Recherche fondamentale

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, jusqu'à sept par animal, et du LPS qui provoque un état de type septique avec fièvre, diarrhée et tremblements, ces derniers servant de point limite, ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le porteur affirme que l'étude de la protéine visée ne s'envisage que dans un "organisme complet" et non sur un modèle cellulaire. Les débouchés annoncés pour l'aplasie fébrile de l'enfant restent formulés comme des perspectives.

Objectifs

Le traitement des cancers de l’enfant utilise la chimiothérapie, qui peut transitoirement entrainer un déficit d’immunité appelé aplasie. Durant cette période, les enfants présentent souvent des épisodes de fièvre, pouvant être sévères et entraîner la mort. Devant ce risque, des mesures importantes sont mises en place avec hospitalisation en urgence et utilisation d’antibiotiques. Les infections en cours d’aplasie fébrile restent une réelle complication avec risque de décès chez ces enfants malades. Onze à 24 % vont présenter une bactériémie (présence d’une bactérie dans la circulation sanguine), facteur de risque de décès en contexte d’aplasie fébrile. En effet, la mortalité au cours des aplasies fébriles chez l’enfant est estimée entre 0,2 et 3 %, pouvant s’élever jusqu’à 10% chez les patients avec une bactériémie. Les infections à Pseudomonas aeruginosa gardent une place majeure tant par leur fréquence que par leur sévérité. A ce jour, il n’existe pas de marqueur biologique pouvant prévenir la gravité d’une aplasie fébrile. Il existe des molécules de danger, libérées dans le corps en période d’infection, et qui sont néfastes pour l’organisme (inflammation majorée, formation de caillots sanguins). Des études publiées montrent que neutraliser ces molécules de danger peut avoir un effet protecteur, améliorant le pronostic au cours d’une infection sévère. Des travaux préliminaires réalisés chez l’adulte présentant une infection sévère et généralisée, suggèrent que la protéine X, naturellement produite par l’organisme, est capable d’inhiber les effets délétères de certaines molécules de danger. Notre projet repose sur l’hypothèse que, chez l’enfant présentant une aplasie fébrile, le taux sanguin de X peut prédire la sévérité de l’infection. Notre étude s’articule en 2 axes : (1) une étude clinique portant sur l’intérêt du dosage de X dans une population pédiatrique suivie en oncologie et (2) une étude chez la souris mesurant la synthèse et l’élimination de X au cours de l’infection et évaluant son potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les débouchés cliniques sont multiples : (i) évaluation de nouveaux marqueurs permettant de prédire la gravité d’un épisode d’aplasie fébrile, (ii) orientation vers le type de pathogène (bactérien, fongique, viral), (iii) proposition d’escalade ou de désescalade de la prise en charge anti-infectieuse, notamment dans le contexte des tumeurs solides pédiatriques et enfin (iiii) un potentiel impact thérapeutique.

Procédures

Dans les quatre procédures de l’étude, les animaux seront traités par des injections intrapéritonéales. Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Dans les quatre procédures de l’étude, des prises de sang seront réalisées. Sous anesthésie gazeuse (moins de 5 minutes), la prise de sang rétro orbitaire permet la récolte de 50 à 100µL de sang en moins de 2 minutes, sans traumatisme et sans douleur. Lorsqu’un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement (avec réveil). Procédure 1 : pour chaque animal • 1 injection intra péritonéale • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 2 : pour chaque animal • 2 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie • • Procédure 3 : • 3 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie Procédure 4 : • 7 injections intra péritonéales. • 3 prises de sang maximum dont 1 sans réveil, juste avant euthanasie L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’administration de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux des procédures 1, 3 et 4. Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre de sous-cutanées qu’un un animal pourra recevoir. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Impact sur les animaux

Ce projet étudie le sepsis, c’est-à-dire une inflammation systémique déclenchée par le LPS (lipopolysaccharide = endotoxine), mimant ainsi une infection bactérienne, chez le sujet soumis à une chimiothérapie aplasiante. Une inflammation systémique donne classiquement de la fièvre. Les souris pourront présenter, suivant la dose reçue (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une fatigue et une douleur potentielle. Une fermeture plus prononcée des yeux (fatigue), une diarrhée transitoire, une modification de comportement par l’absence de mobilité pourront être observées. A une dose plus importante de LPS, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés. Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. 1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle concerne tous les animaux du projet. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les quatre procédures du projet. Elle permet, sous anesthésie gazeuse, une récolte de sang rapide, sans traumatisme et sans douleur. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Ainsi, chaque sinus rétro orbitaire ne sera soumis qu’à un seul prélèvement. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les procédures 1, 3 et 4 du projet si l’injection de buprénorphine (antalgique) est nécessaire. Elle permet une distribution systémique rapide des produits injectés. C’est la voie recommandée pour ce produit. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.

Devenir

Nous souhaitons doser la molécule X ainsi que diverses molécules pro-inflammatoires dans le sang des animaux mais aussi dans des organes comme la rate, le foie, les poumons et les reins qui sont très touchés par l’orage cytokinique déclenché par le sepsis. Les animaux seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Le métabolisme de la protéine X est mal connu à ce jour. Sa synthèse est probablement mixte, avec une production (i) par les cellules sanguines), mais également (ii) par d’autres tissus, dont les endothéliums vasculaires (=vaisseaux sanguins). L’étude de cette protéine ne peut donc s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. Un modèle murin parait être le plus adapté à l’étude de cette protéine.

Réduction

Pour nos expériences, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et avoir le nombre de contrôles internes obligatoires en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre minimal d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 40% d’écart type intra lot est de 10 (Berndston et al. J ANIM SCI 1991). La cinétique des réponses immunitaires pouvant varier d'une expérience à l'autre, celles-ci seront répétées au minimum deux fois pour renforcer l'approche statistique (Cf. chronogramme associé au dossier).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, selon l’annexe III de la directive 2010/63/CE, les souris seront hébergées en cages collectives (5 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général selon les critères de Lloyd et al. (Lab animal management and welfare, 1994). Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la facilité d'introduire une modification génétique chez ces espèces, à la grande taille des portées, au temps de génération court et à la relative facilité d'hébergement et de soins. De plus, la littérature scientifique décrit de nombreux modèles murins de sepsis. Nous disposons au laboratoire, d’une lignée de souris de fond génétique C57BL/6 chez laquelle le gène de la protéine X, étudiée dans ce projet, est rendu non fonctionnel. Cette technique couramment utilisée en recherche pré-clinique permet de démontrer l’importance d’une protéine dans un modèle donné. Notre étude porte sur l’aplasie fébrile pédiatrique. Nous utiliserons donc des animaux de 4 à 5 semaines, sevrés mais n’ayant pas atteint la maturité sexuelle.

576 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un composé par gavage oral répété pendant 13 à 19 jours, 180 d'entre eux subissant en plus une perfusion intracardiaque sous anesthésie sans réveil, et tous sont tués pour analyser leur cerveau et leurs tissus. Le porteur mesure les capacités d'apprentissage par le test de la piscine de Morris et justifie le rat par l'absence de modèle spontané de trisomie 21 et sa proximité génétique avec l'espèce humaine. Le bénéfice annoncé, déplacer de quelques points le quotient intellectuel des patients, reste un objectif lointain avant tout passage en clinique.

Objectifs

Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement crânio-facial et le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent des anomalies crânio-faciales ainsi qu’une une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observée dans la T21. Des collaborateurs proposent des composés ayant la propriété d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons tester l’un de ces composés sur nos modèles rats de la trisomie 21. Ce composé est synthétisé et testé pour l’ADME pharmacologique (administration, distribution, métabolisation et excrétion) par nos collaborateurs. Divers dérivés de ce composé ont été préalablement testés au sein de notre laboratoire sur des modèles souris de la T21, permettant ainsi une amélioration des fonctions cognitives de ce modèle sans aucun effet toxique observé. Sachant que le métabolisme des souris et des rats sont différents, ici nous souhaitons optimiser le traitement sur le modèle rat. Dans ce projet, le composé testé sera administré par notre équipe à des rats modèles de la T21 et à des rats contrôles dans le but de s’assurer qu’ils n’ont pas d’effet toxique. Les rats feront l’objet d’une étude comportementale afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives. Le composé sera testé à différents temps et différentes doses afin d’identifier la durée et la dose minimales nécessaires pour obtenir un rétablissement des fonctions cognitives des rats trisomiques.

Bénéfices attendus

Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la Trisomie 21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la trisomie 21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. De plus, dans le cadre de cette étude, réussir à reproduire sur le modèle rat, les résultats obtenus sur les modèles souris de la Trisomie 21, nous permettra une généralisation des résultats avant le passage en phase clinique du candidat-médicament.

Procédures

Dans le cadre de cette étude, un gavage oral répété sera réalisé sur un total de 576 rats. Ce gavage sera effectué sur un même rat soit 19 fois (étude sur 19 jours), soit 13 fois (étude sur 13 jours). La réalisation du gavage prend 1 à 2min pour un rat par jour. De plus, au cours de ce projet nous réaliserons une perfusion par voie intracardiaque sur 180 rats des 576. La procédure qui est sans réveil sera réalisée une seule fois par rat et elle dure 30min par rat. Pour cela il nous faudra anesthésier l’animal via une administration d’anesthésiant par voie intrapéritonéale. Ce geste nécessaire pour réaliser l’exsanguination de l’animal sous anesthésie générale profonde est réalisé en 1 à 2min par rat.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, un gavage oral répété sera réalisé sur un total de 576 rats. Ce gavage sera effectué sur un même rat soit 19 fois (étude sur 19 jours), soit 13 fois (étude sur 13 jours). La réalisation du gavage prend 1 à 2min pour un rat par jour. Ce geste technique peut entraîner un stress non négligeable, une irritation de l’œsophage et un risque de fausse route existe. De plus, au cours de ce projet nous réaliserons une perfusion par voie intracardiaque sur 180 rats des 576. La procédure qui est sans réveil sera réalisée une seule fois par rat et elle dure 30min par rat. Pour cela il nous faudra anesthésier l’animal via une administration d'anesthésiant par voie intrapéritonéale qui réalisé en 1 à 2min par rat. L’anesthésie de l’animal via l’introduction d’une aiguille par voie intrapéritonéale peut entraîner un stress à l’animal.

Devenir

A l’issu de la procédure expérimentale : Gavage oral d’inhibiteurs de Dyrk1A dans des rats modèles de la trisomie 21, l’ensemble des 576 rats seront mis à mort. 180 rats sont mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques sur le cerveau des animaux, et les 396 autres rats seront euthanasiés selon les bonnes pratiques de laboratoires, les tissus prélevés sur ces derniers seront utilisés pour des analyses moléculaires.

Remplacement

Le rat est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique de cette espèce sont bien connues. Son génome aisément manipulable permet de multiples applications telles que la création de modèles de pathologies humaines. De plus, la nécessité d’utiliser des animaux transgéniques est liée à l’absence de tout modèle spontané de trisomie 21 dans une espèce mammifère autre que l’Homme. De plus, l’intérêt d’utiliser le rat est de pouvoir comparer les résultats obtenus à ceux de la souris. En effet, comme on le sait, il peut exister des différences inter-espèces et il est donc important de comparer les résultats entre deux organismes-modèles. Si des résultats similaires sont obtenus entre les deux espèces, cela permettra une généralisation de ces résultats.

Réduction

Pour ces tests, des rats mâles et femelles seront utilisés à partir de 10-12 semaines, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons le composé sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. De plus, le traitement sera aussi effectué sur des animaux contrôles dans le but de vérifier qu’il n’y ait pas d’effet toxique. La variabilité inter-individu observée dans les études comportementales nécessite de tester 12 à 16 animaux par groupe pour avoir un résultat significatif avec une puissance statistique suffisante. C’est pourquoi nos expériences sont construites sur des groupes de 16 mâles et 16 femelles au maximum par condition. Il nous faudra donc un total de 576 rats dans ce projet (16 rats x 6 groupes x 2 sexes x 3 conditions = 576 rats).

Raffinement

Préalablement aux études des analyses de pré-tox ont été réalisé par nos collaborateurs, pour s’assurer que les molécules n’ont pas d’impact majeur sur les animaux après administration. L’administration des composés sera réalisée par gavage oral durant 19 et 13 jours continus comme expliqué précédemment. Au cours du traitement nous procéderons aux études du comportement : le test de la piscine de Morris. Durant toute l’étude, les animaux feront l’objet d’un contrôle journalier pour vérifier leur bien-être. Les animaux présentant des signes de douleurs seront évalués suivant l’échelle de l’expression faciale et seront exclus des tests puis soignés ou euthanasiés selon la situation et l’avis du vétérinaire. Concernant la procédure de perfusion intracardiaque, elle est effectuée sous anesthésie générale pour éviter tout stress et limiter la douleur de l'animal.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. N’existant pas de modèle spontané de la trisomie 21, le rat avec la souris, sont les seules espèces physiologiquement et génétiquement proches de l’Homme dans lesquelles nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que ces modèles permettent d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes lors de l’optimisation de composé pharmacologique. En outre, le génome du rat étant aisément manipulable, permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du syndrome de Down. De plus, l’intérêt d’utiliser le rat est de pouvoir comparer les résultats obtenus à ceux de la souris. En effet, sachant qu’il existe des différences inter-espèces il est intéressant de comparer les résultats entre les modèles souris et rats afin de généraliser les résultats si ces derniers sont similaires. Enfin, le rat ayant des capacités d’apprentissage plus performantes que la souris, il est un meilleur modèle pour l’étude des déficiences cognitives associées à la trisomie 21. Les rats seront étudiés à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 10-12 semaines, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes d’apprentissage et de mémorisation sont présents.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules de mélanome pour développer une tumeur et des métastases, puis sont tuées par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever tumeur et organes. Le porteur indique que la tumeur peut atteindre 1 500 mm3, seuil déclenchant l'arrêt de l'expérience. Il affirme que la formation de métastases ne peut être modélisée qu'in vivo et conclut que l'étude sur animal est inévitable.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche CPER FEDER destiné à étudier le rôle des cellules stromales mésenchymateuses et à identifier l’expression des micro-ARN (miARN) lors du développement de tumeurs métastatiques. Les métastases sont une cause majeure de décès chez les patients atteints de tumeurs malignes. Les miARN sont des petits ARN régulateurs de l'expression génique. Une modification de l’expression de ces miARN peut contribuer au développement tumoral et à la dissémination métastatique par dérégulation de l’expression de gènes impliqués dans des processus clés du cancer. Le système du complément a démontré des rôles dans la régulation de la croissance tumorale, bien que ceux-ci puissent différer selon les types de tumeurs. C3a a une fonction prépondérante de médiateur dans les phénomènes inflammatoires au sein des tissus. Le ciblage spécifique du système du complément peut être d'une grande importance et valeur dans le futur traitement des tumeurs. Nous utiliserons le modèle de tumeurs induites par l’administration sous cutané de cellules B16-F10 chez les souris C57BL/6. Ce modèle permet le développement de tumeurs primaires et de métastases dites « spontanées », ce qui correspond étroitement à celles développées par les humains. Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée et seront réalisées dans les conditions les moins stressantes possibles pour les animaux. Dans un souci permanent du bien-être animal et afin de minimiser l’emploi des animaux de laboratoire, l’évaluation de l’expression des miARN dans un contexte cancéreux sera réalisée en priorité dans des modèles in vitro. Ce projet engagera des souris dans un nombre estimé à 45 individus pour la durée que couvrira ce projet. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque lot de chaque procédure est réduit, il correspond au seuil minimal qui puisse nous permettre d’apprécier, avec nos moyens techniques et en fonction de la variabilité inter-individus, les effets désirés. Par ailleurs, l’hébergement des animaux pendant la phase d’acclimatation et pendant l’expérimentation sera faite avec enrichissement du milieu afin d’améliorer leur bien-être. A terme, nos travaux permettront d’identifier les miARN impliqués dans l’angiogenèse et annonciateurs de formation tumorale et de dissémination métastatique. Ainsi les cancers pourraient être pris en charge à un stade précoce.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront l’identification des miARN annonciateurs de développement tumorale et ainsi permettre une prise en charge plus précoce des patients atteint de cancer, ainsi que de comprendre le mécanisme et l'implication du système du complément dans la tumorigenèse.

Procédures

Induction de tumeurs métastatiques par injection de cellules B16-F10 ou B16-F10/C3a par voie sous cutanée une seule fois à J1. - Prélèvement sanguin (1mL) par ponction cardiaque après anesthésie volatile des souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont des douleurs légères suite aux injections IP des cellules tumorales et le développement de tumeurs métastatiques.

Devenir

Après l'injection sous cutanée, les souris seront maintenues en vie jusqu'à la fin de l'étude. Les indivisus seront mis à mort à la fin de l'étude par ponction cardiaque précédée d’une anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d'une dislocation cervicale. Les organes prélevés seront scindés en 5 : 1/5 protéine (analyse par western blot), 1/5 ARN, 1/5 miARN (quantification, qRTPCR), 1/5 isopentane, 1/5 paraffine (analyse immunohistologique). La tumeur sera récupérée.

Remplacement

Remplacement: Nos études in vitro avec les cellules stromales mésenchymateuses pulmonaire et un modèle de cellules cancéreuses apportent quelques résultats sur les miARN impliqués dans cette pathologie. Néanmoins, ce modèle cellulaire ne suffit pas a modéliser le processus de développement tumoral dans son ensemble. La formation de métastases est un processus complexe et ne peut être modélisé que in vivo. L’étude in-vivo est inévitable pour comprendre le rôle des cellules stromales mésenchymateuses dans le développement de tumeurs métastatiques, identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans cette pathogenèse et étudier la capacité du c3a à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression du développement tumoral.

Réduction

Réduction du nombre : Pour chaque condition testée, nous utiliserons un nombre minimal de souris pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Nous utiliserons pour l’étude statistique le test one way ANOVA suivi d’un un test de Bonferroni pour comparer les trois groupes d’animaux entre eux, ainsi qu'un t-test suivi d'un test de Student.

Raffinement

Raffinement : La ponction cardiaque sera réalisée sous anesthésie volatile (isoflurane). Le prélèvement des organes se fera après la mise à mort des animaux. L’évaluation de la qualité de l’anesthésie se fera en vérifiant les 4 étapes suivantes : -l’absence de douleur et/ou de réponse réflexe en exerçant une pression au niveau des doigts de l’animal -L’immobilisation de l’animal -La relaxation musculaire -L’état d’inconscience en vérifiant les mouvements respiratoires. Les souris seront observées 3 fois par jour pendant les 10 premiers jours, puis 1 fois par jour pour le reste de l’expérimentation, dans le but de déceler le plus rapidement possible des signes cliniques critiques dus à l’expérimentation (prostration, température trop élevée, perte de poids, …). Ceci sera basé sur une grille de scoring définie. Chaque situation d’animal montrant des signes d’inconfort ou de souffrance liés ou non à l’expérience sera rapporté au vétérinaire responsable de l’animalerie pour que l’animal soit pris en charge de manière individuelle afin d’améliorer son bien-être. Si l'état ne s'améliore pas au-delà de 24h, il sera euthanasié par ponction cardiaque sous anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d’une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés.. De plus, si la taille de la tumeur arrive à 1500mm3 avant J30, l’expérimentation s’arrêtera dès lors, afin d’éviter des expérimentations en durée « non-nécessaires » sur les animaux. La durée de l’étude principale sera de ce fait réduite d’autant. La mesure des tumeurs se fera mécaniquement à l’aide d’un pied à coulisse Caliper. Pour respecter le principe des 3R, un nombre réduit d’animaux a été choisi.

Choix des espèces

Les C57BL/6 sont des souris robustes, et sont déjà utilisées pour la formation de tumeurs métastatiques induites par les cellules B16-F10. Souris adultes de 6 à 8 semaines

120 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson subit sous anesthésie une micro-lésion musculaire à l'aiguille, avec ou sans injection de cellules souches, avant d'être tué à l'un des temps de prélèvement pour analyser le muscle. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'infection ni de mortalité et décrit une lésion sans douleur ni gêne pour la nage. Il vise à orienter les "pratiques zootechniques" de la filière truite, pour laquelle il juge le recours à l'animal vivant "incontournable".

Objectifs

La croissance musculaire nécessite l'activation et la différenciation des cellules souches musculaires aussi appelées cellules satellites. Chez les poissons, les cellules satellites maintiennent des capacités de prolifération et d'autorenouvellement qui permettent la formation continues de fibres musculaires pendant la croissance exponentielle du muscle. Néanmoins, la croissance musculaire hyperplasique diminue avec l'âge et les mécanismes cellulaires sous-jacents ne sont pas encore connus. Nous avons mis en place un protocole d'extraction de cellules souches de muscle de truite et de transplantation de cellules souches musculaires. Nos premiers résultats montrent que les capacités des cellules souches et de leur niche diminuent dès le poids de 500g. Notre objectif est de déterminer si les capacités de régénération sont également très inférieurs chez les poissons d'un poids de 1kg comparé à un muscle de truite jeune (10g).

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de montrer que les capacités de régénération musculaire et donc aussi de formation de nouvelles fibres (hyperplasie) sont fortement altérées chez les poissons de 1kg en comparaison d'un poisson de 10g. Cette connaissance devrait permettre d'orienter les pratiques zootechniques afin de maitriser plus finement la croissance musculaire et les caractéristiques du muscle de truite.

Procédures

Les animaux vont subir sous anesthésie une micro-lésion intramusculaire (blessure réalisée avec une aiguille ) avec (ou pas) injection d’un petit volume de cellules. Pour chaque prélèvement à J3, J7, J15, J30 et J60 les poissons sont euthanasiés selon la méthode §3.3.3.

Impact sur les animaux

Par le passé, nous avons déjà réalisé des expériences de transplantation et de lésion musculaire, et nous n'avons jamais observé d'infection (cutanée, interne) ou de mortalité. La zone lésée étant très petite (piqure d'aiguille), cela ne gène absolument pas la nage des poissons. Par ailleurs, l'injection de cellules souches musculaires dans le muscle ne provoque aucune douleur spécifique ni de nécrose ou infection.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasiés puisque des prélèvements de muscle sont indispensables au projet.

Remplacement

L'objectif scientifique du projet étant de déterminer si les capacités de régénération musculaire sont altérées avec l'âge chez la truite, le recours à des animaux vivants est incontournable.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous allons utilisés les mêmes animaux pour la régénération et la transplantation. En effet, un coté du poisson sera utilisé pour la transplantation et l'autre coté pour la régénération. Le nombre de point de la cinétique (6) est réduit tout en permettant une bonne caractérisation des premières étapes de régénération ainsi que la régénération complète. Ainsi nous utiliserons 60 animaux de 10g et 60 animaux d'1kg ce qui permettra de prélever que 10 animaux par point de cinétique.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, nourriture, enrichissement). Pendant la procédure, les animaux seront anesthésiés, leur manipulation sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Au cours de l'expérimentation nous réaliserons une évaluation quantitative de points limites incluant la nage, la prise alimentaire, la prostration, l'état sanitaire qui permettront d'arréter l'expérimentation si nécessaire.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. L’espèce est grégaire et supporte des densités d’élevage importantes. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). De plus, nous disposons d'une lignée de truites transgéniques mlc2-GFP qui expriment la GFP dans les cellules souches musculaires. Nous allons utiliser des poissons receveurs de 10g et 1kg. Une expérience préliminaire, nous a montré que les capacités myogéniques des cellules souches et de la niche diminuait rapidement dès 100g et atteignait un minimum autour de 500g. Ainsi pour maximiser nos chances d'observer une différence de capacité de régénération, nous allons utiliser des animaux de 10g (~3 mois) et de 1kg (~1,5 an).

70 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent une injection intracérébrale de cellules tumorales par craniotomie, et trente d'entre eux subissent une seconde chirurgie pour implanter un dispositif d'administration et une pompe osmotique. Le porteur teste une voie d'administration locale de médicament contre le glioblastome, et non une molécule, ce qu'il présente comme réalisable seulement in vivo. Il fixe comme point limite une taille de tumeur qu'il décrit comme n'induisant pas encore de souffrance perceptible.

Objectifs

Bien que l'incidence du glioblastome soit faible (~6/100000) la médiane de survie post-diagnostic est de l'ordre de 15 mois malgrè un traitement agréssif associant une chirurgie et une chimio/radiothérapie. Parmi les améliorations thérapeutiques possibles, l'utilisation d'une infusion focale à flux fixe (CED) est une option. Toutefois, ce type d'infusion est limité dans le temps et possible qu'au moment de l'exèrese. L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer l'apport d'un nouveau dispositif médical permettant de délivrer localement un médicament par une infusion multifocale à flux fixe et ceci sans contrainte de temps.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à cours terme est de proposer une approche thérapeutique innovante et modulable pour le glioblastome dont la médiane de survie reste très courte.

Procédures

Parmi les 70 animaux inclus dans cette étude, 70 recevront une injection intracerébrale de cellules tumorales. Ils subiront donc une chirurgie sous anesthèsie générale de 15-20 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 0.5mm de diamètre. Parmi les 70, 30 subiront une seconde chirurgie 8 jours après la première. Les gestes seront identiques à ceux réalisés précédement. 30 subiront une seconde chirurgie, 8 jours après la première, sous anesthèsie générale de 60 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 4mm de diamètre au niveau de la plaque pariètale, suivi par la pose du dispositif et un décollement cutané au niveau interscapulaire afin de poser une pompe osmotique. Les 10 derniers ne subiront pas de chirurgie complementaires. Tous les animaux seront suivi par IRM afin d'évaluer l'impact des thérapies mises en oeuvre sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont relatives aux chirurgies incluses dans le protocole. En effet, une première chirurgie consistera à injecter les cellules tumorales au travers d'un orifice de diamètre inférieur à 1mm dans le crâne du rat après incision cutanée. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post opératoire de buprénorphine (0,1mg/kg 0,1mg/mL Buprécare) et injection locale de lidocaine (16,2mg/mL, 100uL). La seconde chirurgie sera réalisée une semaine après la première, également sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post-opératoire de buprénorphine et injection locale de lidocaine. Cette chirurgie s’accompagnant d’une craniotomie de 4mm de diamètre et d’une tunnelisation pour la pose de la pompe osmotique, des doses supplémentaires de buprénorphine seront dispensées 6h et 18h post chirurgie. Enfin, après chaque chirurgie, les animaux seront isolés pour 24h afin d’éviter qu’ils ne se rongent mutuellement les sutures.

Devenir

En fin de procédure 1 (inoculation de cellules tumorales) tous les animaux seront conservés car impliqués dans la procédure 2. En fin de procédure 2 (evaluation du nouveau dispositif) tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Il existe de nombreux tests de toxicité de molécules sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous on permis de selectionner 2 molécules avec un potentiel thérapeutiques certains sur la lignée de glioblastome testée. Dans notre cas, nous ne cherchons pas à tester une nouvelle molécule mais une voie d'administration innovante et ceci ne peux être réalisé qu'in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante. en effet, une simulation en utilisant G-power montre que pour nos groupes (non traités, traités PBS avec le nouveau dispositif, traités par la molécule 1 avec le nouveau dispositif, traité en CED par la molécule 1 et traité par du PBS par CED) contenant un nombre d'individus équivalent et égal à 10, un gain de survie moyen de 2 jours pour la thérapie CED et au minimum 3 fois supérieur pour le nouveau dipositif peux être mis en evidence avec un risque alpha de 0.05 et beta 0.95.

Raffinement

Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux seront maintenus en normothermie pendant toutes les procédures chirurgicales. Ces procédures seront réalisées sous anesthèsie isoflurane et une injection locale au niveau de la zone d'inscision de lidocaine. Une analgésie pre et post operatoire par de la buprenorphine et également associée. De plus, le suivi réguliers par IRM de la croissance tumorale, là aussi en normothermie assurée par une couverture chauffante asservie à la temperature réctale, et le suivi lors de ces examens du rythme respiratoire, la production de données sériées permet de limiter le nombre d'individus nécessaire pour tester notre hypothèse de travail. De plus, le suivi de la masse tumorale permet d'arreter le protocole expérimental avant tous signes cliniques de souffrance de l'animal. En effet, notre expérience de ce type de modèle nous permet de fixer comme point limite une taille de tumeur de 100µL, taille qui n'induit pas de modifications comportementales traduisant une souffrance.

Choix des espèces

Les tumeurs 9L sont des tumeurs initialement produites chez le rat fisher et ne se developpent que chez cette souche immunocompétente. Les animaux utilisés seront des animaux adultes de 7-8 semaines au moment de la première chirurgie. A cet age, il est possible de poser le dispositif sur le crane de l'animal en ne touchant qu'une seule plaque pariètale. De plus, le dispositif faisant environ 3mm de hauteur, il est possible de suturer sans crèer de tension importante. Enfin, avec cette taille de rat, la pompe osmotique (environ 1cm de long et 0.4cm diametre) alimentant le dispositif une tubulure souple en polyurethane peut être placée entre les omoplates sans entraver la mobilité de la tête.