Recherche fondamentale
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Création et caractérisation fonctionnelle d’un modèle murin du syndrome de Brugada
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont quarante opérées par cathétérisme intracardiaque sans réveil. Ce modèle du syndrome de Brugada est obtenu en croisant deux lignées mutantes, puis soumis à des enregistrements cardiaques et une échocardiographie sous anesthésie et, pour une partie, à l'implantation d'une sonde de télémétrie. Le porteur indique que les souris peuvent développer des arythmies pouvant conduire à des morts subites imprévisibles, ce qui empêche de fixer un point limite. Il conclut que ce niveau d'intégration ne peut être obtenu que sur un modèle animal et renvoie les retombées thérapeutiques au conditionnel.
Objectifs
Le syndrome de Brugada est une maladie génétique caractérisée par un risque élevé d'arythmies cardiaques et de mort subite survenant généralement chez des sujets jeunes (35-40 ans), majoritairement des hommes. Il serait impliqué dans environ 10% des morts subites dans la population générale. Ses mécanismes sont peu connus. On sait cependant qu'ils impliquent des anomalies de l'activité électrique cardiaque. Sur le plan génétique, on pense aujourd'hui que le syndrome de Brugada serait une maladie génétique complexe qui nécessiterait la combinaison de mutations sur plusieurs gènes, chaque gène prédisposant de façon plus ou moins importante à cette maladie. Parmi ces gènes, SCN5A est le plus fréquemment retrouvé (environ 25% des cas). Les mutations de ce gène conduisent à une perte de fonction de la protéine codée par ce gène. Un modèle de souris invalidée pour ce gène (souris KO) présente une perte de fonction équivalente, qui conduit à des anomalies mineures de l'activité électrique cardiaque, prédisposant à la survenue d'arythmies peu sévères. D'autres mutations sur plus de 25 autres gènes ont été identifiées, dont une mutation du gène RRAD. La fonction cardiaque de souris porteuses de la mutation du gène Rrad (souris KI) a été caractérisée : ces souris ne montrent que des anomalies mineures de l'activité électrique cardiaque et ne présentent pas d'arythmies. Dans ce contexte, nous voulons déterminer la contribution relative de ces 2 gènes de prédisposition au syndrome de Brugada dans les mécanismes physiopathologiques de ce syndrome. Pour cela, nous caractériserons la fonction cardiaque de souris avec la mutation sur le gène Rrad et l'invalidation du gène Scn5a (souris KI/KO), obtenues en croisant souris KI et souris KO.
Bénéfices attendus
Cette étude devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques du syndrome de Brugada, pathologie génétique complexe, en combinant pour la première fois plusieurs anomalies génétiques prédisposant à ce syndrome. Le développement d'un modèle murin plus pertinent que les modèles actuellement disponibles pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir la survenue des arythmies. En effet, il n'existe pas actuellement de solution thérapeutique autre que l'implantation d'un défibrillateur chez les patients considérés les plus à risque. Ceux-ci sont cependant difficiles à identifier, et les défibrillateurs implantables ne sont pas sans risque de complications.
Procédures
Dans une première étape, 80 souris seront soumises à 3 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 15 min) à l'âge de 10 semaines, puis de 30 et 50 semaines, et un examen échocardiographique (15-20 min ), réalisés sous anesthésie générale. Dans une seconde étape, 40 autres souris seront soumises à une exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque, d'une durée de 15-30 min, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, sans réveil. Enfin, en fonction des résultats obtenus, 40 souris supplémentaires pourront être implantées avec une sonde de télémétrie, sous anesthésie générale et analgésie, permettant un enregistrement de l'électrocardiogramme en continu (24 h) en condition vigile. La durée de l'intervention chirurgicale est de l'ordre de 30 min. L'âge des animaux lors de ces deux dernières étapes sera déterminé en fonction des résultats obtenus lors de la première étape.
Impact sur les animaux
Les souris KI et les souris KO se développent normalement et ne montrent pas de signes notables de souffrance. Sur cette base, nous n'anticipons pas de survenue d'un phénotype sévère chronique chez les souris KI/KO. On ne peut cependant pas exclure la possibilité que les souris KI/KO présentent des arythmies ventriculaires susceptibles de conduire à des morts subites, même si la fibrillation ventriculaire, généralement à l'origine de la mort subite, n'est que très rarement observée chez la souris. Par définition, la mort subite est totalement imprévisible, ce qui empêche la mise en place de points limites spécifiques. L'enregistrement de l'ECG et l'échographie (procédure 2) ne sont pas des techniques générant de la douleur mais ces examens seront cependant réalisés sous anesthésie pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable. Pour les mêmes raisons, l'exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque (procédure 3) sera également réalisée sous anesthésie. Cette procédure entraine une douleur au niveau du point de ponction cutanée pour cathétériser la veine jugulaire ; celle-ci sera prévenue par une anesthésie locale. Comme toute intervention chirurgicale, l'implantation d'une sonde de télémétrie (procédure 4) peut conduire à une douleur péri- et post-opératoire qui sera prévenue par la mise en place d'une analgésie pour une durée minimale de trois jours.
Devenir
A l'issue de la procédure 2 (électrocardiogramme aux âges de 10, 30 et 50 semaines + échocardiographie à 51 semaines), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur coeur pour des examens histologiques et moléculaires. A l'issue de la procédure 3 (exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque), les souris sont systématiquement mises à mort parce que cette procédure peut avoir des conséquences néfastes sur la souris. En effet, il est possible, mais difficile de suturer la veine jugulaire après avoir retiré le cathéter, ce qui nous oblige à la ligaturer pour éviter les hémorragies, perturbant ainsi le retour veineux depuis la tête de l'animal. Par ailleurs, bien que les cathéters aient un diamètre très faible (1/3-1/2 mm), ils sont suffisamment gros pour léser les valves tricuspides, ce qui peut induire une insuffisance cardiaque droite à plus ou moins long terme. La mise à mort des souris permet en outre de prélever le cœur pour des études moléculaires. A l'issue de la procédure 4 (enregistrement de l'ECG par télémétrie), les animaux seront mis à mort et leurs cœurs prélevés pour des études moléculaires.
Remplacement
Cette étude fait suite à des études in vitro réalisées avec des cardiomyocytes différenciés à partir de cellules souches pluripotentes induites de patients avec un syndrome de Brugada qui ont permis d'identifier des anomalies de l'activité électrique cellulaire et leurs mécanismes moléculaires. Cependant, les arythmies cardiaques en général, et le syndrome de Brugada plus particulièrement, sont des maladies complexes résultant des interactions entre les cardiomyocytes (30-40% des cellules cardiaques), dont l'activité électrique est altérée, les autres cellules cardiaques (fibroblastes, cellules endothéliales, neurones intracardiaques et cellules du système immunitaire) et le système nerveux autonome. Ce niveau d'intégration ne peut être obtenu que sur un modèle animal. Le syndrome de Brugada présente également la particularité d'une localisation préférentielle des anomalies électriques dans le ventricule droit et plus précisément dans l'infundibulum pulmonaire. Ce niveau de spécificité anatomique ne peut être obtenu in vitro.
Réduction
Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (procédure 2), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le projet est organisé en trois étapes successives. La dernière étape ne sera réalisée que si les deux premières démontrent que le nouveau modèle généré est plus pertinent que les précédents. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. Leur taille a été déterminée à l'aide du logiciel de statistiques Sigmastat sur la base de notre expérience antérieure.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels en plastique ou de cabanes en carton pour se camoufler et/ou de papier pour fabriquer des nids. Des mesures spécifiques adaptées à chacune des procédures seront prises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris causées par ces procédures. Ainsi, les enregistrements des électrocardiogrammes et les échographies seront réalisés sous anesthésie pour éviter tout stress lié à une contention des animaux. Les interventions chirurgicales (cathétérisme intracardiaque et implantation de sonde télémétrique) seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Après implantation d'un capteur de télémétrie, qui permet l'enregistrement continu d'un ECG sur des souris vigiles, une analgésie post-opératoire sera mise place pendant au moins 3 jours jusqu'à la disparition de tout signe clinique de douleur ou d'inconfort. Pour ces animaux, les tunnels en plastique seront systématiquement remplacés par des cabanes en cartons, moins rigides, pour éviter d'éventuels frottements et des blessures potentielles sur la zone de l'implant. Tout au long de la vie des souris, des points limites, basés sur la présence de signes cliniques détaillés sur l'aspect général et le comportement des animaux, leur respiration, leur évolution pondérale, leur prise alimentaire ou encore la nature et la couleur de leur fèces et urine, ont été définis. En cas de présence d'un ou deux signes cliniques notables, un traitement et une prise en charge de la douleur adaptés seront mis en place jusqu'à disparition de ces signes. En cas de persistance de signes cliniques notables ou d'apparition d'un signe clinique sévère malgré la prise en charge thérapeutique mise en place, les animaux seront mis à mort, que l'objectif de l'étude soit atteint ou pas. Pour toutes les souris inclues dans cette étude, la mise à mort sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus utilisée en recherche, notamment dans le cadre de modèles de pathologies génétiques. De plus, notre équipe possède une expertise avec ce modèle sur l’ensemble des procédures nécessaires au projet (ECG, échocardiographie, cathétérisme intracardiaque, télémétrie). Enfin, plus spécifiquement dans le cadre de ce projet, la création du nouveau modèle repose sur l'utilisation de 2 modèles de souris déjà existants. L'étude sera réalisée avec des souris adultes dans la mesure où la pathologie chez l'humain n'est que rarement détectée chez les enfants ou les adolescents.
Prévention de l’athérosclérose: régulation de l’homéostasie du cholestérol grâce à l’injection d’anticorps EU1/3
- Recherche fondamentale
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632 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises trois à cinq mois à un régime riche en cholestérol, à six à dix injections dans la veine de la queue, à des mesures de pression artérielle et à des séances d'IRM ou d'échographie, pour tester des anticorps censés freiner l'athérosclérose. Le porteur indique que le régime peut provoquer des œdèmes de la face et des membres, une perte de poids et une nécrose localisée au point d'injection. La justification du devenir décrit une euthanasie finale pour prélever les organes, alors que le champ structuré enregistre ces souris comme rendues à l'élevage, une incohérence dans la déclaration.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de protéger de l'accumulation du cholestérol dans les vaisseaux sanguins en utilisant des anticorps. Cette accumulation de cholestérol s’appelle l'athérosclérose. C’est une maladie inflammatoire qui implique le système immunitaire et qui est chronique. Cette accumulation conduit à la formation de cellules gorgées de cholestérol qui s’accumulent pour former des plaques d’athérome dans la paroi des vaisseaux sanguins. L’origine de ces cellules gorgées de cholestérol est double : cellules du système immunitaire et cellules de la paroi des vaisseaux sanguins. La rupture de la plaque d’athérome favorise la crise cardiaque et l’accident vasculaire cérébral (AVC). Les outils thérapeutiques actuels ne sont pas suffisants pour empêcher efficacement la progression de la maladie et la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc nécessaire. Nous avons montré récemment, que deux protéines étaient responsables du contrôle de l’entrée et la sortie du cholestérol dans la cellule. Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées, qui n’expriment pas l’une ou l’autre de ces deux protéines responsables du trafic du cholestérol dans la cellule. Nous allons les nourrir avec un régime riche en cholestérol qui provoque la survenue de l’athérosclérose. Nous allons traiter ces souris à l’aide d’anticorps spécifique qui favorisent la biodisponibilité des protéines du contrôle du trafic du cholestérol dans la cellule. Nous allons ainsi montrer que les souris traitées présentent moins d’accumulation de cholestérol dans la paroi des vaisseaux sanguins que les souris non traitées. Ce projet permettra de mieux comprendre et de mettre en place une nouvelle prise en charge de l’athérosclérose.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une connaissance fine de la survenue des atteintes cardiaques liées aux dépôt de cholestérol dans les artères et de déterminer si l’injection d’anticorps est en mesure de prévenir ou diminuer la gravité de ces atteintes cardiaques.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime riche en cholestérol pendant 3 mois ou 5 mois. Ils seront soumis à 6 injections (protocole de 3 mois de régime) ou 10 injections (protocole de 5 mois de régime) dans la veine de la queue (processus de 10 minutes environ). Ils seront également soumis à une mesure de la pression artérielle à la queue, avec une phase d'habituation de 2 semaines et une mesure en début et en fin de protocole. Les animaux seront soumis également à une IRM et/ou échographie au début et à la fin du protocole.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les souris lors des expérimentations sous régime riche en cholestérol avec ou sans injection dans la veine de la queue sont le développement d'oedème facial et des membres en toute fin de la période de régime. Un stress engendré par les injections à la veine de la queue et lors de l'anesthésie finale en IP. L'injection à la queue peut potentiellement entrainer des dégats cellulaire au point d'injection aboutissant à la mort très localisée des tissus. Le traitement (en début de régime et après traitement avec les anticorps) peut potentiellement entraîner une perte de poids.
Devenir
Les animaux soumis à un régime riche en cholestérol et traité par anticorps seront euthanasiés pour prélever les organes à des fins de caractérisation histologiques et biochimiques et ainsi répondre aux objectifs de l'étude.
Remplacement
L’athérosclérose est un phénomène multifactoriel qui ne peut être totalement décrit par un modèle cellulaire qui ne permet l’analyse que d’un ou deux types de cellules à la fois et omet les interactions multicellulaires, primordiales dans cette pathologie. Nous avons montré, principalement dans un modèle cellulaire, qu'une protéine était une actrice majeure dans le contrôle de l’accumulation de cholestérol dans la cellule. Afin de poursuivre nos études et de mieux comprendre les mécanismes contrôlant l’accumulation du cholestérol au niveau de la plaque d’athérome, nous devons intégrer les facteurs présents dans un organisme entier qui sont responsables de la survenue de cette pathologie.
Réduction
Si nous arrivons à mettre en évidence un mécanisme d’action rapidement, nous n’utiliserons pas le nombre total d’animaux demandé dans ce projet. Nous utiliserons également des souris afin de faire des cultures de cellules de vaisseaux sanguins et de cellules cardiaques, dans le but de caractériser les mécanismes cellulaires de l’accumulation du cholestérol. Ceci permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaire à notre étude. Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes ont été calculés et déterminés pour obtenir un effet statistique fiable et robuste et permet de limiter le nombre d'animaux utilisé au strict nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Nous mettrons en place différents points limites dans notre expérimentation pour atténuer autant que faire se peut la gêne de nos animaux liée au régime riche en cholestérol que nous leur donnerons : ces points limites sont définis en tenant compte de l’aspect et du comportement des animaux au cours du régime (oedèmes dus à l’insuffisance cardiaque qui peut s’installer, prostration). Pendant la phase de régime, les animaux seront 2 à 5 par cage, avec des enrichissements sous forme de morceaux de bois pour que les animaux usent leurs dents et un carré de coton qu’ils pourront utiliser pour confectionner leur nid. Le suivi de l’état des animaux sera quotidien.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour créer des lignées génétiquement modifiées. Nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiées qui permet d’accélérer l'accumulation de cholestérol dans la paroi des vaisseaux sanguins quand ces animaux sont soumis à un régime riche en cholestérol. Ces modifications génétiques n’ont aucun impact sur la longévité ou le bien-être des souris hors régime riche en cholestérol. Pour cette étude ou les souris sont soumises à 3 ou 5 mois de régime riche en cholestérol, nous utiliserons des souris adulte de 3 mois, afin de déterminer l'évolution de la maladie qui, comme chez l'homme, apparaît à l'adolescence pour s'aggraver et évoluer vers des pathologies comme l'AVC ou la crise cardiaque à l'age adulte. Les souris de 3 mois ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleure reproductibilité des résultats.
Entretien d’une lignée de souris exprimant le rapporteur ‘Cre’ sous le contrôle du promoteur du gène de la POMC (Tg (POMC1-cre)16Lowl/J) pour l’invalidation du gène de la SELENOT chez les souris SELENOT floxées (SelTfl/fl)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet du projet est l'entretien d'une lignée génétiquement modifiée, avec biopsie d'un bout de queue sous anesthésie pour le génotypage et puçage des animaux. Les individus de génotype inadéquat sont tués après génotypage et les reproducteurs sont tués lorsqu'ils ne produisent plus de portées. Le porteur affirme que ce modèle est "indispensable" pour étudier le rôle d'une protéine dans l'obésité, une approche qui n'existerait selon lui que chez la souris.
Objectifs
La SELENOT est une nouvelle thiorédoxine impliquée dans le contrôle du stress du RE des cellules neuroendocrines. Elle est notamment impliquée dans la production de la POMC et de l’insuline, suggérant que cette protéine anti-oxydante pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique et qu’un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités. En effet, il est maintenant bien établi que le cerveau obèse est stressé et que le stress du RE dans l'hypothalamus joue un rôle central dans la résistance à la leptine et le développement de l'obésité. Lors d'un régime riche en graisses (high fat diet, HFD) chronique, les neurones hypothalamiques développent un stress du RE qui induit une résistance à la leptine et à l'insuline, et conduit à un gain de poids. Les données récentes ont permis d’établir que le développement des neurones POMC et la maturation de la POMC sont altérés par le stress du RE qui est associé à l'obésité, entraînant une diminution de la production et de la sécrétion d'alpha-MSH, le régulateur central de l'homéostasie énergétique. Ces observations suggèrent que les neurones POMC pourraient être avantageusement ciblés pour le traitement des dysfonctionnements des neurohormones causés par le stress du RE et associés à l'obésité.
Bénéfices attendus
L'obésité et le diabète de type 2 connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans de sorte que la pandémie de "diabesity" actuellement observée au niveau mondial constitue un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que l’hypothalamus de sujets obèses est soumis à un stress oxydatif et inflammatoire permanent, suggérant que des facteurs de contrôle de ce stress pourraient être impliqués dans l’homéostasie énergétique et constituer des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. L’utilisation d’approches histologiques nous a permis de réaliser une première évaluation de l’expression de la SELENOT dans le système nerveux central et en périphérie. L’utilisation de souris présentant une invalidation du gène de la SELENOT dans les neurones à POMC présente un avantage pour caractériser le rôle physiologique de la SELENOT dans les contrôles métaboliques neuroendocrines, la prise de nourriture et la prise de poids sous régime HF et le contrôle de la glycémie. De fait, ce modèle de souris POMC (Tg (POMC1-cre)16Lowl/J) est indispensable pour cette étude qui concourra à la compréhension du rôle de la SELENOT dans la production de la neurohormone satiétogène alpha-MSH et les mécanismes moléculaires sous-tendant son action.
Procédures
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biopsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm destiné au génotypage des animaux) sous anesthésie à l'isoflurane : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie. Les animaux auront un système d’identification par puçage.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris ciblant la transgénèse aux neurones POMC (Tg POMC1-cre)16Lowl/J) est fondé sur l’expression dirigée de la protéine Cre sous le contrôle du promoteur de la POMC. L’activité de ce promoteur naturel et l’expression de la recombinase Cre dont l’utilisation a été largement rapportée dans la littérature, n’induit pas d’effet délétère, de nuisance ou d’effet indésirable chez les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux générés dans ce projet sera destiné à la reproduction et à l'entretien de la lignée POMC-Cre ; SelTfl/+. Les animaux de génotype adéquat seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissance à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ne produisant plus de portées sero mis à mort selon les procédures précédemment décrites. Les animaux de génotype inadéquat donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.
Remplacement
L’étude de la prise de poids et du métabolisme glucidique n’est possible que dans un système intégré et nécessite donc l’utilisation d’animaux modèles afin d’avoir une approche physiologique de l’implication de la SELENOT dans les régulations neuroendocrines via les neurones à POMC.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à réduire le nombre d'animaux générés en choisissant de travailler sur les animaux homozygotes pour la construction (Tg (POMC1-cre)16Lowl/J), plutôt qu'hétérozygotes. Le nombre d'animaux de génotype non adéquat, générés dans la descendance des croisements est ainsi divisé par deux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront affinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux reproducteurs seront maintenus à trois par cage pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de matériel pour construire un nid). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux. Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Pour réduire une éventuelle souffrance liée à la mise bas, les femelles seront suivies quotidiennement pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. La mise bas en elle-même sera étroitement surveillée afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal et l’aide nécessaire sera apportée aux femelles en cas de difficultés au cours de la mise bas.
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes qui n’existe pas chez d’autres modèles mammifères. Ainsi, des souris de la lignée C57Bl/6J ont été utilisées afin de générer les animaux portant la construction transgénique (Tg (POMC1-cre)16Lowl/J). Elles seront accouplées avec des animaux de la lignée SelTfl/fl entretenue également sur un fond génétique C57Bl/6J. Reproduction des souris à partir de 8 semaines de vie.
Production d’anticorps polyclonaux sur lapins
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
200 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'un antigène et d'un adjuvant sous la peau ou dans le derme, puis des prélèvements sanguins aux oreilles sur animaux vigiles, avant un prélèvement terminal au cœur sous anesthésie, pour produire des anticorps polyclonaux destinés à la recherche ou au diagnostic. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose. Sur le remplacement, il affirme que la production d'anticorps polyclonaux ne peut être reproduite in vitro de façon satisfaisante et retient donc le lapin pour son volume sanguin et sa réponse immunitaire.
Objectifs
Produire sur lapins de grandes quantités de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigés contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic.
Bénéfices attendus
L'antigène est produit par le demandeur qui doit fournir des informations permettant d'évaluer une toxicité intrinsèque de la molécule injectée, et les possibles conséquences sur l'état général de la production d'anticorps contre cette molécule. En fonction des informations fournies et du risque évalué, il pourra être demandé de tester la toxicité de la molécule in vitro dans un modèle cellulaire avant de l'injecter au lapin.
Procédures
Injections sous-cutanées ou intra-dermiques sur animaux vigiles : 200 lapins. Durée, quelques secondes Prélèvement sanguin (oreilles) sur lapins vigiles : 200 animaux. Acte qui dure quelques secondes Prélèvement sanguin (cœur) sur lapins anesthésiés (acte terminal) animaux : Acte qui dure quelques minutes
Impact sur les animaux
Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 72h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux). Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique
Remplacement
La production d'anticorps polyclonaux dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. Certains tests pour évaluer la toxicité d’antigène seront réalisés in vitro avant l’animal.
Réduction
Dans la très grande majorité des cas, un seul animal est nécessaire pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire d'utiliser 2 ou 3 animaux. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 40 animaux par an.
Raffinement
Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 72h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes clinique malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce de taille intermédiaire (on peut utiliser aussi la souris, des petits ruminants ou des équidés) dont la réponse immunitaire et le volume sanguin circulant permettent d'obtenir les quantités d'anticorps nécessaires aux projets des entités de recherche Jeune adulte de 2,7 à 3 kg (âge optimal pour la réponse immune)
Lien cause à effet entre microbiote et diarrhée chez l’agneau
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
140 moutons, brebis et agneaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les agneaux mâles étant abattus et les femelles rendues au troupeau. Ils subissent des prélèvements de sang, de fèces et de contenu du rumen par sonde œsophagienne, un geste qui provoque un stress transitoire et parfois une irritation de l'œsophage. Le porteur cherche à relier l'installation du microbiote à l'apparition de diarrhées chez le jeune ruminant. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la relation entre l'hôte et son microbiote.
Objectifs
Ce projet propose de suivre le flux d'établissement microbien depuis sa source (rumen et vagin de la brebis, environnement) jusqu'à l'écosystème du rumen adulte (un mois après le sevrage) chez des agneaux sains et diarrhéiques. L’objectif est d’établir une relation de cause-conséquence entre l’installation du microbiote et l’apparition des troubles digestifs chez le jeune. Nous recherchons à relever les trois critères qui définissent la causalité : i) ordre chronologique - X arrive avant Y ; ii) la relation entre X et Y n’est pas due au hasard et iii) Il n’y a rien d’autre qui explique la relation entre X et Y.
Bénéfices attendus
A l’issue du projet, nous souhaitons raccourcir la liste des microbes différentiellement abondants identifiés dans la première phase. Ceci nous permettra d’imaginer une nouvelle expérimentation afin de répondre au troisième critère de la causalité : il n’y a rien d’autre qui explique la relation entre X et Y.
Procédures
Les brebis et les agneaux subiront des prélèvements sur animaux vigiles (prises de sang, de contenu ruminal et de féces). Les brebis auont deux prélèvements à deux mois d'intervale. les agneaux subiront les mêmes prélèvements mais avec une fréquence plus élevés une dizaine ente la naissance et l'âge de 3 mois. La réalisation du prélèvement sera en soit très rapide car chacun ne durera qu'une à deux minutes en incluant la contention.
Impact sur les animaux
Les animaux seront logés et soignées dans les conditions traditionnelles ; de même les techniques des prélèvements sont des pratiques couramment appliquées. Le contenu ruminal sera prélevé par sonde oesophagienne. Un stress transitoire est généré par ce type de prélèvement et dans certains cas une légère irritation de l'oesophage peut être observée. La contention physique des animaux s’effectuera dans les conditions habituelles d’élevage. Une personne compétente maintiendra la tête de l'animal pour éviter son balancement de gauche à droite et permettre l'ouverture de la bouche. L'expérimentateur introduira alors doucement le tube protecteur dans la bouche de l’animal, puis la sonde elle-même, et attendra que l'animal déglutisse la sonde avant de l’enfoncer précautionneusement, au rythme des déglutitions de l’animal, jusque dans le rumen. Une fois la sonde en place dans le rumen, le tube protecteur sera attaché au mufle de l'animal par une pince mouchette. Cette mouchette ne sera pas utilisée pour contenir ou restreindre l'animal, mais simplement pour éviter que le tube protecteur de la sonde ne sorte de la cavité buccale : en aucun cas la personne chargée de la contention ne devra tenir la mouchette durant le prélèvement. Une fois le prélèvement effectué, la sonde sera retirée lentement, puis la mouchette et enfin le tube protecteur. L’animal sera alors libéré de sa contention et reprendra sa place normalement dans le troupeau. L’ensemble de ces manipulations ne dure que 1 à 3 minutes. Les prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire.
Devenir
A l’issue de l’expérimentation, les brebis et les agneaux femelles seront gardées en vie : au tarissement des brebis, celles-ci retourneront dans le troupeau expérimental de même que les agneaux femelles pour assurer le renouvellement. Les agneaux mâles seront abattus dans notre abattoir expérimental où des prélèvements et mesures seront réalisés dans les différents compartiments du tube digestif afin de le caractériser finement..
Remplacement
La question scientifique touchant à la relation hôte-microbiote, nous ne pouvons pas y répondre par des modèles in vitro.
Réduction
Cinq lot de 20 agneaux et 40 mères seront utilisés dans cette expérimentation. Le nombre des animaux a été étudié pour 1)tenir compte de l’importante variabilité individuelle observée dans la composition du microbiote digestif surtout en début de vie lors de sa mise en place; 2) s'assurer d'avoir un nombre d'animaux suffisant par lot présentant de signes de troubles digestif sans accourrir aux challenges; 3) assurer des répétitions pour obtenir la force statistique nécessaire pour arriver à la causalité.
Raffinement
Les agneaux font l’objet d’une surveillance régulière par les personnels animaliers et d’une pesée toutes les semaines afin de vérifier la courbe de croissance. Tout signe de souffrance, se manifestant par de l’abattement, un refus de s’alimenter, ou un comportement anormal (considérés comme points limites) sera signalé, consigné dans le cahier d’expérimentation et pourra entrainer l’arrêt des prélèvements et la fin de l’expérimentation pour un individu donné voire l’euthanasie si nécessaire. Néanmoins, les prélèvements ne devraient pas induire de douleur car ils sont réalisés rapidement par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
L'objectif est de comprendre les déterminants microbiens déclancheurs des diarrhées chez le jeune ruminant, un travail sur les ovins s'avère donc, par définition en tant qu’espèce-cible et espèce-modèle, plus pertinent qu'un autre modèle pour les ruminants d’élevage. L'étude de la modulation du microbiote gastrointestinal après la naissance nécessite d'utiliser des agneaux nouveau-nés. Les agneaux seront répartis en lots 12h après la naissance et jusqu'à l’âge de 3 mois.
Modèle d’inflammation aigüe
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intradermique puis, cinq jours plus tard, une injection dans la voûte plantaire des deux pattes arrière pour déclencher une réaction inflammatoire, sans analgésique afin de ne pas interférer avec l'inflammation. Le porteur teste des cellules stromales mésenchymateuses censées réduire cette inflammation, en vue de traitements de l'arthrose et de la polyarthrite. Il affirme que les modèles in vitro ne suffisent pas à évaluer l'efficacité dans un contexte inflammatoire complexe.
Objectifs
Dans le cadre du traitement des pathologies ostéo-articulaires telles que l’arthrose ou la polyarthrite rhumatoïde, ldifféretnes approches de thérapies cellulaires sont en cours d’évaluation. Notre projet de recherche consiste à étudier les capacités thérapeutiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) pour diminuer l’inflammation associée à ces maladies. L’évaluation des propriétés anti-inflammatoires des CSM (ou de molécules thérapeutiques libérées par ces cellules) peut être effectuée dans un modèle inflammatoire simple, avant d’avoir recours à des modèles plus complexes et plus lourds à mettre en œuvre. Le modèle que nous utiliserons est le modèle d’hypersensibilité retardée (DTH) chez la souris. Le projet repose sur l’utilisation des cellules stromales mésenchymateuses murines ou humaines. La voie d’injection des cellules est locale. En parallèle, nous évaluerons les mécanismes moléculaires mis en place par ces cellules en utilisant des cellules souches mésenchymateuses déficientes pour l’expression de certains gènes et nous déterminerons l’impact de ces molécules sur l’effet thérapeutique des cellules.
Bénéfices attendus
Le modèle d’hypersensibilité retardée est un modèle rapide, simple et reproductible d’inflammation permettant d’évaluer l’efficacité d’un traitement immunomodulateur médié par les cellules stromales mésenchymateuses et des molécules ou des vésicules extracellulaires qu’elles libèrent. Grâce à ce modèle, nous pourrons valider in vivo une molécule identifiée in vitro ou un nouveau médicament cellulaire plus efficace sur l’inflammation que les approches thérapeutiques déjà en cours d’évualuation clinique chez les patients souffrant de pathologies ostéo-articulaires avec notamment des atteintes inflammatoires importantes. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement efficace des pathologies ostéo-articulaires. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire en identifiant des traitements plus efficaces aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge de l’inflammation des patients touchés par ces pathologies
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection intra-dermique puis 5 jours plus tard, à une injection au niveau de la voûte plantaire des deux pattes arrière. Toutes les injections se feront sous anesthésie générale gazeuse (maximum 5 min/animal) au moment de l’intervention.
Impact sur les animaux
Nuisance et effets indésirables : la douleur induite par les injections de BSA méthylée en intradermique puis dans la voûte plantaire des souris sera de degré modéré et ne nécessitera pas l’administration d’analgésique qui pourrait interférer avec les mécanismes d’inflammation. Un stress lié à l’anesthésie peut être présent mais sans impact sur le comportement des animaux. Concernant les molécules qui seront testées : elles auront été sélectionnées et validées in vitro auparavant pour leur effet anti-inflammatoire. Il n’est donc pas attendu qu’elles puissent générer un effet indésirable
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de la procédure.
Remplacement
Avant de proposer une thérapie cellulaire ou acellulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des traitements proposés dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte complexe d’inflammation rencontré in vivo.
Réduction
Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et une analyse statistique afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour chaque expérience. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe expérimental afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux.
Raffinement
Enrichissement du milieu : Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle quotidien. L’injection des traitements est réalisée sous anesthésie gazeuse générale. Surveillance liée aux procédures : Les souris seront observées quotidiennement et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés et consignés dans une grille de score. Les points d’injection seront désinfectés à la vétédine avant et après injection et surveillés quotidiennement. Jusqu’à présent, nous n’avons jamais mis en évidence de signes d’irritation aux sites d’injection. La durée très courte de l’expérience garantit également une limitation de la douleur dans le temps.
Choix des espèces
Le modèle murin d’hypersensibilité retardée a été choisi parce qu’il présente l’avantage d’être simple, rapide et qu’il permet d’évaluer rapidement l’effet anti-inflammatoire d’un traitement avant d’avoir recours à des modèles in vivo plus complexes. Les animaux sont utilisés à semaine 7, âge recommandé pour ce modèle murin.
Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des leucocytes des vaches laitières
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
8 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort, toutes réintégrant ensuite le troupeau. On leur injecte dans un quartier de la mamelle un composé inflammatoire qui provoque une fièvre brève et une douleur à la palpation entre quatre et douze heures, avec des prélèvements de lait et de sang. Le porteur indique qu'aucun analgésique n'est administré car il fausserait l'inflammation étudiée. Il affirme que cette approche évite une infection bactérienne expérimentale qui condamnerait les animaux à l'équarrissage.
Objectifs
Ce protocole s’inscrit dans le cadre de travaux visant à améliorer la résistance des animaux aux mammites, ces dernières représentant une des maladies majeures à ce jour en élevage bovin. Notre but est de mieux connaître les globules blancs, et plus particulièrement les neutrophiles qui ont un rôle essentiel dans la défense des vaches contre les mammites. Les neutrophiles sont les premières cellules immunitaires à arriver sur le site de l'inflammation mammaire lors des mammites bovines, d’où l’importance de la connaissance précise de ces cellules. Parmi les globules blancs des bovins, ces neutrophiles se répartissent en deux sous-groupes, chacun possédant des propriétés spécifiques soit d'activation ou de diminution de la réponse inflammatoire. L'objet de la présente demande est de nous permettre de caractériser finement les neutrophiles de la glande mammaires lors d'une inflammation et d’étudier comment les proportions et les activités biologiques respectives de différents types de neutrophiles évoluent, à la fois dans le sang et dans le lait, lors d'une inflammation mammaire.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration de la résistance des vaches laitières aux mammites. Il contribuera à une meilleure connaissance des neutrophiles recrutés dans le lait lors d'une inflammation et de leur rôle dans le contrôle de cette inflammation. Les données préalables recueillies dans le cadre du projet Masticells suggèrent que la proportion des neutrophiles régulateurs parmi les neutrophiles du lait à différents temps après déclenchement d'une mammite sont variables. Ces neutrophiles régulateurs ayant des capacités de modulation de la réponse immunitaire de l'hôte, ils pourraient intervenir dans les processus de contrôle de l'inflammation et potentiellement de réparation tissulaire après inflammation. A termes, cette meilleure caractérisation des neutrophiles du lait pourrait être introduite dans les critères d’amélioration génétique de la résistance des vaches laitières aux mammites.
Procédures
Une inflammation mammaire sera induite par injection, via le canal du trayon, d'un composé inducteur d'inflammation dans un des 4 quartiers de la glande mammaire des 8 vaches recrutées. Des prélèvements de lait (2x40ml) et de sang (à la jugulaire) sont prévus à 4 temps (t=0h, 4h, 72h et 144h post-injection de LPS).
Impact sur les animaux
Compte-tenu des travaux antérieurs et des données de la littérature, l'injection du composé inflammatoire (LPS) induira une inflammation locale de courte durée (plus de signes locaux d'inflammation 12h après injection) accompagnée d’une fièvre de courte durée (pic de température rectale à 8h post-injection et retour à une température normale 12h post-injection). Le quartier injecté est douloureux à la palpation entre 4h et 12h post-injection. L’état général, l’intensité de l’inflammation locale et la douleur sont évalués à l’aide d’une grille de notation. L’utilisation d’un médicament pour limiter la douleur (analgésique) n ‘est pas possible en raison de son impact sur le déroulement de l’inflammation. Les prises de sang ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à la contention lors de la distribution des aliments. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.
Devenir
Les animaux réintègreront le troupeau de l’unité expérimentale sur décision de la personne responsable du bien-être des animaux. La réponse inflammatoire consécutive à l'injection de LPS est de courte durée. Ce traitement n’engendre classiquement que peu d’inconfort et, par ailleurs, les animaux seront dans tous les cas soignés en cas de pathologie.
Remplacement
Les informations collectées lors de ce protocole porteront sur l'espèce concernée par les mammites (vache). L'approche proposée permet de remplacer une infection bactérienne expérimentale qui condamnerait les animaux à l'équarissage. Cette méthode alternative permet l'évaluation globale des premières étapes de la réponse au niveau de l’animal entier. Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de modèle in vitro permettant de reproduire le recrutement des neutrophiles sanguins dans la glande mammaire suite à une infection mammaire.
Réduction
Huit vaches laitières en lactation seront incluses dans le projet. Ce nombre permet d'obtenir une valeur médiane des proportions de neutrophiles régulateurs dans le lait lors d'une inflammation mammaire. Nous comparerons l'évolution de ce pourcentage à différents points au cours de l'inflammation (t=4h, t=72h, t=144h). Les proportions des neutrophiles régulateurs aux différents temps seront analysées statistiquement par des approches de statistiques adaptées aux petits échantillons. Ce nombre a été déterminé pour satisfaire une condition de validité du test statistique qui sera utilisé (effectif d'au moins 5 animaux) et prendre en compte la possibilité d'une non-réponse de certains animaux (situation rencontrée lors de tests précédents à une fréquence de 5%). La capacité maximale de l'installation est de 8 animaux traités simultanément. Ce nombre d'animaux permettra de traiter tous les animaux en une seule série et ainsi contrôler des variations qui auraient été liées à plusieurs séries espacées dans le temps. Les variables contrôlées seront la race des animaux et le stade de lactation : les animaux seront de la même race (Prim'Holstein) et seront en milieu de lactation (entre 3 et 7 mois).
Raffinement
L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité et la durée de l’inflammation et permet de mimer les premières étapes d’une vraie infection. Les animaux seront gardés à proximité des bâtiments le jour de l’injection afin de pouvoir les surveiller de façon suivie. Tout signe d’une dégradation de l’état de santé d’un des animaux entraînera l’intervention du vétérinaire praticien de l’unité. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être pris au cornadis pour la distribution des aliments. Elles sont réalisées par du personnel expérimenté. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le bovin. Il s’agit de vaches laitières de race Prim’Holstein en lactation. Les travaux sont réalisés sur la vache laitière car c'est une des espèces sujette aux mammites. Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Il s'agit de vaches adultes (âgées de 3 à 6 ans) en lactation (stade de lactation entre 3 et 7 mois) non mises en reproduction.
Étude de la réponse immunitaire innée induite par des bactéries pathogènes chez le vertébré Danio rerio (zebrafish).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
70 610 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'au sévère, déclaré sévère pour 64 410 d'entre eux, la plupart tués en fin d'expérience et quelques adultes gardés vivants pour la reproduction. Aux stades embryonnaire et larvaire, ils sont infectés par des bactéries pathogènes et observés par transparence, puis mis à mort par surdose d'anesthésiant. Le porteur présente le recours au poisson zèbre comme relevant lui-même du "Remplacement" des mammifères, tout en déclarant plus de 64 000 individus en souffrance sévère. Il affirme que l'usage d'animaux reste "incontournable", une cellule ne pouvant reproduire un organisme entier.
Objectifs
Les maladies infectieuses affectent les personnes et les animaux avec un impact considérable sur les économies mondiales et la santé publique. La résistance aux antimicrobiens est responsable des échecs de traitement entraînant une estimation de 700.000 décès humains chaque année dans le monde (OMS, 2018). Il donc est urgent de résoudre ce problème croissant en développant des thérapies alternatives. Comprendre comment les infections affectent les organismes vivants est une étape importante pour le développement de ces thérapies . Cependant, elle nécessite de travailler avec des modèles animaux. Afin d’adopter la stratégie 3R (Remplacement, Raffinement et Réduction) pour ses travaux, ce projet implique l’utilisation du zebrafish (Danio rerio) (Remplacement). Le zebrafish a été choisi car l’étude de son embryon offre de nombreux avantages pour l’étude de certaines maladies infectieuses. En effet, du fait de sa transparence, nous pouvons l’observer directement sous un microscope pour suivre sa réponse immunitaire aux infections à différents temps sans avoir à l’euthanasier. Ceci permet de Réduire de façon substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour mener convenablement les études. De surcroit, de très nombreux outils expérimentaux sont disponibles, comme par exemple, des lignées de zebrafish où l’on peut observer directement les cellules qui luttent contre les infections avec un microscope. Ces outils permettent de Raffiner les expériences et donc d’obtenir des résultats beaucoup plus robustes et statistiquement plus significatifs. Le but du présent projet est de : -comprendre le developpement d’une infection induites par des microbes impliqués dans des maladies humaines - étudier et comparer la nocivité des différentes bactéries, c’est-à-dire comprendre comment ces bactéries infectent les organismes vivants (animaux), survivent et se développent dans ces organismes, -identifier les facteurs microbiens impliqués dans ces processus -identifier les gènes de l’hôtes impliqués dans la défense contre les bactéries -identifier des médicaments ou therapies permettant lutter contre les infections bactériennes.
Bénéfices attendus
Le but ultime de ce projet est d’apporter des solutions thérapeutiques à des problèmes clefs du domaine des infections bactériennes. A couts terme, le projet fournira des connaissances fondamentales sur le développement des maladies infectieuses. Ces connaissances seront plubliées dans des revues scientifiques spécialisées permettant la diffusion de la science. Les différents microbes que nous étudierons ont en commun la capacité de survivre dans l’organisme qu’ils infectent, leur permettant ainsi de persister à long terme, conduisant à des infections chroniques. Ce projet permettra de comprendre comment les microbes échappent aux défenses immunitaires de de l’organisme hôte et nous identifierons les molécules produites par l’agent infectieux qui sont importantes pour la persistance du microbe dans l’organisme hôte. Les résultats obtenus dans le cadre de ce projet permettront à moyen terme d’identifier des molécules pouvant être ciblée par de futurs traitements anti-microbiens. A plus long terme de nouveaux medicaments anti-bactériens seront developpés pour traiter des patients atteints d’ infections chroniques.
Procédures
Les gestes techniques réalisés sur animaux de plus de 5 jours de développement sont les suivants : - Immobilisation sous anesthésie générale dans de l’eau à 28°C dans une boite avec un fond en verre pour l’observation avec un microscope, au stade 6 à 17 jours de développement sur une durée courte inferieur à 1h ou sur une longue durée (entre 1 et 15 heures au cours de la nuit). Cette intervention lorsqu’elle est courte (inférieur à 1 h) pourra être répétée une fois chaque jour jusqu’à 17 jours (n total= 46 800 embryons et larves).
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues sont les suivantes : -Pour les embryons ayant subies une infection, les microbes présents dans l’organisme peuvent induire une infection aigue ou chronique. Du fait de l’infection, l’animal peut ressentir des effets nuisibles et changer de physiologie ou de comportement. - Pour les embryons traités avec des médicaments, si la dose n’est pas adaptée, elle peut induire des effets secondaires sur l’organisme. Si tel est le cas, l’animal peut ressentir des effets nuisibles et changer de physiologie ou de comportement La surveillance régulière des embryons par simple observation permettra de détecter ces changements dès leur apparition, la prise de nourriture et les mouvements de nage seront surveillés.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux seront mis à mort, soit en fin d’expérience, soit en cours d’expérimentation pour tout animal qui, présente un état prédictif d’une grande douleur ou d’une mort prochaine. Pour la mise à mort, les animaux seront traités tout d’abord avec un anesthésiant puis la dose d’anesthésiant sera augmentée pour atteindre une dose léthale et induire la mort. Les animaux morts seront ensuite traités avec de l’eau de javel (lorsque l’animale est infecté par un microbe), puis ils seront ensuite congelés à -20°C et éliminés comme des déchets biologiques et incinérés. Pour l’étude des gènes importants dans la défense contre les bactéries, seuls les animaux porteurs des modifications génétiques permettant l’inactivation du gène d’intérêt, seront maintenus dans notre animalerie pour constituer le stock d’animaux reproducteurs, c’est-à-dire qui seront uniquement utilisés pour des accouplements afin d’obtenir des embryons. Ces animaux seront gardés sous observation quotidienne jusqu’au stade adulte et pendant les deux premières années afin de déceler toute anomalie et détecter tout signe de maladie afin de prévenir une soufrance ou une mort éventuelle par une mise à mort.
Remplacement
Une cellule ne pouvant reproduire la complexité d’un organisme entier, pour l’instant, l’utilisation des animaux reste incontournable. Aujourd’hui, aucun des modèles animaux disponibles pour l’étude de l’inflammation et des infections faisant l’objet de ce projet ne permet de combiner à la fois : 1) l’induction d’une véritable infection induisant le développement d’une maladie proche de celle observée chez l’homme 2) la possibilité d’une évaluation rapide de l'efficacité des médicaments en visualisant leur effet sans mettre à mort l'animal grâce notamment aux techniques d’imagerie des organismes vivants par transparence. Le développement du modèle animal zebrafish reste donc un choix incontournable. Il offre ainsi une alternative tres intéressante aux modèles mammifères permettant ainsi le Remplacement. En effets les infections ainsi qu’une grande partie des observations faites sur l’animal seront realisées avant le stade de 5 jours de développement.
Réduction
La transparence intrinsèque des embryons et des larves de zebrafish permet de décrire et de suivre les infections en temps réel par transparence, à differents temps sans avoir à euthanasier l’animal et donc de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires, les adultes assurant uniquement la production d’œufs. Pour des raisons de reproductibilité, chaque expérience est reproduite 3 fois de façon indépendante, avec un nombre minimal d’individus à utiliser pour chaque expérience. Les tests statistiques et le nombre de poissons pour chaque experience ont été determinés grâce aux données bibliographiques. Par la suite, le nombre d’animaux sera réajusté au cours du projet grâce à des logiciels de statistique permettant d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaires.
Raffinement
Tous nos poissons font l’objet d’une surveillance quotidienne (y compris les week-ends et jours fériés) par du personnel qualifié et avec roulement d’astreinte. Pour les larves de zebrafish, la surveillance est basée sur l’observation par transparence de plusieurs paramètres physiologiques comme la presence d’une bonne circulation sanguine, la mesure du rythme respiratoire ou autre symptômes anormaux. Pour les adultes, la surveillance est basée sur l’observation de changements du rythme respiratoire, de leur comportement, et d’une réponse de stress, ainsi que l’observation des signes externes de maladies. Les individus présentant des caracteristiques anormales seront automatiquement mis à mort avec un anesthésiant puis la dose d’anesthésiant sera augmentée jusqu’à une dose léthale pour induire la mort. Tout au long des expériences, les embryons et les larves de zebrafish sont maintenus à la température optimale de 28°C avec un cycle jour/nuit. La qualité de l’eau est surveillée afin de presenter en permanence les paramètres en sel et de pH optimaux. Nous contrôlons qu'ils ne soient pas maintenus en trop forte densité et que les individus ayant des caractéristiques anormales soient mis à mort systématiquement. Les larves maintenues au dela de 5 jours auront un milieu enrichi en micro-organismes. Tout geste technique sera réalisé avant 5 jours de développement et sous anesthésie générale. Des réunions concernant l’animalerie et la surveillance des poissons sont organisées régulièrement et permettent de faire évoluer le système de suveillance des animaux et de raffinement.
Choix des espèces
L’espèce choisie est le zebrafish (Danio rerio). Les nouvelles techniques rendent le zebrafish pertinent pour le Remplacement des mammifères pour l’étude de l’inflammation et des maladies infectieuses notamment grâce à sa transparence et à l’utilisation d’imagerie en temps réel qui permettent de Réduire le nombre d’animaux pour atteindre des résultats statistiquement bons. De plus, l’existance de nombreux outils expérimentaux permettant de suivre facilement les cellules immunitaires marquées par transparence permettent de Raffiner les études. Par rapport au modèle souris, le zebrafish répond donc parfaitement aux besoins de Remplacer, de Réduire et de Raffiner. Par sa taille, le zebrafish se révèle attractif pour la découverte de nouveaux médicaments . Pour les expériences de test de médicaments et d’infections, nous utilisons des embryons et des larves de zebrafish. Tous les gestes techniques sont effectués avant le stade 5 jours. Une partie des analyses se font sur des embryons et larves dont les stades ne dépassent pas 5 dpf et qui ne nécessitent donc pas de répondre à un protocole soumis au comité d’éthique. Seules certaines larves font l’objet d’un suivi plus long, notamment pour l’étude des infections persistentes au-delà de 5 jours. Aucune infection n’ est réalisée sur le stade adulte. Donc en fonction de l’analyse realisée, nous utiliserons des larves de différents stades de developement : du stade 1-cellule (0 jour de développement) à 17 jours de développement. Seules certaines larves etudiées en microscopie seront maintenues en vie jusqu’à 1 mois. Pour l’obtention d’animaux portant une modification génétique permettant l’étude des gènes importants pour la réponse immunitaires, les animaux sont elevés jusqu’à l’age adulte mais ne subissent aucune infection. S’ils portent la modification génétique d’intérêt, ils seront maintenus dans l’animalerie pour assurer la reproduction et pour produire des œufs.
Développement de vecteurs non viraux en vue du traitement des surdités congénitales
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux âgés de 2 à 30 jours subissent une chirurgie d'injection intra-cochléaire de vecteurs, sont séparés de leur mère le temps de l'intervention, puis tués par dislocation cervicale quinze jours plus tard pour étudier leur cochlée. Le porteur indique qu'aucun modèle in vitro d'oreille interne ne permet de tester la diffusion des vecteurs dans le temps. Une éventuelle application aux surdités humaines est renvoyée à une dizaine d'années, après des tests sur des porcs.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de corriger certaines surdités d’origine génétique, grâce au développement de nouveaux transporteurs (vecteurs) non viraux permettant d’acheminer l’information génétique corrigée aux cellules de l’organe de l’audition, la cochlée, afin de restaurer les capacités auditives. Ces tests seront réalisés sur des souris C57/Bl6, dont l'oreille interne est bien caractérisée et proche de celle de l’homme. Objectif : Optimiser les conditions d’utilisation (efficacité, localisation) de vecteurs non viraux au sein de la cochlée.
Bénéfices attendus
Le développement de vecteurs non viraux efficaces au niveau de l’oreille interne pourrait permettre leur utilisation pour corriger les surdités congénitales humaines. Celles-ci sont actuellement traités par appareillage auditif ou implantation cochléaire en fonction de l’intensité de la perte auditive. Bien que ces traitements soient dans la majorité des cas efficaces, les résultats sont imparfaits dans certaines conditions, notamment pour la compréhension de la parole en milieu bruyant. Le développement d’alternatives permettrait d’optimiser la correction apportée, et améliorer la qualité de vie des individus ayant une surdité congénitale. Le temps estimé du projet est de 2 ans. En fonction des résultats, notamment de l’efficacité et de la localisation, nous pourrons cibler au mieux certaines anomalies génétiques provoquant une surdité. Nous testerons l’efficacité de la thérapie génique sur des modèles murins, pour une durée estimée de 4 ans, car nécessitant un suivi plus prolongé. Si l’efficacité est confirmée, des tests sur modèles porcins seront nécessaires avant une potentielle utilisation chez l’homme, dans une dizaine d’années.
Procédures
180 souris auront une injection intra cochléaire (chirurgie d'une durée de 5 à 8 minutes sous anesthésie générale) à 2 ou 15 ou 21 ou 30 jours après la naissance et seront mises à mort 15 jours après l'injection.
Impact sur les animaux
Les procédures d’injection intra cochléaire peuvent être source d’inconfort pour les animaux (douleur, risque d’infection), pendant environ une semaine. Les pesées réalisées quotidiennement après injection seront source de stress, les 3 premiers jours, puis tous les 3 à 4 jours, soit 5 à 6 pesées par animal. Les souris à un âge précoce seront séparés de leur mère pendant une dizaine de minutes le temps de l'injection.
Devenir
Les animaux seront mis à mort par dislocation des vertèbres cervicales, pour étude des cochlées.
Remplacement
La conformation 3D des explants utilisés in vitro est incomplète, et ne permet pas de refléter la diffusion in vivo. De plus, ces explants ont une durée de vie limitée de 3 à 5 jours. Il n’existe pas actuellement de modèle d’oreille interne utilisable in vitro permettant de tester la transfection au cours du temps, et dans les mêmes conditions 3D qu’in vivo, et il n’existe pas non plus de lignées de cellules ciliées de cochlées , ou de culture primaire de cellules ciliées à partir de prélèvement, qui permettraient de cibler spécifiquement les cellules d’intérêt. Le remplacement est donc impossible.
Réduction
Des explants d’oreille interne ont été utilisés in vitro permettant de sélectionner les 2 vecteurs les plus efficaces, à partir de prélèvements réalisés sur animaux mis à mort hors champ réglementaire et autorisés par la structure bien-être de l'établissement. Après utilisation de 36 animaux, si l'analyse statistique intermédiaire (Test de Mann-Whitney) montre des résultats significatifs, le projet sera poursuivi sur 144 animaux.
Raffinement
En complément de l'anesthésie générale, des anesthésiques locaux seront utilisés pour gérer la douleur post-opératoire générée par l’injection de vecteurs et l’incision réalisée au niveau de l’oreille interne. Concernant le suivi journalier des animaux, des grilles de soin adaptées à notre procédure ont été établies afin d’identifier pour chaque animal les points limites et points limites terminaux permettant de prendre en charge immédiatement les signes de stress, d’angoisse ou de douleur.
Choix des espèces
L'utilisation de souris pour étudier de nouveaux transporteurs (vecteurs) au sein de l’oreille interne est pertinente car : -L’oreille interne de souris est morphologiquement proche de celle de l’homme -Nous maîtrisons la technique chirurgicale nécessaire à la mise en place de ce modèle, qui ne provoque pas de baisse d'audition. Les injections seront réalisées 2 ou 3 jours après la naissance, équivalent du stade embryonnaire chez l’homme, en termes de développement de l’oreille interne. Les souris étant sourdes à cet âge, à 15 jours de vie, au début du développement de l’oreille interne, à 21 jours de vie en cours de développement de l’oreille interne et à 30 jours de vie à la fin du développement de l’oreille interne. Différentes études ont montré des différences en termes de répartition des transporteurs (vecteurs) en fonction de l’âge des souris.
Étude de la peur chez le rongeur : rôle des réactivations neuronales en lien avec une mémoire aversive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
514 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'au sévère, déclaré sévère pour 380 d'entre elles. Elles subissent une injection intracérébrale de virus et l'implantation de fibres optiques ou d'électrodes, puis un conditionnement qui associe un environnement à des stimulations désagréables, avant la réactivation optogénétique des neurones et la mise à mort. Le porteur étudie la peur et l'anxiété et affirme que ce travail ne peut se faire ni in vitro ni chez des invertébrés, jugés trop simples. Les retombées annoncées pour les troubles anxieux humains restent hypothétiques.
Objectifs
Les troubles anxieux représenteraient d’un quart à la moitié des troubles mentaux à travers le monde. En France, la prévalence des troubles anxieux est de 21,6%. Malgré cette prévalence, les traitements ne sont efficaces que chez seulement 30% des patients. Cette faible efficacité peut être en partie expliquée par la difficulté de classer précisément les différentes réactions de peur (comme les crises de panique et l’anxiété) dans les modèles animaux. Or, de récentes études menées au sein de notre laboratoire ont montré qu'un nouveau protocole expérimental permettait l'identification chez la souris de 2 états similaires à la panique et l'anxiété. Avec cette nouvelle perspective, l'anxiété semble être liée a des réactivations de neurones liés à une mémoire négative dans le cerveau. Le but de ce projet serait alors d'étudier l'impact de la réactivation artificielle de neurones liés à une mémoire négative chez la souris afin de savoir si cela permet l'observation d'un état similaire à l'anxiété. L'ensemble de ces travaux permetrait une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux et corporels impliqués dans des situations aversives, comme la peur et l'anxiété.
Bénéfices attendus
Ces travaux apparaissent comme nécessaires afin de pouvoir améliorer notre compréhension des troubles liés à la peur car ils pourraient permettre une définition claire des troubles associés à la peur, notamment en se basant sur des critères objectifs, universels et mesurables. Cette meilleure définition pourrait alors permettre une meilleure identification et évaluation de troubles mentaux afin d'anticiper leur apparition et d'améliorer la prise en charge des patients. De par l'utilisation du modèle rongeur, nous espérons pouvoir transposer les résultats de nos travaux non seulement aux patients atteints de troubles mentaux, mais aussi à d'autres espèces animales comme les animaux de production ou domestiques. En effet, les résultats de ces travaux pourraient également permettre une meilleure évaluation de l'état émotionnel de l'animal, thématique d'importance croissante dans l'amélioration du bien-être animal.
Procédures
La plupart des animaux de ce projet subiront une injection intracérébrale de virus permettant l'expression de protéines fluorescentes et parfois d'opsines (molécules permettant l'activation du neurone après stimulation lumineuse). Un quart des animaux ne subira qu'une deuxième rapide chirurgie pour implanter des fibres optiques en position intracérébrale. Les autres subiront une chirurgie plus technique permettant notamment l'enregistrement de signaux électrophysiologiques et l'implantation de fibres optiques. Suite à ces chirurgies, la plupart des animaux suivront un protocole d'association d'un environnement donné à des stimulations désagréables. Ils seront ensuite replacés dans cet environnement pour étudier la mémoire qu'ils en ont. Dans un autre temps, les neurones associés à cet environnement seront réactivés dans un contexte neutre. Après ce protocole expérimental qui dure de 3 à 4 semaines, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes ainsi que les caractéristiques (niveau d'activation, nombre, localisation,..) des neurones qui ont été réactivés.
Impact sur les animaux
Pour réaliser les travaux de ce projet, il est nécessaire de réaliser des procédures invasives sur les sujets expérimentaux comme l'injection intracérébrale ou la chirurgie d'implantation des électrodes. De plus, le protocole de conditionnement aversif implique d'utiliser des stimulations désagréables pour l'animal afin de mieux pouvoir étudier la peur. Tout au long de leur hébergement, les animaux ont accès dans leur cage à des objets d’enrichissement (dôme, tubes). Le suivi par le personnel de l'animalerie est quotidien dans un contexte général et le suivi post-chirurgie est assuré par l'expérimentateur quotidiennement pendant une semaine avec relevé de signes potentiels de douleur et prise en charge analgésique si nécessaire.
Devenir
A l'issue de la procédure 1 et 2, les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes ainsi que les caractéristiques (niveau d'activation, nombre, localisation,..) des neurones qui ont été réactivés.
Remplacement
Notre objectif est de comparer les réactions de défense quand elles sont induites par une expérience réelle et quand elles sont initiées par le souvenir d’une expérience aversive. Ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Ces études ne peuvent pas non plus être réalisées chez les invertébrés, qui ont une structure cérébrale et un comportement trop simple De plus nous souhaitons étudier à la fois les réactions comportementales mais aussi les paramètres physiologiques comme la respiration ou le rythme cardiaque pour pouvoir faire un parallèle avec l’Homme (en plus de la proximité des agents pharmacologiques pour traiter les troubles anxieux). Enfin, les outils permettant de manipuler les neurones liés à un souvenir aversifs nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques et ont été le mieux caractérisés chez la souris. Le modèle rongeur est le seul modèle permettant de répondre à tous ces critères.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés nous adoptons une stratégie où nous vérifions méthodiquement et progressivement l’efficacité de la technique. En effet, la procédure 1 a pour but de mieux appréhender les caractéristiques des neurones réactivés par optogénétique et donc les effets observés dans la procédure 2. Le nombre d'animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire, pour pouvoir réaliser des tests statistiques, à partir de nos résultats. Étant donné que nos résultats dépendent de l’efficacité des injections virales, de l’efficacité du conditionnement, de l’efficacité de la procédure chirurgicale,... globalement de la bonne réussite dans l’enchainement des gestes techniques, le nombre d’animaux total doit être conséquent. Néanmoins, la quantité massive d’informations apportés par un seul animal opérationnel est telle qu’elle peut permettre des analyses de haut niveau pendant plusieurs années.
Raffinement
Nos procédures seront optimisées afin de minimiser la douleur et la souffrance des animaux. Les chirurgies se feront en conformité avec la règlementation (anesthésie et analgésie appropriées). Les animaux recevront un soin optimal après les chirurgies. Tout au long de leur hébergement, les animaux ont accès dans leur cage à des objets d’enrichissement (dôme, tubes). Le suivi par le personnel de l'animalerie est quotidien dans un contexte général et le suivi post-chirurgie est assuré par l'expérimentateur quotidiennement pendant une semaine avec relevé de signes potentiels de douleur et prise en charge analgésique si nécessaire.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car il s’agit de l’espèce pour laquelle nous avons le plus de données préexistantes dans ce domaine permettant de réduire au maximum les expériences préliminaires pour la validation des procédures. De plus, il s’agit de l’espèce, pour laquelle l’outil pharmacogénétique est le plus développé et le plus caractérisé. Nous utiliserons des souris de laboratoire sans modification génétique ainsi que des souris transgéniques. L’efficacité des infections virales au niveau du cerveau décroît avec l’âge de la souris. En revanche, la procédure de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance de l’os du crâne est stabilisée. C’est pourquoi, en accord avec la littérature, nous choisirons un âge compris entre 5 et 9 semaines pour réaliser les injections stéréotaxiques. Les implantations d’électrodes se feront 1 semaine après les injections de virus.
Impact à l’adolescence de l’exposition précoce aux drogues sur le comportement et le système dopaminergique dans un modèle de comorbidite schizophrénie – troubles de la consommation d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de sept jours, chaque raton subit une chirurgie du cerveau pour léser l'hippocampe, 320 recevant plus tard un implant d'électrodes, puis les animaux sont exposés à l'alcool et isolés durant l'adolescence avant d'être tués pour vérification histologique. Le porteur justifie le rat par l'auto-administration d'alcool, plus difficile à observer chez la souris, et par la reprise d'un modèle déjà utilisé au laboratoire. Il indique utiliser mâles et femelles pour ne pas avoir à éliminer d'animaux surnuméraires.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact à l'adolescence d'expositions précoces aux drogues sur les troubles du comportement et sur la transmission dopaminergique au sein du noyau accumbens dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'alcool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agents cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission dopaminergique. En effet la dérégulation de ce système de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la consommation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie. A ce jour, aucune étude ne s'est intéressée aux effets à court terme des expositions précoces aux drogues dans les modèles de schizophrénie.
Bénéfices attendus
Il a déjà été montré que l'exposition précoce à l'alcool durant l'adolescence est nécessaire pour l'observation à l'âge adulte d'une consommation exagérée d'alcool. Néanmoins, nous n'avons pour le moment aucune information concernant la co-exposition avec des agents cannabinoides, drogues très fréquemment consommées par les adolescents et les jeunes adultes atteints de schizophrénie ou non. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques précoces qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact à l'adolescence d'une exposition précoce à des drogues couramment utilisées sur les systèmes dopaminergiques.
Procédures
Tous les animaux du projet (soit 960 ratons mâles et femelles) subiront une chirurgie à l'âge de 7 jours. Cette opération ne dure jamais plus de 20 minutes et se fera sous anesthésie générale et sous anesthésie locale. Par la suite à l'adolescence 320 rats subiront une seconde chirurgie qui ne durera pas plus de 30 minutes. De plus, les animaux auront la possibilité d'avoir accés à de l'alcool (10% à l'adolescence pendant 15 jours et 20% pendant 4 semaines à l'âge adulte). Cette exposition à l'alcool se fera de manière volontaire par les animaux puisqu'ils seront soumis à un protocole de libre choix à 2 bouteilles, une bouteille contenant la solution d'alcool et une bouteille d'eau.
Impact sur les animaux
Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à J7 suite à la lésion de l'hippocampe ventral par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à environ J50 - J60 suite à l'implantation d'électrodes d'enregistrement par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. Isolement des animaux pendant la période d'exposition à l'alcool à l'adolescence pendant 14 jours.
Devenir
Les procédures initiales ne sont que des étapes qui nous permettent de générer nos animaux modèles de comorbidité. Tous les animaux issus de ces procédures seront répartis en différents groupes expérimentaux avant d'être euthanasiés en fin de protocole pour vérification histologiques des sites de lésions et d'implantations.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant le même modèle NVHL en prenant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet. De plus nous réaliserons les expériences aussi bien sur les mâles que sur les femelles pour ne pas avoir à éliminer les animaux surnuméraires mais également, dans le but d'une réduction, ne pas à avoir à refaire tout ce projet ultérieurement uniquement sur les femelles (et donc euthanasier les ratons mâles surnuméraires à ce moment).
Raffinement
Pour chacune des procédures nous avons mis en place un série de points limites ainsi qu'une grille de scoring du bien-être animal. Une action thérapeutique adaptée sera déclenchée dès q'un point limite sera atteint. « En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe tout au long du projet sauf pendant les périodes d'évaluation de la consommation d'alcool. Ces périodes seront limitées au strict minimum nécessaire et l'isolement sera contrebalancé par une manipulation accrue par les expérimentateurs (enrichissement inter-espèce).
Choix des espèces
Le modèle NVHL est un modèle décrit chez le rat. Pour poursuivre nos études nous devons utiliser le même modèle que précédemment. Le rat est un modèle idéal pour l'étude de la comorbidité troubles de la consommation d'alcool/schizophrénie en particulier en ce qui concerne certaines études comportementales comme l'auto-administration d'alcool qu'il est plus difficile d'observer chez les souris. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. Le modèle de schizophrénie que nous allons utiliser nécessite une lésion de l'hippocampe ventral au 7ème jour de vie. Tous les petits seront ensuite soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle préexposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.
Etude des modifications de l’activité des gènes impliqués dans la croissance des cellules de cancers du sang
- Recherche fondamentale
- Oncologie
795 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes, elles sont irradiées puis greffées avec des cellules leucémiques humaines, subissent des prélèvements de sang à la joue et des ponctions de moelle osseuse au fémur, avant d'être tuées pour analyse. Le porteur indique que la maladie peut provoquer perte de poids, baisse de mobilité et, rarement, paralysie des membres. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet de cultiver ces cellules leucémiques, trop fragiles hors d'un organisme vivant.
Objectifs
La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une forme de cancer qui touche les cellules de la moelle osseuse, qui produisent normalement les globules rouges, les plaquettes et les globules blancs. La leucémie est caractérisée par la prolifération excessive et le blocage de la maturation de ces cellules immatures. Les leucémies affectent enfants et adultes, et bien que, ces dernières décennies, de nombreux progrès ont été fait du point de vue thérapeutique, des rechutes fatales sont observées dans 20 % des cas pédiatriques ; chez l’adulte, la survie globale à 5 ans est seulement de 30-40% chez les patients de moins de 60 ans, et de 20% pour les plus de 60 ans. Un sous type particulier de cancers du sang affectant les cellules myéloïdes (les leucémies aiguës à mégacaryoblastes) sont généralement observées chez l’enfant et sont de très mauvais pronostic. Elles résultent d’une prolifération accrue des cellules à l’origine des plaquettes, bloquant ainsi leur maturation en plaquette. Il est donc essentiel de poursuivre la compréhension des mécanismes conduisant à ces pathologies pour concevoir des thérapies ciblées afin d’améliorer la survie des patients leucémiques. L’objectif de notre projet est d’identifier des régions du génome humain qui régulent l’expression de gènes favorisant les cancers. Afin de réaliser cet objectif nous utiliserons un modèle de cancers du sang affectant les cellules myéloide humaine se développant dans des souris dépourvues de système immunitaire et ne pouvant rejeter la greffe, seule façon de modéliser cette maladie.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes conduisant au cancer doit nous conduire à concevoir des thérapies ciblées. Au terme de notre projet, les résultats obtenus devraient contribuer à l’amélioration des traitements proposés aux patients.
Procédures
Nous utiliserons des souris dépourvues de système immunitaire permettant ainsi l'amplification (absence de rejet de la greffe) des cellules tumorales de patients atteints de LAM. Les souris seront irradiées avec une dose suffisamment faible pour ne pas induire leur mort mais permettant la greffe de cellules humaines (durée de l'irradiation: moins de 2 min). Ces cellules seront injectées quelques heures après l’irradiation dans la veine de la queue, aucune anesthésie ou analgésie ne sera nécessaire (durée de l'injection: 30 s). Les souris recevront un traitement antibiotique dilué dans l’eau de boisson durant les 2 semaines suivantes afin d’éviter tout risque d’infection liée à la perte de leur système immunitaire. Des échantillons de sang seront prélevés sur souris éveillée de manière bi-mensuelle dans la veine de la joue, la durée d’un prélèvement est inférieure à une minute. Ces prélèvements seront effectués pendant 3 mois et demi suivant l’injection de cellules. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins deux semaines. Des prélèvements de moelle osseuse réalisés au niveau du fémur pourront être réalisés deux fois maximum à 2 semaines d’intervalle. Pour cela, une anesthésie gazeuse sera effectuée, la durée d’un prélèvement est inférieure à 5 minutes. Une analgésie est prévue afin d’éviter la douleur.
Impact sur les animaux
Une perte de poids, une réduction de la mobilité et une négligence du toilettage pourraient être observés chez les animaux lors de la progression de la leucémie. Une paralysie des membres inférieurs peut être observé dans de très rares cas. L’irradiation sublétale des animaux, conduisant à l’ablation des cellules immunitaires, peut rendre les animaux plus susceptibles aux infections. Les prélèvements sanguins itératifs et les biopsies de moelle osseuse peuvent représenter un risque hémorragique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à différents temps et les organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode alternative permettant de cultiver les cellules leucémiques primaires de patients in vitro. En effet, ces cellules sont extrêmement fragiles et ne peuvent pas être maintenues en vie en dehors d'un organisme vivant. En outre, la culture cellulaire ne permet pas de modéliser les différentes interactions entre les cellules tumorales et l’environnement dans lequel elles prolifèrent. Ces interactions ne sont possibles que dans un organisme entier vivant afin de conserver les interactions des cellules leucémiques avec les cellules des organes environnants.
Réduction
Grâce à des analyses statistiques, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements, ...etc.). De plus, un suivi clinique des souris sera également entrepris 2 fois par semaine pour détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. L'administration d'un antalgique sera réalisée en cas de douleur légère avant l'euthanasie de l'animal si son état se dégrade soudainement. Enfin, les cages où sont maintenus les animaux feront l’objet d’un change hebdomadaire, et nous nous assurerons d’y apporter le maximum d’enrichissements (Social : les souris seront en groupe de 5 pour favoriser les interactions sociales entre elles. Matériel : bûchettes en bois, papier kraft, tunnels, ...etc.).
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Les souris seront des souris adultes afin de maximiser la prise de greffe comme cela a été décrit auparavant dans la littérature scientifique.