Recherche fondamentale

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre applications sur la peau, une instillation dans le nez et une injection dans l'abdomen, pour tester un inhibiteur protéique dans un modèle d'inflammation pulmonaire. Le porteur décrit un inconfort de l'ordre de la minute lors de l'instillation nasale et une douleur passagère au point d'injection. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico ne permet d'étudier l'inflammation pulmonaire dans un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester une nouvelle stratégie thérapeutique dans un modèle d'inflammation pulmonaire chez la souris Balb/c. Cette nouvelle stratégie est basée sur l’injection d'un inhibiteur de nature protéique d'une protéine impliquée dans la sécrétion de mucus et dans la contraction musculaire au niveau pulmonaire.

Bénéfices attendus

Nous travaillons sur la fonction respiratoire et il n’existe pas d’alternative pour étudier les phénomènes mis en jeu dans l'inflammation pulmonaire au niveau d’un organisme entier mis à part les modèles animaux.

Procédures

4 applications percutanées (1 fois par semaine, durée 1 min) 1 application intra nasale (durée 1 min) 1 injection intra péritonéale (durée 30s)

Impact sur les animaux

La phase de challenge par voie intra nasale peut contribuer à un inconfort temporaire (ordre de la minute maximum). Lors de l’injection intrapéritonéale une légère douleur passagère peut être ressentie au point d'injection.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de la procédure pour les besoins expérimentaux

Remplacement

Les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de l'inflammation pulmonaire, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.

Réduction

Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les paramètres immunologiques (fréquences des cellules inflammatoire) (T-test, bilatéral, risque α à 0.05 et une puissance de test de 0.9) conduit à utiliser un minimum 8 souris/groupe. Le même calcul concernant la résistance des voies aériennes mesurée par FlexiVent nous conduit a un minimum de 8 souris/groupe.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi des signes généraux et le suivi des points limites sont effectués au quotidien afin de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle reconnu dans le cadre des études de l'inflammation du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. De plus, nos modèles ont été établis sur cette espèce. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de ces souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les protocoles d’induction d'inflammation seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines. L’âge de la souris pouvant modifier la réponse de type inflammation, nous utilisons des sujets sevrés. Ceux-ci sont néanmoins jeunes afin que le phénomène de sénescence ne puisse pas interférer avec les mécanismes étudiés dans le cadre de protocole de longue durée.

Greffées d'une tumeur sous la peau puis traitées par cinq injections, 1 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur, mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, peut occasionner gêne et douleur. L'objectif est de tester des anti-inflammatoires censés relancer les défenses immunitaires contre le cancer. Le porteur situe les retombées à l'identification possible de nouvelles cibles, sans engagement de résultat.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires. Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’un épuisement des globules blancs lors du cancer. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer l’impact d’un traitement bloquant l’action de ces protéines sur l’épuisement des réponses immunitaires et la croissance tumorale

Bénéfices attendus

A terme, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Une injection de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie générale (1 minute/souris). Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation. 5 injections de traitements (30 sec/souris).

Impact sur les animaux

Les injections de traitement et l'injection de cellules tumorales peuvent entraîner un stress et une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort.

Remplacement

La complexité de l’étude du cancer nécessite d’avoir recours à un organisme vivant pour étudier l’ensemble des acteurs impliqués dans ce phénomène. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes plus simples ne nécessitant pas d’animaux, et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés afin d’avoir un nombre minimal d’animaux pour pouvoir obtenir des résultats exploitables. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi très régulièrement par le responsable du projet.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies biologiques sont conservées entre la souris et l'Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus pour envisager ensuite d’éventuels traitements chez l’Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la biologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 10 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

Un choc électrique, une restriction alimentaire et des injections de toxines directement dans le cerveau : 2 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les toxines détruisent des voies nerveuses pour reproduire la maladie de Parkinson, avant l'implantation d'une canule cérébrale et une série de tests comportementaux. Le projet cherche des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur deux établissements. Le porteur reconnaît que ces modèles ne reproduisent que partiellement la maladie humaine, ce qui le conduit à en combiner plusieurs.

Objectifs

Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.

Scarifiées à la queue pour des prélèvements répétés de gouttes de sang, 1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations reproduisant un diabète ou des tumeurs du pancréas et reçoivent des injections activant la mutation, des gavages, un régime gras et des tests de glycémie répétés. Certains fœtus sont traités à travers la mère gestante. Le porteur qualifie ces souris de "modèles uniques au monde" et affirme que la mesure de la glycémie ne peut se faire qu'in vivo.

Objectifs

Récemment, une nouvelle mutation d’une protéine pancréatique a été décrite dans plusieurs familles de patients. Cette mutation cause un diabète chez les hommes, et des tumeurs du pancréas chez les femmes. Pour le moment, son mode d’action n’est pas connu. Les hommes touchés développent un diabète particulier différent du diabète de type 1 auto-immun et du diabète de type 2 lié à l’obésité. Les femmes présentent quant à elles des tumeurs particulières du pancréas issues des cellules productrices d’insuline, entrainant une sécrétion excessive et incontrôlée d’insuline qui provoque des hypoglycémies répétées (baisse anormale du sucre dans le sang). L’objectif de ce projet est donc de rechercher les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de ces troubles du pancréas. A plus long terme, ces recherches devraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi de proposer de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un grand intérêt pour le traitement à la fois du diabète et du cancer du pancréas puisque les mutations de notre protéine d’intérêt ont été décrites dans ces deux pathologies. Sur le plan clinique, nous prévoyons des retombées potentielles à moyen et à plus long terme. En effet, le diabète est une maladie métabolique complexe qui implique souvent plusieurs gènes. Cette hétérogénéité rend difficile son étude. Il existe aussi certaines autres formes de diabète qui n’impliquent qu’un seul gène. Elles sont présentes soit chez des nouveau-nés, soit chez de jeunes adultes. Dans ce contexte, il est plus facile de comprendre les mécanismes à l’origine de la maladie et ainsi de progresser vers des voies thérapeutiques. C’est le cas du facteur que nous étudions au laboratoire, qui est produit dans le pancréas. Une seule mutation du gène codant pour ce facteur suffit à déclencher un diabète. Nous pensons donc que notre étude chez la souris pourra permettre non seulement de décrire une nouvelle forme de diabète monogénique, mais aussi d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’élaborer de nouveaux traitements. Le facteur que nous étudions est également associé à l’apparition de tumeurs pancréatiques chez des patients. Son rôle biologique reste toutefois encore mal compris à ce jour. Notre projet permettra d’élucider son implication dans le cancer pancréatique qui représente une cause de mortalité importante.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des souris qui portent des mutations représentatives de celles portées par des patients qui présentent soit un diabète, soit des tumeurs du pancréas. Ces souris seront examinées à différents stades de la vie, allant de la vie fœtale à des stades âgés. Certains des animaux utilisés nécessitent l’injection d’un composé pour activer la mutation étudiée. Les animaux adultes vigiles (éveillés) porteurs de cette mutation inductible, recevront une ou cinq administrations de la substance par injection soit une (ou trois) administrations par voie orale, soit une administration par application d’une solution sur la peau (1 ou 3 fois) (durée de chaque geste inf à 30sec). Des fœtus seront également traités en administrant le composé chez la mère gestante : soit par gavage (1 à 2 doses), soit par injection (1 ou 2 fois) soit dans l’alimentation pendant une semaine (durée de chaque geste inf à 30 sec). Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la régulation de la glycémie. Pour cela, ils auront un prélèvement, puis ils seront placés à jeun pendant 16 heures, et auront un second prélèvement (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Ils recevront une injection (10 sec) suivie de 5 prélèvements d’une goutte de sang durant les 2h suivantes. Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris. Dans le cadre d’une étude longtudinale, ce lot de souris pourra être soumis à ce type d’injection puis prélèvement au maximum 3 fois lors de ces 2 tests (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Enfin, certaines souris seront exposées à un régime riche en graisse pendant des durées allant de 14 jours à 3 mois. Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la glycémie, impliquants une injection et 7 prélèvements d’une goutte de sang, Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris (durée de chaque prélèvement inf à 10sec).

Impact sur les animaux

Les modèles générés pour l’étude n’ont pas de phénotype dommageable. Les nuisances attendues sont celles liées aux différentes injections. Ces nuisances correspondent à l’introduction d’une aiguille et donc à des douleurs associées à une injection classique. Celles-ci sont de courte durée, et ces différentes injections ne provoquent aucun autre effet secondaire à l’exception de la nuisance de l’injection. Les souris exposées à régime particulier (riche en graisse) peuvent présenter une prise de poids sans conséquence sur le bien-être des animaux. Après injection, nous nous attendons à observer une légère hyperglycémie (élévation de la glycémie) à la fois chez les mâles et les femelles lorsque des tests métaboliques seront effectués. Sur la base de nos premiers résultats, l’hyperglycémie devrait être moindre chez les femelles. Néanmoins, cette hyperglycémie modérée ne sera probablement que passagère, et une glycémie normale sera rétablie après quelques heures. Pour les mesures de glycémie, le premier prélèvement étant réalisé après une légère scarification de la queue et les suivants après le retrait de la croûte, ce geste entraînera une douleur légère et de courte durée. Cela prend 10 à 20 secondes maximum répétées 5 fois sur 120 minutes, les temps de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les souris que nous utilisons sont des modèles uniques au monde. Les paramètres physiologiques, c’est à dire les mesures de glycémie et d’insulinémie ne peuvent être effectuées que in vivo. De plus, il existe un dialogue entre les différents organes de la souris. Cette interaction entre les différents organes impliqués dans le métabolisme glucidique de la souris -le foie, le muscle et le tissu adipeux- ne peut être analysée que dans un organisme entier vivant. Néanmoins, pour limiter les investigations in vivo, un maximum d’informations proviendra d’analyses sur des tissus fixés et d’analyses bio-informatiques in silico à partir de prélèvement post-mortem. Nous effectuerons également des expériences in vitro quand cela est possible pour limiter les expériences in vivo. Par exemple, la culture d’îlots de Langerhans prélevés sur des souris post-mortem, un animal pouvant générer environ 100 îlots qui sont ensuite stimulés in vitro..

Réduction

Nos modèles représentent des modèles uniques au monde pour étudier les pathologies trouvées chez l’homme. En effet, ce sont le seul moyen d’étudier les effets d’une mutation, qui chez l’homme, déclenche un diabète ou un insulinome. Les stratégies d’accouplement ont été optimisées afin de réduire le nombre d’animaux.. D’après la littérature, nous avons défini la taille de nos groupes pour permettre des résultats concluants et faire des analyses statistiques. Pour réduire le nombre de souris utilisées, une étude pilote sera réalisée pour certains modèles de souris avant de définir les conditions optimales. Une approche Go/No Go sera ensuite appliquée afin de déterminer si les inductions pour activer la mutation étudiée se feront au stade fœtal ou adulte. Cela signifie que nous ferons un choix de la méthodologie utilisée selon les résultats préliminaires obtenus. Si nous constatons que l’activation de la mutation est satisfaisante pendant le développement foetal, nous choisirons plutôt cette méthode et nous n’activerons pas la mutation au stade adulte.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine du diabète et de la cancérologie, les animaux seront suivis régulièrement afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score sera également mise en place. Dans le cadre des procédures, toutes les manipulations seront réalisés pour garantir le meilleur confort à l’animal. En particulier, lors des expériences impliquant des injections, les animaux seront observés de façon quotidienne, de manière à surveiller l'état général de la souris. Pour rappel, nous n’attendons pas de nuisance particulière, hormis une légère hyperglycémie chez les mâles après injection. De plus, les animaux aux stades fœtal et nouveau-né seront utilisés uniquement pour des prélèvements d’organes après injection. Aux stades plus tardifs, les tests réalisés ne nécessitent pas d’utiliser des analgésiques pour ces tests.

Choix des espèces

Nos modèles murins sont uniques et la souris est le seul organisme existant qui puisse permettre d’étudier l’effet de mutations de notre protéine d’intérêt. Etant donné son cycle de reproduction et sa parenté biologique avec l’homme, la souris constitue un modèle de choix pour mener nos expériences. De plus, il est accepté et validé par la communauté internationale que la souris est pleinement appropriée pour les études du métabolisme que nous proposons. Les stades de développement étudiés sont les suivants : fœtus (E18,5), 1 mois, adultes de 3 mois, 6 mois, 12 mois, 18 mois, et 24 mois. En effet, on sait que notre protéine d’intérêt peut jouer un rôle dans la différenciation des cellules pancréatiques pendant la vie fœtale, mais aussi sur leur prolifération pendant la période postnatale jusqu’à un mois.. Nous souhaitons donc déterminer si la mutation étudiée affecte ces cellules à ces stades. Plus tard, cette mutation pourrait déclencher un diabète ou une tumeur pancréatique, selon le stade de la vie de la souris. En effet, on sait que ce type de phénotype est très dépendant du métabolisme et de l’âge de la souris). C’est pour cette raison qu’il est impératif d’étudier le phénotype des souris à ces différents stades de la vie adulte.

Saignés et mis à mort dès l'éclosion pour une partie, opérés à 24 jours pour l'implantation de deux capteurs de température pour d'autres, 260 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La pose des capteurs se fait sous anesthésie, l'un dans l'abdomen, l'autre sous la peau. Tous sont ensuite exposés à des vagues de chaleur artificielles, jusqu'à 32°C six heures par jour pendant cinq jours, pour mesurer une résistance à la chaleur transmise par la mère. Les carcasses seront valorisées commercialement, sauf celles des dix animaux ayant porté les capteurs.

Objectifs

Le projet vise à évaluer, l’impact de la « programmation thermique embryonnaire » appliquée sur des œufs embryonnés de futures reproductrices, sur leur descendance, des poulets de chair produits terminaux, exposés à des vagues de chaleur. Cette étude sera conduite sur une race à croissance lente adaptée aux conditions d'élevage en plein air, qui devrait être plus sensible aux vagues de chaleur potentielles. La capacité de la progéniture de ces femelles reproductrices soumises ou non à un traitement thermique à résister aux défis de la chaleur sera évaluée à l'aide d'indicateurs physiologiques et comportementaux qui ont été validés comme mesures de la robustesse ou de la résilience dans des environnements fluctuants et sous-optimaux. LE PROJET SE DEROULERA DANS L'EU 1, SAUF LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE PAR VOIE CHIRURGICALE QUI SE DEROULERA DANS L'EU 2.

Bénéfices attendus

L’objectif général du projet est de proposer des stratégies de programmation thermique afin de renforcer la robustesse des animaux et leur capacité d’adaptation à des vagues de chaleur. L’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale réalisée sur les œufs de futures reproductrices qui est relativement peu étudiée. La connaissance de l’impact d’une programmation thermique d’œufs de futures reproductrices et la transmission potentielle à sa descendance d’une meilleure capacité à s’adapter à des vagues de chaleur n’a jamais été étudié, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être de la progéniture.

Procédures

Une prise de sang sera réalisée à l’éclosion sur 30 femelles futures reproductrices et 32 descendants. Ces animaux sont ensuite mis à mort pour des prélèvements de tissus. Une prise de sang sera également réalisées sur les femelles avant leur entrée en ponte (1 seule prise de sang) et sur les descendants avant, pendant et après le coup de chaleur (3 prises de sang sur les mêmes individus pour suivre leur réponse aux vagues de chaleur et leur capacité d’adaptation / récupération). La pose de capteurs internes de suivi de température sera réalisée par voie chirurgicale sur des poulets à l’âge de 24 jours (2 capteurs/poulet, l’un en intrapéritonéale et l’autre en sous cutané). Les animaux seront sous anesthésie générale dont de délai prévisionnel est de 30 min, le délai de chirurgie est estimé entre 15 et 20 min par poulet. L’application de vagues de chaleur sur tous les descendants débutera 10 jours avant la mise à mort pour une durée de 5 jours. Les fluctuations oscilleront entre 32°C pendant 6h en journée et 25°C durant 6h la nuit. Ces deux plages de température sont séparées de 6h durant lesquelles la température augmente ou diminue graduellement. DANS L'EU1 SERONT EFFECTUEES TOUTES LES EXPERIMENTATIONS SAUF L'ANESTHESIE GENERALE ET LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE QUI SERONT REALISES DANS L'EU2. LES ANIMAUX SERONT TRANSPORTES DEUX FOIS ENTRE LES DEUX EU (5 MIN PAR TRAJET).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer de la douleur et de l’inconfort en cas d’insuffisance d’action de l’anesthésie. Cette dernière peut provoquer une dépression respiratoire, même si le risque est limité avec une anesthésie gazeuse. Dans nos conditions, l’apparition de complications post-opératoires est peu probable mais reste possible (risques d’infection, de rejet du capteur, ou de réponse inflammatoire excessive). La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’exposition aux vagues de chaleur peut engendrer des conséquences physiologiques potentielles (augmentation de la température corporelle, déséquilibre hydro-électrolytique, réduction de l’appétit, etc.) ainsi que des conséquences comportementales (agitation, apathie, ou comportements visant à éviter la chaleur comme regroupement en zones fraîches ou tentatives d’échappement). L’élevage des animaux au sol en groupe peut entraîner des comportements agressifs, voire de picage, qui peuvent être exacerbés lors d’épisodes de chaleur. LE TRANSPORT ENTRE LES DEUX EU PEUT ENGENDRER UN LEGER STRESS.

Devenir

Suite aux prélèvements de sang à l’éclosion, les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus d’intérêt métabolique. A la fin de la procédure de chirurgie, les animaux seront replacés dans leur parquet d'origine avec leurs congénères jusqu'à la fin de l'élevage du lot. Tous les autres animaux inclus dans le protocole seront mis à mort en fin d’élevage de la bande. Les carcasses de ces animaux pourront être valorisées commercialement à l’exception de celles des 10 animaux qui auront porté les capteurs de température.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ou in vitro n'est capable de reproduire l'effet de la programmation thermique chez l'espère cible, le poulet de chair, et son impact durant toute la durée de vie de l'animal (physiologie, comportement, performances, etc..).

Réduction

Au niveau du volet des reproductrices, 15 femelles par traitement (N=30) seront prélevés (sang + tissus) à l’éclosion pour évaluer l’impact de la programmation thermique sur la physiologie de l’animal à l’état initial. De nouveaux prélèvements de sang seront réalisés avant l’entrée en ponte des femelles (N=15 par groupe) pour évaluer le statut physiologique et métabolique des femelles. Le nombre d’animaux expérimentaux choisi est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes en intégrant la variabilité interindividuelle attendue en termes de poids, composition corporelle, statut métabolique et robustesse. Nous avons volontairement choisi une puissance statistique, car en absence de challenge type conditions d'élevage dégradées ou coup de chaleur plus tard dans la vie, nous nous attendons à avoir des effets de faible amplitude mais variés. Sur la base des travaux antérieurs réalisés, les marqueurs sanguins de stress oxydatifs sont les plus variables. L’unité statistique pour les dosages de biomarqueurs sera l’animal.

Raffinement

Dès l’éclosion, les descendants seront élevés au sol sur copeaux, avec accès à l’eau et à l’aliment ad libitum, dans un bâtiment à environnement contrôlé (température, ventilation, lumière). Ce mode d’élevage favorise les interactions sociales. Les animaux seront visités au moins deux fois par jour (week-ends et jours fériés inclus). En cas de signes de détresse ou de maladie (cf grille d’atteinte des points limites), un isolement en infirmerie ou une euthanasie pourra être envisagé. L’environnement sera enrichi avec des rubans colorés à picorer et un perchoir. Lors du coup de chaleur, les pipettes seront vidangées trois fois par jour pour garantir une eau fraîche. En période de forte chaleur, une attention particulière sera portée à la baisse effective des températures pour assurer des phases de récupération. Raffinement des prises de sang : elles seront réalisées par deux opérateurs expérimentés, avec une contention calme et précise. Une garde sur l’aiguille limitera les risques de pénétration excessive et de lésions cérébrales. Raffinement de la chirurgie : une prémédication sera administrée 15 min avant l’anesthésie gazeuse (bréchet). Chaque animal sera endormi individuellement. Une antibioprophylaxie débutera la veille de l’intervention et se poursuivra pendant 3 jours post-opératoires. En cas de signes de douleur (prostration, anorexie…), une dose d'antalgique pourra être donnée. Les animaux seront isolés durant 5 jours post-opératoires en infirmerie, avec suivi individuel selon une grille dédiée à l’évaluation post-chirurgicale. Cette procédure a été testée avec succès dans un essai précédent chez des poulets à croissance lente : aucune mortalité, réintégration au parquet d’origine après traitement, et croissance équivalente aux témoins. LE TRANSPORT DES ANIMAUX DE L'EU 1 VERS L'EU 2 AVANT L'OPERATION ET LEUR RETOUR DE L'EU 2 VERS L'EU 1 SERA REALISE PAR UN TECHNICIEN FORME DANS UN VEHICULE AGREE POUR LE TRANSPORT D'ANIMAUX VIVANTS. LE TRAJET EST TRES COURT (MOINS DE 5 MIN).

Choix des espèces

Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur. Après éclosion, les animaux seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à 30 semaines pour la partie « reproducteurs », et jusqu’à environ 75 jours pour la descendance. L’évaluation de l’intérêt d’une programmation thermique embryonnaire lors de l’incubation se fera tout au long de la durée d’élevage des animaux sur les 2 générations (reproductrices et descendants). La mise en place de capteurs de température interne sera faite sur les descendants. L’opération se fera sur des animaux de 24 jours afin qu’il puisse supporter l’acte de chirurgie et permettre de suivre les paramètres du capteur tout au long de la vie de l’animal. Par ailleurs, l’épisode artificiel de forte chaleur sera appliqué en fin d’élevage, 10 jours avant mise à mort, âge où les animaux sont les plus sensibles aux variations/pics température. Il convient donc de suivre les critères zootechniques, comportementaux et sanitaires pendant toute la durée de l’élevage. Les poulets seront élevés de leur jour d’éclosion jusqu’à l’âge classique de mise à mort pour un élevage d’animaux labels (75 jours max).

1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inoculation sous anesthésie déclenche une infection urinaire aiguë ou chronique, suivie de prélèvements d'urine et de sang, de séances d'imagerie jusqu'à trois fois par semaine et d'administrations répétées de composés, pour tester de nouveaux anti-infectieux face à l'antibiorésistance. Le porteur signale une hématurie, de la léthargie et une perte de poids possibles pendant l'infection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la colonisation des voies urinaires et conclut que le recours à la souris reste "indispensable".

Objectifs

Les infections du tractus urinaire (ITU) représentent un enjeu majeur de santé publique, en raison de leur fréquence élevée, de leur tendance à la récidive, en particulier chez les patientes, et de l’augmentation préoccupante de la résistance aux antibiotiques. Dans ce contexte, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-infectieuses constitue un besoin médical prioritaire. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements anti-infectieux dans des modèles murins d’infections urinaires aiguës et chroniques. Ces modèles, largement décrits dans la littérature scientifique, permettent de reproduire de manière contrôlée les différentes phases de l’infection et d’étudier la dynamique bactérienne ainsi que la réponse aux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser l’évolution de l’infection urinaire dans des conditions aiguës (jusqu’à 6 jours) et chroniques (jusqu’à 4 semaines) après inoculation bactérienne et évaluer l’efficacité thérapeutique de composés candidats administrés par différentes voies (orale, sous-cutanée, intra-péritonéale ou intra-veineuse), en mesurant leur capacité à réduire la charge bactérienne. Les procédure permettront de suivre longitudinalement la progression de l’infection chez l’animal vivant grâce à une approche d’imagerie non invasive basée sur la bioluminescence bactérienne, permettant une évaluation quantitative et répétée. Une analyse de la distribution bactérienne et l’impact des traitements au niveau des organes cibles (vessie, urètre, reins) en fin d’étude sera effectuée. Ce projet permettra ainsi de générer des données précliniques essentielles pour identifier et caractériser de nouvelles molécules à potentiel thérapeutique contre les infections urinaires, contribuant à répondre à la problématique croissante de l’antibiorésistance.

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation urinaire réalisée sous anesthésie inhalatoire, comprenant deux administrations rapprochées effectuées lors d’une même séance (environ 10 minutes au total par administration). Cette intervention a lieu une seule fois par animal, dans les deux procédures. Des prélèvements d’urine seront réalisés sur animaux vigiles : 2 à 3 prélèvements sur une durée maximale de 6 jours pour le modèle aigu, et un prélèvement par semaine pendant 4 semaines pour le modèle chronique. Chaque prélèvement dure environ une minute et consiste en une collecte non invasive lors d’une miction spontanée. Les traitements expérimentaux seront administrés selon la voie choisie (orale, parentérale, topique ou intraveineuse), avec une fréquence maximale quotidienne ou biquotidienne selon la voie. Chaque administration dure quelques secondes à une minute. Une imagerie in vivo pourra être réalisée afin de suivre l’évolution de l’infection de manière non invasive. Cette procédure dure environ 5 à 10 minutes sous anesthésie et pourra être effectuée jusqu’à trois fois par semaine. Les animaux seront observés quotidiennement (une à deux fois par jour selon le modèle), avec une durée d’observation inférieure à une minute, afin d’assurer leur suivi clinique et leur bien-être. En fin d’étude, chaque animal sera soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde, suivie d’une euthanasie réglementaire et de prélèvements d’organes. Cette intervention dure environ 5 à 10 minutes. Un prélèvement sanguin sera effectué une fois par semaine sous anésthésie et l'intervention durera 5 à 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en œuvre dans ce projet peuvent entraîner des nuisances ou effets indésirables, principalement liés à l’induction de l’infection et aux administrations de traitements. L’instillation transurétrale, réalisée sous anesthésie, peut provoquer une irritation locale de l’urètre et de la vessie, ainsi qu’un inconfort transitoire au réveil. Ces risques sont limités par l’utilisation de matériel adapté et par du personnel formé. Dans le modèle aigu, une inflammation locale, une hématurie modérée et une altération transitoire de l’état général (léthargie, baisse d’activité) peuvent être observées. Dans le modèle chronique, les signes sont généralement plus modérés, avec une gêne persistante et une inflammation de bas grade. Une perte de poids modérée peut survenir, en particulier en phase initiale. Les anesthésies répétées à l’isoflurane peuvent induire un stress léger et transitoire. Les prélèvements urinaires et sanguins peuvent également générer une gêne ponctuelle liée à la contention ou à la ponction. L’administration des traitements (gavage, injections) peut entraîner un stress ou un inconfort léger selon la voie utilisée. Des mesures seront appliquées afin de limiter l’intensité et la durée de ces effets.

Devenir

À la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort de manière rapide et indolore, sous anesthésie, afin de pouvoir prélever les tissus nécessaires aux analyses. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant de reproduire de manière fiable l’ensemble des aspects physiopathologiques impliqués dans les infections urinaires, en particulier la colonisation des voies urinaires, les réponses immunitaires locales, la persistance bactérienne et la pharmacocinétique des traitements. Les modèles cellulaires ou organoïdes ne permettent pas d’évaluer l’efficacité de traitements dans un contexte d’infection systémique ou tissulaire, ni d’intégrer les paramètres pharmaco-dynamiques in vivo. Par conséquent, le recours au modèle murin reste indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le projet intègre plusieurs mesures concrètes visant à limiter le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe de réduction des 3R. Le nombre d’animaux a été estimé sur la base de calculs de puissance statistique à partir de données préliminaires internes et de la littérature, afin de garantir que seuls les effectifs strictement nécessaires seront mobilisés pour répondre aux objectifs scientifiques. L’utilisation d’une technologie d’imagerie bioluminescente permet un suivi non invasif et longitudinal de l’infection sur un même animal, réduisant ainsi le recours à des euthanasies inter-médiaires pour le recueil de données. Cette approche limite significativement le nombre total d’animaux requis pour l’analyse cinétique de la réponse au traitement. Les groupes de contrôle (témoin négatif et témoin positif) seront mutualisés entre plusieurs ex-périmentations lorsque cela est possible, notamment lors du criblage de différents composés, afin d’éviter la duplication de lots témoins. L’exploitation complète des animaux en fin d’expérimentation est prévue, avec prélèvements de plusieurs organes (vessie, urètre, reins) pour différentes analyses (microbiologie, histologie, biologie moléculaire), optimisant ainsi les données obtenues par individu. Une phase pilote, menée sur un effectif réduit, permettra de valider et d’ajuster les protocoles d’infection et de traitement avant les séries expérimentales principales, afin d’éviter des essais non concluants. Les tissus prélevés sont partagés pour analyses complémentaires validées afin de réduire le nombre d’animaux supplémentaires. Les analyses statistiques seront effectuées afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser tout en assurant la robustesse des résultats.

Raffinement

Toutes les procédures ont été conçues pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. L’injection intra-urétrale de l’inoculum bactérien est réalisée sous anesthésie générale par isoflurane, avec une contention douce et un matériel adapté (cathéter à petit calibre). Pour limiter l’inconfort lors de l’instillation transurétrale, un lubrifiant stérile et un analgésique local (lidocaïne) seront appliqués sur la sonde. Ces mesures de raffinement visent à réduire la douleur et l’irritation sans interférer avec l’infection ou les traitements testés. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique quotidien incluant l’observation du comportement ainsi que la prise de poids. Des critères d’arrêt seront appliqués si un animal présente des signes cliniques dépassant les seuils définis. L’utilisation d’un suivi par imagerie bioluminescente limite les interventions répétées, les prélèvements invasifs, ainsi que le stress induit par des manipulations fréquentes. Les prélèvements d’urine sont réalisés sur animal vigile, sans ponction, par simple recueil de mictions spontanées au moment de la contention. Des mesures de raffinement sont également adaptées à chaque voie d’administration afin de limiter le stress et l’inconfort. Pour le gavage, l’utilisation de sondes adaptées, de volumes contrôlés et d’un personnel expérimenté permet de réduire les risques (fausse route, lésions). Une habituation à la contention est recommandée. Pour les injections sous-cutanées et intrapéritonéales, l’emploi d’aiguilles fines, de volumes adaptés et l’alternance des sites limitent la douleur et les réactions locales. La voie intraveineuse nécessite un personnel formé afin de réduire les échecs et les lésions. Pour la voie topique, l’utilisation de formulations non irritantes est privilégiée. La voie la moins invasive sera choisie lorsque possible, avec une surveillance des sites d’administration afin de détecter toute réaction et d’adapter les pratiques si nécessaire. En cas de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par isoflurane suivie d’une méthode physique validée (dislocation cervicale). Enfin, tous les personnels intervenant sur le projet sont formés à la manipulation des animaux, aux procédures d’anesthésie, d’injection et de suivi clinique, conformément aux exigences règlementaires.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour ce projet est la souris, qui constitue le modèle de référence pour l’étude des infections urinaires bactériennes. Ce modèle est largement documenté dans la littérature scientifique et présente une très bonne reproductibilité des infections. La physiopathologie de l’infection urinaire chez la souris reproduit de manière fiable les principales étapes observées chez l’Homme, notamment la colonisation de la vessie, l’ascension vers les reins et la réponse inflammatoire locale. La souris permet en outre de combiner des approches d’imagerie in vivo, des analyses moléculaires fines et des évaluations quantitatives de la charge bactérienne. Elle constitue donc un modèle robuste, validé et pertinent pour répondre aux objectifs de ce projet, en particulier pour tester l’efficacité de nouveaux traitements anti-infectieux dans des conditions expérimentales proches de la physiologie humaine. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris adultes, âgées de 6 à 12 semaines au moment de l’inoculation bactérienne. Ce stade de développement correspond à des animaux immunologiquement matures, physiologiquement stables, et adaptés à l’établissement reproductible du modèle d’infection urinaire utilisé dans cette étude.

Pour mettre en place trois modèles de métastase dans un ganglion, 1 338 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une chirurgie d'injection de cellules cancéreuses dans le ganglion inguinal, puis pour certains deux injections d'immunothérapie dont les effets indésirables reproduisent l'inflammation et l'auto-immunité observées chez l'humain. Le développement tumoral peut lui-même causer des douleurs. Les souris sont tuées pour des prélèvements de tumeurs et d'organes, ces trois modèles devant servir de base à un projet ultérieur sur l'immunothérapie des ganglions métastatiques.

Objectifs

Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuses ont révolutionné le traitement des cancers. Cependant aujourd’hui, l’effet de ces traitements sur les métastases au ganglion n’est pas encore bien décrit. Nous souhaitons étudier l’effet des traitements d’immunothérapie dans un ganglion métastatique, et étudier l’environnement vasculaire et immunitaire de celui-ci. Pour réaliser notre étude, nous avons besoin de 3 modèles reproductibles et robustes de ganglion métastatique. L’objectif de ce projet est de mettre en place nos modèles de ganglion métastatique, puis dans un second temps de mettre en place le schéma thérapeutique d’immunothérapie utilisé actuellement en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’obtenir 3 modèles différents de métastases au ganglion, permettant d’étudier différents types de cancer et les effets des traitements d’immunothérapie sur ceux-ci. Par la suite, nous approfondirons l’étude avec un projet nécessitant ces modèles pour étudier les interactions entre les systèmes immunitaires et vasculaires des ganglions métastatiques au cours du traitement d’immunothérapie.

Procédures

Tous les animaux de ce projet auront une chirurgie au niveau du ganglion inguinal pour l’injection de cellules cancéreuses (10 minutes) sous anesthésie générale avec un analgésique générale et une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone d’injection. Par la suite, certains animaux recevront deux injections en vigile (environ 10 secondes par injection) de traitement d’immunothérapie.

Impact sur les animaux

L’anesthésie et l’injection de cellules tumorales peut induire une douleur modérée et du stress chez les animaux, ainsi qu’une dégradation de l’état des animaux (perte de poids, lenteur dans les mouvements). Le développement tumoral peut causer des douleurs chez l’animal. Les traitements d’immunothérapie peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l’homme avec une inflammation et une autoimmunité.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements post-mortem de tumeurs ou organes.

Remplacement

Les procédures réalisées sur l’animal ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. A ce jour, il n’est pas possible d’étudier le système immunitaire et son interaction avec le développement tumoral et le système vasculaire in vitro. La mise en place de métastases nécessite un organisme complexe pour étudier les interactions et paramètres mis en jeux. De plus, les cellules des vaisseaux sanguins auxquelles nous nous intéresserons dans la suite de ce projet sont très plastiques et ne conservent leur phénotype que dans un environnement particulier in vivo.

Réduction

Nous souhaitons mettre en place des modèles de tumeur métastatique dans le ganglion inguinal. Pour la robustesse de nos résultats, nous avons besoin de plusieurs modèles cellulaires. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est suffisant pour mettre en évidence que les modèles sont robustes et écarter de façon certaines ceux qui ne le sont pas. Ce projet est conçu avec une hiérarchie entre les deux procédures, où la réalisation d’une procédure ultérieure n’est possible que si les résultats des procédures précédentes le justifient.

Raffinement

Pour l’injection des cellules ainsi que pour l’imagerie, les souris sont maintenues sur tapis chauffant. Les conditions d’anesthésie, avec une analgésie générale et locale, sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. La colle chirurgicale permettra d’une part de diminuer les traumatismes induits à la peau causés par des points de suture et d’autre part d’augmenter la rapidité d’action et de diminuer ainsi le temps d’anesthésie. Le suivi des animaux sera réalisé tous les jours par les expérimentateurs et les soigneurs, tous ayant connaissance des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques du projet.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. Les ganglions lymphatiques étant apparus tardivement au cours de l’évolution, un modèle mammifère est nécessaire pour l’étude présentée ici, centrée sur les métastases dans ces ganglions lymphatiques. Les souris sont âgées entre 6 à 12 semaines, et présentent à ce stade un système immunitaire mature.

Immunodéprimées pour accepter des cellules pulmonaires humaines, 169 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un emphysème est d'abord provoqué par instillation d'élastase dans la trachée, avant la greffe de cellules alvéolaires humaines par inhalation sous anesthésie. L'atteinte pulmonaire peut entraîner des difficultés respiratoires et une perte de poids. Les poumons sont prélevés après la mise à mort pour évaluer si les cellules greffées réparent les alvéoles détruites, une preuve de concept en vue d'une éventuelle thérapie cellulaire humaine.

Objectifs

L’emphysème pulmonaire est une maladie fréquente et potentiellement grave pouvant évoluer vers une insuffisance respiratoire. Il est principalement lié à l’exposition à la fumée de cigarette et se caractérise par la destruction progressive des alvéoles pulmonaires. Cette altération résulte d’un défaut de régénération alvéolaire dont les mécanismes restent encore mal connus. À ce jour, aucun traitement ne permet de former de nouvelles alvéoles ni d’améliorer durablement la fonction alvéolaire chez les patients atteints de formes sévères. Des avancées récentes suggèrent que les cellules épithéliales alvéolaires (CEA) peuvent se greffer dans le poumon de souris endommagées par une autre pathologie, la fibrose pulmonaire, et contribuer à une amélioration de leur état de santé. Il a également été montré que le vieillissement cellulaire, appelé sénescence, peut limiter l’efficacité de ces greffes. L’hypothèse de ce projet est que la transplantation de CEA, en particulier de cellules non sénescentes, dans un modèle murin d’emphysème induit par instillation d’élastase, permettrait de réparer les alvéoles lésées. Il sera également étudié si l’association avec des fibroblastes peut renforcer l’efficacité de la greffe. Le premier objectif de ce projet est de mettre en place un modèle d’emphysème chez des souris immunodéprimées en déterminant la concentration d’élastase nécessaire pour induire l’atteinte pulmonaire. Le second objectif va consister à greffer des CEA humaines obtenues à partir de poumons humains transplantés dans les poumons emphysémateux murins (xénogreffe) afin d’évaluer leur capacité de réparation. Les CEA humaines seront greffées seules, avec ou sans élimination des cellules sénescentes et avec ou sans des cellules de support (fibroblastes) et les fibroblastes primaires humains obtenus de poumons de patients emphysémateux et non emphysémateux ayant subi une chirurgie thoracique carcinologique ou une transplantation. Les cellules sénescentes et non sénescentes seront isolées grâce à des sondes fluorescentes puis transplantées dans le modèle murin. Le recours au modèle animal est justifié par sa pertinence pour l’étude des thérapies cellulaires, contrairement aux cultures in vitro.

Bénéfices attendus

Si les résultats sont positifs, ils constitueront une première preuve de concept concernant : 1) la capacité des CEA à s’implanter avec succès dans le poumon emphysémateux avec l’aide ou non des fibroblastes. Cela permettrait d’envisager la transplantation de cellules dans cette maladie chez l’homme. 2) la sélection de cellules non sénescentes comme outil important pour augmenter la capacité des CEA à s’implanter dans le poumon emphysémateux et d’augmenter leur capacité de réparation Dans l’ensemble, ces résultats ouvriraient un nouvel axe de recherche pour l’équipe, fondé sur l’optimisation de la thérapie cellulaire à base de cellules CEA dans l’emphysème.

Procédures

Injection dans l'abdomen sur animal vigile. Durée de la procédure : 30 sec Instillation dans la trachée. Durée de la procédure : 5 min Xénogreffe par inhalation sous anesthésie générale. Durée de la procédure : 1 à 2 min Prélèvement des poumons sous anesthésie générale profonde. Durée de la procédure : 3 à 4 min. L’instillation d’élastase est une instillation unique, de même que l’instillation des cellules épithéliales alvéolaires humaines (à différents temps en fonction des groupes).

Impact sur les animaux

L’instillation endotrachéale peut générer une douleur légère au moment de l’anesthésie. Elles peuvent potentiellement générer du stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal, ou encore lors des déplacements de cage. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil. Le développement de l’emphysème dû à l’instillation de l’élastase conduit à des dommages du poumon qui peuvent entraîner des difficultés respiratoires (dyspnée) et potentiellement une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue de leurs procédures respectives afin de prélever et d’étudier leurs poumons.

Remplacement

Les modèles de culture cellulaire, qu’ils soient en 2D ou en 3D, ne permettent pas de reproduire l’emphysème. Ils ne permettent pas non plus d’appréhender la faisabilité et les effets d’une greffe de CEA dans le poumon ou d’évaluer l’efficacité de traitements visant à atténuer cette pathologie. À l’inverse, le modèle murin d’emphysème induit par l’élastase est un modèle largement utilisé et validé pour l’étude de l’emphysème. Il permet d’évaluer l’effet thérapeutique de la greffe de CEA dans un contexte physiologique de lésion pulmonaire. De plus, si ce modèle permet de réparer le poumon lésé chez la souris grâce aux cellules implantées, cela suggérera que ces cellules d’intérêt jouent un rôle clé dans la régénération pulmonaire. L’identification et la caractérisation des cellules greffées capables de restaurer la fonction pulmonaire permettront ainsi de les définir comme des cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 169. Cela correspond au minimum pour obtenir des résultats pour une expérience pilote. Des expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=8 d’animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans nos modèles d’emphysème.

Raffinement

Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les porteurs de ce projet. Une surveillance accrue de notre part sera faite durant les 24h suivant l’instillation d’élastase. Les souris seront hébergées en groupe de 5 par cage dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi par des maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton. Les zootechniciens et les porteurs du projet seront en communication concernant le bien-être, la santé des animaux et le respect des points limites. Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine. Si nous sommes amenés à avoir un mâle isolé, nous réduirons au maximum l’impact de cet isolement par une augmentation de l’enrichissement de son environnement et par le maintien de stimulations sociales indirectes (contacts visuels à travers la cage, contacts olfactifs en ajoutant de la litière provenant de la cage d’où il provient).

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée. Également, le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique instillation d’obtenir un emphysème important chez la souris et ce modèle est très utilisé dans la littérature. Les animaux ne seront pas utilisés avant l’âge de 2 mois, pour attendre la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris. Les souris seront utilisées quand elles pèseront au moins 25 g.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral est provoqué par un caillot bouchant une artère du cerveau, suivi d'une chirurgie sous anesthésie, d'observations au microscope jusqu'à deux heures et de tests moteurs, l'AVC pouvant laisser douleurs et déficits de mouvement. L'étude teste des nanoparticules censées mieux dégrader les caillots résistants sans provoquer de saignement, un bénéfice pour de futurs patients formulé au conditionnel. Le résumé insiste à plusieurs reprises sur le "confort", le "bien-être" et la douleur prise en charge, autour d'un protocole qui déclenche délibérément un AVC.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux, ou AVC, sont un problème de santé majeur dans le monde. Chaque année, ils touchent plus de 13 millions de personnes. Ils sont l’une des principales causes de décès et la première cause de handicap chez l’adulte. Un AVC se produit lorsque le cerveau ne reçoit plus suffisamment de sang. Dans la majorité des cas, cela arrive lorsqu’un vaisseau sanguin cérébral est bouché par un caillot de sang : on parle alors d’AVC ischémique. Pour traiter ces AVC, les médecins disposent d’un médicament visant à dissoudre ce caillot pour rétablir la circulation du sang. Cependant ce traitement n’est pas toujours efficace et il peut parfois provoquer des saignements dans le cerveau. Des recherches récentes ont montré que les caillots résistants au traitement contiennent des structures ressemblants à des filets et produits par des cellules sanguines. L’objectif de ce projet est de faciliter la dégradation des caillots résistants, tout en réduisant les risques de saignements liés au traitement actuel. Pour cela, nous proposons d’utiliser une enzyme capable de détruire les filets et fixée sur de très petites particules ayant elles-mêmes un effet protecteur sur les vaisseaux sanguins. Des études sur l’animal sont nécessaires pour comprendre comment ces caillots se forment dans le cerveau puis tester l’efficacité et la sécurité de ce nouveau traitement. Nous étudierons notamment son effet sur la circulation du sang et sur les handicaps après l’AVC. Ce projet pourrait, à terme, permettre de développer un traitement plus efficace et plus sûr pour les personnes souffrant d’un AVC. Tout au long de ces recherches, le bien-être animal est une priorité. L’utilisation d’animaux est strictement nécessaire, leur nombre est limité au minimum, et toutes les procédures sont réalisées par du personnel formé, avec une prise en charge de la douleur adaptée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation de petites particules protectrices des vaisseaux modifiées avec une enzyme capable de dégrader les structures responsables de la résistance des caillots permet d’améliorer la circulation du sang et donc l’état des patients après un AVC.

Procédures

Les animaux participeront à différentes étapes au cours de l’étude, toutes réalisées avec une attention particulière portée à leur confort et à leur bien-être. Pour soulager la douleur, les animaux recevront deux à quatre administrations de médicaments antidouleur, selon les besoins de chaque procédure. Ces produits seront injectés, sur des animaux éveillés, et chaque injection durera environ une trentaine de secondes. Une injection de glucose pourra être réalisée si les résultats de la première procédure de l’étude le rendent nécessaire. Cette injection sera effectuée sur des animaux éveillés et durera une dizaine de secondes. Une intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale, après l’administration de médicaments contre la douleur. L’ensemble de l’anesthésie et de la chirurgie durera environ une heure. Pour certaines observations, une nouvelle anesthésie générale sera nécessaire. Elle permettra d’observer la circulation du sang en temps réel à l’aide d’un microscope spécifique. Cette phase pourra durer jusqu’à deux heures. Avant ces observations, un produit fluorescent sera injecté sous anesthésie générale afin de mieux visualiser les vaisseaux sanguins. Quatre heures après le début de l’AVC, deux traitements seront administrés à des animaux anesthésiés. Le premier, contenant nos petites particules modifiées (ou une solution de contrôle), sera injecté en environ une minute. Le second traitement, utilisé pour dissoudre les caillots, sera administré lentement sur une durée totale d’environ trente minutes afin de garantir la sécurité des animaux. À la fin de l’étude, les animaux seront placés sous anesthésie générale profonde, après prise en charge de la douleur, afin de permettre le prélèvement des tissus sans souffrance. Après certaines interventions, une ou deux injections de solution hydratante, réchauffée à la température du corps, seront administrées pour favoriser une bonne récupération. Chaque injection durera environ trente secondes.

Impact sur les animaux

Le modèle d’accident vasculaire cérébral utilisé dans cette étude peut entraîner une douleur au réveil de l’anesthésie ainsi que des difficultés de mouvement ou de sensibilité. Ces effets sont considérés comme modérés. Après l’intervention, certains animaux peuvent également présenter une perte de poids ou une déshydratation, en particulier lorsqu’ils sont suivis pendant 24 heures. Là encore, ces effets sont modérés. Un stress lié à l’anesthésie ainsi qu’un inconfort temporaire dû aux injections peuvent survenir lors des différentes manipulations. Ces désagréments sont légers et de courte durée. Enfin, les tests de comportement réalisés dans le cadre de l’étude peuvent provoquer un léger stress ou une anxiété passagère chez les animaux, sans effet durable.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer du sang, le caillot et les tissus.

Remplacement

Des expériences réalisées en laboratoire, sur des cellules, ont permis de concevoir et de vérifier le fonctionnement des petites particules protectrices utilisées dans cette étude. Ces tests sont indispensables, mais ils ne suffisent pas à reproduire ce qui se passe réellement dans le cerveau lors d’un AVC, un phénomène complexe qui fait intervenir de nombreux mécanismes différents. L’utilisation de souris est donc nécessaire pour étudier l’efficacité de ces petites particules dans des conditions proches de la réalité. Le modèle expérimental utilisé consiste à provoquer la formation d’un caillot qui bouche une artère du cerveau. Il permet de reproduire les situations dans lesquelles le traitement utilisé par les médecins est moins efficace et/ou entraîne des effets indésirables lors de la dissolution du caillot. Il permet de mieux comprendre ses limites et de tester des solutions pour le rendre plus sûr et plus efficace.

Réduction

Afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats fiables, les groupes d’étude ont été préparés avec beaucoup de soin. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé à l’aide d’un outil informatique spécialisé, qui permet de déterminer précisément le minimum requis pour que les résultats soient interprétables. Cette organisation permet de limiter strictement le nombre de souris utilisées, tout en garantissant que l’étude puisse répondre correctement aux questions scientifiques posées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est une priorité tout au long de cette étude. Avant et pendant les expériences, les animaux vivent en groupe, dans des cages adaptées et enrichies, afin de favoriser leur confort et leurs comportements naturels. Pour éviter toute douleur, des médicaments contre la douleur sont systématiquement administrés avant et après les interventions. Avant la chirurgie, une anesthésie locale est appliquée sur la zone concernée afin de limiter toute sensation désagréable. L’intervention elle-même est réalisée sous une anesthésie générale adaptée, permettant aux animaux de ne rien ressentir pendant l’opération. Après la chirurgie, les animaux sont étroitement surveillés jusqu’à leur réveil complet. Un suivi régulier de leur état de santé est ensuite assuré à l’aide de critères précis permettant de détecter rapidement toute gêne ou souffrance. Si un animal présente des signes de douleur ou de mal-être, des mesures immédiates sont mises en place pour le soulager. Lorsque cela s’avère nécessaire, et afin d’éviter toute souffrance prolongée, l’animal peut être mise à mort conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Des recherches précédentes ont montré que les études menées chez la souris sont adaptées pour mieux comprendre les maladies qui touchent les vaisseaux du cerveau. Le modèle utilisé dans ce projet consiste à provoquer la formation d’un caillot qui bouche une artère du cerveau. Il reproduit de façon proche ce qui se passe chez l’être humain lors d’un accident vasculaire cérébral (AVC). Ce modèle permet également d’étudier l’effet du traitement actuellement utilisé pour dissoudre les caillots et d’en évaluer les limites. L’utilisation de ce modèle chez l’animal est indispensable pour tester l’efficacité des petites particules protectrices, utilisées seules ou en association avec le traitement de référence. Elle permet d’observer leur impact sur la reprise de la circulation du sang dans le cerveau ainsi que sur les troubles neurologiques liés à l’AVC. L’AVC est un phénomène complexe qui fait intervenir de nombreux mécanismes agissant en même temps. Ces interactions ne peuvent pas être entièrement reproduites en laboratoire sur des cellules seules, ce qui rend l’expérimentation animale nécessaire pour répondre aux objectifs de cette étude.