Recherche fondamentale

193 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une neurochirurgie pour induire dans l'hypothalamus l'expression d'une protéine, et 16 femelles reçoivent en plus un frottis vaginal quotidien pendant cinq semaines, afin d'étudier l'effet de l'hormone IGF1 sur le contrôle cérébral de l'ovulation. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des hémorragies et une baisse de température, et que les animaux atteignant les points limites sont mis à mort. Il affirme que la reproduction, fonction intégrée, ne peut s'observer que sur un "organisme vivant", ce qui justifierait selon lui le recours au rat.

Objectifs

L'ovulation dépend de l'intégration de facteurs hormonaux, métaboliques, et environnementaux par le cerveau et plus particulièrement par les neurones hypothalamiques à kisspeptine (KP) qui vont orchestrer la sécrétion de la gonadolibérine ou GnRH permettant le pic de l'hormone lutéinisante (LH) à l'origine de l'ovulation. L'objectif est de développer et de mettre en oeuvre une technique permettant d'induire la synthèse d'une proteine dans une région cible du cerveau sur une période de temps étendue (supérieure à 3 semaines) afin d'étudier l'influence de cette proteine sur le contrôle central de l'ovulation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de deux ordres: le premier consiste en une meilleure compréhension des effets de l' Insulin Growth Factor 1 (IGF1), hormone périphérique, sur le fonctionnement dans le noyau arqué des neurones à KP et plus généralement sur la synchronisation du moment de l'ovulation par l'hypothalamus; le second est la mise au point d'une technique innovante, ne nécessitant pas la mise en oeuvre de bâtiments ayant un niveau de biosécurité élevé, pour induire une proteine dans une région délimitée du cerveau et à un âge déterminé de l'animal ce qui permettra de mieux comprendre sa fonction. Cette technique si elle est validée pourra être déployée chez des espèces animales (telles les espèces de rente) chez lesquelles les outils de génie génétique sont peu disponibles.

Procédures

Tous les animaux (n=193) seront soumis à une neurochirurgie d'une durée moyenne de 15 minutes par animal. Pour ce faire, les animaux seront anesthésiés et leur température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant. Parmi ces 193 animaux, 16 femelles auront un suivi de cyclicité par frottis vaginal réalisé pendant cinq semaines à raison d'un frottis quotidien (les femelles vigiles sont maintenues le temps du frottis).

Impact sur les animaux

Effets directs: Toute neurochirurgie peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. L'incision de la peau du crâne peut induire une douleur localisée. Effets indirects: Mobilité et hygiène du pelage éventuellement réduites suite à la neurochirurgie, l'induction de la synthèse d'IGF1 pourrait avoir des effets sur le poids de l'animal (perte ou gain). Les effets directs sont de courte durée (

Devenir

Le projet porte sur le cerveau et sur l'analyse anatomique et fonctionnelle d'un traitement in situ constitué par un transfectant et un plasmide. De ce fait, il est nécessaire d'euthanasier tous les rats de ce projet en fin d'expérimentation afin de confirmer la zone d'injection, de mesurer son étendue et de caractériser d'éventuelles lésions tissulaires.

Remplacement

La fonction de reproduction étant une fonction intégrée sous contrôle de l'hypothalamus, elle ne peut s'observer que sur un organisme vivant. Les expériences s'appuieront néanmoins sur les données de la littérature pour choisir les critères expérimentaux les plus pertinents et réduire le nombre de tests.

Réduction

Le choix du nombre d’individus par lot s'appuie sur les données de la littérature et notre expérience antérieure montrant que des résultats exploitables et statistiquement fiables peuvent être obtenus avec des groupes compris entre 5 et 7 animaux selon les données à exploiter. La réalisation successive des expériences (et non en parallèle) permet de réduire le nombre de lots expérimentaux car chaque critère établi sera réutilisé dans l'expérience suivante. La taille des lots a été déterminée en nous basant sur notre expérience antérieure où selon les données quantifiées, la variabilité inter-animale et le test statistique utilisé il faut au minimum 7 animaux/groupe. Nous avons ajouté 1 animal par lot afin de prévenir tout risque lié à la chirurgie.

Raffinement

Les rats seront hébergés par trois en présence d'objets en carton (boites à oeufs, tube). Une semaine d'habituation à la manipulation par l'expérientateur sera prévue pour chaque lot de chaque série d'expérience. Les rats seront anesthésiés lors des chirurgies et recevront un traitement antalgique consécutivement à la neurochirurgie. Les rats recevront une pommade ophtalmique pour conserver une bonne lubrification de l'oeil pendant la chirurgie. La surveillance post-opératoire s'appuiera sur l'observation quotidienne du comportement, de l'apparence physique et du poids corporel. La molécule étudiée est une hormone endogène qui n'est pas connue pour avoir des effets nocifs sur la santé des animaux, de même l'absence de nocivité du transfectant a été établie. Néanmoins, une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée tout au long de l'expérimentation ainsi qu'un suivi de poids bihebdomaire.

Choix des espèces

C’est une espèce de référence pour l'étude du contrôle central de la reproduction utilisée en routine par de nombreux laboratoires. L'intérêt de cette espèce dans le cadre de notre projet est la durée courte des cycles ovariens (4 jours) et la bonne reproductibilité/fiabilité des coordonnées stéréotaxiques pour les approches de neurochirurgie. Les animaux seront sexuellement matures afin d'avoir un axe gonadotrope activé et, dans le cas des femelles une activité de reproduction régulière facilement observable par la réalisation de frottis vaginaux. De plus, les coordonnées stéréotaxiques de l'atlas de référence s'appliquent pour des animaux dont le poids est proche de 280g.

Une partie des souris de ce projet est privée d'une protéine mitochondriale de la même famille qu'une enzyme responsable d'une maladie aux atteintes neuromusculaires sévères. 36 souris, mâles et femelles, porteuses de cette inactivation ou témoins, vont être utilisées, toutes tuées en fin de protocole pour l'analyse de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous régime normal ou riche en lipides, chacune passe deux tests de tolérance, au glucose et à l'insuline, qui durent environ trois heures dans un tube de contention avec cinq prises de sang à la queue, deux isolements de 48 heures pour la calorimétrie et une échographie sous anesthésie après rasage et crème dépilatoire. Le porteur ne décrit aucun effet de l'inactivation sur les souris elles-mêmes, alors qu'il justifie le choix de l'espèce par sa capacité à "exprimer fortement les syndromes mitochondriaux incluant les atteintes de différents systèmes, l'intolérance à l'effort et les déficits neurologiques".

Objectifs

Dans le cadre de ce projet nous nous intéressons à une famille d’enzymes, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, en utilisant des cellules en culture, une sous-famille unique de ces enzymes dont les membres sont très similaires à l’enzyme responsable de la pathologie mitochondriale a été mise en évidence. Cette sous famille de protéines est également impliquée dans l’activité énergétique de la mitochondrie. Dans des modèles in vitro, un mécanisme pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients a été récemment décrit. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique mitochondrial, nous voulons étudier le rôle d’une protéine appartenant à cette sous famille. Pour cela un modèle de souris avec cette protéine désactivée a été généré. Nous voulons ainsi étudier les effets de la suppression de cette protéine en particulier sur les fonctions physiologiques en condition normale et sous régime riche en lipides. Nos objectifs spécifiques sont donc chez 36 souris : D’analyser les effets cardiaques et métaboliques en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De mesurer les variations de la biochimie du sang en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De réaliser une étude tissulaire en condition normale et en condition de régime riche en lipides.

Bénéfices attendus

La mitochondrie est un élément présent dans les cellules et jouant un rôle central dans plusieurs fonctions. Elles produisent l’essentiel de l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Cette activité énergétique mitochondriale est donc cruciale et son altération entraine des maladies rares et sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, la compréhension des mécanismes régulant ces activités énergétiques mitochondriales représente une étape essentielle vers le développement d’approches thérapeutiques contre ces pathologies. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une protéine dans la régulation du métabolisme énergétique mitochondriale. Celle-ci fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille. A long terme, notre projet permettra d'identifier les cibles sur lesquelles agir afin d'améliorer les fonctions mitochondriales. Ainsi, une fois que nous aurons détaillé le mode d’action de cette protéine, nous souhaitons identifier des molécules actives sur celle-ci et utiliser ces molécules pour restaurer les fonctions mitochondriales dans des pathologies.

Procédures

Durant ce protocole, une cohorte de 36 animaux suivra une série de tests qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi en lipides sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un seul test de tolérance au glucose par souris, dans lequel l'animal reçoit une injection intrapéritonéale de glucose suivi de 5 prélèvements d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un seul test de sensibilité à l'insuline par souris sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie. Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contention afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 48h, ce qui peut être un stress d'isolement. Ce test sera répété deux fois par souris. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. L’échographie sera réalisée une fois par souris, elle nécessite que l’animal soit sous anesthésie. La procédure dure environ 20 min par souris. Enfin, des prélèvements sanguins seront effectués en fin d’étude pour analyser des paramètres biochimiques. Ces prélèvements, un par souris, se font en quelques minutes.

Impact sur les animaux

Durant le projet, les animaux subiront un prélèvement sanguin, qui dure quelques minutes. Nous étudierons les mécanismes de régulation du glucose et la sensibilité à l'insuline. Dans ce protocole, les animaux recevront une injection d'insuline et de glucose, et subiront des prélèvements de gouttes de sang à intervalle réguliers sur une période de 3 heures, afin de suivre leur glycémie. Pour connaitre leur métabolisme énergétique, ils seront isolés pour une période de 48h. Cet isolement permet de connaitre la valeur de chaque individu et est indispensable pour pouvoir conclure sur ce paramètre. L’échographie se déroule quant à elle sous anesthésie à l'isoflurane pendant toute la durée du test. Les animaux seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée. Enfin, le régime enrichi en lipides peut entrainer la présence de lésions cutanées dues à un hyper-toilettage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation génétique sur les organes.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et d'animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests en conditions de régime riche en lipides et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et moléculaires sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro dans le domaine physiopathologique. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire incluant mâles et femelles porteurs des génotypes KO et wild-type. de plus, les groupes contrôles et expérimentaux ont un fond génétique identique. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, nous avons opter pour une approche intégrative où les animaux sont utilisés pour différents tests et analyses. Tous les types de tissus que nous souhaitons étudiés seront prélevés sur chacun des animaux utilisés. Pris dans son ensemble, le design de notre projet permet d'optimiser au maximum la quantité d’animaux nécessaire à sa réalisation.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Ainsi, durant le prélèvement sanguin, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance accrue et quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux sera mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure, si ces derniers sont atteints nous procéderons à l'arrêt de l'expérience.

Choix des espèces

Le modèle expérimental utilisé dans ce projet et le modèle murin, largement utilisé dans le contexte de modifications génétiques. La souris est un modèle établit et solide concernant l’étude des pathologies mitochondriales. En effet, ce modèle permet d'exprimer fortement les syndromes mitochondriaux incluant les atteintes de différents systèmes, l’intolérance à l’effort et les déficits neurologiques. Les animaux seront utilisés à 8 semaines, soit le début de l’âge adulte.

63 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, puis douze perfusions intraveineuses d'une heure par un cathéter alors qu'elles sont éveillées, avant un prélèvement de sang cardiaque terminal, pour tester un candidat médicament anticancéreux dans un modèle de cancer de la vessie. Le porteur annonce un effet "vaccinal" contre les récidives, à partir de résultats antérieurs, et vise des données précliniques pour un futur essai chez l'humain. Il indique que le cathéter peut s'obstruer et que la pousse tumorale peut gêner la locomotion.

Objectifs

Le TLR3 est un récepteur impliqué dans l’immunité et est exprimé par les cellules normales mais aussi dans de très nombreuses cellules tumorales. L’activation de ce dernier par certaines molécules entraîne une mort spécifique des cellules cancéreuses (mais pas des cellules normales), ainsi qu’une activation de l’immunité ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes induit une vaccination à long terme contre la tumeur empêchant ainsi les récidives cancéreuses. Des études précédentes ont démontré l’ensemble des effets cités ci-dessus (guérisons complète de 45% des souris traitées et vaccination à vie des souris guéries contre les récidives dans 66% des cas). Ces résultats ont été obtenus lors d’injections intratumorales d’une toute nouvelle famille de molécules activant le TLR3 (spécifique, utilisable en clinique et bien tolérée). Dans la présente étude, le candidat médicament adapté à une injection dans le système veineux (ici perfusion intraveineuse sur souris vigiles sans contention) va être comparé en doses croissantes sur 63 souris dotées d’un cathéter pour déterminer : (1) l’efficacité antitumorale, (2) la tolérance et (3) les mécanismes d’action (dont l’action sur le système immunitaire). Pour ce faire, le modèle de cancer de la vessie sera utilisé pour que l’activité de ce candidat médicament puisse être directement comparable aux études précédentes et à venir.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’efficacité du candidat médicament par voie d’administration en perfusion intraveineuse et à trouver sa dose efficace pour une action anti-tumorale. L’hypothèse est également que ce candidat médicament permettra d’éviter les récidives avec un effet vaccinal. Il est testé ici sur un modèle de tumeur de la vessie mais il pourrait avoir des actions sur une multitude de cancer.

Procédures

- Anesthésie pour identification, tonte, injection de cellules tumorales dans le flanc …. (5 min) - Douze traitements (injection intraveineuse lente par le cathéter) d’une heure sur souris non anesthésiées. - Une anesthésie pour prélèvement de sang intracardiaque suivi d’une mise à mort (10-15 min).

Impact sur les animaux

Les animaux sont reçus déjà dotées d’un cathéter dans la veine jugulaire avec un injecteur double qui est susceptible de s’obstruer. Les animaux subiront un stress lors des contentions, mesures, entretien des cathéter, anesthésies et greffe tumorale. L’anesthésie terminale en vue du prélèvement sanguin intracardiaque peut entraîner l’arrêt du cœur. La pousse tumorale peut engendrer une gêne dans la locomotion.

Devenir

A la fin de l'unique procédure, tous les animaux seront mis à mort avant prélèvements en point final sans réveil (analyses pharmacocinétiques, biodistribution et biomarqueurs).

Remplacement

Pour cette étude, des souris ayant un système immunitaire complet et dotées d’un cathéter sur la veine jugulaire permettant les injections et les prélèvements seront directement reçues du fournisseur. Ces expériences sur petits animaux ne peuvent pas être REMPLACEES. Seul un modèle in-vivo, possédant un système immunitaire complet, permet l'étude de l'effet vaccinal thérapeutique et anti-récidives contre les tumeurs. Il en va de même pour les facteurs physiologiques pouvant influer sur l’effet de la molécule testée (biodisponibilité, métabolisation, distribution cellulaire, réponse immunitaire...). Aucune donnée bibliographique n’étant disponible sur ces molécules, seules les expérimentations permettront de disposer de ces données et d'étudier l'efficacité du candidat médicament aux différentes étapes de la progression tumorale. Ces expériences s'inscrivent dans le cadre du développement d'une application thérapeutique et fournira des données précliniques précieuses pour la conception d'un essai clinique chez l’Homme.

Réduction

Une précédente preuve de concept a permis de déterminer que le nombre de souris prévu pour cette expérience était adapté. Ainsi, la REDUCTION du nombre d'animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats sera respectée, tout en utilisant les méthodes statistiques adaptées. Des études statistiques seront effectuées sur les mesures de croissances tumorales et sur le nombre de tumeurs n’atteignant pas une taille critique.

Raffinement

Le RAFFINEMENT sera respecté par la mise en place d’une définition précise des points limites précoces et prédictifs, sur la base d'une grille de score validée sur ce modèle et sur ce type de traitement. Une surveillance adaptée des animaux 3 fois par semaine permettra d'éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 et isolés pendant le temps du traitement dans des cages transparentes et pourront ainsi se voir à travers les parois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’à de l’enrichissement. Un prélèvement de sang aura lieu à la fin de 2 des 12 traitements sans que l’animal s’en rende compte par le cathéter. Les autres prélèvements seront des prélèvements terminaux pratiqués sous anesthésie et antalgie. Ce modèle se rapproche donc physiologiquement d’une infusion clinique sur l’Homme. Ce dispositif permet aussi de ne pas piquer plusieurs fois dans la même veine, ce qui peut l’abîmer.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques et immunologiques : (1) En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé, avec des grilles de comparaison entre la souris et l'homme très bien définis pour les perfusions intraveineuses. (2) La réponse immunitaire chez cette espèce est également très bien définie. Or, seul le modèle animal possédant un système immunitaire complet permet l'étude de l'effet vaccinal contre le cancer. Les expériences s’effectueront sur des souris de 9 à 11 semaines après 7 jours d'acclimatation dans l’EU. A ce stade de développement, la croissance tumorale est plus reproductible et bien tolérée, de plus, le système immunitaire est suffisamment mature pour induire une réponse vaccinale. Les souris utilisées seront toutes des femelles afin de limiter le risque d’agressivité inter-individu par rapport aux mâles. De plus, les études précédentes ont également été effectuées sur des souris femelles, ce qui permettra de comparer les résultats de cette étude.

2 259 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales ou un produit cancérigène suivi d'un agent provoquant une inflammation du côlon, puis sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs organes, afin d'étudier le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les cancers. Le porteur indique un risque de prolapsus rectal et une perte de poids, et renvoie ses retombées thérapeutiques éventuelles chez l'humain à un horizon lointain. Il affirme que la complexité du développement tumoral impose l'animal et revendique une expertise de plus de vingt ans pour fixer les effectifs.

Objectifs

Les cancers représentent la première cause de décès en France. L'immunothérapie a permis de faire des avancées spectaculaires dans leur traitement. Des recherches précliniques et cliniques laissent espérer une augmentation du nombre de patients que nous pourront traiter dans le futur. Notre projet s’inscrit dans cette perspective. Il est maintenant clairement établi qu’une population de cellules du système immunitaire qu’on appelle lymphocytes T régulateurs, appelés plus simplement « Treg », a un rôle délétère dans les cancers en inhibant fortement les réponses immunes contre les tumeurs. Certains traitements efficaces en immunothérapie des cancers agiraient par destruction des Treg. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle joué par les Treg dans la physiopathologie des cancers et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies, nous devons avoir recours à l'animal pour mieux comprendre ces mécanismes et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le rôle fondamental du microenvironnement dans le développement tumoral ne peut être reproduit et analysé dans des modèles de culture cellulaire. Il est d'ailleurs important de rappeler ici que toutes les avancées récentes en immunothérapie des cancers proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme. Nous allons travailler sur le rôle joué par certaines molécules exprimées par les Treg infiltrant les tumeurs ou impliquées dans la régulation du métabolisme de ces cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dans lesquelles l’expression de ces différentes molécules est éliminée dans les seuls Treg. Mieux comprendre le rôle de ces molécules dans les Treg permettra de mieux comprendre la physiopathologie des cancers. De plus, le ciblage de certaines de ces molécules dans les Treg pourrait amener à de nouveaux traitements des cancers. C’est l’objectif général de ce projet.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement de la physiopathologie des cancers, notamment concernant la régulation de ces maladies par les Treg. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Le projet comprend 2 procédures. Pour la première procédure, l’expérience débutera par l’injection de cellules tumorales sous la peau chez des souris anesthésiée et maintenues sur une plaque chauffante. L’injection en elle-même des cellules ne durera pas plus de 30 secondes et l’anesthésie durera moins de 5 minutes par souris. On effectuera ensuite un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal, la taille des tumeurs avec un pied à coulisse et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 90 secondes par souris. Pour la mesure de la taille des tumeurs, on fera une contention par la peau du cou et pour la mesure du poids des souris, on fera une contention par la queue. Certaines de ces souris seront également traitées 10 à 17 jours après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 18 ou 30 jours après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris). Pour la deuxième procédure, le début de l’expérience consistera à injecter un produit carcinogène. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Puis, on donnera dans l’eau de boisson un produit déclenchant une inflammation dans l’intestin qui va favoriser l’apparition d’un cancer du colon sur le long terme. Ce dernier produit sera administré 3 fois (à 1 semaine, 4 semaines et 7 semaines après le début de l’expérience) pendant 1 semaine. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Certaines de ces souris seront traitées pendant 1 semaine, 6 semaines ou 9 semaines après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 12 semaines après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

A l'état basal, aucun phénotype dommageable n'a été reporté ou observé au laboratoire pour les différentes lignées utilisées dans ce projet. L’inoculation des 3 lignées tumorales n’entraine pas de douleur systémique spécifique. L'induction du cancer colorectal provoque l'apparition de tumeurs dans le colon distal en 1 à 3 mois avec risque de prolapsus rectaux et une perte de poids inférieure à 10% du poids initial. Le traitement par le tamoxifène entraine une perte de poids modérée (

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, tumeurs, colon etc…) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des cancers, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des cancers et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

REGLES GENERALES. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons 7 souris par groupe pour les analyses de croissance tumorale, d’immunophénotypage par cytométrie de flux et d’analyse histologique. Les groupes seront constitués de 4 souris pour les analyses transcriptomiques. Les expériences seront répétées 3 fois. Nous ne pouvons descendre en dessous de ces valeurs. La taille des effectifs et le nombre de fois où les expériences seront reproduites ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. STRATEGIE D’ANALYSES GROUPEES. Dans la plupart des cas, nos études portent sur des analyses multifactorielles. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences sur différentes lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin les comparer entre elles et par rapport au même groupe témoin. STRATEGIE D'UTILISATION DE SOURIS GENETIQUEMENT MODIFIEES HOMOZYGOTES. Dès qu'il sera possible de le faire, nous maintiendrons nos souris génétiquement modifiées à l'état homozygote pour les transgènes. De cette façon, toutes les souris seront utilisables pour les expériences. STRATEGIE D’OPTIMISATION DES ANIMAUX EUTHANASIES. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver le plus de données possibles par animal. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire le nombre de souris utilisées à un total de 2259 pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum dans des cages de Longueur 36,50 cm, largeur 20,5 cm et hauteur 12,5 cm). Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. L'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi pour permettre aux souris de faire un nid avec des lanières de papier Kraft. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs au moins 3 fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au vétérinaire responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. Une discussion sera engagée pour déterminer s'il y a lieu d'administrer un analgésique et si oui lequel. Le choix dépendra de l'intensité et de la durée de la douleur éventuelle. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, soit nous l'euthanasions et le sortons de l'étude soit on lui donne un analgésique. En général, on choisira plutôt de le sortir de l'étude car les analgésiques peuvent interférer avec le système immunitaire. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Le modèle d’induction de cancer du colon est un modèle préclinique mimant la pathologie humaine. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 6 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.

3 120 rats et 1 680 souris subissent jusqu'à deux chirurgies de 30 minutes, des traitements par différentes voies d'administration et des recueils d'urine, puis sont tous tués pour une étude histologique du cerveau. Ces 4 800 rongeurs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et leurs organes doivent ensuite alimenter une banque de tissus de l'institut. Le projet teste des nanoparticules censées rétablir l'élimination des protéines qui s'agrègent dans les neurones, dans des protocoles destinés à reproduire la maladie de Parkinson. Le résumé ne dit ni comment cette pathologie est provoquée, ni à quoi servent les chirurgies, ni quels tests comportementaux sont pratiqués, et le porteur affirme que les rongeurs atteints ne présentent "pas de symptome marqué".

Objectifs

Actuellement, Les maladies neurodégénératives ne possèdent pas de traitement curatif, mais seulement des traitements symptomatiques ayant un effet limité, accompagné d’effets indésirables. Le but de ce projet est de développer un outil thérapeutique visant à restaurer la voie de « nettoyage » des neurones en permettant ainsi l’élimination de protéines qui s’agrègent et tuent les neurones. Les lysosomes sont des organites cellulaires impliqués dans la survie des cellules, en dégradant certaines molécules anormales qui s’accumulent provoquant ainsi des pathologies neurodégénératives. Or chez les patients atteints de certaines formes de ces pathologies, la fonction lysosomale est perturbée et ne permet donc plus le nettoyage cellulaire dans les neurones, entrainant leur mort. La stratégie de ce projet est donc de développer et tester via différents modes d’administration des nanoparticules contenant des molécules permettant de refonctionnaliser la voie de « nettoyage » des neurones dans différents modèles animaux de la Maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Les synucléinopathies comme la maladie de Parkinson touchent plus de 100.000 personnes en France, dont 80% sont âgées de plus de 65 ans, au cours des années à venir nous allons observer une augmentation importante du nombre de cas en raison du vieillissement de la population et de l'amélioration de l'espérance de vie. De ce fait la découverte d’un traitement curatif utilisant des nanoparticules est un des grands axes de notre recherche. Ce projet s’inscrit dans une optique à long terme avec à terme une application clinique du composé utilisé.

Procédures

Chirurgie : au maximum deux chirurgie de 30 minutes. Traitements avec les différents modes d'administration. Récolte d'urine excrétée.

Impact sur les animaux

Effets liés à la chirurgie, mais bien encadrés au niveau analgésie et avec un suivi postopératoire sur 3 jours minimum. Le modèle neurodégénératif chez la souris ou le rat n'entraine pas de symptome marqué, en effet les désordres sont plutôt visibles à l'échelle moléculaire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau.

Remplacement

Dans le respect du R de remplacer, dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement spatiotemporel des synucléinopathies dans des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé afin d'obtenir des résultats significatifs en réalisant une cohorte par groupe (test statistiques ANOVA). Nous utilisons des tests comportementaux qui sont non invasifs et permettent un suivi au long cours sur un même animal. Les organes étudiés en fin de procédure représenteront une banque de tissus utilisable pour d'autres analyses ultérieures au sein de notre Institut (cerveau en général et pour ce projet particulièrement reins, foie).

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines d'acclimatation permet aux animaux de se familiariser avec leur nouvel environnement. Les animaux sont hébergés dans des cages transparentes placées sur portoirs ventilés et maintenues à 21°C et 55% d’humidité. L'enrichissement de leur milieu est représenté par des maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher ou ronger. Des batonnets de bois sont aussi intégrés dans les cages pour permettre aux animaux de ronger. Anesthésie et analgésie : la douleur et l’inconfort générés par la chirurgie et les méthodes d’administration sont maitrisés par un recours à l’anesthésie (gazeuse) et l’utilisation d’analgésiques. Des points limites adaptés pour les deux espèces sont uivis : une mobilité réduite voir difficile suite à la chirurgie, une attitude de repli, une allure du poil terne et mal nettoyé (difficulté à récupérer le poids initial) dans les jours suivant la chirurgie. Un suivi post-opératoire est dans tous les cas réalisé grâce à une fiche de scorage qui évalue la perte de poids, la mobilité, les interactions avec les congénères, aspect du poil. Les animaux sont pesés de manière hebdomadaire pendant toute la durée de l’étude.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat largement transférables à l'homme. De plus, ces espèces permettent d’utiliser des animaux modifiés génétiquement.

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, une injection de Staphylococcus aureus ou de sa toxine, avec des prélèvements de sang, pour tester si l'absence de cavéoline-1 aggrave l'infection. Le porteur indique que les souris peuvent montrer prostration, apathie, hérissement des poils, perte de plus de 20 % du poids et forte variation de température, et que les effets sont irréversibles. Il affirme que la perméabilité vasculaire au cours de l'infection ne peut être évaluée qu'en système intégré chez l'animal.

Objectifs

Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie fréquemment retrouvée dans le nez, le tractus respiratoire et la peau. Dans certaines conditions, S. aureus peut causer un grand nombre de maladies, allant des infections mineures comme des infections superficielles de la peau et des tissus mous jusqu’à des infections mortelles telles que le syndrome de choc toxique, la pneumonie, la septicémie et l'endocardite infectieuse. C'est toujours actuellement l'une des cinq causes les plus fréquentes d'infections acquises dans les hôpitaux et souvent la cause d'infections postopératoires. Chaque année, environ 750 000 patients dans les hôpitaux de France contractent une infection staphylococcique, soit environ 4 000 décès. Par conséquent, il est crucial de définir les facteurs de risque qui contribuent à l'invasion de l'hôte par S. aureus. Les toxines de S. aureus induisent la formation de pores à travers les cellules qui favorisent la perméabilité des vaisseaux sanguins et la dissémination de la bactérie dans les organes. La protéine cavéoline-1 est un régulateur critique qui limite la formation et l’élargissement de ces pores. La perte d’expression de la cavéoline-1 entraine un doublement du nombre de pores et leur élargissement d’un facteur 3. Ces résultats étant basés sur des études in vitro, l’objectif de notre étude est de démontrer que la perte d’expression de la cavéoline-1 chez l’animal est responsable d’une hyper-susceptibilité des animaux à l'infection par S. aureus.

Bénéfices attendus

Les travaux préalables ont permis de montrer un lien causal entre la formation des pores induits par S. aureus et la survenue de dysfonctions vasculaires (œdème, hémorragie et aggravation de l’infection). Ce projet doit permettre d’apporter un bénéfice à la compréhension de la formation des pores vasculaires et leur importance dans la régulation de la perméabilité vasculaire . Ceci aura en outre des retombées probables dans la compréhension de certaines formes de maladies vasculaires conduisant à des hémorragies spontanées sans diminution du nombre de plaquettes.

Procédures

L'injection des bactéries aura lieu une seule fois sur animaux anesthésiés (durée d'anesthésie 10 min). Des prélèvements sanguins à la queue seront effectués également après anesthésie et la souris maintenue endormie jusqu'à l'arrêt des saignements (anesthésie totale 15 min). Les expériences d'injection de colorant non toxique pour vérifier l'intégrité des vaisseaux seront effectuées sur animaux sous anesthésie, maintenue pendant 20 minutes, jusqu'au prélèvement de sang en aorte qui entraine l'arrêt cardiaque et respiratoire.

Impact sur les animaux

L’ensemble des résultats obtenus in vitro sur cellules concordent pour indiquer que la perte d’expression de la cavéoline-1 entraine une augmentation du nombre et du diamètre des pores cellulaires lors de l’intoxication par la toxine EDIN. On peut anticiper que si les effets in vitro sont reproduits chez l'animal, l'absence de cavéoline-1 devrait aggraver les symptomes lors de la bactériémie à S. aureus produisant l’EDIN-B. Les animaux pourraient ainsi montrer des signes d’hyper-susceptibilité à l’infection à travers l'augmentation de perméabilité vasculaire, manifestés par un phénotype caractéristique de prostration, immobilité, apathie, hérissement des poils ou/et perte de poids de plus de 20%. La multiplication des bactéries pourrait entrainer une modification importante de la température corporelle, soit une fièvre, soit une hypothermie en cas de choc septique. Par ailleurs, concernant les nuisances liées aux actes expérimentaux, les animaux vigiles seront soumis à des actes de contentions afin d'injecter un mélange anesthésiant. Toutes les autres manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les prélèvements non terminaux à l'extrêmité de la queue seront effectués par section < à 0.5 mm et les souris réveillées une fois l'hémostase réalisée afin de minimiser les nuisances au réveil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue du projet car les effets des bactéries et de la toxine sont irréversibles après l’injection et les animaux ne peuvent être ré-utilisés sous peine de créer des biais.

Remplacement

La cavéoline-1 est un gène de susceptibilité à la formation de pores transendothéliaux induits par l’EDIN-B, une toxine produite lors d'une infection par Staphylocoque. La formation de ces pores corrèle avec l’apparition de complications vasculaires. L’évaluation de la pathogénicité vasculaire de l’exotoxine EDIN-B en terme de perméabilité vasculaire au niveau des différents organes ne peut se faire que par une étude chez l’animal en système intégré.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux nous partirons de nos données antérieures sur l’infection bactérienne induite par Staphylococcus aureus. Pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude nous procèderons en étapes successives, la première étape étant la comparaison des sensibilités des souris contrôles ou présentant une absence de cavéoline-1 aux souches bactériennes exprimant ou non la toxine. Si une différence est présente, l'étape-2 servira à confirmer le rôle de la toxine Edin avec des souches mutantes contrôles. Enfin, la perméabilité vasculaire sera examinée après injection i.v. de la toxine EDIN purifiée. Les effectifs ont été calculés sur la base d'une analyse de puissance. Sachant que toutes les souris ne développent pas de bactériémie, pour un risque 5% et une puissance de 80%, nous avons calculé des effectifs de 30 animaux par groupe. Ceci correspond à une différence entre les groupes variant de 0.13 à 0.35, suffisante pour répondre à la question biologique.

Raffinement

Les points-limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance, et une surveillance quotidienne des animaux nous permettra de détecter au plus tôt ces points limites. Les souris sont maintenues dans leur groupe, qui aura été mis en place une semaine avant le démarrage des expériences. La cage est enrichie en jouets, et en frisure et coton à déchiqueter pour favoriser la nidation et maintenir la température en cas de refroidissement des animaux. De la nourriture sera systématiquement placée dans le fond de la cage avant le début de l'expérience, et aux premiers signes d'apatie on rajoutera de la nourriture gélifiée, plus apétante et hydratée.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par Staphylococcus aureus. C'est une espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, qui développe des symptomes similaires à ce que l'on observe chez l'homme. De plus dans le cas de cette étude, il s'agit de déterminer le rôle de la cavéoline-1 dans le développement de l'infection, et l'utilisation des souris transgéniques invalidées pour la cavéoline-1, mâles et femelles, nous permettra d'obtenir des conclusions claires.