Recherche fondamentale

Pour améliorer les immunothérapies anticancéreuses, 5740 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est irradiée, une autre reçoit des injections quotidiennes puis une greffe de tumeur sous la peau, avec pour effets possibles une perte de poids, des difficultés respiratoires et des zones de nécrose pouvant s'infecter. L'objectif est de comprendre comment les cellules dendritiques activent la réponse immunitaire contre les tumeurs. Le porteur affirme que ni les organoïdes ni les organes sur puce ne reproduisent la complexité du micro-environnement d'une tumeur.

Objectifs

Le système immunitaire joue un rôle majeur dans l’élimination des tumeurs et le contrôle des métastases. Cependant, par différents mécanismes, les tumeurs altèrent les fonctions des cellules immunitaires et compromettent l’efficacité de la réponse immunitaire. Plusieurs essais cliniques d’immunothérapies montrent que le système immunitaire peut être reprogrammé pour contrôler différentes tumeurs comme par exemple : des mélanomes métastatiques ou certains cancers du sein. Néanmoins, le taux de réponse objective à ces traitements demeure encore limité, et la composition de cellules immunitaires de la tumeur apparaît comme un biomarqueur prédictif majeur de l’efficacité thérapeutique. Ainsi, de nombreuses études précliniques suggèrent que l’efficacité de ces immunothérapies dépend principalement de la localisation intra-tumorale de cellules immunitaires, appelées cellules dendritiques qui ont pour rôle d’activer le système immunitaire. L’un des enjeux majeurs de l’immuno-oncologie est donc d’identifier des stratégies optimisant la fonction de ces cellules dendritiques au sein des tumeurs afin d’améliorer les immunothérapies. Nous avons identifié différents facteurs limitant la fonction des cellules dendritiques des tumeurs. Notre objectif est maintenant de déterminer si ces facteurs pourraient être des cibles thérapeutiques permettant de reprogrammer ces cellules dendritiques et d’induire une réponse immunitaire permettant le rejet des tumeurs et métastases. Ces études pré-cliniques chez la souris pourraient conduire au développement de nouvelles immunothérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera d’une part des connaissances fondamentales sur les signaux régissant la programmation des cellules dendritiques en condition physiologique. D’autre part, les connaissances générées par ce projet apporteront une meilleure compréhension des mécanismes empéchant le rejet des tumeurs par le système immunitaire et pourront contribuer, à terme, au développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie anticancéreuse.

Procédures

Pour ce projet il est envisagé que: - 360 souris recevront un traitement quotidien par voie intrapéritonéale d'environ 10 secondes pendant 3 à 4 jours- 360 souris seront irradiées et recevront une injection intraveineuse d'une durée maximale de 30 secondes- 240 souris recevront un traitement quotidien par voie intrapéritonéale d'environ 10 secondes pendant 3 à 4 jours, une injection intraveineuse d'une durée maximale de 30 secondes et une injection sous-cutanée d'une durée maximale de de 30 secondes - 240 souris seront irradiées et recevront deux injections intraveineuses d'une durée maximale de 30 secondes chacune, espacées de 3 semaines et une injection sous-cutanée d'une durée maximale de 30 secondes- 720 souris recevront un traitement quotidien par voie intrapéritonéale d'une durée de 10 secondes pendant 3 à 4 jours et une injection intraveineuse d'une durée maximale de 30 secondes- 1400 souris recevront un traitement quotidien par voie intrapéritonéale d'une durée de 10 secondes pendant 3 à 4 jours et une injection sous-cutanée de tumeurs d'une durée maximale de 1 minute- 180 recevront un traitement quotidien par voie intrapéritonéale d'une durée maximale de 10 secondes pendant 3 à 4 jours, une injection sous-cutanée de tumeurs puis 3 injections sous-cutanées - 720 souris seront irradiées et recevront deux injections intraveineuses espacées de 3 semaines et une injection sous-cutanée de tumeurs d'une durée maximale de 30 secondes- 1400 souris seront irradiées et recevront une injection intraveineuse d'une durée maximale de 30 secondes et une injection sous-cutanée de tumeurs d'une durée maximale de 1 minute- 120 souris recevront un traitement quotidien par voie intrapéritonéale d'une durée maximale de 10 secondes chacune pendant 3 à 4 jours et 2 injections sous-cutanée de tumeurs d'une durée maximale de 1 minute séparées de 6 à 8 semaines

Impact sur les animaux

Les tumeurs utilisées ne métastasent pas mais peuvent occasionner des modifications du comportement général (prise alimentaire et hydrique, posture, déplacements, interactions sociales, comportement de nidification), une perte de poids, des difficultés respiratoires, une augmentation du rythme respiratoire ainsi qu’une altération de la température corporelle. Les mêmes nuisances peuvent être observées suite à l’injection de molécules régulant la fonctions des cellules dendritiques. Certains modèles de mélanome utilisés dans ce projet peuvent présenter, à des stades avancés, des zones de nécrose non hémorragiques qui peuvent s'infecter. Une immunosuppression transitoire induite par l'irradiation peut rend les animaux plus susceptibles aux infections et des risques de diarrhées, amaigrissement, déshydrations et des changements de comportement (prostration, réduction des déplacements et des interactions sociales).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés soit pour prélèvement d'organe et analyse fonctionnelle du système immunitaire soit lorsqu'ils auront atteint le point limite

Remplacement

L’utilisation de modèles expérimentaux intégrés est essentielle à ce projet. En effet, la diversité cellulaire du stroma des tumeurs est encore peu connue ainsi que son organisation tridimensionnelle. Cette complexité n'est à ce jour pas reproduite fidèlement par les organoides ou organes sur puce. Ces paramètres ont un rôle clé dans le recrutement des cellules immunitaires et les interactions cellulaires (stroma- cellules immunitaires- cellule dendritique) essentielles à la programmation des cellules dendritiques, la question de ce projet. Par ailleurs, il n'existe à ce jour aucun modèle expérimental permettant de générer in vitro la diversité des sous-population de cellules dendritiques retrouvées dans différents tissus in vivo.

Réduction

L’ensemble des expériences est conçu de manière à réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la robustesse scientifique et statistique des résultats. Nos études préliminaires ont permis une maîtrise approfondie des modèles employés, permettant ainsi d’optimiser les effectifs expérimentaux. Les molécules dont l'action sur les cellules dendritiques seront sélectionnés sur la base de données expérimentales de notre équipe ainsi que de données de la littérature. Afin de prendre en compte les variations expérimentales et interindividuelles, tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés, les expériences seront réalisées sur des lots de 3 à 5 souris, chaque expérience étant répétée au minimum deux fois, et uniquement jusqu’à l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Seules les molécules montrant un effet lors du premier test seront testées dans les réplicatats expérimentaux.

Raffinement

Le bien-être animal, identifié comme un facteur potentiel de variabilité expérimentale, fait l’objet d’une attention particulière tout au long du projet. Les animaux sont suivis quotidiennement par les personnels de la zootechnie, et tous les deux à trois jours par l’expérimentateur après le début des procédures expérimentales, ou plus fréquemment si nécessaire. Toute modification du comportement général (prise alimentaire et hydrique, posture, déplacements, interactions sociales, comportement de nidification) fait l’objet d’une évaluation systématique et des mesures appropriées sont mise en oeuvre dès les pemiers signes cliniques observés. Toutes les procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie. Les animaux sont hébergés en conditions sanitaires controlées exemptes de pathogènes spécifiques, dans des portoirs ventilés, à raison de 5 souris/ cages de 500 cm² enrichi par la mise à disposition d'objets permettant de se faire un nid abrité. La nourriture et l’eau sont disponibles ad libitum. Une diffusion sonore contrôlée est assurée afin d'atténuér les bruits environnementaux. Les opérations de change et les expériences sont réalisées dans des conditions permettant de maintenir ce statut sanitaire afin de limiter les risques infectieux.

Choix des espèces

La possibilité de générer des modèles soit sur-exprimant soit déficient pour une molécule d’intérêt font des souris un modèle de choix pour mieux comprendre les interactions entre le système immunitaire et les tumeurs naissantes. Par ailleurs, les modèles murins pré-cliniques ont montré leur pertinence dans la découverte et le développement de nouvelles immunothérapies. En effet, le système immunitaire et ses régulations sont très similaires entre l'homme et la souris et les immunothérapies aujourd'hui utilisées en cliniques ont été découvertes et validées dans des modèles de souris. Des souris adultes de 6 à 16 semaines sont utilisées

Quarante séances de recharge par ultrasons et environ soixante-dix-sept passages au tube test étalés sur quatre-vingts semaines: 50 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit d'abord une sonde télémétrique implantée par chirurgie, puis subit des anesthésies répétées, des échographies et des tests comportementaux mesurant le statut social, le sursaut et l'anxiété. L'objectif déclaré est de valider un implant rechargeable sans fil pour un suivi cardiovasculaire de longue durée. Le porteur avance que ce dispositif "pourrait révolutionner" le suivi des patients, une perspective renvoyée à des applications cliniques futures.

Objectifs

L’utilisation de sondes implantables chez l’animal permet de mesurer les variations physiologiques chez l’animal vigile, offrant ainsi un suivi précis et non invasif de la dynamique cardiovasculaire et de ses fluctuations. Toutefois, ce type de dispositif est limité par la durée de vie des batteries, qui ne dépasse généralement pas quatre semaines. Or, dans le cadre de recherches nécessitant un suivi longitudinal des variables cardiovasculaires pour évaluer les modifications physiopathologiques à long terme, cette contrainte constitue un frein majeur car les dispositifs disponibles reposant sur des batteries à usage unique. Le développement d’un dispositif rechargeable sans fil représenterait donc un véritable atout. L’exploitation d’un phénomène physique tel que l’émission d’ultrasons pourrait offrir une solution innovante et durable pour recharger en toute innocuité des implants médicaux. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la faisabilité de l’implantation et de la recharge d’un tel dispositif chez le rongeur, ainsi que ses effets physiologiques et comportementaux, afin d’en caractériser et valider l’utilisation pour un suivi cardiovasculaire de longue durée. Un objectif secondaire consistera à étudier la réactivité et la résilience des rongeurs face aux stress sociaux, tout en explorant les corrélats neuronaux dans la régulation du système nerveux autonome à travers la réactivité des paramètres cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Le projet visant à utiliser des sondes de télémétrie rechargeables par ultrasons chez le rongeur présente de nombreux bénéfices importants potentiels pour la recherche biomédicale et les applications cliniques futures. 1. Amélioration de la durée de suivi Les dispositifs actuels de télémétrie sont limités par la durée de vie des batteries, généralement autour de quatre semaines. La recharge sans fil par ultrasons permet une surveillance continue sur une période prolongée, dépassant les limitations actuelles. Cela est particulièrement avantageux pour les études longitudinales nécessitant un suivi à long terme des variables cardiovasculaires. 2. Collecte de données de haute qualité (raffinement) En permettant un suivi continu et ininterrompu, ces sondes offrent une collecte de données plus complète et précise que les dispositifs externes. Les mesures en temps réel de la pression artérielle, de l'électrocardiogramme, de l'activité et de la température fourniront des informations détaillées sur la dynamique cardiovasculaire et les réponses physiologiques des animaux aux divers stimuli ou traitements. 3. Applications cliniques potentielles Les technologies développées et testées dans ce projet pourraient être transposées à des applications cliniques chez l'humain. Les dispositifs médicaux de types implants rechargeables par ultrasons pourraient révolutionner le suivi des patients sur le long terme et augmenter les capacités de mesures. 4. Avancées en recherche biomédicale La possibilité de suivre, sur le long terme et avec une grande précision, les changements physiopathologiques ouvriront de nouvelles perspectives pour la recherche biomédicale. Les chercheurs pourront ainsi approfondir la compréhension des mécanismes sous-jacents liant le stress aux maladies cardiovasculaires, notamment en explorant leurs interactions et comorbidités. 5. Efficacité et durabilité accrues Les dispositifs rechargeables par ultrasons représentent une avancée écologique en réduisant les déchets électroniques liés aux batteries jetables. De plus, l'efficacité de la recherche sera améliorée, avec moins de temps et de ressources nécessaires pour la maintenance des équipements.

Procédures

Chirurgie d’implantation d’une sonde télémétrique : 1 acte par animal, réalisé sous anesthésie gazeuse ; protocole opératoire standard avec incision minimale, implantation, fermeture en deux plans et surveillance post-opératoire. Séances de recharge du dispositif par ultrasons sous anesthésie gazeuse : environ 40 sur 80 semaines ; durée 10 à 20 minutes par session ; fréquence maximale attendue : une recharge toutes les deux semaines. Évaluations échographiques: environ 18 examens sur la période ; durée inférieure à 45 minutes par examen ; installation sur platine chauffante avec protection oculaire et gel ultrasonore, surveillance jusqu’au réveil complet. Jalons d’évaluations comportementales (statut social, réflexe de sursaut, anxiété) : environ 18 jalons sur la période ; paramètres et durées par test — Tube test : hebdomadaire à partir de la troisième semaine post-opératoire ; environ 77 sessions sur 80 semaines ; durée moyenne 30 secondes par essai (maximum 2 minutes), plusieurs essais par paire, ordre randomisé. Startle (réflexe de sursaut) : expositions sonores intense et brèves; enregistrement immédiat. Boîte claire/obscure: session de quelques minutes par jalon ; mesure du temps en zone claire et sombre et du nombre de transitions. Épreuves pharmacologiques de réactivité du système nerveux autonome : environ 12 sessions distinctes sur 80 semaines (environ une fois par trimestre pour deux composés) ; monitoring continu pendant 15 à 30 minutes après administration, puis retour en cage après réveil complet. Suivi longitudinal télémétrique : acquisitions de routine continues selon le calendrier expérimental ; collecte non invasive des paramètres (pression artérielle, ECG et variabilité, température, activité locomotrice).

Impact sur les animaux

1. Les chirurgies d’implantation des sondes télémétriques qui se feront sous anesthésie générale peuvent entraîner des douleurs post-opératoires légères à modérées, avec un impact limité dans le temps (quelques jours) sur le bien-être des animaux. 2. Anesthésie gazeuse : La manipulation des animaux et l’induction de l’anesthésie peuvent engendrer un stress léger. 3. Injection : Une douleur légère peut être ressentie au niveau du site d’injection.4. Tests comportementaux : Les tests comportementaux utilisés sont des tests classiques d’évaluation cognitive, sociale ou d’exploration, bien caractérisés dans la littérature. Bien que ces tests puissent générer un certain stress de manipulation, il est bien établi qu’ils n’induisent pas d’effets physiologiques indésirables immédiats ou à long terme. 5. Impact des sondes implantées Les sondes implantées peuvent provoquer une réaction immunitaire ou une irritation des tissus environnants, entraînant une inflammation chronique ou d'autres complications locales. Ces réactions peuvent affecter le bien-être des animaux et potentiellement altérer les données collectées.

Devenir

Les animaux ayant subi la chirurgie d’implantation d’un dispositif nécessitent une récupération post-mortem pour évaluer son impact sur les tissus environnants ; réalisation d’analyses histologiques et immunohistochimiques (examen des tissus cardiaques, vasculaires et cérébraux) ; impossibilité de réutilisation dans un autre protocole en raison des interventions subies.

Remplacement

Le remplacement des modèles animaux est un objectif central en recherche biomédicale. Toutefois, dans cette étude, l’utilisation de souris vivantes est indispensable, car aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire avec précision les interactions complexes entre le système nerveux autonome, le système cardiovasculaire et la réponse physiologique au dispositif implanté. Cependant, plusieurs alternatives ont été envisagées pour limiter l’utilisation des animaux : modélisation informatique et simulations physiologiques — avant les expérimentations in vivo, des simulations numériques sont utilisées pour optimiser les paramètres d’implantation et de recharge des sondes ; tests préliminaires sur tissus ex vivo — certaines validations techniques sont réalisées sur tissus cardiaques isolés avant l’expérimentation animale ; exploitation de données issues d’études précédentes — une revue approfondie de la littérature scientifique permet d’éviter toute duplication d’expérience déjà réalisée. Malgré ces approches, seul un modèle animal vivant permet d’évaluer de manière intégrée la dynamique cardiovasculaire et l’impact du dispositif sur le long terme, justifiant ainsi l’utilisation de souris dans ce projet.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique des résultats, plusieurs stratégies ont été mises en place : optimisation du nombre d’animaux — une analyse de puissance statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimal nécessaire, évitant ainsi toute utilisation excessive ; approche longitudinale — chaque souris servira à plusieurs analyses physiologiques et comportementales au cours du protocole, réduisant le besoin de multiplier les groupes expérimentaux ; phase d’optimisation préalable — des tests préliminaires seront effectués sur un nombre restreint d’animaux afin d’optimiser les procédures avant leur mise en œuvre à plus grande échelle ; exploration de plusieurs paramètres chez un même individu — l’utilisation de sondes télémétriques multi-paramétriques permet d’obtenir plusieurs types de mesures (ECG, pression artérielle, température, activité) à partir du même animal. Grâce à ces méthodes, cette étude respecte le principe de réduction, garantissant une utilisation responsable des animaux tout en assurant des résultats fiables et exploitables.

Raffinement

Le projet intègre des mesures strictes pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout en garantissant des résultats expérimentaux fiables : amélioration du bien-être animal — hébergement en groupe pour éviter l’isolement sauf nécessité médicale ; enrichissement du milieu avec matériaux de nidification, tunnels et abris pour favoriser les comportements naturels ; période d’habituation de 7 jours avant toute intervention pour réduire le stress lié aux manipulations ; optimisation des procédures chirurgicales et post-opératoires — chirurgie réalisée par des expérimentateurs formés afin de minimiser la durée d’intervention et le risque de complications ; utilisation d’une anesthésie générale gazeuse, plus douce et offrant une récupération rapide ; administration d’analgésiques et d’anti-inflammatoires avant, pendant et après la chirurgie pour limiter la douleur ; surveillance post-opératoire rapprochée (48 heures) avec critères stricts pour évaluer la récupération des animaux ; réduction du stress lié aux manipulations — entraînement progressif aux manipulations expérimentales pour limiter les réactions de peur ; utilisation de techniques de contention douce réduisant l’impact des interventions répétées ; recharge des sondes sous anesthésie gazeuse légère, évitant tout inconfort prolongé ; optimisation des tests comportementaux et physiologiques — tests éthologiques réalisés dans un environnement familier pour limiter le stress expérimental ; utilisation de mesures télémétriques pour un suivi en continu, évitant des manipulations invasives répétées ; critères d’arrêt éthique stricts pour interrompre toute procédure en cas de détresse excessive. Ces stratégies assurent une approche éthique et responsable, garantissant le bien-être des animaux tout en maintenant la qualité scientifique des données collectées.

Choix des espèces

L’espèce (souris) a été sélectionnée pour cette étude en raison de sa pertinence scientifique et expérimentale. Les souris sont couramment utilisées en recherche biomédicale en raison de leur homologie génétique élevée avec l’humain, de leur taille réduite facilitant la gestion expérimentale, et de leur cycle de reproduction court, permettant des études longitudinales efficaces. De plus, l’existence de modèles génétiquement modifiés et d’outils avancés, tels que la télémétrie, en fait une espèce idéale pour le suivi des variables cardiovasculaires en conditions chroniques. Leur système cardiovasculaire et nerveux autonome présente des similitudes avec celui des humains, ce qui permet d’étudier avec précision l’impact de la télémétrie rechargeable par ultrasons sur les paramètres physiologiques. Les animaux utilisés dans cette étude seront des souris jeunes adultes âgées de 7 semaines ou plus au moment du début des expérimentations. Ce choix est justifié par plusieurs facteurs scientifiques et expérimentaux : 1. Maturité physiologique : À cet âge, le système cardiovasculaire, nerveux et immunitaire est pleinement développé, garantissant une réponse physiologique stable et représentative des mécanismes étudiés. 2. Tolérance aux interventions : Les souris jeunes adultes présentent une meilleure récupération post-chirurgicale et une plus grande résistance au stress expérimental par rapport aux individus plus âgés ou immatures. 3. Comparabilité avec les études existantes : L’âge choisi correspond aux standards des études précliniques utilisant des modèles murins pour l’évaluation des dispositifs médicaux et des réponses cardiovasculaires. 4. Réduction des biais développementaux : L’utilisation de souris à un stade adulte permet de limiter les variations liées à la croissance et d’assurer des résultats plus homogènes. Ainsi, cet âge permet d’optimiser la qualité des données recueillies tout en garantissant le bien-être des animaux conformément aux principes éthiques en vigueur.

2608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection reproduisant une infection bactérienne, qui déclenche un état proche du choc septique humain, avec isolement, faiblesses locomotrices, perte de poids et hypothermie dans les heures précédant la mise à mort. D'autres subissent des prélèvements sanguins par voie rétro-orbitale, dont un prélèvement terminal, pour récupérer leurs neutrophiles. Le porteur précise n'utiliser que des mâles, afin d'écarter la variabilité liée au cycle des femelles.

Objectifs

Le sepsis est une pathologie grave caractérisée par une réponse inflammatoire généralisée consécutive à une infection non contrôlée, responsable de plus de 11 millions de décès par an dans le monde. Malgré la mise en œuvre de recommandations internationales, les progrès médicaux et les milliards investis chaque année, le traitement du sepsis reste essentiellement symptomatique, en raison d’une compréhension encore incomplète des mécanismes impliqués. Les neutrophiles, acteurs centraux du système immunitaire, constituent la première ligne de défense contre les infections. Ils ont la capacité de se déplacer rapidement vers les sites infectieux, d’ingérer les agents pathogènes et de libérer des substances toxiques pour les détruire. Plus récemment, il a été montré que les neutrophiles peuvent également produire des pièges extracellulaires constitués de leur propre ADN associé à des composés microbicides, capables de capturer et de tuer les pathogènes. Ce mécanisme est essentiel pour contrôler la propagation des infections. Lors d’un sepsis, les fonctions des neutrophiles sont profondément perturbées, ce qui contribue à l’aggravation de l’état clinique. Ils ne se développent pas correctement, se déplacent moins efficacement et produisent en excès des substances toxiques et des pièges extracellulaires. Ces mécanismes, normalement protecteurs, deviennent alors délétères : ils aggravent les lésions des organes et augmentent le risque de mortalité. La complexité du sepsis, impliquant des interactions entre cellules immunitaires, vaisseaux sanguins, coagulation et organes, ne peut être reproduite fidèlement in vitro. Les modèles animaux, notamment murins, permettent de reproduire les principales caractéristiques du sepsis humain et restent nécessaires pour évaluer l’effet de candidats traitements dans un organisme vivant. Notre laboratoire a démontré le bénéfice de certains candidats thérapeutiques sur la survie et l’état clinique d’animaux septiques, souvent associé à une modulation de l’activité des neutrophiles. Nous cherchons désormais à mieux comprendre les mécanismes responsables de la dérégulation des neutrophiles au cours du sepsis et l’impact de différents candidats traitements.

Bénéfices attendus

La dysfonction des neutrophiles au cours du sepsis est décrite comme un phénomène aggravant les symptômes et contribuant à la sévérité de la maladie chez les patients septiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer l’effet de différents candidats traitements sur différentes fonctions des neutrophiles dans le contexte du sepsis, afin d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles d’améliorer la prise en charge de cette pathologie.

Procédures

Une partie des animaux inclus dans cette étude pourra subir une ou plusieurs injections de molécules thérapeutiques avant la mise à mort. Les nuisances associées à ces procédures sont considérées comme légères, car elles n’entraînent que le stress lié à la manipulation des animaux et une douleur limitée à celle induite par l’introduction d’une aiguille, sans douleur persistante. Certains de ces animaux pourront également faire l’objet de prélèvements sanguins, notamment par voie rétro-orbitale. Dans ce cas, une anesthésie locale sera systématiquement mise en place, en complément de l’anesthésie générale, afin d’éviter toute douleur inutile lors du prélèvement. Par ailleurs, certains animaux recevront une injection permettant de mimer une infection bactérienne, induisant des symptômes proches de ceux observés lors du sepsis humain, sur une durée maximale de 48 heures avant l’euthanasie. Ces animaux recevront un analgésique systémique permettant d’éviter toute souffrance inutile. Au cours de cette études les animaux pourront recevoir jusqu’à 2 injections (l’injection d’une solution se fait en moins de 5 min) et pourront subir jusqu’à 3 prélèvements sanguins dont un terminal juste avant l’euthanasie (le temps de manipulation des animaux pour ces prélèvements et également estimé à 5 min). Ces prélèvements seront espacés d’au moins 6 heures.

Impact sur les animaux

Une partie importante du projet sera réalisée sur des animaux sains, afin d’obtenir des neutrophiles matures et pleinement fonctionnels. Ces animaux ne seront soumis qu’aux manipulations nécessaires à l’euthanasie et, éventuellement, à une injection sous-cutanée réalisée environ deux heures avant celle-ci, dans le but d’augmenter la concentration de neutrophiles circulants. Ces interventions sont considérées comme faiblement invasives et génèrent un stress limité et transitoire. L’autre partie du projet sera effectuée sur des animaux traités par une injection intrapéritonéale (i.p.) d’une molécule permettant de mimer une infection bactérienne, administrée 24 heures avant les prélèvements, afin de reproduire un état physiopathologique proche du choc septique humain. Les animaux développent certains des signes cliniques se rapprochant du sepsis humain : modification du comportement (isolement), altération de l’état général (faiblesses locomotrices), perte de poids et hypothermie. Dans l’ensemble des protocoles, les manipulations nécessaires (capture, contention, injection de molécules, prélèvements sanguins, anesthésie à l’isoflurane) sont susceptibles d’engendrer un stress temporaire pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure

Remplacement

La dysfonction des neutrophiles au cours du sepsis résulte d’une dérégulation systémique du système immunitaire. Par exemple, la molécule, que nous utilisons pour induire un choc endotoxinique chez les animaux, provoque in vivo une augmentation significative de la production de pièges extracellulaires, alors que cette même molécule n’en induit aucun mesurable in vitro. Ces dysfonctions résultent de mécanismes complexes, dépendant de l’activation simultanée de multiples populations cellulaires immunitaires et non immunitaires, et demeure difficile à reproduire fidèlement in vitro. Le remplacement des neutrophiles primaires par des lignées cellulaires n’est pas envisageable dans ce contexte. Bien que certaines lignées myéloïdes différenciées présentent des similarités avec les neutrophiles, elles demeurent imparfaites, ne reproduisant pas de manière fiable le comportement de neutrophiles primaires dans l’organisme. L’utilisation de neutrophiles primaires isolés à partir d’animaux reste donc nécessaire pour évaluer l’effet des traitements dans un contexte physiopathologique pertinent.

Réduction

Pour les études in vitro, la collecte d’un nombre suffisant de neutrophiles nécessite l’utilisation de plusieurs animaux, car la proportion de neutrophiles circulants chez la souris est naturellement faible, ce qui limite la quantité de cellules obtenues pour les différentes conditions expérimentales. Afin de pallier cette contrainte, nous avons récemment mis en place, sur la base de données issues de la littérature, un prétraitement des animaux par une molécule mobilisant les neutrophiles de la moelle osseuse vers le sang périphérique en quelques heures. Ce prétraitement, consistant en une unique injection par voie sous-cutanée, permet d’augmenter significativement le nombre de neutrophiles récupérés et ainsi de réduire de manière importante le nombre d’animaux nécessaires par expérience. Pour les études in vivo, le nombre d’animaux utilisés a été défini à partir des résultats préliminaires déjà obtenus au sein du laboratoire, où la dérégulation des neutrophiles est de plus en plus étudiée. Cette approche permettra d’éviter les répétitions inutiles et de limiter le nombre d’animaux aux effectifs strictement nécessaires à la validation statistique des résultats . Parallèlement, les organes et tissus prélevés sur les animaux sains ou septiques seront mutualisés et utilisés pour d’autres projets en cours au sein du laboratoire, afin d’optimiser l’utilisation de chaque individu et éviter toute expérimentation redondante.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au bien-être animal à travers un suivi régulier des animaux et ce afin de déceler tout excès de douleur, ce qui introduirait un biais dans nos recherches. Plus particulièrement chez les animaux septiques, le bien-être sera mesuré en évaluant les 5 paramètres standardisés suivants, afin de déterminer un score global sur 20 (chaque paramètre étant noté de 0 à 4) : le suivi de l’état physique, du comportement et des sécrétions seront réalisées par un examen visuel. Cette surveillance commencera dès 6h suivant l’induction du modèle de sepsis et sera renouvelé à 16h puis toutes les 8h. Le suivi du poids de l’animal sera réalisé à l’aide d’une balance et le suivi de la température sera réalisée à l’aide d’un thermomètre rectal pour souris. Les animaux ne devront pas atteindre un score global≥17 pour les paramètres standardisés. Ce score est prédictif d’un risque de décès élevé sous 4 heures et de dysfonctions d’organes généralisées. Ces critères seront résumés sous forme d’un tableau et ont été définis à partir des données de la littérature. Les animaux seront placés dans une armoire ventilée dont la pression et la température sont contrôlables. Les animaux septiques étant hypothermiques, la température de l’armoire sera augmentée de 3 degrés par rapport à la température standard de l’animalerie, afin de facilité la régulation de la température de ces animaux (les animaux contrôles seront hébergés dans les mêmes conditions). Ils auront un accès constant à l’eau, à la nourriture, au matériel pour leur nid et à des activités de jeu. Aucun rongeur ne sera seul, sauf en cas d’agressivité ou de soins particuliers. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anésthésie générale à l’isoflurane pour la voie intracardique et sous anesthésie générale à l’isoflurane avec l’addition 2 minutes avant le prélèvement d’un collyre anésthésique en locale au niveau de l’œil.

Choix des espèces

L’étude du sepsis, à travers l’utilisation de souris comme modèle animal, a fait l’objet de plus de 10 000 publications au cours des 40 dernières années. Utiliser la souris facilitera la mise en perspective de nos résultats. Un large éventail de techniques sont adaptées au modèle souris pour étudier différents paramètres et mécanismes, dont celles décrites dans cette saisine. Les souris auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation, soit l’âge de leur maturité sexuelle (naissance > 1 mois). Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois prépubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu. Nous avons choisi de travailler avec des souris mâles, afin de nous affranchir du cycle oestrien des femelles, qui peut induire de la variabilité dans nos résultats et modifier notre interprétation.

4 648 rats porteurs du gène humain HLA-B27, qui développent spontanément une spondylarthrite, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. La majorité sert à l'élevage des lignées, les autres subissent un stress par immobilisation deux heures par jour pendant deux semaines, des administrations de composés bactériens ou des injections de cellules immunitaires. Le porteur indique que ces rats développent colite, inflammation articulaire et atteintes de la peau, avec un antalgique prévu au-delà d'un score articulaire de 8 sur 16. Il affirme que ce modèle est le seul à reproduire toutes les atteintes de la maladie et le juge "indispensable".

Objectifs

La Spondyloarthrite (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent au sein de la population adulte française. Le gène d’intérêt est fortement associé au développement de SpA et constitue le facteur génétique principal multipliant le risque de développer cette maladie par 40. Malgré une association démontrée il y a plus de 50 ans, les raisons pour lesquelles ce gène confère cette prédisposition sont encore peu connues. L’identification des mécanismes impliqués dans l’association gène/maladie est importante car la SpA est une maladie fréquente, touchant 0,45% de la population adulte en France. De manière importante, il n’existe aucun traitement curatif, seulement des thérapies ralentissant la progression de l’état inflammatoire et de la maladie. Les modèles in vitro ne permettent pas d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques lors de la SpA car ils ne récapitulent pas la complexité d’un organisme. Ainsi, l’étude du rat transgénique pour ce gène constitue le seul modèle récapitulant toutes les atteintes de la SpA et est considéré comme le modèle le plus pertinent d’étude. Dans ce modèle surviennent spontanément toutes les manifestations de la SpA : une inflammation articulaire chronique, une inflammation intestinale et des atteintes inflammatoires de la peau et des griffes. Le développement de ces symptômes cliniques nécessite une flore microbienne conventionnelle, ainsi ces rats élevés en condition stérile ne développent pas de SpA. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer l’influence des constituants du microbiote intestinal sur l’activation des cellules du système immunitaire du rat conduisant au développement de la SpA et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Une meilleure compréhension du rôle pathogène des composants du microbiote et des cellules immunitaires pourra conduire à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos expériences consisteront d’abord à administrer des composants du microbiote à des rats ainsi qu’à des rats contrôles puis à évaluer l’activation des cellules immunitaires et la sévérité de la SpA. L’ensemble de ces approches permettra de disséquer les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal et ses composants influencent l’activation des cellules immunitaires au cours de la SpA, dans l’objectif final d’identifier et tester de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

La SpA est une maladie multifactorielle impliquant des facteurs génétiques et environnementaux menant à une dérégulation inflammatoire. La SpA est responsable de douleurs invalidantes et d’un handicap fonctionnel chez des jeunes adultes et il n’existe aucun traitement curatif. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires liés aux constituants du microbiote permettra de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. L’utilisation de ce modèle est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques et de pouvoir accéder aux tissus d’intérêt de la SpA, car l’accès en routine aux biopsies humaines (notamment de ganglions lymphatiques, de moelle osseuse ou de tissu synovial d’articulations inflammées) n’est pas envisageable. Par ailleurs, les expérimentations de modifications du microbiote ou du système immunitaire doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Enfin, de telles expérimentations ont permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques telles qu’un médiateur soluble produit par les cellules immunitaires aujourd’hui utilisé en clinique.

Procédures

Les différentes lignées de rats seront élevées et maintenues lors de la procédure 1(3 600 animaux). Le projet s’articule ensuite selon 4 procédures indépendantes avec un animal n’étant impliqué que dans une seule de ces 4 procédures. Lors de la procédure 2, les animaux seront soumis à un stress contrôlé par immobilisation 2 heures par jour, 5 jours par semaine pendant 2 semaines. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 144 animaux. Lors de la procédure 3, les animaux recevront plusieurs administrations de composés bactériens, 5 fois par semaines pendant 3 semaines par voie orale. En cas d’échec de la voie oral, les animaux seront soumis à deux administrations de composés bactériens en 1 seul jour par voie sous-cutanée ou intradermiques. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 360 animaux. Lors de la procédure 4, les animaux seront soumis à une injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 384 animaux. Enfin, lors de la procédure 5, les animaux seront administrés avec des agents biologiques et chimiques (candidats thérapeutiques) par infusion continue en utilisant des pompes osmotiques. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 160 animaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent les rats qui développent de manière spontanée les symptômes de la SpA à partir de 3-4 semaines d’âge. Le premier symptôme est la survenue d’une inflammation intestinale se traduisant par une colite qui sera accompagnée dans 15% des cas par des atteintes articulaires. Ces inflammations articulaires varient au cours du temps et certaines se résorbent sur le temps (environ 20% des cas). Les animaux seront suivis pour le développement de ces symptômes à l’aide d’une grille d’évaluation (annexe 2) utilisée dans plusieurs laboratoires permettant de quantifier la sévérité de la maladie et la nécessite si la maladie est très sévère d’mettre à mort l’animal. Depuis plus de 20 ans d’utilisation de ce modèle un nombre presque nul d’animaux a atteint ce stade de sévérité. La procédure de stress (procédure 2) vise à augmenter l’incidence d’arthrite chez ces animaux mais de nombreuses études montrent que ce stress induit est seulement temporaire. Enfin les administrations par voie orale sous-cutanée ou intradermiques présenteront un léger inconfort aux animaux le plus souvent associé à la contention de l’animal. En cas de douleur, un traitement antalgique par voie sous-cutanée sera mis en place.

Devenir

A l'issue des procédures 1 à 5, les animaux seront euthanaisés.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant l’étude de la SpA, une pathologie qui est responsable de douleurs invalidantes et d’un handicap fonctionnel chez des jeunes adultes. De manière importante, Il n’existe aucun traitement curatif. De plus, l’étiologie de la SpA est encore mal connue, mais pourrait être la résultante de la dérégulation de plusieurs composantes (microbiote intestinal et cellules immunitaires). Les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire cette complexité. Ainsi, l’étude de l’interaction entre ces différentes composantes impliquées nécessite un modèle animal. Dans ce contexte, plusieurs modèles précliniques de SpA ont été développés. Parmi eux, le rat B27 est le modèle le plus pertinent pour étudier cette pathologie associée à l’expression de l’allèle de susceptibilité majeur de la SpA : le HLA-B27. Ce modèle, particulièrement utilisé, est indispensable pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques et une application chez l’homme. En outre, de telles expérimentations ont permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques telles que l’IL-17 (maintenant utilisé en clinique) et plus récemment CCR6.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est strictement limité tout en garantissant la robustesse statistique des résultats afin de respecter le principe de réduction. Plusieurs test préalables nous permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet significatif. Le nombre d’animaux par groupe varie selon le type d’expérience. Tandis que des effectifs réduits (environ 4 animaux) peuvent suffire pour des analyses moléculaires et tissulaires ; des évaluations fonctionnelles sur le développement et la sévérité de la SpA nécessitent des effectifs plus élevés (environ 6 à 8 animaux par groupe), pouvant être ajustés si nécessaire. Une expérience de mise au point du système expérimental permet aussi ensuite de réduire le nombre d’animaux utilisés ensuite (procédure 3). Ce projet s’inscrit dans la continuité de nos travaux antérieurs au laboratoire, ainsi que de projets similaires menés dans d’autres établissements. Lorsque cela est possible et compatible avec les exigences règlementaires, les animaux proviennent d’élevages issus de notre projet précédent, limitant ainsi l’acquisition de nouveaux animaux spécifiquement pour cette étude. Des animaux initialement utilises pour la caractérisation de lignées et génotypes pourront ainsi être inclus ultérieurement dans des procédures de stress ou d’administration (procédure 2 à 5). De même, des animaux reproducteurs vieillissants pourront être réaffectés lorsque cela est scientifiquement et éthiquement justifié. Enfin, les analyses seront faites à la fin de chacune des expériences et permettront le cas échéant de ne pas effectuer une expérience supplémentaire si la significativité est atteinte.

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement sont mises en oeuvre pour garantir le bien-être des animaux tout au long du protocole. Lors de la procédure d’élevage utilisant des rates transgéniques B27, l’alimentation sera supplémentée en fromage pour les femelles gestantes leur permettant une alimentation plus riche lors de cette période afin de mieux nourir les petits. Après chaque séance de stress contrôlé, les rats seront retournés dans leur cage respective avec 1 autre rat pour permettre de réduire le stress de la contention. Pour les administrations intraveineuses, les animaux seront anesthésiés avant l’injection afin de diminuer le stress et la douleur liées à la procédure. L’anesthésique utilisé sera l’isoflurane par voie inhalée. Pour le confort des animaux, les rats ne seront pas isolés mais le nombre d’animaux sera de 2 à 3 par cage suivant leur poids et les changes des cages seront plus fréquents (2 fois par semaine) chez les animaux malades. Pour l’administration par voie orale de composés du microbiote, nous utiliserons une canule en plastique adaptée à l’animal et à son poids, afin de diminuer la douleur liée à la procédure. Le geste sera réalisé par des personnes entraînées à cette technique. Pour limiter le stress après administration de composés du microbiote, les animaux seront maintenus en cage par groupe expérimental respectif, 2 ou 3 animaux par cage. Les changes des cages seront plus fréquents chez les animaux dont l'inflammation intestinale est importante. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel compétent, permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou d’inconfort. Ces observations sont effectuées par le personnel de zootechnie, par le vétérinaire lors des contrôles réguliers et par les expérimentateurs. Nous utiliserons un tableau de scoring hebdomadaire permettant d’évaluer la sévérité des symptômes (annexe 2). L'administration d'un médicament analgésique (Butorphanol par voie sous-cutanée 1 fois par jour pendant 1 semaine) est prévue pour limiter les douleurs liées à la SpA chez les rats qui présentent une inflammation articulaire forte mais qui n'ont pas atteint le point limite (score articulaire supérieure à 8/16). En cas de présence d’arthrites, l’alimentation humidifiée avec de l’eau sera mise à disposition dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est le rat, en raison de sa pertinence préclinique et de son adéquation expérimentale mimant les formes axiales et périphériques de la SpA. Les atouts sont la survenue spontanée de la maladie chez les rats B27 possédant le facteur génétique majeur de prédisposition à la SpA, et la disponibilité de plusieurs lignées génétiquement modifiées. Les lignées de rats B27 utilisées sont complémentaires et permettent d’évaluer l’efficacité des traitements en fonction des atteintes cliniques. Les analyses cellulaires, moléculaires, histologiques et cliniques permettent d’appréhender le bénéfice fonctionnel global, tout en respectant les principes des 3R. Ainsi, l’utilisation des rats B27 est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques de la SpA. Par ailleurs, les expérimentations de modulation du microbiote ou du système immunitaire doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Les animaux utilisés dans ce projet seront des rats à différents stades de développement allant de 3 semaines d’âge (correspondant au sevrage et au stade prémorbide chez le rat B27) à l’adulte. Ce choix permet d’évaluer le rôle du stress (procédure 2), des composant du microbiote (procédure 3) et de cellules immunitaires purifiées (procédure 4) et de composés thérapeutiques candidats (procédure 5) lors du développement de la SpA du rat B27. Quelques expériences de caractérisation de nos lignées utiliseront des femelles gestantes (n=10 sur 5 ans). Cette saisine inclue une procédure d’entretien des lignées (procédure 1) nécessitant des rats adultes âgés de 2 à 6 mois. Ces âges correspondent à la période de fertilité de ces animaux en laboratoire.