Recherche fondamentale

115 souris femelles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tumeurs. Chaque animal reçoit sous anesthésie deux greffes de cellules cancéreuses humaines du foie, une par flanc, puis des injections de molécules empêchant les cellules tumorales de réparer leur ADN. Le projet reste préliminaire et emploie des billes non radioactives, en amont d'une étude ultérieure avec les billes radioactives de la radiothérapie interne. Les bénéfices annoncés pour les patients restent suspendus à ces résultats et à un éventuel passage chez l'être humain.

Objectifs

Aujourd’hui, le cancer du foie est le troisième cancer qui cause le plus de décès. Un des traitements utilisés s’appelle la radiothérapie interne. Il consiste à envoyer de toutes petites billes dans le corps, qui contiennent une substance radioactive. Ces billes détruisent spécifiquement les cellules du cancer en abîmant leur ADN. Ce traitement fonctionne souvent mieux que d’autres, surtout quand le cancer est avancé. Mais il ne marche pas toujours : environ 3 personnes sur 10 ont un cancer qui résiste à ce traitement. Cela peut être parce que les cellules arrivent à réparer leur ADN. Le but de ce projet est de tester de nouvelles substances qui empêchent les cellules de réparer leur ADN, pour rendre le traitement plus efficace. Pour cela, nous implanterons des cellules de cancer du foie sous la peau des souris pour former une tumeur, afin de tester ces nouvelles substances pour voir si elles ralentissent la croissance du cancer. Ces tests sont des manipulations préliminaires, nous utiliserons des billes non radioactives pour comprendre leurs effets associés aux substances avant d’utiliser les vraies billes (lors d’une prochaine étude).

Bénéfices attendus

Nous avons déjà obtenu de bons résultats en laboratoire, sur des cellules tumorales cultivées sur des plaques en plastique en combinant ces billes avec des substances qui empêchent les cellules de réparer leur ADN. Maintenant, nous voulons tester cela chez la souris. Pour cela, nous injecterons des cellules cancéreuses sous la peau des souris pour créer une tumeur. Les cellules tumorales cultivées sur du plastique sont plus simples à utiliser, mais ça ne représente pas vraiment ce qui se passe dans un vrai corps. Par exemple, les cellules poussent à plat et ne sont pas en contact avec le reste d’un organisme. Avec les souris, c’est plus proche de la réalité, car les cellules vivent dans un vrai corps. Cela permet de mieux tester les traitements. Si les résultats sont bons et que les tumeurs diminuent, cela pourrait aider à améliorer les traitements chez les humains et à traiter plus de personnes.

Procédures

On réalise deux injections sous la peau de souris femelles adultes sous anesthésie (1 injection sur chaque flanc de l'animal), de cellules cancéreuses humaines de foie. Les cellules vont s’implanter à l’endroit de l’injection et commencer à croître. Cette injection dure moins de 30 secondes. La taille des tumeurs va être suivie par mesure régulière à l'aide d'un pied à coulisse électronique (appareil permettant de mesurer le diamètre de la tumeur de l’extérieur de la souris). L’ensemble des souris seront alors évaluées 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs (les lundis, mercredis et vendredis). Ensuite, une injection dans le ventre est effectuée afin d’administrer les molécules qui empêchent la réparation de l’ADN. Cette injection dure également moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

(1) Un stress physique serait une nuisance induite par l’anesthésie lors de l’injection des cellules tumorales humaines sous la peau des souris et lors de l’injection des billes non radioactives et/ou des molécules qui empêchent la réparation de l’ADN dans l’abdomen des animaux, (2) Une douleur modérée peut être engendrée par la croissance des tumeurs sous-cutanées. Les animaux ne subissent pas d'autres stress ou douleurs dans ce projet.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les tissus cancéreux seront prélevés pour analyses post mortem.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu des caractéristiques offertes par ce modèle (développement de vaisseaux entre la tumeur et le reste d’un organisme vivant, mode d’injection des molécules) impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant à travailler à l'échelle d'un organisme entier.

Réduction

Dans le but de répondre à la loi des 3R (Réduire), nous avons sélectionné dans cette étude préliminaire, deux types de cellules tumorales grâce aux résultats obtenus sur les cellules tumorales cultivées dans des boîtes en plastique. Nous avons également déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Dans le but de réduire le nombre d'animaux par groupe, chaque souris sera implantée de cellules tumorales issues d’un type de cellules tumorales commercialisées sur chaque flanc (droit et gauche) de la souris.

Raffinement

Les souris vivent par groupes de 5 dans des cages adaptées à leur taille. Leurs cages ont un système spécial avec de l’air propre pour éviter qu’ils attrapent des microbes. Leur nourriture est aussi protégée pour rester propre. Les souris seront observées 3 fois par semaine (le lundi, le mercredi et le vendredi) pour vérifier qu’elles vont bien, en regardant leur apparence, leur masse et leur comportement. 4 fois par an, on vérifie aussi que leur environnement est sain et sans microbes. Pendant l’expérience, on leur donne des objets comme du coton pour faire leur nid et des tubes colorés. Ces objets enrichissent leur milieu en les aidant à se sentir bien et permettent aussi de les manipuler sans induire un stress inutile. Lors d’une manipulation, les animaux sont endormis pour ne pas avoir mal et pour éviter qu’ils stressent. Si un animal a mal ensuite, on peut lui donner un médicament (analgésique) pour le soulager. Les chercheurs surveillent attentivement les animaux pour repérer rapidement s’ils ne vont pas bien, grâce à une liste de signes précis. Enfin, les animaux sont manipulés régulièrement pour qu’ils s’habituent au contact humain et soient moins stressés.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour nos expériences. Cela permet de mettre des cellules cancéreuses humaines sous la peau de la souris sans que son corps ne les rejette. La souris est aussi pratique car elle est petite et les tumeurs y grandissent rapidement. Travailler seulement avec des cellules cultivées sur des plaques de plastique ne suffit pas, car cela ne montre pas comment une tumeur fonctionne et répond à un traitement dans un organisme vivant. Avec la souris, on peut observer la tumeur dans un environnement vivant, ce qui est plus réaliste. Nous utiliserons des souris femelles adultes âgées de 6 semaines. Elles sont déjà assez grandes pour commencer les expériences et cela permet qu’elles restent au même stade pendant toute l’étude. Après leur arrivée, les souris s’adaptent à leur milieu pendant 4 jours pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, nous leur injecterons des cellules cancéreuses, nous suivrons la croissance de la tumeur, puis nous testerons les traitements.

Nourris à la pipette dès deux jours de vie, sensibilisés chaque semaine pendant six semaines par un patch sur le dos rasé, les souriceaux issus de la reproduction sont ensuite tués pour prélèvement de tissus. Au total 530 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les mères tuées au sevrage et les mâles reproducteurs à la fin de la reproduction. Le projet cherche à savoir si un additif alimentaire déjà présent dans des produits ultra-transformés favorise l'allergie à la noisette chez le nouveau-né. Le porteur affirme que le modèle in vivo est "actuellement le seul adapté" pour reproduire la réponse allergique.

Objectifs

Le projet vise à identifier comment un additif alimentaire incorporé dans les formulations alimentaires pour équilibrer l’apport en phosphate et calcium, peut conduire à des désordres immunitaires via sa capacité à stimuler le système immunitaire et/ou son affinité pour des protéines identifiées comme allergène. Il peut aussi potentiellement modifier le microbiote intestinal et fragiliser la barrière intestinale. L’augmentation de la prévalence des allergies alimentaires observée depuis une vingtaine d’année coïncide avec l’augmentation de la consommation d’aliments ultra-transformés. Parmi les aliments ultratransformés, on trouve ceux contenant des additifs alimentaires, dont le risque de déclencher des réactions allergiques commence à être évoqué. Ils ont une grande capacité de couplage avec des allergènes. Ces mélanges peuvent à la fois favoriser l’exposition des allergènes dans le corps et interagir avec le système immunitaire en impactant la réponse immunitaire du corps. La consommation de l'additif s’établit donc dès les premiers jours de vie, jusqu’à la diversification alimentaire. Notre question est donc : est-ce que la consommation chronique de l’additif alimentaire a un potentiel effet stimulant du système immunitaire chez le nouveau-né et favorise le développement d’une allergie lors de l’étape de diversification alimentaire ? L’allergène choisi est la noisette.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme d’action d’un additif alimentaire sur le développement d’une allergie alimentaire à la noisette. Par la comparaison des différents paramètres mesurés, le protocole répondra à l’hypothèse formulée suivant la bibliographie, à savoir : l'additif consommé chroniquement participe à la sensibilisation et au déclenchement de l’allergie alimentaire en favorisant l’exposition des allergènes et/ou limitant la dégradabilité des allergènes lors de la digestion. Ce mécanisme est basé sur les grandes capacités de mélange entre l'additif et les allergènes.

Procédures

Les souris issues de reproduction : les fèces seront récoltées 1 fois par avant la première sensibilisation et 1 fois la veille de la mise à mort. Le tétage à la pipette sera effectué chaque jour à partir de 2 jours de vie jusqu’à 21 jours de vie et une fois lors de la mise à mort. Les souris seront sensibilisées 1 fois par semaine sous anesthésie pendant 6 semaines à partir de 3 semaines de vie. Les femelles gestantes seront pesées tous les deux jours.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes seront pesées plusieurs fois par semaine afin de confirmer la gestation par la prise de poids. La pesée peut occasionner un stress chez la souris par la répétition de la pesée. Ce stress est limité par une pesée rapide effectuée par une personne exercée et avec un tube pour éviter la contention. De plus, il est possible que les souris aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués : les méthodes de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances en raison de la répétabilité des gestes (1 fois par semaine pendant 6 semaines) mais aussi de par la présence d’un patch sur le dos, des démangeaisons dues au rasage et des irritations dues au patch. Enfin, les souris peuvent exprimer de l’inconfort liés aux symptômes à la mise en place de l’allergie provoqués par l’administration de l’allergène (tremblements, chute de la température corporelle, douleurs stomacales), également par les anesthésies gazeuses répétées. Le tétage répété peut occasionner du stress chez la mère et ses petits.

Devenir

A la fin de la procédure, les souris issues de la reproduction seront mis à mort afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et de la fonction gastro-intestinale. Les souris femelles reproductrices seront mises à mort au sevrage de leur descendance et les souris mâles reproducteurs seront mis à mort à la fin de la reproduction.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de la réponse allergique, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.

Réduction

Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les molécules d'intérêt dans l'allergie conduit à utiliser des groupes de 12 souris chacun. Dans la mesure où cette étude pourrait générer une alerte en santé publique, nous avons des groupes de 12 animaux. Le protocole est répété une seconde fois pour analyser d'autres paramètres de l'allergie par rapport au premier.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation soient exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permettent de minimiser l'inconfort et la douleur. Dans le cadre du projet, une gestation compliquée peut être observée. Elle pourra conduire à une mise à mort en fonction du tableau des points limites. Il est aussi possible d’observer une mise bas problématique (ex : cannibalisme). Dans ce cas, les petits seront séparés de la femelle pour être placés dans une autre portée, ou mis à mort si des signes de souffrances ou des blessures sont observés. Les souris seront hébergées dans des cages dans un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité) selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages. Pour les fécès, le personnel est expérimenté et fait le prélèvement tôt le matin là où les souris défèquent un peu plus vite. Celui réduit leur temps d’isolement. Pour les pesées, les souris sont déplacées à travers leur tube d’enrichissement : de leur cage à la balance. Le personnel les habitue à ces tubes dès la fin de leur acclimatation. Pour la pose de patch, la souris lors de son réveil est placée sous lampe chauffante et de la nourriture est déposée au fond de la cage.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris mâles et femelles. Les souris constituent un modèle reconnu dans le cadre des études du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. De plus, nos modèles d’allergie ont été établis sur cette espèce. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils du système immunitaire. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront âgées de 6 semaines à leur arrivée. Les souris seront mises en reproduction à 7 semaines de vie, l’âge où elles sont mâtures sexuellement. Les mâles reproducteurs seront mis à mort à la fin de la reproduction et les femelles reproductrices seront mises à mort au sevrage des souriceaux. Les souriceaux issus de la reproduction auront 2 jours de vie pour le premier tétage à la pipette. La première sensibilisation aura lieu au moment du sevrage des souriceaux, à 3 semaines de vie. La mise à mort sera effectuée à 9,5 semaines de vie.

Pour tester une thérapie brevetée censée accélérer la cicatrisation, 132 souris subissent l'induction chirurgicale d'une plaie sur le dos, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal est ensuite hébergé seul pendant trois à dix jours pour l'empêcher d'arracher les pansements, et voit sa plaie photographiée tous les deux jours sous anesthésie. Un dernier prélèvement de sang est réalisé sous anesthésie profonde avant la mise à mort. Le porteur affirme que le remplacement par des modèles in vitro "n'est pas envisageable", ce premier essai visant à préparer un développement chez l'être humain.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants liés à la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. L’objectif de ce projet est d’évaluer chez la souris une nouvelle thérapie dans le but d’accélérer la cicatrisation de plaies cutanées. Des études in vitro sur des modèles cellulaires ont permis de démontrer une augmentation du nombre de cellules, et sur des modèles de peau reconstruite de démontrer des activités sur la cicatrisation et sur la vascularisation du principe actif breveté, laissant envisager une régénération accélérée et donc une cicatrisation plus rapide de plaies cutanées. Ce projet constituera la toute première évaluation sur un modèle de plaie cutanée chez la souris de cette nouvelle thérapie, en comparaison avec un produit inactif (placebo). Le traitement ne sera effectué qu’une seule fois aussitôt après l’induction des plaies cutanées. Au cours de l’étude, 3 jours et 10 jours après traitement, les plaies cutanées seront prélevées pour la réalisation d’un ensemble d’analyses, après un prélèvement de sang. Un ensemble d’organes sera également prélevé pour la réalisation d’un ensemble d’analyses. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner la ou les formulations à l’une des 3 doses utilisées montrant la meilleure efficacité sur les phases initiales de la cicatrisation pour en poursuivre leur développement chez l’animal et envisager par la suite un développement chez l’Homme afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.

Bénéfices attendus

La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et la régénération des cellules. Les plaies chroniques représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouvelles thérapies sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie expérimentale brevetée, tout d’abord sur un modèle de plaie simple, dans la perspective de réalisation par la suite d’études d’efficacité sur des modèles de plaies cutanées chroniques chez la souris. Cette nouvelle thérapie pourrait ainsi à terme, être utilisée chez l’Homme, pour le traitement de plaies cutanées chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.

Procédures

Les 132 souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 15 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis réitéré après si nécessaire. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées et photographiées tous les 2 jours sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un maintien des souris en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 à 10 jours au maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci, mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les souris d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde à la fin de l’étude et avant euthanasie des animaux, en 2 minutes environ.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps. L’hébergement en cage individuelle des souris est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture et les sparadraps permettant la protection de ces plaies cutanées. Cet hébergement en cage individuelle des souris, pendant une durée de 3 à 10 jours maximum, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. Le change de pansement, effectué tous les 2 jours sous anesthésie gazeuse, pourra également induire un stress d’une courte durée.

Devenir

Les 132 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiées et des prélèvements de peau, au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, de sang et d’un ensemble d’organes, seront effectués pour réaliser un ensemble d’analyses.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer l’efficacité de traitement sur le processus cicatriciel dépendant de mécanismes physiologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal vivant.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’effectuer l’ensemble des analyses envisagées et d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études in vitro sur cultures cellulaires et à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle de plaie cutanée chez la souris ayant montré des effets importants de traitements sur la cicatrisation. Des analyses statistiques des résultats obtenus seront réalisées à la fin de l’étude.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire) et de leur traitement ou non. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré tous les 2 jours lors de chaque observation des plaies cutanées. En cas d’atteinte d’un point limite, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront hébergées dans des cages de taille adaptée. Des petites briques de bois, des carrés de papier absorbant et une balançoire seront placés dans chaque cage de souris comme dispositifs d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les souris d’un même portoir.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille ne nécessitant pas l’utilisation d’un gros volume de nouvelle thérapie très coûteuse à produire, de sa facilité de manipulation, et du modèle de plaie cutanée validé dans cette espèce qui pourra être utilisé pour la poursuite de ce projet avec des études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques chez la souris. Les animaux seront de jeunes souris mâles et femelles âgées de 6 semaines et d’un poids de 18-20 g à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines et d’un poids de 20-22 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de souris utilisées lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, jusqu'à quarante mesures de la tumeur et jusqu'à trente administrations de chimiothérapie et d'immunothérapie, avant d'être tuée pour analyse des organes. Le projet cherche à valider une protéine comme cible pour rendre l'immunothérapie plus efficace contre le cancer. Les groupes de seize animaux sont justifiés par la robustesse statistique, le bénéfice pour les patients restant une perspective générale.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l’effet de l’activation ou de l’inhibition d’un mécanisme biologique impliqué dans le développement des tumeurs et dans le fonctionnement du système immunitaire, dans un modèle murin. Des résultats préalables montrent que l’inhibition de ce mécanisme ralentit la croissance des tumeurs lorsque les défenses immunitaires de l’organisme sont fonctionnelles, ce qui suggère une interaction entre ce mécanisme et le système immunitaire. Cette modulation est également associée à des changements dans l’activité de certaines cellules immunitaires présentes dans la tumeur. L’objectif principal est d’évaluer les effets de cette modulation, seule ou en association avec des traitements anti-tumoraux de référence, dans des conditions où l’activité de ces cellules immunitaires est diminuée. Cela permettra de préciser leur rôle dans le contrôle de la croissance tumorale. Plus largement, ce projet vise à mieux comprendre comment ce mécanisme biologique influence les défenses immunitaires contre les tumeurs et l’efficacité des traitements.

Bénéfices attendus

Dans le monde, le cancer est la deuxième cause de décès, avec près de 10 millions de morts chaque année. Pour lutter contre cette maladie, les traitements les plus couramment utilisés sont la chimiothérapie et la radiothérapie. Ces thérapies agissent directement sur les cellules cancéreuses pour les détruire. Toutefois, elles peuvent parfois provoquer des effets secondaires importants et ne sont pas toujours efficaces chez tous les patients. L’immunothérapie représente une approche différente : elle vise à stimuler le système immunitaire du patient afin qu’il reconnaisse et élimine lui-même les cellules cancéreuses. Ces dernières années, cette stratégie a connu de grandes avancées et a permis des succès encourageants. Cependant, l’immunothérapie ne fonctionne pas encore pour tous les types de cancer, et nous ne comprenons pas toujours pourquoi certains patients ne répondent pas à ce traitement. Ce projet de recherche permettra de valider de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’améliorer l’efficacité de l’immunothérapie.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale (moins de trois minutes par animal, 1 fois). Toutes les souris vigiles seront soumises à l’évaluation de la croissance tumorale par une méthode non invasive (5 minutes par animal, 2 fois par semaine, 40 fois maximum). Toutes les souris seront soumises à des traitements anti-tumoraux administrés sur animaux vigiles (moins d’une minute par souris par administration). Une administration unique de chimiothérapie sera réalisée en début de traitement. Les traitements immunologiques seront ensuite administrés selon les schémas suivants : une administration quotidienne pendant 6 jours consécutifs, puis une administration hebdomadaire, ou une administration hebdomadaire seule selon les groupes expérimentaux. Le nombre total d’administrations ne dépassera pas 30 par animal. A la fin des expériences, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. Les traitements de chimio- et immuno-thérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections peuvent s’infecter. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert une induction tumorale, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement stimulant le système immunitaire dans un contexte de thérapie anti-cancéreuse. Notre protéine cible a été identifiée grâce à une étude de transcriptomique. Nous souhaitions évaluer notre hypothèse in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de l’immuno-stimulation et ses mécanismes vu sa complexité.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, des groupes de seize souris (huit femelles et huit mâles) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés pour un total de 640 animaux. Nous appliquerons des tests statistiques appropriés pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées, dans une pièce dédiée distincte de la zone d’hébergement des animaux. Toutes les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, etc...). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons: - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. La souris présente l’avantage de disposer de nombreux modèles génétiquement modifiés permettant d’analyser de façon spécifique le rôle de certains mécanismes biologiques dans les processus étudiés. Cette disponibilité constitue un élément déterminant pour répondre aux objectifs du projet. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de six semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire efficient.

2 232 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, réparties en groupes d'âge de deux à dix-neuf mois. Chacune subit gavages, injections dans le muscle de la cuisse, tests d'effort et prélèvements sanguins, certaines étant transportées entre deux établissements, pour étudier le lien entre la graisse intramusculaire et le métabolisme du muscle. Les retombées pour la santé humaine, fragilité musculaire liée à l'âge ou à l'obésité, sont annoncées "à plus long terme". Le porteur reconnaît qu'aucun calcul de puissance n'a été possible et que l'effectif repose sur ses habitudes expérimentales.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 2 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux établissements utilisateurs (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.