Recherche fondamentale
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Le rôle de PRL2 dans la lymphangiogenèse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
436 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes, des nouveau-nés et des adultes reçoivent des injections de tamoxifène, et une partie subit une chirurgie de prélèvement d'un fragment de peau du dos, pour étudier le rôle d'une protéine dans la formation des vaisseaux lymphatiques. Le porteur indique une euthanasie immédiate en cas de saignement péritonéal, de mort des embryons dans l'utérus ou de nouveau-nés délaissés. Les animaux sont mis à mort pour prélever plusieurs tissus, le remplacement étant écarté au motif que le développement embryonnaire ne se reproduit pas in vitro.
Objectifs
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse (la formation des vaisseaux lymphatiques) afin de comprendre les mécanismes de la formation des vaisseaux lymphatiques. Ce projet se divise en deux axes : (1) Déterminer si notre protéine d'intérêt est impliquée dans la lymphangiogenèse pendant le développement embryonnaire et à quel stade précisément. (2) Déterminer si cette protéine est impliquée dans la lymphangiogenèse chez l’adulte dans un contexte de cicatrisation de tissue.
Bénéfices attendus
La lymphangiogenèse est un sujet de recherche relativement récent et bien qu’il y ait des avancées majeures dans la compréhension de ce processus, beaucoup d’aspects restent encore à être étudier, notamment le rôle des régulateurs intracellulaires dans la formation des vaisseaux lymphatiques. Parmi ces régulateurs, nous avons principalement des protéines kinases et des protéines phosphatases. Dans ce projet, nous proposons d’étudier une protéine phosphatase qui a déjà un effet modulateur dans le développement vasculaire sanguin. Le système vasculaire sanguin et lymphatique ayant des mécanismes similaires, nous pensons que cette phosphatase aurait également un rôle régulateur sur la formation des vaisseaux lymphatiques. Les résultats préliminaires in vitro montrent que notre phosphatase d’intérêt a un effet sur la prolifération et la migration des cellules endothéliales lymphatiques, mais également sur la formation de structure tubulaire par ces cellules. Ceci suggère que cette phosphatase pourrait donc avoir un rôle dans la régulation de la lymphangiogenèse. Si cela est aussi observé in vivo, ce projet nous permettra d’ajouter un nouveau régulateur dans le processus et également une meilleure compréhension du rôle des phosphatases dans la lymphangiogenèse. La lymphangiogenèse est un processus important pour le bon fonctionnement de l’organisme et un dérèglement de ce processus entraîne souvent le développement ou l’aggravation d’une pathologie comme par exemple les lymphoedèmes ou les métastases. Ainsi, tout régulateur de la lymphangiogenèse peut devenir une cible thérapeutique pour activer ou inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques afin de prévenir ou de guérir les pathologies. Par exemple, dans le cas des cancers avec un risque de métastase, les deux voies les plus probables pour les cellules tumorales sont les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Donc, en inhibant la formation de ces vaisseaux à la périphérie de la tumeur, le risque de métastase diminue. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de lymphangiogenèse comme adjuvant, comme les anti-angiogéniques, pourrait améliorer le traitement des cancers. Or, pour inhiber la lymphangiogenèse, il est nécessaire de comprendre le mécanisme de formation des vaisseaux pour pouvoir cibler les régulateurs. Dans notre cas, notre phosphatase d’intérêt pourrait devenir une cible pour inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques.
Procédures
Un total de 108 femelles gestantes recevront deux injections intrapéritonéales d’hydroxytamoxifen sur deux jours consécutifs (E9-E10, E11-E12 ou E13-E14) et seront euthanasiées à E18. Un total de 208 nouveaux-nés recevront également 2 injections intrapéritonéales d’hydroxytamoxifen à P1 et P3 et seront anesthésiés à P7. 120 souris entre 8 et 10 semaines recevront 3 injections intrapéritonéales de tamoxifen par semaine pendant 2 semaines. Chaque injection intrapéritonéale prend moins d'une minute par souris. Les souris injectées avec du tamoxifen subiront par la suite une chirurgie de 5 minutes pour un prélèvement de peau de 8 mm de diamètre sur le dos. Durant la chirurgie, elles seront sous anesthésie générale (isoflurane), sous anesthésie locale cutanée (crème Anesderm 5%) et sous analgésique (buprénorphine). Ces souris recevront ensuite une application quotidienne de vaseline (moins d'une minute par application) et seront ensuite suivies pendant une vingtaine de jours avant d’être euthanasiées. Les injections d'hydroxytamoxifen et de tamoxifen servent à induire l'extinction d'expression de notre protéines d'intérêt dans les cellules composant les vaisseaux lymphatiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous croiserons deux lignées de souris différentes afin d'obtenir une nouvelle lignée de souris avec une délétion spécifique de notre protéine phosphatase dans les cellules endothéliales lymphatiques. Au laboratoire, nous travaillons également avec une lignée de souris ayant une délétion ubiquitaire d'expression de notre protéine phosphatase et également une lignée de souris ayant une délétion spécifique de notre protéine phosphatase au niveau des vaisseaux sanguins et lymphatiques. Aucun phénotype délétère n’a été observé chez ces deux lignées lors de l'extinction d'expression de la protéine. De ce fait, la lignée de souris que nous établirons pour projet ne devrait pas présenter de phénotype dommageable. Cependant, l’apparence et le comportement des animaux seront tout de même observés pour prévenir d’un quelconque phénotype dommageable. En cas de cachexie, de prostration, de tremblements ou d’autre comportement anormal, l’animal sera immédiatement sacrifié. La création de cette lignée de souris sera suivie et validée par la SBEA.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses visant à déterminer la formation des vaisseaux lymphatiques. Les vaisseaux lymphatiques forment un réseau vasculaire dans le corps entier des animaux. Ainsi plusieurs tissus seront récupérés sur l'animal (oreille, diaphragme, mésentère et peau).
Remplacement
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse (formation des vaisseaux lymphatiques), autant au niveau développemental que chez l’adulte. Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire les conditions de développement embryonnaire et de cicatrisation in vitro. Le développement embryonnaire est un processus complexe où chaque étape est importante pour que la suivante puisse commencer. La formation des vaisseaux lymphatiques suit également cette logique et chaque étape importante a déjà été lié à un stade de développement particulier chez l'embryon de souris. Ainsi, le modèle murin nous permet d'étudier le rôle de notre protéine à des étapes précises de la formation des vaisseaux lymphatiques. La formation des vaisseaux lymphatiques implique également des interactions complexes avec d'autres cellules de l'organisme, comme les cellules immunitaires dans le cas d'une cicatrisation. Or ces interactions celulle-cellule sont difficile à reproduire car tous les mécanismes ne sont pas encore décrit.
Réduction
Pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochables, nous utiliserons 10 souris de chaque génotype/expérience. Expériences répétées 4 fois (1 expérience pour ajuster les protocoles et 3 expériences pour prouver la reproductibilité des résultats). Nos génotypes d’intérêt premier sont les souris avec une délétion inductible de notre protéine et les souris sans délétion inductible. Nous aurons aussi des animaux contrôle secondaire pour vérifier que le gène d'induction de la délétion n'a pas d'effet seul. Si aucun effet n’est observé lors des 2 premières expériences, nous exclurons ces souris par la suite pour réduire le nombre d’animaux. Nous avons optimisé nos croisements pour n’obtenir que les génotypes d’intérêt à chaque portée, ce qui est d’autant plus important lors de nos expériences au stade embryonnaire et post-natal, où le génotype n'est pas connu, pour limiter le nombre d’animaux. Nous ferons des croisements séparés pour les souris contrôle secondaire, afin de pouvoir les exclure facilement si nécessaire. Nombre maximal d’animaux estimé = 436. Les études statistiques seront réalisées grâce à un test ANOVA afin de comparer les différents groupes génotypiques entre eux dans chaque expérience.
Raffinement
Une surveillance d’une grande attention sera faite après chaque geste expérimental. Pour les injections intrapéritonéales, 10 minutes d’observation et une vérification 1h après. En cas d’inconfort ou de souffrance, l’animal sera tout de suite pris en charge par les soigneurs et sacrifié si son état est trop grave. En cas de saignement au niveau de la cavité péritonéale, l’animal sera immédiatement sacrifié. Pour les femelles gestantes, en cas de mort intra-utérine des embryons la femelle sera immédiatement euthanasiée. Pour les nouveaux-nés, s’ils ne se nourrissent plus ou sont mis à l’écart, ils seront euthanasiés. Dans le cas des tests de cicatrisation, un analgésique et un anesthésiant local seront utilisés en plus de l’anesthésie générale lors de la chirurgie et les souris seront placées sur un tapis chauffant. Suite à la chirurgie, de la vaseline sera appliquée quotidiennement pour couvrir la plaie et la maintenir humide. Pour ne pas influencer les résultats, l’utilisation d’un désinfectant ne se fera qu’en cas d’infection ou de suppuration. Si l’état de l’animal s’aggrave et sans amélioration après traitement, il sera sacrifié. Les cages seront enrichies en accord avec la procédure expérimentale. Des tunnels seront présents dans chaque cage. Pour les femelles gestantes ou avec des petits, il y aura un enrichissement de la litière en copeaux et des accessoires de nidification. Pour les animaux en cicatrisation, les cages seront aménagées pour que chaque animal soit isolé, mais avec un contact visuel et olfactif avec son congénère. Pour toutes les procédures expérimentales, il y aura un suivi quotidien des animaux et chaque changement physique ou comportemental sera noté sur une fiche de suivi hebdomadaire. Tout comportement anormal grave comme la prostration ou des tremblements entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal. Pour des changements plus légers, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et une décision sera prise en concertation avec le vétérinaire, les soigneurs et le responsable du projet pour définir la meilleure prise en charge de l’animal. Les soins seront toujours effectués par les mêmes expérimentateurs pour réduire le stress des animaux et tout le personnel de l’animalerie impliqué dans ce projet a les compétences et l’expérience nécessaire pour la partie expérimentale. Au cours du projet, nous nous maintiendrons informer des possibles améliorations de raffinement adaptables à nos procédures.
Choix des espèces
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse, autant au niveau développemental que chez l’adulte. Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro. Par des tests fonctionnels in vitro, nous avons déjà établi que la diminution d’expression de notre protéine dans les cellules endothéliales lymphatiques formant les vaisseaux impacte les processus biologiques essentiels à la lymphangiogenèse. Afin de confirmer l’importance de cette protéine phosphatase dans la formation des vaisseaux lymphatiques, nous voulons donc passer à un modèle murin avec une délétion spécifique de la protéine dans les cellules endothéliales lymphatiques. La lignée de souris de notre projet sera obtenue par le croisement de deux lignées déjà existantes et cette lignée permettra de déléter spécifiquement notre protéine phosphatase au niveau des vaisseaux lymphatiques. Ce modèle nous permettra ainsi d’étudier le rôle de notre protéine dans la formation des vaisseaux lymphatiques, aussi bien au niveau développemental que chez l’adulte. Les procédures au niveau dévelopemental impliquent 2 injections d’hydroxytamoxifen à des femelles gestantes au stade embryonnaire E9-E10, E11-E12 ou E13-E14. Ces stades de développement correspondent à différentes étapes importantes de la formation du système vasculaire lymphatique : formation des sacs lymphatiques, développement des vaisseaux collecteurs et formation des valves. Les embryons seront récupérés à E18 pour analyse du réseau lymphatique. Pour le développement vasculaire lymphatique post-natal, des nouveaux-nés recevront 2 injections d’hydroxytamoxifen, à P1 et à P3, et seront sacrifiés à P7. Pour définir le rôle de notre protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse chez l’adulte, nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 10 semaines pour les expériences de cicatrisation. Cela nous assure une cicatrisation optimale de la plaie avec un système immunitaire performant pouvant induire la lymphangiogenèse.
Un modèle murin d’étude de la réparation de l’ADN dans le développement du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
522 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie de 30 à 45 minutes pour introduire un marqueur fluorescent dans les embryons par électroporation, afin d'étudier des lésions programmées de l'ADN dans le cerveau en développement. Le porteur indique des injections d'analgésiques avant et après l'opération et une surveillance quotidienne, avec euthanasie en cas d'atteinte de points limites. Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes, et le porteur affirme que ces questions ne peuvent s'étudier que sur le mammifère "in toto".
Objectifs
Les cassures de l’ADN sont des lésions génomiques très toxiques qui interviennent lors du développement du système nerveux central. Des mécanismes puissants de réparation de ces lésions évitent l’instabilité génétique qu’elles pourraient engendrer. La mauvaise réparation de ces lésions est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme comme certaines maladies neurodégénératives, des déficits immunitaires sévères et le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des lésions de l'ADN se traduisent par une létalité embryonnaire tardive consécutive à la mort des neurones. Plusieurs facteurs impliqués dans diverses voies de réparation des dommages à l'ADN ont été identifiés à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme et analysés dans des modèles animaux d’invalidation génique afin d’en mieux comprendre la fonction. L'objectif du présent projet est d'identifier les raisons de la létalité embryonnaire de certaines lignées de souris déficientes en voie de réparation de l'ADN. Nous émettons l'hypothèse que certains dommages programmés de l'ADN dans le cerveau en développement sont à la base du phénotype. Nous projetons de générer une lignée de souris mutantes incapables de générer ces lésions et d'évaluer si ce fonds génétique peut sauver la létalité embryonnaire des animaux déficients en réparation de l'ADN. De plus nous produirons une souris reportrice pour suivre les cellules dans lesquelles interviennent ces lésions programmées.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est la détermination de la fonction des lésions programmées de l’ADN dans les phases précoces du développement du cerveau. Cette fonction est jusqu'à présent inconnue. Cette étude nous permettra alors de mieux comprendre la mort cellulaire neuronale et la létalité embryonnaire qui en découle chez les animaux porteurs d'anomalies de la réparation de l'ADN. In fine, cette étude participera à la compréhension de maladies génétiques de l'enfant caractérisées par des anomalie du développement, l'existence de microcéphalies ainsi que le développement de tumeurs cérébrales et les mécanismes de vieillissement accéléré.
Procédures
Pour l'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN, des embryons à E12.5 ou 14.5 recevront par électroporation in utero (en une seule intervention et sous anesthésie générale) des souris femelles gestantes un marqueurs fluorescent de ces dommages . La chirurgie dure entre 30 et 45 min selon le nombre d’embryons avec 45 min comme durée maximum.
Impact sur les animaux
Les souris avec un défaut de réparation de l'ADN ont un phénotype dommageable connu ; une létalité embryonnaire. Nous n’envisageons pas de phénotype dommageable des deux lignées mutantes faisant l’objet de ce dossier. L’analyse des lésions de l’ADN dans le cerveau par l'introduction intra-embryonnaire d'un marqueur fluorescent peut présenter quelques nuisances liées à l'expérimentation. Afin de minimiser ces nuisances, les souris placées sur une plaque chauffante reçoivent une anesthésie générale ainsi que des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré- et post-opératoire. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou l'euthanasie de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques
Remplacement
Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du cortex des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux avec défaut de réparation de l'ADN nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité́ embryonnaire, baisse de viabilité́ avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Selon le calcul de puissance effectué sous G*Power (puissance de 0.8 et une p-value de ≤0.05), l'évaluation du caractère dommageable nécessite 65 animaux pour la lignée Pgbd5 KO, 289 animaux pour les croisements de Pgbd5 sur fonds génétiques XRCC4 ou PAXX/Xlf KO et 65 animaux pour la lignée reportrice. L’analyse statistique sera réalisée par un test non-paramétrique Mann-Whitney de comparaison de fréquences.
Raffinement
Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone EOPS afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement euthanasiés. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure. Lors de la procédure #2 la litière utilisée dans la cage est spécifique pour les animaux opérés et permet de diminuer le risque d'infection de la cicatrice. La nourriture ainsi qu’un gel hydrique sont placés directement dans la litière pour une meilleure accessibilité. Lors des actes chirurgicaux, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées (Isoflurane, induction : 3%, maintien : 2%) et reçoivent des injections sous-cutanées (seringues 27G, volume injecté de 5µl/g) d'analgésiques en pré́- (Buprenorphine 0,05μg/g) et post-opératoire (Kétoprofène 5μg/g). La couverture antalgique du kétofene dure 36h post opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou l'euthanasie de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. L'analyse des phénotypes dommageables éventuels se fait sur des femelles gestantes pour la létalité embryonnaire et sur des animaux nouveau-nés de la naissance jusqu'au sevrage pour la baisse de viabilité. L'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN est effectuée sur des embryons à E12.5 et E14.5. Les embryons sont ensuite analysés à E16.5 et E18.5 après activation du marqueur fluorescent.
Etude de la fonction de la protéine CKIP1 dans les microglies de souris EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections d'un composé (tamoxifène) cinq jours de suite, avant prélèvement du cerveau, pour étudier le rôle d'une protéine dans les cellules immunitaires du cerveau. Le porteur décrit l'inconfort comme lié aux injections répétées, sans détailler d'autre suivi que le poids et un scorage de posture et de toilettage. Il s'agit d'une recherche fondamentale dont les bénéfices annoncés restent la connaissance générale et une cible pharmacologique "potentielle".
Objectifs
Les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central façonnent les réseaux de neurones au cours du développement. Chez l’adulte elles participent à la surveillance et l’entretien du cerveaux en éliminant les cellules mortes ou inutiles. Dans le cerveau sain, les cellules immunitaires ont une morphologie complexe caractérisée par des prolongements ramifiés en perpétuelles mouvements. Ces mouvements sont importants car grâce à eux les cellules peuvent explorer le cerveau à la recherche de dysfonctionnements. Il se trouve que dans la plupart des pathologies du cerveau le mouvement de ces prolongements s’arrêtent et il est difficile de savoir si l’arrêt de ces mouvements est une cause ou une conséquence de la pathologie. De plus les mécanismes cellulaires contrôlant ces mouvements sont pour la plupart inconnus. Il est donc important de comprendre le fonctionnement de ces mouvements et leur rôle exact pour mieux comprendre leurs impacts sur les pathologies du cerveau. Nous avons identifié une molécule exprimée par ces cellules immunitaires qui pourrait être impliquées dans ces mouvements, nous proposons de la supprimer pour étudier les effets sur le fonctionnement des cellules et la réponse cellulaire lors d’une inflammation mimant une pathologie. Ce projet a deux objectifs principaux. 1) Caractériser le rôle de cette protéine dans la physiologie des cellules immunitaires du cerveau. 2) Etudier les répercussions de l’invalidation de la protéine sur la neuro-inflammation, et le fonctionnement du cerveau. Ces expériences nous permettront de mieux comprendre la fonction de cette protéine mais également de d’appréhender le rôle que jouent les cellules immunitaires aux cours des pathologies du système nerveux central.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’un projet de recherche fondamentale dont les résultats bénéficieront à la connaissance générale du système nerveux central tant chez l’homme que l’animal, et permettront de mieux comprendre les interactions entre le système nerveux central et le système immunitaire. Les résultats attendus de cette recherche permettront de mieux comprendre les processus cellulaires conduisant aux pathologies neurodégénératives du système nerveux central et aux troubles engendrés par l’auto-immunité. Il permettra surtout de mieux comprendre les voies de signalisations associées à notre protéine d’intérêt et d’en faire une potentielle cible pharmacologique.
Procédures
Une Injections IP de tamoxifene sur 5 jours consécutifs/ animal. Chaque injection se fait en 30 secondes max/animal. Prélèvement de tissus sur des animaux morts (432).
Impact sur les animaux
Inconfort lié à l’injection répétée de tamoxifène
Devenir
Mise à mort pour récolter les tissus et faire des analyses morphologique et transcriptomiques
Remplacement
Il s’agit d’un projet de recherche fondamental visant à étudier le rôle d’une protéine jusqu’alors inconnue. Les expériences réalisées dans ce projet ne peuvent donc pas être modélisées. Nous travaillons sur des cultures de cellules primaires provenant d’animaux nouveaux nés ou réaliserons des études histologiques sur des cerveaux de souris pour obtenir nos données.
Réduction
Les lots et procédures ont été élaborés de manière à optimiser les groupes contrôles et à éviter la redondance. Les effectifs ont été déterminés à l’aide d’un test statistique de puissance. La significativité sera déterminée à l’aide de test ANOVA ou non paramétrique si la normalité des échantillons n’est pas obtenue. Il s’agit de travaux originaux jamais réalisés à notre connaissance dans la littérature.
Raffinement
Afin de limiter le nombre d’expériences et l’inconfort lié aux expériences in vivo, nous avons développé un modèle de culture dans lequel la morphologie de nos cellules d’intérêt est préservée. Ceci nous permettra de limiter l’utilisation de souris entière pour réaliser nos expériences. De façon générale le bien-être des animaux sera évalué de façon quotidienne. Les souris seront observées dans leurs cages pendant plusieurs minutes puis pesées. L’évaluation se fera selon un scorage établi (posture, poids, toilettage) de sorte à identifier les points limites.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle car couramment utilisée au laboratoire. Les souris permettent d’avoir recours à des animaux transgéniques. Il existe une abondante littérature sur le fonctionnement synaptique chez la souris ce qui évitera de reproduire certaines expériences pour valider notre modèle. Pour la culture cellulaire les animaux seront âgés de 2 à 5 jours lors des injections stomacales de tamoxifène et de 10 jours lors de la mise en culture. Cet âge permet d’obtenir une résistance suffisante aux conditions d’hypoxie et d’ischémie des cellules rencontrées lors de la mise en culture et une maturation suffisamment avancée pour obtenir des cellules ramifiées. Les expérimentations in vivo seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 6-10 semaines.
Evaluation de la fertilité après induction et synchronisation des ovulations en utilisant une molécule GnRH de synthèse chez la brebis
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système urogénital
60 brebis de race Lacaune vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes gardées en vie dans l'établissement à l'issue. Chaque animal reçoit un implant de mélatonine et une injection intramusculaire, et subit dix-huit prises de sang, pour tester une hormone de synthèse censée déclencher et synchroniser les ovulations en dehors de la saison sexuelle. Le porteur inscrit le projet dans le remplacement d'une hormone existante par une molécule posant selon lui moins de problèmes de "bien-être animal", à des fins d'insémination en élevage. Il affirme qu'aucune alternative n'existe pour étudier l'efficacité de ces hormones sur l'ovulation.
Objectifs
La reproduction chez les ovins et caprins est saisonnée. Chez les deux sexes, il existe au cours de l’année une période d’activité sexuelle maximale (saison sexuelle), en général d’août à janvier, et une autre d’activité minimale ou de repos sexuel (contre-saison), en général de février à juillet. La durée de la saison sexuelle est très variable selon les races. La reproduction des brebis et des chèvres en contre-saison permet aux éleveurs d’étaler la production de lait ou de viande sur l’année, et ainsi de répondre à la demande des consommateurs.
Bénéfices attendus
La reproduction chez les ovins et caprins est saisonnée. Dans le cadre d’une mise à la reproduction des brebis et des chèvres en période de contre-saison (période de repos sexuel, pratique appelée « désaisonnement »), l’insémination animale est pratiquée chez les petits ruminants quasi exclusivement après un traitement hormonal d’induction et de synchronisation des chaleurs et des ovulations (mimant les mécanismes endocriniens), méthode aujourd’hui la plus efficace pour désaisonner la mise à la reproduction. Le projet s'inscrit dans un contexte d'évolution des pratiques de maîtrise de la reproduction vers la réduction, voire la suppression, de l’utilisation de traitements hormonaux pour la synchronisation des chaleurs et des ovulations. La recherche de méthodes alternatives est en cours via le développement et/ou l’évaluation de traitements vétérinaires (molécules de synthèse) posant moins de problème en termes de bien-être animal et d’enjeux environnementaux.
Procédures
Les brebis seront soumises à une pose d'implant sous-cutané de mélatonine (une seule fois par brebis, durée moyenne d'environ 30 secondes), à des injections par voie intramusculaire (une seule injection par brebis, durée de quelques secondes) et à des prises de sang (au total 18 prélèvements/brebis, durée de prélèvement moyenne d'environ 30 secondes par brebis).
Impact sur les animaux
Lors des prises de sang (par ponction à la veine jugulaire), des injections (par voie intramusculaire) et de la pose des implants sous-cutanés de mélatonine, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général. Une surveillance journalière de l’état général des animaux et du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite) voire d’une infection. La contention des animaux pour les interventions réalisées par les animaliers (en binôme) est faite dans un espace réduit en présence de congénères pour limiter le stress. La présence journalière répétée des animaliers lors de l'alimentation et des soins est associée à une diminution du stress des animaux.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie dans l'établissement utilisateur à l'issue du projet.
Remplacement
L’étude de l’efficacité des hormones gonadotropes sur l’induction et la synchronisation des ovulations chez les brebis ne peut être réalisée qu’avec l’utilisation d’animaux vivants. Aucune alternative n’existe.
Réduction
Le projet utilisera 60 brebis réparties en 5 lots de 12 brebis. Les variables étudiées seront la proportion de brebis ovulant après traitement, le jour d’augmentation de progestérone plasmatique > 0,5 ng/ml et la proportion de brebis gestantes. Des calculs de puissance ont été faits avec ces 3 variables afin de déterminer le nombre de brebis/lot. Le nombre minimum de brebis à inclure par lot est déterminé par la variable proportion de brebis gestantes. Avec 12 brebis par groupe, nous pourrons montrer : # une différence notable pour la proportion de brebis ovulant après traitement, entre 67 % (8/12, observée dans des études antérieures avec GnRH) et 100 % (12/12, attendue dans le lot témoin avec eCG) avec un risque alpha (p) de 5 % et une puissance de 83 %. # une différence (>= 1,5 jours ± 1 jour) du jour moyen d’augmentation de progestérone après ovulation (entre le groupe avec eCG et un groupe avec GnRH) avec un risque alpha de 5 % et une puissance de 92 % (test de Mann et Whitney). # une différence notable pour la proportion de brebis gestantes, entre 17 % (2/12, échec de fertilité dans les lots avec GnRH) et 67 % (8/12, fertilité attendue dans le lot témoin avec eCG) avec un risque alpha (p) de 10 % et une puissance de 83 %. L’objectif de cette étude exploratoire est de déterminer si les ovulations induites par la GnRH de synthèse sont fertiles et si la fertilité obtenue nous incite à poursuivre (ou pas) cette stratégie pharmacologique.
Raffinement
Les brebis passeront 6 semaines en bergerie de quarantaine avec une visite journalière pour l’alimentation et l’observation sanitaire. L’habituation des brebis à la manipulation dans ce nouvel environnement commencera au bout de 2 semaines après leur arrivée en quarantaine, avec une pesée. Après 4 semaines, les deux prises de sang pour le test de cyclicité seront réalisées. Après 6 semaines en bergerie de quarantaine, les brebis intègreront la bergerie de l’installation pour commencer le traitement de synchronisation des ovulations. Les lots expérimentaux seront alors constitués (habituation au parc de tri et marquage de la toison avec une peinture adaptée, pour repérer les lots). Afin de respecter la grégarité de l’espèce, les brebis sont placées ensemble sur litière paillée et leur contention pour les différentes interventions est faite dans un espace réduit en présence de congénères pour limiter le stress dû à l’isolement. La présence journalière répétée des animaliers lors de l'alimentation et des soins aux animaux est associée à une diminution du comportement de stress. Les brebis sont surveillées de façon journalière. Lors des prises de sang (par ponction à la veine jugulaire), des injections (par voie intramusculaire) et de la pose des implants sous-cutanés de mélatonine, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général. Les animaux seront tondus au niveau du cou pour une visualisation aisée des veines. Dans la mesure du possible, les prélèvements seront réalisés en alternant les veines jugulaires droite et gauche. Une surveillance de l’état général des animaux et du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite) voire d’une infection. En cas de signes de maladie (fièvre >40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé sur 48 h, anorexie, perte de poids >à 15%...) un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil ou avec son intervention si nécessaire.
Choix des espèces
L’espèce ovine, et notamment la brebis de race Lacaune laitière, est la cible de l’étude de façon à remplacer l’utilisation de l’hormone eCG dans le cadre du traitement d’induction et de synchronisation des ovulations utilisé en élevage (afin de pratiquer l’insémination animale). De façon à tester l’efficacité d’hormones gonadotropes pour contrôler le cycle oestrien des brebis, le projet utilisera des brebis adultes de race Lacaune, sexuellement matures et ayant déjà agnelé lors d’une reproduction antérieure.
Etude des effets antagonistes du sélénium sur la toxicité au mercure chez les géniteurs de truite arc-en-ciel.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
5 778 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère, une partie mise à mort sous anesthésie sans réveil. Reproductrices et alevins sont nourris pendant plusieurs semaines avec un aliment contenant du méthylmercure à quatre fois la limite légale, pour étudier l'effet protecteur du sélénium sur cette contamination. Le porteur revendique des retombées pour la santé humaine et pour la valorisation de coproduits de thon dans l'élevage de la truite. Il affirme que l'étude des mécanismes chez la descendance ne peut être menée sur lignée cellulaire ni par modélisation.
Objectifs
L’objectif de ce projet sera de mieux comprendre et caractériser l’antagonisme du sélénium vis-à-vis du méthylmercure dans l'alimentation des géniteurs de truite arc-en-ciel, principale espèce aquacole produite en France, sur son métabolisme, sa détoxication, ainsi que sur les paramètres antioxydants et la réponse pro-inflammatoire chez la descendance.
Bénéfices attendus
Ces travaux auront ainsi des répercutions en santé humaine en améliorant les connaissances sur les conséquences qu’entraînent une exposition, par l’alimentation parentale, au méthylmercure sur la descendance. Cette expérimentation permettra aussi d’évaluer la possibilité d’utiliser des coproduits de thon comme ingrédient alternatif pour l’élevage de la truite arc-en-ciel.
Procédures
Trois prélèvement de sang au maximum de 2 mL chez les géniteurs de truites d'un poids moyen compris entre 0,6 et 1 kg anesthésiés dans un bain de benzocaïne (durée : environ 1 minute pour chaque prélèvement de sang). Alimentation pendant 6 mois de plusieurs lots de géniteurs de truite (90 animaux au total) avec un aliment contenant 2 ppm de méthylmercure. Alimentation pendant 3 semaines de plusieurs lots d'alevins de truite (1800 animaux au total) issus des géniteurs utilisés dans le projet avec un aliment contenant 2 ppm de méthylmercure.
Impact sur les animaux
La limite légale de mercure et de sélénium dans les aliments aquacoles est de 0,5 mg/kg, donc la dose la plus haute représente ici 4 fois la limite légale pour le mercure et 8 fois la limite légale pour le sélénium. Ces concentrations ont été choisies suite à un premier essai nutritionnel réalisé chez des truites juvéniles ainsi qu’une étude bibliographique des effets du sélénium et du mercure chez les poissons au stade géniteur (Penglase et al., 2014 ; Khadra et al., 2019). Ces doses assurent l’observation d’un challenge pro-oxydant et inflammatoire par le mercure, tout en évitant une non métabolisation de ce dernier ainsi qu’un blocage de la reproduction ou une mortalité certaine des poissons. Une légère baisse de la croissance transitoire avait été observée chez les juvéniles et pourrait également être observée chez les géniteurs ou alevins, en plus de l'observation au niveau métabolique d'un stress oxydant et pro-inflammatoire limité.
Devenir
L’ensemble des animaux de l’expérimentation sera euthanasié et destiné au prélèvement d’échantillons pour analyses
Remplacement
S’agissant d’un essai nutritionnel chez des géniteurs de truite et dans le but d’étudier les mécanismes physiologiques et moléculaires qui en découlent chez la descendance, l’étude ne peut donc pas être réalisée sur des lignées cellulaires ou par des calculs et des modélisations informatiques.
Réduction
Le nombre de poissons mis en expérimentation est calculé a minima compte-tenu de la variabilité individuelle observée dans des études antérieures avec dix femelles et cinq mâles par bassin pour pouvoir obtenir suffisamment de pontes simultanées dans chaque lot pour la deuxième partie de l’essai sur la descendance. Avec 6 régimes testés chacun dans deux bassins, le nombre de géniteurs de truite mis en expérimentation sera de 6x2x15=180. A J0, 9 poissons n’ayant pas encore reçu de régime expérimental seront prélevés pour les analyses, soit un total de 189 géniteurs utilisés pour cet essai sur les géniteurs.
Raffinement
Les procédures sont raffinées avec des conditions d’élevage optimisées énoncées ci-dessus. Les animaux seront nourris à satiété visuelle afin d’assurer leur bien-être et ne pas polluer le milieu par une trop grande distribution d’aliment qui ne serait pas consommé. Les effectifs seront limités afin de réduire les rejets dans l’eau. La supplémentation en mercure organique sera testée car mieux assimilée que la forme inorganique, donc potentiellement plus toxique pour l’animal mais moins polluante au niveau environnemental. Les doses minimales à partir desquelles un effet est visible ont été choisies. Le mercure sera ajouté avant extrusion de l’aliment afin de limiter sa potentielle dissolution dans le milieu aquatique. Un mélange attractant sera ajouté dans l’aliment végétal afin de maximiser la prise alimentaire. Des analyses de mercure seront réalisées en cours d’essai afin de vérifier l’absence de pollution de l’eau. Si tel était le cas, l’essai serait stoppé.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est la première espèce piscicole produite en France et a donc un poids agronomique et commercial important, ce qui en fait un choix privilégié pour cet essai, en plus de son intérêt scientifique : espèce à gros œufs avec alevins contenant de larges réserves vitellines issues des dépôts maternels. Les animaux utilisés seront des géniteurs de truites femelles et mâles avec un ratio 2/1, afin d’être dans les conditions optimales de reproduction et pouvoir étudier l’effet de l’alimentation parentale : maternelle et paternelle (en particulier pour les effets épigénétiques) chez la truite arc-en-ciel.
Etudes des propriétés intrinseques des neurones néocorticaux chez trois modèles transgéniques (souris) de maladie neurodéveloppementale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 216 souris issues de trois lignées transgéniques censées reproduire des troubles neurodéveloppementaux vont être utilisées, certaines pour quatre heures d'enregistrement de l'activité cérébrale sous anesthésie, d'autres pour sept jours de tests comportementaux, à raison de vingt minutes par jour. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré ou se déroulent sous anesthésie sans réveil. À l'issue, 540 souris sont gardées en vie pour de futures expériences, les autres sont tuées, une partie encore sous anesthésie pour prélever leur cerveau, une autre au CO2. Les tests, censés mesurer l'anxiété et la réaction aux sons et au toucher, ne sont pas nommés, et le porteur écrit qu'un traitement des défauts sensoriels "a le potentiel d'améliorer d'autres symptômes" de ces troubles.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux (TN) touchent environ 1 enfant sur 60. Les facteurs génétiques, ainsi que les facteurs environnementaux, jouent un rôle important dans l'étiologie de ce trouble complexe. Certains TN se caractérisent par des déficiences en matière de communication et d'interaction sociale ainsi que par des comportements stéréotypés répétitifs. Les personnes atteintes de ce trouble présentent souvent une réponse inappropriée aux stimuli sensoriels. Cette sensibilité anormale peut avoir un impact dévastateur sur leur vie quotidienne (par exemple, incapacité à porter certains vêtements, à tolérer le bruit ou la lumière dans un centre commercial ou une école) et peut entraîner des inégalités dans l'accès à l'éducation, etc. A ce jour, il n'existe aucun traitement permettant d'améliorer la vie de ces personnes. L'objectif de notre projet actuel est de mieux comprendre les processus neurobiologiques qui sous-tendent les défauts de traitement de l'information sensorielle dans les modèles murins de la TN. Nous effectuerons des enregistrements cérébraux et des tests comportementaux afin de tester la capacité de molécules potentiellement thérapeutiques à corriger les défauts de traitement sensoriel dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Notre projet s'attaque à des défis importants pour comprendre la base neurobiologique de l'expérience sensorielle atypique dans les TN (et sa remédiation). Les innovations particulières de notre approche sont (1) l'utilisation d'un système cérébral qui est hautement conservé entre les souris et les humains, fournissant ainsi un système modèle idéal pour les études translationnelles. (2) Nous utilisons une approche thérapeutique basée sur un mécanisme, soutenue par de solides données préliminaires et publiées et par la génétique humaine. Notre proposition aborde un certain nombre de défis importants en suspens dans la recherche sur les TN, y compris la pertinence de développer des approches expérimentales comparables dans les modèles de recherche humains et rongeurs, et le rôle critique des caractéristiques sensorielles altérées dans les TN. De plus, comme les caractéristiques sensorielles sont fortement déterminantes pour d'autres symptômes des TN, toute approche thérapeutique ciblant le traitement atypique de l'information sensorielle a le potentiel d'améliorer d'autres symptômes de ce trouble.
Procédures
Nous effectuerons des enregistrements cérébraux sur des souris anesthésiées qui recevront une analgésie tout au long de l'expérience pour gérer toute douleur. La durée de cette expérience sera de 4 heures. Nous effectuerons des tests comportementaux pour observer l'anxiété des souris et leur réaction aux sons et au toucher. Les souris seront manipulées et habituées avant ces tests comportementaux. Les tâches comportementales seront effectuées pendant 7 jours, à raison de 20 minutes maximum par jour.
Impact sur les animaux
Après avoir transférer les animaux vers l'animalerie expérimentale, une période d'acclimatation d'au moins 5 jours est observée avant le début de la procédure. Durant cette période, les animaux sont surveillés quotidiennement par l'expérimentateur et/ou les zootechniciens de l'animalerie. Pour atténuer les conséquences du stress lié à ce transfert, de la nourriture humide sera disponible (placée sur le sol de la cage). En cas de faiblesse ou de très petits animaux, les soins seront également complétés par des " packs de gel " et une surveillance renforcée sera mise en place (avec pesée des animaux si nécessaire). Surveillance quotidienne, fourniture de matériaux pour la construction du nid, et hébergement dans une cage collective sera fait pour réduire, éviter et atténuer toute forme de souffrance des animaux de la naissance à la mort.
Devenir
À la fin de la procédure 1, les souris seront gardées en vie pour des expériences ultérieures afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans les études futures. A la fin de la procédure 2, les souris seront euthanasiées humainement alors qu'elles sont encore sous anesthésie et leur cerveau sera collecté pour un examen morphologique des neurones. A la fin de la procédure 3, ces souris seront euthanasiées humainement par inhalation de CO2 par une personne formée et selon les méthodes réglementaires approuvées par la DDPP.
Remplacement
Le modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité des interactions neuronales nécessaire pour le traitement de l’information sensorielle qui demande un système intact. Le remplacement par les méthodes in vitro ou in silico n’est pas possible à ce jour. Cependant, certaines expériences préliminaires visant à tester le potentiel des nouvelles molécules thérapeutiques seront réalisées in vitro avant l'application de ces molécules chez l’animal.
Réduction
Pour les enregistrements cérébraux, notre strategie d’experimentation nous permet d’effectuer une analyse précoce de nos donnees au fur et a mesure et de modifier la taille d’echantillon si besoin. Pour les tests comportementaux, la taille de nos échantillons est similaire à celle suggérée par d'autres études similaires. Nous ne pouvons pas utiliser les mêmes souris dans les groupes non traités, administrés avec le véhicule et administrés avec le traitement, car cela aurait pour conséquence que les mêmes souris subissent chaque test comportemental plusieurs fois, ce qui pourrait confondre nos résultats comportementaux, comme cela a été rapporté dans plusieurs études précédentes. Il s'agit d'une considération particulièrement importante dans nos tests, car nous examinerons l'accoutumance sensorielle, qui pourrait être gravement affectée par la répétition des mêmes tests sur les souris plusieurs fois. Nous suggérons toutefois d'effectuer des tests pilotes pour vérifier ce point. De plus, nous ne pouvons pas réutiliser les souris comportementales de la procédure 1 de cette APAFiS car elles auront reçu le traitement. Cependant, les souris non traitées de ce groupe seront utilisées pour les tests pilotes mentionnés ci-dessus.
Raffinement
Avant expérimentation: Surveillance quotidienne et vérification de l’état de l’animal (posture, comportement, vivacité, état de pelage). Pendant les enregistrements cérébraux: Le séance d'enregistrement se fait sous anesthésie générale. Le mélange anesthésique utilisé a une action analgésique. Un crème ophtalmique (ocrygel) est appliqué aux yeux. L'animal est maintenu sur tapis chauffant. Durant la séance d’enregistrement la température de l’animal est contrôlée grâce à une sonde rectale. Pour les enregistrements longs: injection s.c. d'une solution physiologique (0.9% NaCl) Réduire au maximum l’angoisse : Hébergement de manière à correspondre aux besoins de l’animal – mise à disposition du matériel pour la construction d’un nid.
Choix des espèces
Ce modèle (la souris) a été choisi car les rongeurs ont un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant le traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, la souris est actuellement la seule espèce de mammifère dont il est possible de modifier le génome en routine pour créer des modèles de maladies humaines. 28 à 48 jours (procédure 1 et 2) : Justification : Conformément aux études précédentes réalisées, des animaux âgés de 28 à 48 jours seront utilisés. De 9 à 16 semaines d'âge (procédure 3) : Justification : Conformément aux études précédentes, les tests comportementaux de la procédure 3 seront réalisés sur des souris adultes (âgées de 9 à 16 semaines).
Évaluation préclinique de l’Accident de Décompression : injection post-plongée de nanocapsules contenant de la perfluorodécaline.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
76 rats Wistar vont être utilisés, tous les survivants tués à l'issue, dans des procédures que le porteur lui-même classe en gravité sévère. Chaque rat, cathéter posé dans la veine caudale, est maintenu en contention pendant une plongée hyperbare simulée de 83 minutes puis observé une heure, épisode décrit comme provoquant une douleur et une angoisse sévères, pour tester des nanocapsules d'oxygène contre l'accident de décompression. Le porteur indique qu'un analgésique est administré avant la plongée sans modifier l'apparition des symptômes, dont la paralysie fait partie du tableau clinique. Il affirme que l'accident de décompression ne peut être induit et étudié que chez l'animal, faute de marqueur biologique validé.
Objectifs
L’accident de décompression (ADD) représente le risque le plus grave chez les plongeurs subaquatiques professionnels et de loisir, mais concerne aussi toutes les personnes soumises à des modifications de la pression ambiante (patients et personnels des chambres hyperbares, pilotes, astronautes, ouvriers tunneliers…). Ses manifestations vont de la simple démangeaison jusqu’à la paralysie définitive ou, à l’extrême, au décès. Or, environ un tiers des personnes accidentées conserve des séquelles invalidantes malgré les traitements actuels. Il est donc nécessaire d’améliorer l’efficacité du traitement de cette pathologie. L’administration intraveineuse de solutions de perfluorocarbone (PFC) a montré son efficacité chez des modèles animaux (rongeurs et miniporcs). Ce transporteur d’oxygène est potentiellement efficace dans le traitement de nombreuses pathologies dont l’ADD. L’encapsulation du PFC dans des nanocapsules d’albumine (Albumin-derived perfluorodecalin-containing nanocapsules, A-PFC-N) offre des perspectives prometteuses. Ces préparations présentent une faible toxicité autorisant des applications thérapeutiques ; de plus, l’enveloppe d’albumine, soluble à la fois dans l’eau et les lipides, ne provoque pas de réaction immunitaire. Enfin, ces capsules sont stables en solution et peuvent être administrées par voie intraveineuse. Un travail récent a montré l’intérêt des A-PFC-N sur un modèle murin d’ADD en réduisant l’apparition des ADD. Aujourd’hui, notre objectif est de tester l’efficacité des A-PFC-N dans la prévention secondaire de l’accident de décompression chez un modèle murin d’ADD. Nous projetons ainsi d’appliquer ce traitement expérimental non plus en préventif, comme précédemment, mais après une plongée simulée, afin de se rapprocher des conditions susceptibles de se produire chez l’humain.
Bénéfices attendus
A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur l’étude de l’efficacité des nanocapsules d’albumine contenant de la perfluorodécaline en traitement secondaire de l’ADD. Nous allons pouvoir confirmer ou infirmer ce que nous avions déjà observé en comparant les différents groupes. A moyen terme, si les résultats sont confirmés positivement, une étude clinique pourra être envisagée pour le traitement secondaire de l’ADD chez l’humain. A long terme, les bénéficiaires seront tous les personnels susceptibles d’être atteints d’ADD.
Procédures
Tous les animaux (n=76) sont soumis à deux actes pendant la procédure. Dans un premier temps, pour chaque animal, un analgésique sera administré 1 heure avant la plongée simulée, avant qu'une anesthésie gazeuse ne soit réalisée. Puis, l'animal sera placé dans un tube de contention et un cathéter veineux souple sera implanté dans la veine caudale latérale. L'ensemble de ces gestes dure 10 minutes au maximum. Puis, toujours sous l’effet de l'analgésique et vigile, les 76 animaux seront maintenus en contention pendant le protocole hyperbare, qui est une procédure sévère et dure 83 minutes au maximum. A l'issue de la plongée simulée, tous les animaux recevront immédiatement, via le cathéter veineux, une injection dont le contenu est différent entre les groupes que nous avons constitués. Ils seront alors extraits du tube de contention et une observation stricte de l’évolution des symptômes sera réalisée pendant une heure à l’aide de la table de suivi de soin. Enfin, à l’issue de la période d’observation de 60 min, tous les animaux vivants seront anesthésiés et mis à mort.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : le stress généré par la mise en place du cathéter au niveau de la veine latérale caudale (intensité légère, durée 3 heures) ; le stress généré par le maintien du rat dans un tube de contention (intensité modérée, durée 2 heures) ; l’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules (intensité légère et durée maximale de 2 minutes) ; la douleur et l’angoisse lors de la plongée simulée et lors de la période d’observation de l’apparition des symptômes pendant une heure post-plongée (Intensité sévère, durée maximale deux heures) ; le stress généré par la préhension et l’injection de l'anesthésique à l'issue de la période d'observation (intensité modérée, durée maximale 2 minutes).
Devenir
A l’issue de la période d’observation de la plongée simulée, tous les animaux survivants seront mis à mort. Nous prélèverons du sang, des tissus, les organes d'intérêt pour des analyses multiples (Histologie des tissus prélevés, dosages biochimiques des paramètres inflammatoires, détermination des activités enzymatiques) afin de déterminer si notre traitement est efficace.
Remplacement
Les expérimentations cliniques induisant des accidents de décompression ne sont envisageables que chez l’animal. Chez l’humain, le risque d’ADD est quantifié à partir de la quantité de bulles veineuses circulantes, or les données récentes montrent clairement que cette mesure est très insuffisante. Par ailleurs, en l’absence de marqueur biologique validé de l’ADD, les approches in vitro ne peuvent être mises en œuvre que sur des échantillons de tissus prélevés sur des animaux préalablement soumis à des décompressions génératrices d’accidents de décompression. De même, les modèles cellulaires, par ailleurs utilisés au laboratoire, permettent d’étudier les effets de la pression ambiante, mais ne sont pas applicables à l’étude de l’ADD. Le remplacement n’est donc pas possible dans cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe (4 groupes de 15 animaux) correspond à l'effectif minimal pour assurer une puissance statistique de 0,8 au risque alpha = 0,05. Plusieurs variables sont analysées : - la proportion d’animaux souffrant d’un accident de décompression, en relation avec le traitement pharmacologique, - la gravité de l’ADD et son évolution en relation avec le traitement pharmacologique - les paramètres biologiques d’intérêt, déterminés à partir de dosages biologiques dans les tissus prélevés. Les paramètres suivant une loi normale sont comparés à l’aide d’une ANOVA à 1 facteur suivie de tests post-hoc (Dunnett contre un groupe témoin, en l’occurrence le groupe “contrôle NaCl” pour l’incidence et la gravité de l’ADD). Si la distribution normale n’est pas respectée, les différences entre groupes sont analysées à l’aide d’une ANOVA non paramétrique (Kruskall Wallis). En ce qui concerne la procédure expérimentale N°1, dès lors que le profil de plongée simulée est validé, la procédure s’arrête. Si des rats ont déjà été livrés, ils intègrent la procédure expérimentale n°2.
Raffinement
A partir de l’âge de 10 semaines et jusqu’à 12 semaines, âge d’entrée dans la procédure, les rats sont habitués à l’usage d’un tube de contention quotidiennement et de manière progressive. Ils sont manipulés tous les jours par des personnes formées et habituées à travailler avec des rats de laboratoire. On commence par 5 minutes de contention le premier jour puis on augmente progressivement la durée jusqu’à 2 heures. Une heure avant la plongée simulée, un antalgique est injecté par voie sous-cutanée afin de diminuer la douleur pendant les injections des nanocapsules et la période d’observation sans modifier l’évolution des symptômes. L’implantation d’un cathéter souple au niveau de la veine latérale caudale est réalisée sous anesthésie gazeuse. L’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules est légère et ne dure que 2 minutes après la sortie du caisson hyperbare, cela relève davantage de la contention à laquelle les rats sont déjà habitués pendant la période d’habituation au maintien dans un tube de contention. L’appréciation de la survenue d’un ADD à l’issue du protocole hyperbare ne peut se faire que sur des animaux vigiles et dont le comportement n’est pas modifié par d’autres facteurs que la présence d’ADD. C’est un accident grave mais certains animaux survivent et ne présentent aucun symptôme. La grille que nous utilisons pour évaluer la gravité de l’ADD est un outil robuste avec des critères fiables. Dans cette étude l’évolution de l’ADD sera appréhendée en fonction de sa gravité sur 60 minutes. C’est le temps nécessaire pour observer et s’assurer que les traitements sont efficaces ou pas. Puis les animaux seront mis à mort. Le point limite est la convulsion, seul critère qui conduira systématiquement à l’arrêt de la procédure avant les 60 minutes d’observation.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans ce projet sont des rats Wistar. Il s’agit d’un modèle utilisé couramment au laboratoire et lors de notre première étude concernant les nanocapsules de PFC. Chez ce modèle expérimental, nous possédons à la fois de nombreuses données biologiques concernant les effets d’expositions hyperbares et une bonne connaissance des symptômes d’ADD. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Afin d’être certain d’avoir atteint le stade de «jeunes adultes», matures sexuellement, au moment de la plongée simulée dans le caisson hyperbare, tous les animaux sont âgés de 12 semaines pour qu’ils atteignent la masse corporelle de 450g environ (c’est ce paramètre le plus important dans notre projet).
Activité des circuits corticaux dans un modèle murin d’autisme
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour injecter un virus et implanter une fibre optique, puis un test de reconnaissance d'objet avec enregistrement de l'activité neuronale, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur décrit des souris invalidées pour un gène lié à l'autisme et à la déficience intellectuelle, et indique que la chirurgie peut causer œdème et douleur post-opératoire. Il affirme que ces procédures sont "essentielles" et qu'aucun modèle informatique des comportements complexes n'existe encore.
Objectifs
Le but de notre projet est d'étudier la contribution d'un gène muté dans le trouble du spectre autistique. Nous explorerons son rôle dans l'apprentissage et la mémoire. Nous analyserons l'activité des circuits neuronaux du cortex préfrontal par photométrie par fibre lors d'un test de reconnaissance d'objet chez des souris invalidées pour le gène d'intérêt comparées aux souris sauvages. Nous étudierons l'activité de différentes sous-populations neuronales impliquées dans la neurotransmission excitatrice et inhibitrice.
Bénéfices attendus
Ces expériences devraient permettre de déterminer le rôle du gène d'intérêt dans l'activité des circuits corticaux préfrontaux lors de la mémoire de reconnaissance, contribuant ainsi à mieux comprendre son implication dans l'autisme et la déficience intellectuelle. L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogénèse de ces maladies, afin de permettre à terme de développer des approches thérapeutiques adaptés.
Procédures
Une procédure chirurgicale est effectuée sous anesthésie générale pour injecter dans le cerveau un virus exprimant un marqueur calcique fluorescent et implanter la fibre optique pour la photométrie par fibre. La durée de la chirurgie est de 30-40 min. Aucun phénotype dommageable n’est prévu suite à la procédure. Après une période de récupération de 3 semaines, les souris sont habituées pendant 3 jours (10 min, 2 fois par jour) à un champ ouvert où sera effectué le test de reconnaissance d'objet. Le jour du test, l'activité neuronale est enregistrée par photométrie par fibre pendant 15-20 min en état basal, puis pendant 10 min lorsque l'animal explore 2 objets identiques. L'animal est ensuite replacé dans sa cage et au but de 10 min, il est réintroduit dans le champ et l'activité neuronale est enregistrée pendant 10 min lorsqu'il explore un objet familier et un objet nouveau. Au total, la procédure dure 45-50 min. Après 2 jours de repos, les souris sont enregistrées à nouveau lors d'un deuxième test de reconnaissance d'objet (45-50 min). A la fin des expériences, les animaux subiront une perfusion intracardiaque avec un agent fixateur pendant 3 min, sous anesthésie profonde, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques. Au total, la procédure de perfusion dure 10-15 min.
Impact sur les animaux
La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées.
Devenir
Tous les animaux injectés avec le virus et utilisés dans les expériences de photométrie par fibre (n=105) seront perfusés avec un agent fixateur à la fin des expériences, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques.
Remplacement
Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits cognitifs et l'activité des circuits neuronaux intacts. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre les conséquences de l'inactivation du gène d'intérêt dans le cerveau. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 105 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux au strict nécessaire afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement dans ce type d'expériences. Pour cela, le nombre d’animaux doit se situer entre 12-15 par condition étudiée. En effet, la variabilité interindividuelle élevée observée lors des tests comportementaux, y compris le test de reconnaissance d'objet, nécessite de groupes de taille relativement élevée. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique de virus et la pose de fibres optiques sont réalisées sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris sont hébergées à raison de 4 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La stratégie d’enrichissement consiste à ajouter un nid des lanières de papier Kraft. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Une semaine avant le test de reconnaissance d'objet, les souris sont manipulés quotidiennement par l'expérimentateur pendant 5 min afin de les habituer et réduire le stress. De plus, les souris sont exposées au champ ouvert plusieurs fois avant le test de reconnaissance d'objet, d'abord en groupe et ensuite individuellement, afin de réduire le stress engendré par l'environnement nouveau. 48 h de repos sont réservées entre les procédures comportementales.
Choix des espèces
Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-6 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.
Evaluation des effets d’une exposition chronique au TiO2 sur l’homéostasie intestinale et métabolique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées pendant 115 jours au dioxyde de titane, additif alimentaire E171, avec gavages et prélèvements de fèces réguliers, pour évaluer ses effets sur l'intestin et le métabolisme. Le porteur affirme attendre un léger surpoids, une perméabilité et une inflammation intestinales, et présente le recours à l'animal comme "difficilement remplaçable" pour reproduire les échanges entre organes sur une longue durée. Il indique que les résultats doivent aider industriels et autorités à décider du maintien de l'autorisation du E171.
Objectifs
Les particules minérales manufacturées sont abondantes dans les produits de la vie quotidienne (cosmétiques, textiles, matériaux de construction), dont l’alimentation. Parmi ces particules, le dioxyde de titane (TiO2) est un additif alimentaire utilisé comme colorant/opacifiant et agent de brillance dans les confiseries, les aliments transformés, les sauces et le glaçage. En Europe, l'utilisation du TiO2 alimentaire (référencé E171) est autorisée sans établissement d'une dose journalière acceptable. L'autorité européenne de sécurité sanitaire des aliments (EFSA) a estimé les niveaux d'exposition journalière au E171 entre 0,9 et 10,4 mg/kg de poids corporel (p.c)/jour chez l’enfant et entre 0,3 et 6,8 mg/kg p.c/j chez l’adulte. Face à ces niveaux élevés de consommation, les conséquences pour l’homme d'une exposition chronique aux particules de TiO2 soulèvent des questions de santé publique. Les craintes vis-à-vis de cet additif composée de particules micro- et nanométriques reposent sur des effets génotoxiques, de stress oxydant et inflammatoires des nanoparticules de TiO2 observés sur cellules intestinales. Cependant, la toxicité orale du TiO2 est encore peu étudiée et les autorités sanitaires ont conclu à la nécessité de tests pour évaluer les risques pour la santé des additifs alimentaires contenant des nanoparticules, particulièrement avec le E171. Dans les pays occidentaux, l'augmentation de la prévalence de l'obésité associée à des désordres métaboliques suggère des facteurs de risque liés au mode de vie. Parmi ces facteurs, l'ingestion chronique de particules inorganiques a été proposée. Le but de ce projet est d'étudier le lien entre l'exposition orale chronique au E171 et l'apparition et/ou l'aggravation de désordres métaboliques et intestinaux.
Bénéfices attendus
Outre l'apport de données inédites sur les effets d'une ingestion de TiO2 alimentaire sur le développement de désordres intestinaux et métaboliques, ce projet aidera les parties prenantes et les industriels dans leur décision de maintenir ou non l'autorisation et l'utilisation du E171 dans les aliments. Ce projet pourrait également permettre d'établir un lien potentiel entre facteurs environnementaux (ici ingestion d'additif alimentaire) et augmentation exponentielle dans les pays occidentaux de désordres métaboliques. En conclusion, ce projet fournira des données précieuses pour l'évaluation des risques chez l'Homme d'une exposition au TiO2 alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à un gavage avec du Dextran-FITC à J94 pour évaluer la perméabilité intestinale et à un gavage avec du glucose à J108 pour réaliser le test de tolérance au glucose. Des prélèvements de fèces seront réalisés tout au long de l'expérimentation (1 fois toutes les deux semaines).
Impact sur les animaux
Il est attendu que les animaux exposés au E171 développent un léger surpoids accompagné d'une perméabilité inestinale, d'une inflammation intestinale a bas bruit ainsi que d'une intolérance au glucose. Toutefois ces désordres intestinaux et métaboliques devraient être d'une intensité inférieure a celle observé lors d'un traitement des animaux avec un régime riche en graisse. Nos données préliminaires n'indiquent aucune altération de comportement et de prise alimentaire chez les animaux exposés au E171 incorporé aux croquettes à la dose testé dans cette étude.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réasliser différents prélèvements de tissus sur l'animal en fin d'expérience.
Remplacement
Le projet étudie les effets du E171 (nanomatérieux alimentaires) après une période d'exposition chronique de 115 jours. De plus, l'étude portera sur les impacts sur l'axe microbiote-intestin-foie. Aucun modèle alternatif ne permet de recréer tous les dialogues inter-organes sur une période aussi longue. Le recours à l'animal est donc nécessaire et difficilement remplaçable par des modèles in vitro ou ex-vivo.
Réduction
Les régulations attendues, principalement concernant les tests de tolérance au glucose peuvent être assez fines. Ainsi, chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris pour que les résultats soient statistiquement exploitable, après analyse avec des tests statistiques adaptés. De plus, les procédures de notre projet seront réalisées 2 fois pour pouvoir générer suffisamment d'échantillons pour nos différents end points.
Raffinement
Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées aux animaux, la coupure effectuée au niveau des queues de souris nécessaire pour la mesure de perméabilité intestinale et le test de tolérance au glucose seront réalisé sous analgésie locale. De plus, de l'enrichissement sera disposé dans les cages, sous la forme d'une maisonnette et de dispositif de nidification. Le bien-être des animaux sera assuré par une observation quotidienne et également par un suivi de poids et prise alimentaire hebdomadaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Les souris utilisées seront âgées de 5 semaines afin de faire des observations sur des souris adultes et matures.
Combinaison de la protonthérapie et de l’immunothérapie pour les tumeurs cérébrales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
402 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées dans d'autres protocoles au sein de leur établissement d'origine. Elles reçoivent une implantation de tumeur cérébrale sous anesthésie puis une irradiation de 20 Gy fractionnée en deux séances par jour sur quatre jours, avec prélèvement de sang, pour comparer protonthérapie et rayons X sur la réponse immunitaire. Le porteur indique que les séances répétées peuvent baisser la fréquence respiratoire et entraîner une perte de poids, et que la chirurgie tumorale peut être douloureuse. Il affirme que l'étude du système immunitaire lié à une tumeur cérébrale ne se fait pas in vitro et qu'aucune espèce moins évoluée que la souris ne convient.
Objectifs
« La radiothérapie (RT) fait partie des traitements les plus utilisés chez les patients atteints de cancer. A l’heure actuelle, en France, 60% des patients diagnostiqués pour un cancer sont traités par RT. Pour les tumeurs du cerveau, la RT fait partie du traitement standardisé. Nous avons précédemment montré que l’irradiation aux rayons-X pouvait modifier le système immunitaire dans le cas des tumeurs du cerveau, notamment en augmentant la proportion de cellules associées à une progression tumorale et en diminuant la quantité de cellules anti-tumorales dans le sang. Contrairement à la RT conventionnelle qui utilise des rayons-X, la protonthérapie utilise des particules chargées plus lourdes et de haute énergie. Parce qu’elle peut déposer de façon précise des doses d’irradiation dans le tissu, la protonthérapie peut être utilisée pour : i) limiter les risques de toxicité en réduisant l’exposition du tissu sain, et ii) augmenter la dose déposée à la cible pour accroître le contrôle tumoral. Le premier objectif de cette étude est d’appréhender si la protonthérapie pourrait présenter des avantages par rapport aux rayons-X au niveau du système immunitaire anti-tumorale dans le cas d’une irradiation cérébrale. Le second objectif est de déterminer si la combinaison de la protonthérapie et de stratégies thérapeutiques ciblant le système immunitaire serait bénéfique pour le traitement des tumeurs du cerveau. »
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les connaissances scientifiques sur les effets de la protonthérapie sur l’inflammation. De plus, cela permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la protonthérapie et l’immunothérapie (dont les tumeurs cérébrales sont très résistantes). Le projet scientifique global présente également une partie clinique dont le comité de proection des personnes a été accepté en décembre 2021. Les résultats du projet ci présent pourront ainsi être comparés aux données cliniques. Ainsi, l’ensemble de ces résultats pourra rapidement être adapté à la clinique dans le but d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de tumeurs cérébrales. Plus généralement, ce projet permettra d’appréhender en détail les relations entre la protonthérapie et les immunothérapies.
Procédures
Les animaux subiront plusieurs types d’interventions (irradiations, prélèvements sanguins, …). Les interventions spécifiques, leurs fréquences et leurs durées pour chaque animal sont détaillées en Annexe I. -Initiation du développement de la tumeur : L’implantation des tumeurs est réalisée sous anesthésies L’implantation dure quelques minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. -L’irradiation du cerveau : alors qu’ils sont anesthésiés. L’irradiation est réalisée sous anesthésie générale. Lors de l’irradiation, une dose totale de 20Gy sera délivrée de manière fractionnée comme en clinique : 2.5Gy/séance avec deux séances par jour (espacées de 6h) sur 4 jours consécutifs. - Le prélèvement sanguin sera réalisée sur souris éveillée Ce prélèvement dure une minute et n’est réalisé qu’une seule fois/souris.
Impact sur les animaux
L’irradiation par elle-même n’induit pas de douleurs mais peut induire une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. Les répétitions bijournalières et ce sur 4 jours consécutifs peuvent également induire une perte de poids des animaux jusqu’à 10 jours après irradiation. Le prélèvement sanguin ne provoque pas de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale peut induire des douleurs. Le transport des animaux peut induire un stress surtout que cette étude.
Devenir
Tous les animaux de l'étude qui seront transportés dans notre EU pour les protocoles d'irradiation retournenront dans leur EU d'origine pour la poursuite des protocoles
Remplacement
L’évolution du système immunitaire et ce en lien avec la circulation sanguine cérébrale après un traitement ainsi que la formation et l’évolution de l’inflammation tumorale ne peuvent pas être évaluées in vitro. Les expériences in vivo sont absolument nécessaires pour étudier l’impact d’un traitement et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient être transposées à la clinique, on ne peut pas utiliser d’espèces moins évoluées que la souris. La souris présente un système immunitaire similaire à l’homme et nous disposons d’un modèle in vivo de tumeur cérébrale bien maitrisé dans le laboratoire qui récapitule plusieurs caractéristiques retrouvées chez les patients.
Réduction
Afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour les analyses, le nombre d’animaux nécessaires / groupe prend en compte la variabilité entre les individus basée sur des expériences antérieures et des expériences préliminaires. Ce nombre d’animaux a été déterminé mathématiquement grâce à des logiciels statistiques adaptés afin de réduire au maximum tout en assurant une puissance statistique satisfaisante. Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, à chaque fin de protocole, les tissus (cerveaux, rates et ganglions lymphatiques) seront prélevés pour des études post-mortem.L’imagerie nous permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en évitant des euthanasies à tous temps. »
Raffinement
Les animaux subiront une période d’habituation, d’acclimatation avant la radiothérapie. Les animaux subissent une anesthésie pendant l’irradiation. Les animaux sont surveillés tous les jours pendant toute la durée du protocole, weekend compris. Le poids des souris est suivi tous les 2-3 jours avant, pendant et deux semaines après l’irradiation. Pendant l’irradiation et la semaine suivante, les animaux disposent de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter la perte de poid. Pour le modèle de tumeur, les animaux sont anesthésiés pendant la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux sont surveillés tous les jours pendant le protocol, weekend compris. Les souris sont hébergées dans des cages avec 5 souris/cage dans un environnement enrichi (roues/cartons/bâtons à ronger). Le transport des animaux sera pris en charge par un transporteur agréé.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux chez l’animal sont indispensables pour récapituler au mieux l’environnement des tumeurs qui se développent chez les patients. Nous utiliserons une souche de souris qui présente toutes les populations de cellules immunitaires et parce que le modèle de tumeur cérébral utilisé repose sur l’injection de cellules tumorales issues de cette souche. De plus, pour cette espèce et pour les cellules étudiées, tous les outils de caractérisation sont déjà validés. Les animaux seront agés de 7 semaines. Ce stade correspond à de jeunes adultes et est parfaitement adapté en termes de physiologie aux pathologies ciblées.
Les inhibiteurs d’ERAP comme nouvelle approche pour traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
192 rats transgéniques HLA-B27 vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie tous les sept jours jusqu'à J63, pour tester des inhibiteurs d'ERAP contre des maladies auto-immunes comme la spondylarthrite ankylosante. Le porteur indique que l'inflammation de ce modèle reste légère et transitoire, ce qui l'amène à ne prévoir ni analgésique ni anti-inflammatoire. Il présente ces maladies comme relevant d'un fort "besoin médical" et le rat transgénique comme un modèle de référence.
Objectifs
Les ERAPs sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour traiter les maladies auto-immunes et auto-inflammatoires. Les ERAP 1 et 2 sont des amino-peptidases intracellulaires (métalloprotéases) chargées de la transformation finale des antigènes peptidiques pour présentation par les molécules du CMH de classe I. Ils régulent ainsi la réponse immunitaire adaptative par les lymphocytes T cytotoxiques (LcT) et affectent l'immunodominance en impactant le répertoire peptidique global présenté par le CMH-I. Ces enzymes ont beaucoup attiré l'attention depuis la première découverte d'ERAP1, puis d'ERAP2. Les enzymes ERAP ont des rôles complémentaires et des fonctions importantes in vivo. Un certain nombre d'haplotypes ERAP sont liés au risque de souffrir de diverses maladies auto-immunes ou auto-inflammatoires, notamment le diabète de type 1 (T1D), la spondylarthrite ankylosante (SA), le psoriasis, la maladie rare de Behçet (BD) et l'uvéite de Birdshot (BU). Plusieurs études (voir état de l'art) ont révélé comment les ERAP modulent l'immunopeptidome dans différents contextes pathologiques. Un obstacle scientifique est la disponibilité de petites molécules inhibitrices d'ERAP efficaces, sélectives et biodisponibles. Aucun inhibiteur d'ERAP n'a été évalué in vivo jusqu'à présent et les rapports sur la modulation de l'immunopeptidome par les composés ERAP ne sont pas disponibles. L'objectif du projet est d'identifier des inhibiteurs pharmacologiques d’ERAP à travers méthodes intégrés de chimie médicinale (du criblage fonctionnel de la présentation de l'antigène combiné au profilage des immunopeptidomes dans les cellules des patients) et l’évaluation préclinique de leur efficacité thérapeutique dans un modèle de rat transgénique HLAB-27. Ce modèle présente une maladie inflammatoire multi-systémique avec un phénotype proche de la clinique des spondylarthropathies humaines, des arthrites réactives et autres maladies. La susceptibilité génétique des rats transgéniques exprimant l’allèle HLA-B27/β2-microglobuline humaine en fait un modèle de choix pour cet objectif.
Bénéfices attendus
Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements personnalisés des maladies auto-immunes/auto-inflammatoires. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour la spondylarthrite ankylosante et la maladie de Behçet qui sont des maladies à fort besoin médical.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins réalisés en rétro-orbitaire, à partir de J0 et chaque 7 jours après le début du protocole de traitement, jusqu'au sacrifice (J63). Ces prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse à l'isofluorane 2%. Le volume maximal prélevé sera égal à 500μL. Pour chaque rat, le prélèvement sanguin durera au maximum 5 minutes, y compris la durée de l'anesthésie
Impact sur les animaux
Le rat transgénique HLA-B27 présente une maladie inflammatoire multisystémique avec un phénotype proche de la clinique des spondylarthropathies humaines, des arthrites réactives, et autres maladies. L'apparition et la sévérité des symptômes inflammatoires chez le rat HLA-B27 sont liées à l'environnement extérieur (le microbiote intestinal pathogène est responsable des lésions inflammatoires plus sévères). L'état sanitaire de l'animalerie centrale de l'Institut Pasteur de Lille prévoit un élevage sans pathogènes. Dans ces conditions, notre cohorte de rats HLA-B27 présente des formes légères d'inflammation multisystémique, c'est pourquoi l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires n'est pas envisagée. L'inflammation intestinale, ainsi que les douleurs articulaires apparaissent dès la 10ème semaine de vie mais surviennent de manière ponctuelle, discontinue et transitoire (d'une durée variable d'un ou deux jours) et se manifestent, respectivement, par des diarrhées, sans perte de poids et par des douleurs d'articulations, touchant les membres inférieurs, uni ou bilatérale. L'uvéite se manifeste aussi de façon ponctuelle et transitoire avec un dégrée de sévérité très limité. Concernant les molécules candidates qui seront administrés, leur toxicité est préalablement testée par la plateforme ADME de l'institut Pasteur de Lille et leur administration tiendra compte des études de toxicité et de pharmacodynamique afin de ne pas avoir d'effets indésirables qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation.
Devenir
A l'issue de la procedure tous les animeaux seront euthanasiés
Remplacement
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, le criblage d'une série d'inhibiteurs d'ERAP1/2 préalablement modélisés et synthétisés par l'équipe partenaire (Deprez) sera réalisé sur des modèles cellulaires par la plate-forme ADME de l'Institut Pasteur de Lille (incluse dans l'Infrastructure Nationale ChembioFrance), par quantification LCMS-MS. De plus une évaluation de la sécurité sera exprimée sous la forme d'un rapport IC50 et CC50 (test cellulaire à haut contenu d'apoptose ou de nécrose (Caspase-3/7 activité Propidium iodure) et évalué la plateforme Equipex Imaginex. Les inhibiteurs candidats seront préalablement testés par des expériences de pharmacodynamiques afin de garantir une exposition et une voie optimale avant les tests chez les rats HLA-B27.
Réduction
Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, et corrélation de Spearman). Le nombre d’animaux par groupe est de n = 8, qui est calculé sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes).
Raffinement
Tout rongeur montrant des signes de douleur ou de mal-être sera euthanasié. Les animaux sont observés et pesés d’une manière quotidienne pour une attention particulière aux points limites suivants: -une modification du comportement (prostration, poils hérissés, cris, blessure) -une perte de poids supérieur à 15%. Le suivi quotidien de l'état de santé des rats permettra d'observer l'apparition et l'évolution des manifestations inflammatoires typiques de ce modèle (uvéite, orchite, douleurs articulaires). Le modèle de rat HLA-B27 est maitrisé au laboratoire depuis plusieurs années et nous avons pu observer que ces types de manifestations inflammatoires sont transitoires (d'une durée maximale d'un ou deux jours) et souvent extrêmement légères et ne sont pas prises en compte comme points limites.
Choix des espèces
Le rat transgénique HLA-B27/β2-microglobuline est, à ce jour, considéré comme un modèle animal de référence des maladies inflammatoires systémiques. Caractérisé par un faible nombre de copies de HLA-B27 et une expression transgénique élevée de la β2-microglobuline humaine, le rat HLA-B27 présente une forte ressemblance clinique et histologique avec les spondylarthropathies humaines, avec arthrite réactive, rhumatisme psoriasique, inflammation articulaire périphérique et axiale, uvéite et l'iritis. Chez l'homme, ces maladies sont fortement associées à l'allèle HLA-B27. Les bases moléculaires de la maladie inflammatoire multisystémique chez les rats HLA-B27 résident principalement dans le stress du réticulum endoplasmique (RE) généré par le mauvais repliement des chaînes lourdes de HLA-B27 avant leur association avec ß2m, avec une accumulation conséquente dans le RE induisant l'activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en particulier dans les macrophages. Ces évidences soutiennent la pertinence du modèle HLA dans l'évaluation de l'effet thérapeutique des inhibiteurs d'ERAP. L'utilisation des rats non transgéniques (nTg-Fisher 344) de la même colonie sera justifiée par la nécessité de comparer d’un côté la difference du niveau d’inflammation entre les rats HLA-B27 et les rat wild-type et d’un autre coté les effets des molécules testées dans un modèle non inflammatoire.
Evaluation d’inhibiteurs d’une enzyme impliquée dans l’agressivité et la prolifération tumorale (EZH2) sur la croissance tumorale du carcinome à cellules de Merkel dans un modèle de souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
30 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant quatre semaines, pour tester des inhibiteurs d'EZH2 contre le carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique qu'aucune analgésie ne sera administrée afin de ne pas interférer avec les traitements, et qu'une perte de poids, une tumeur de plus d'un centimètre cube ou une ulcération déclenchent la mise à mort par élongation cervicale. Il affirme que le recours au modèle murin est "obligatoire" pour développer ces tumeurs.
Objectifs
Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet âge de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée à 1/100 000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée à 40%. Dans 80% des cas, le génome du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV) est intégré dans celui des cellules tumorales induisant alors l’expression de deux oncoprotéines virales (antigène grand T ; LT et antigène petit t ; st). Dans ce contexte, une étude récente menée au sein du laboratoire a permis de mettre en évidence l’induction de l’expression d’EZH2 (Enhancer of zest homolog 2), une histone méthyltransférase, par les oncoprotéines virales. Cette enzyme est impliquée dans l’agressivité et la prolifération tumorale d’autres cancers. De plus, une forte expression d’EZH2 a pu être confirmée au sein d’une cohorte de 96 patients présentant un CCM avec un niveau d’expression plus important dans les tumeurs MCPyV positives. L’effet des inhibiteurs d’EZH2 à déjà été démontré sur d’autre tumeurs solides. Dans ce contexte la cytotoxicité de deux de ces drogues a pu être démontrée au sein de notre laboratoire, in vitro sur des lignées cellulaires humaines de CCM. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, l'effet inhibiteur sur la croissance tumorale du GSK343 et du DZNeP dans un modèle murin de xénogreffe, maîtrisé dans le laboratoire, utilisant la lignée WaGa.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de valider dans un modèle pré-clinique l'utilisation d'inhibiteur d'EZH2 dans l'indication du carcinome à cellules de Merkel. Ces molécules pourraient potentiellement être utilisées chez l'Homme en complément de l'immunothérapie ciblant PDL1.
Procédures
Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules WaGa afin d'établir le modèle tumoral. Suite à leur inclusion, elles recevront quotidiennement par voie intrapéritonéale les deux molécules évaluées ou le véhicule pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
Chez l’Homme, le carcinome à cellules de Merkel est décrit comme non douloureux, néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20% et prostration des animaux, volume tumorale supérieur à 1cm3 ou apparition d’ulcération), conduira à leur mise à mort par élongation cervicale.
Devenir
L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris.
Remplacement
Afin d’étudier l’impact du traitement sur la croissance tumorale, le test sur modèle murin est obligatoire
Réduction
Une seule dose de chaque traitement sera testée sur la base des résultats de cytotoxicité in vitro préalablement obtenus au laboratoire ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. De plus, un test de Wilcoxon a permis de déterminer le nombre d'animaux nécéssaires.
Raffinement
Les souris seront hébergées avec un enrichissement social (5 souris de même sexe / cage) dans des cages enrichies avec des maisonnettes en plexiglas et du papier absorbant. Du fait du statut immunodéficient des souris, l’ensemble du matériel d’enrichissement, ainsi que l’aliment et l’eau de boisson seront stérilisés. Après les injections intra-péritonéales, les souris recevront sous forme de récompense des friandises (cacahuètes en coque, catalogue PLEXX). Aucun traitement d'analgésique ne sera administré afin d'éviter toute interférence avec les traitements testés.
Choix des espèces
Le seul modèle disponible de CCM étant des lignées humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est obligatoire afin de permettre le développement de tumeurs chez la souris. Les NOD/SCID sont un modèle de référence pour les xénogreffes de cellules humaines . 7 semaines incluant la semaine d’acclimatation d'une semaine. Stade physiologique : croissance