez l’homme en clinique : l’électrocardiograhie (ECG) et l’échocardiographie. Elles permettent un suivi de la fonction cardiaque au cours du temps. Cela permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés pour des mesures répétées et peu, voire non-invasives, au cours du temps. Les animaux ne sont pas sacrifiés après chaque examen (étape) nécessaire à l’étude. Chaque animal est son propre témoin. Le protocole expérimental a été conçu à partir d'études précédentes similaires. Pour limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, nous étudierons aussi les effets électrocardiographiques avec une méthode d’enregistrement simplifiée de l’ECG. Cette approche a de nombreux avantages : elle est techniquement simple, peu coûteuse, avec un court temps de mesure et facile à mettre en œuvre pour un dépistage d’altérations évidentes. En cas d’altérations significatives, et seulement si, une mesure d'ECG en ambulatoire (sur des animaux vigiles) serait alors mise en œuvre pour approfondir les effets. Notre expérience et une analyse statistique a permis de définir le nombre minimum mais suffisant d'animaux nécessaire dans chaque groupe expérimental pour les deux procédures. Chaque animal étudié sera utilisé en fin de protocole après sacrifice pour mesurer des caractéristiques histologiques, biochimiques et moléculaires. Les données numériques seront moyennées +/- l'écart-type. Nous exécuterons un test normalité de D'Agostino-Pearson (symétrie et distribution Gaussienne) pour chaque ensemble de données indépendantes avec une analyse des variances pour les comparaisons par one-way ANOVA et un test post-hoc (Bonferroni or Tukey) pour comparer les paires de données.

Raffinement

Nous réaliserons des approches in-vivo non invasives et performantes (échocardiographie, électrocardiographie) utilisées chez l’homme afin de transférer les résultats et les connaissances acquises vers la clinique. Nous veillerons à maintenir les meilleures conditions de vie possibles pour les animaux tout au long du protocole, ce qui garantira aussi la qualité et la pertinence des résultats scientifiques acquis. Notre objectif est également de réduire au strict minimum la quantité de détresse imposée aux animaux. Cela inclut la réduction des contraintes pour les animaux, à savoir en matière de stress (ex : période de « repos » après le transport), douleurs éventuelles (soins adéquats avant, pendant et après l’implantation des capteurs de télémétrie ; anesthésie/analgésie), enrichissement du milieu (jouets, tunnel, cell nest; carrés de coton pré-découpés, etc…) pour répondre à leurs besoins physiques et comportementaux, détresse éventuelle, points limites et arrêt anticipé de la procédure en particulier si des effets indésirables intervenaient durant le protocole.

Choix des espèces

Les modèles murins sont utilisés en laboratoire pour des études pré-cliniques, et en particulier pour des investigations pharmacologiques. D’une manière générale, le modèle souris est de très loin le plus utilisé de tous les modèles animaux. Les paramètres cardiaques morphologiques et fonctionnels chez la souris normale sont parfaitement connus, à la fois au laboratoire et via une bibliographie abondante; ce qui élargit les possibilités de comparaison et d’interprétation des résultats avec les études déjà effectuées dans le domaine. Nous utiliserons des souris Swiss, une souche hétérogène avec un pourcentage élevé d'hétérozygotie au niveau des allèles, car elles imitent le mieux la variabilité génétique de la population humaine typique. Les animaux seront réceptionnés au stade adulte, à 2 mois. Ils seront utilisés après la phase d'adaptation dans l'animalerie. Le stade choisi rend plus précises les investigations échocardiographiques et l'implantation des capteurs de télémétrie pour l'ECG (taille de l'animal).