Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
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- Système respiratoire
- Système urogénital
Évaluation de la toxicité de l’ADCITMER, un nouveau biomédicament dans le traitement du carcinome à cellules de Merkel chez des rats Wistar males.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
20 rats Wistar mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection dans la veine pénienne sous anesthésie puis deux prélèvements de sang, avant d'être mis à mort pour mesurer la toxicité d'un biomédicament destiné au carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique surveiller le pelage "piqué", une perte de poids de 20 % et une hausse des transaminases comme seuils déclenchant la mise à mort. Il présente l'étude comme une obligation réglementaire préalable à un essai clinique de phase I.
Objectifs
Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet age de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hemopathie, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée a 1/100000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée a 40%. Au stade métastatique inopérable les cliniciens ont peu d’options thérapeutiques induisant une réponse tumorale durable. L’pression du CD56, glycoprotéine de surface impliquée dans l'adhésion cellulaire, a été observée dans 66% des cas de CCM confirmant le choix de cette cible thérapeutique. Un immunoconjugué (anticorps anti- CD56 couplé à la drogue MMAE) a été développé, l’Adcitmer, pour cibler spécifiquement le CD56 et induire la mort des cellules tumorales. L'évaluation in vitro de cette molécule a confirmé son effet cytotoxique sur les lignées de CCM. Pour finir, l'impact sur la croissance tumorale a été montré dans un modèle murin de xénogreffe utilisant une lignée humaine de CCM . L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, la toxicité de l’Adcitmer chez le rat.
Bénéfices attendus
Le bénéfice premier attendu est d'obtenir la dose maximale tolérée afin de pouvoir proposer une fenêtre thérapeutique optimale pour un essai préclinique réglementaire puis un essai clinique de phase I.
Procédures
Les animaux seront injectés une seule fois dans la veine penienne puis deux prélèvements sanguins seront effectués à 4 et 21 jours post-injection de l'Adcitmer. L’injection dans la veine pénienne durera 5 min par animaux, le prélèvement sanguin durera 3 min également.
Impact sur les animaux
Après 21 jours ou en cas d’atteinte de points limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20%, prostration des animaux ou augmentation des transaminases de 1,5 fois par rapport à la limite supérieur de la norme (normes pour le rat Wistar mâle : ASAT 93 +/- 20 UI/L et ALAT : 32 +/- 5 UI/L), les animaux seront sacrifiés afin d’observer l’impact de l’Adcitmer sur les rats traités versus les rats témoins. Le cœur, la rate, le foie et les poumons seront prélevés pour vérifier que le traitement n’a pas altéré la morphologie des organes. L’analyse histologique sera assurée par les pathologistes de l’équipe. Les critères de jugement de l’étude sont : - Une réduction significative du poids des animaux (une puissance de test supérieure à 80% avec un seuil de risque alpha de 0.05, un test U de Mann Whitney) - Un changement du comportement des animaux Ce protocole suit la règle des 3R : Réduction : Trois doses de traitement seront évaluées sur la base des résultats de réduction de la croissance tumorale préalablement obtenu chez la souris au laboratoire avec trois injections à 10mg/kg in vivo ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de rats utilisés. Raffinement : Les rats seront hébergés dans des cages enrichies avec des abris et du matériel de nidification et une plateforme. L’interaction avec les soigneurs aura lieu tous les jours pour les adapter aux contacts deux semaines avant le début de l’étude afin de réduire le stress lié aux manipulations. Afin de réduire le stress, les rats seront hébergés par paires. Remplacement : La molécule a été évaluée sur des cellules saines n’exprimant pas le CD56 in vitro et n’a pas montré de toxicité in vivo dans un model murin de xénogreffe de CCM. Cependant, une étude de toxicité in vivo est obligatoire afin d’étudier l’impact du traitement sur les organes et le comportement des animaux.
Devenir
La mise à mort de tous les animaux permettra d'évaluer la dose maximale tolérée afin de pouvoir proposer une fenêtre thérapeutique optimale pour un essai préclinique réglementaire puis un essai clinique de phase I.
Remplacement
La molécule a été évaluée sur des cellules saines n’exprimant pas le CD56 in vitro et n’a pas montré de toxicité in vivo dans un model murin de xénogreffe de CCM. Cependant, une étude de toxicité in vivo est obligatoire afin d’étudier l’impact du traitement sur les organes et le comportement des animaux.
Réduction
Trois doses de traitement seront évaluées sur la base des résultats de réduction de la croissance tumorale préalablement obtenu chez la souris au laboratoire avec trois injections à 10mg/kg in vivo ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les rats seront hébergés dans des cages enrichies avec des abris et du matériel de nidification et une plateforme. L’interaction avec les soigneurs aura lieu tous les jours pour les adapter aux contacts deux semaines avant le début de l’étude afin de réduire le stress lié aux manipulations. Afin de réduire le stress, les rats seront hébergés par paires.
Choix des espèces
Le modèle Wistar est un modèle de référence dans les études de toxicité des immunoconjugués. Les males ont été choisi pour injecter en intraveineuse dans la veine pénienne la molécule après une anesthésie. Ceci permet une meilleure réussite et reproductibilité des injections par rapport à la veine caudale. De plus, l’utilisation de sujets d’un même sexe permet de réduire la variabilité interindividuelle et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif. 8 semaines (incluant la semaine d’acclimatation). Stade physiologique : croissance.
Evaluation chez la poule pondeuse de la contribution des effets génétiques et non génétiques à la persistance de la ponte et de l’efficience alimentaire.
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- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
512 poules pondeuses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent une unique prise de sang, puis sont abattues à 90 semaines par étourdissement électrique et saignée, pour relier des marques génétiques et épigénétiques à la persistance de la ponte et à l'efficience alimentaire. Le porteur précise que cette mise à mort entre dans le cycle de routine d'un sélectionneur privé, dont les animaux servent aussi à l'étude. Il affirme qu'il n'est pas possible de remplacer les animaux par des analyses in vitro pour un objectif portant sur des performances de production en fin de carrière.
Objectifs
Ce travail est financé dans l'appel d'offres SFS-13-2020, en collaboration avec un partenaire du projet. Un accord de consortium a été signé. L'objectif de l’expérimentation est d'évaluer, chez la poule pondeuse en sélection, la contribution des effets génétiques et épigénétiques à la variabilité des caractères liés à la persistance de la ponte, la qualité des œufs et l’efficience alimentaire, en fin de production (90 semaines).
Bénéfices attendus
L'évaluation à l'échelle du génome de la variabilité génétique et épigénétique nous permettra d'identifier les régions génomiques et les marques épigénétiques contribuant à la variation phénotypique des caractères de production, de qualité et d'efficacité à un âge de la poule qui n'a pas été analysé jusqu'à présent (90 semaines de vie). Ces données seront utilisées pour développer de nouveaux modèles de prédiction génomique. Ces données nous permettront également d'estimer la variabilité génétique et épigénétique de cette lignée parentale et de proposer des stratégies de conservation de la diversité génétique et épigénétique dans les lignées parentales.
Procédures
Les 512 poules pondeuses seront soumises à une seule prises de sang qui seront réalisées par des personnels qualifiés.La durée de la prise de sang pour chaque animal est inférieure à 10 secondes.
Impact sur les animaux
Nous n’attendons pas de nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La prise de sang sera effectuée par des personnes expertes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en vue de prélèvements de tissus par étourdissement électrique suivi d'une saignée. Cette mise à mort entre dans le cycle d’activités de routine du sélectionneur, le bâtiment accueillant une nouvelle génération d’animaux après un vide sanitaire de quelques semaines.
Remplacement
L'objectif de l'étude étant d'évaluer la contribution génétique et épigénétique à la variabilité des caractères liés à la production, la persistense de la ponte, la qualité des œufs et l’efficience alimentaire chez la poule pondeuse à un âge avancé de production, il n'est pas possible de remplacer les animaux par des analyses in vitro.
Réduction
Nous n'avons pas produit d'animaux pour cette étude car nous utilisons les animaux produits par le sélectionneur privé pour son programme de sélection. Ceci nous donne la possibilité d’avoir accès à un grand nombre de phénotypes ainsi qu'au pedigree des animaux sans avoir besoin de produire d’avantage d'animaux. Notre étude consiste à ajouter aux phénotypes fournis par le sélectionneur des phénotypes métaboliques et à produire des données de génotypage et d'épigénotypage afin de pouvoir identifier des QTL (quantitative trait loci : variants d'ADN associés à un phénotype) et des QTM (quantitative trait methylation : variants de méthylation associés à un phénotype). Les caractères que nous souhaitons étudier sont multifactoriels et sous le contrôle de multiples gènes situés à différents QTL et/ou QTM. L'approche que nous prévoyons d'utiliser pour identifier ces régions est l'étude d'association génétique/épigénétique à l'échelle du génome (GWAS) qui nécessite l'analyse d'un grand nombre d'individus. C'est tout l'intérêt d'utiliser des animaux qui sont produits par le sélectionneur dans le cadre de sa sélection, plutôt que de produire de nouveaux animaux expérimentaux. On attend ainsi une puissance raisonnable, supérieure à 70%, avec notre échantillon de 512 descendants.
Raffinement
À l'âge de 90 semaines, juste avant l’abattage des animaux, nous effectuerons une prise de sang et une échographie. Ces procédures seront effectuées par du personnel qualifié afin de causer le moins d'inconfort possible aux animaux, en particulier la prise de sang au niveau du sinus occipital (voir plus loin) qui est très rapide mais nécessite d’être faite par une personne expérimentée. Toutes les activités jusqu'à l'âge de 90 semaines (phénotypages divers, prise de sang à 70 semaines) sont liées aux activités de sélection de l'éleveur privé et ne font pas partie de cette DAP. La possibilité d'avoir accès à une lignée parentale commerciale nous permet d’avoir un dispositif animal puissant, qui devrait nous permettre de transposer nos résultats à d'autres lignées commerciales sans avoir besoin de mettre en place de nouvelles expériences.
Choix des espèces
Nous sommes intéressés par l'identification des régions génomiques et des variants de méthylation qui contribuent à la variation des caractères d'intérêt tels que la persistance de la ponte, la qualité des œufs, l'efficacité alimentaire et la composition corporelle chez la poule pondeuse à un âge avancé de production. La poule domestique est donc l’espèce de choix. Nous travaillerons avec des poules adultes de 90 semaines pour étudier les performances et l'efficacité à la fin de leur carrière productive. La nécessité de collecter des données à un âge aussi tardif est due au fait que les performances antérieures ne sont pas nécessairement corrélées aux performances tardives.
Etude d’un type de mémoire en utilisant le modèle du poisson zèbre au stade larvaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
35 840 poissons zèbres au stade larvaire vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Âgés de 7 à 14 jours, ils sont soumis à des flashs lumineux et des sons pendant sept heures, ou immobilisés dans l'agarose pendant trois heures, pour étudier un type de mémoire appelé habituation. Le porteur affirme que l'étude d'un cerveau entier chez un animal vivant est "essentielle" et qu'aucune approche in vitro ne convient. Le nombre déclaré, très élevé, tient au recours à de nombreuses conditions et à une imagerie à haut débit portant jusqu'à 300 poissons simultanément.
Objectifs
Comprendre comment les animaux apprennent et forment des souvenirs est une question fondamentale en neurosciences. S'il est clair que les souvenirs se forment grâce à la plasticité des réseaux neuronaux, de nombreuses questions restent ouvertes. Par exemple, dans un circuit neuronal complexe de vertébrés, lesquels et combien de neurones sont soumis à la plasticité ? Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans cette plasticité ? Pour répondre à cette question des poissons zèbres sont utilisées car leur cerveau est relativement simple (~100 000 neurones), petit (0,25 mm3) et l'activité de tous les neurones peut être mesurée de façon indépendante. Lorsqu'il est stimulé par un flash de lumière ou un stimulus acoustique, le poisson zèbre réagit par un sursaut. En cas d'éclairs répétés, cette réponse diminue, formant un type de mémoire à long terme connu sous le nom d’habituation. Afin de comprendre cette habituation et les composants qui pourraient avoir une influence sur cette habituation, dans un premier temps, des tests ont été réalisés sur des embryons âgés de moins de 5 jours issues de différentes lignées existantes sans phénotypes dommageables. Suite à des résultats prometteurs obtenus sur des embryons âgés de moins de 5 jours, des études complémentaires sont nécessaires sur des sujets plus âgés (de 7 et 14 jours). Les deux études décrites ci-dessous sont envisagées. - habituation sur des poissons âgés de plus de 7 et 14 jours en absence ou présence drogues psychoactives (sans effet sur le développement du poissons) pendant 7h - observation de l'activité neuronale des poissons in vivo (live imaging) lors de l'habituation. Ce projet sera réalisé sur des poissons issus de lignées existantes sans phénotype dommageable. L'étude de l'activité neuronale dans son ensemble n'est pas envisageable in vitro puisque nous avons besoin de la fonctionnalité du cerveau dans son intégralité. Des études d'habituation avec d'autres objectifs ont déjà été réalisées dans différents laboratoires à travers le monde avec des tests statistiques robustes et connus ce qui nous permet de limiter au maximum le nombre de poissons utilisés. A partir de 5 jours les poissons seront maintenus dans des aquariums, à faible densité, dans un courant d'eau continu et ils seront nourris 3 fois par jours avec de la poudre adéquate.
Bénéfices attendus
L'étude de l'habituation chez le poissons zèbre nous permettra de mieux comprendre les effets positifs de certaines drogues sur l''habituation et les mécanismes cellulaires mis en place dans cet apprentissage.
Procédures
Dans la procédure 1, les poissons âgés de 7 et 14 jours, seront soumis à des stimuli visuels ou acoustique en présence ou absence de drogues pendant 7h. Dans la procédure 2, les poissons âgés de 7 et 14 jours, seront immobilisés dans de l'agarose pendant 3 heures et seront soumis à des stimuli visuels en présence ou absence de drogues. Aucune intervention physique n'est prévue.
Impact sur les animaux
Pour la procédure 1, les poissons seront soumis à des flashs de lumière et à des bruits pendant 7h. Ces stimuli ont un effet mineur sur les poissons. Les drogues utilisées dans la procédure 1 ont été validées au préalable et n'ont eu aucun effet sur la survie et le bien-être du poisson de moins de 5 jours. Pour la procédure 2, les poissons seront immobilisés dans de l'agarose à 2 % préalablement refroidis à 29°C afin qu'ils ne soient pas brulés. Pendant toute la durée de l'expérience qui durera 3h, les poissons seront suivis visuellement. Tout état anormal (battement anormal de la queue ou entrée massive de calcium dans les neurones) entrainera l'arrêt immédiat de l'expérience et la mise à mort des poissons par balnéation dans de l'eau à 0/4°C puis transfert dans de l'eau de javel.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort à la fin de chacune des deux procédures
Remplacement
L'étude de l'activité neuronale dans son ensemble n'est pas envisageable in vitro puisque nous avons besoin de la fonctionnalité du cerveau dans son intégralité. L'étude de la mémoire et du comportement ne peut se faire que sur un cerveau entier, dans des animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques
Réduction
Ce projet sera réalisé sur des poissons issus de lignées existantes sans phénotype dommageable. Les poissons mutants (-/-) et les contrôles seront issus de la même ponte en croisant des poissons hétérozygotes, génotype sous lequel toutes les lignées sont maintenues. Des études d'habituation sur le poisson zèbre avec d'autres objectifs, ont déjà été réalisées dans différents laboratoires à travers le monde avec des tests statistiques robustes et connus ce qui nous permet de limiter au maximum le nombre de poissons utilisés. La méthode statistique utilisée sera la comparaison avec les poissons contrôles à l'aide de la méthode d'analyse comportementale multi-composants. Dans ces analyses, les différences cumulatives entre les conditions traitées et les conditions témoins sont comparées par rapport à la présentation de stimulus pour définir des intervalles de confiance à 95 %. Dans ce cas 60 poissons seront utilisés par condition par test comportemental. Toutes les études ont été préalablement réalisées sur des poissons âgés de moins de 5 jours non soumis à l'expérimentation animale afin de tester 1) que les lignées de poissons ayant présenté un comportement intéressant 2) que les drogues ayant montré un effet. La procédure 2 consistant en l'immobilisation du poisson dans de l'agarose pour observation de l'influx de calcium au microscope nécessitera 10 poissons par condition qui est le nombre minimum nécessaire pour pouvoir calculer une différence statistique interprétable entre deux groupes de poissons. La procédure 2 ne sera réalisée que si des résultats intéressants auront été obtenus à la procédure 1.
Raffinement
A partir de 5 jours les poissons seront maintenus dans des aquariums, à faible densité (40 poissons dans 80 cm2) , dans un courant d'eau continu et ils seront nourris 3 fois par jours avec de la poudre adéquate. A ce moment-là, les poissons seront observés attentivement et tout poisson présentant un comportement ou développement anormal ou un des points limites tels que problème de flottabilité, immobilité mouvements anormaux sera mis à mort immédiatement par balnéation dans de l'eau à 4°C pendant 10 min puis transfert dans de l'eau de javel
Choix des espèces
Les études comportementales associées à des approches d’imagerie sur l’organisme entier, à une résolution pouvant atteindre l’échelle cellulaire (poisson optiquement transparent jusqu'à 4 semaines) fait du poisson zèbre un modèle pertinent. Ces approches d'étude de comportement à haut débit (300 poissons imagés simultanément) et d'imagerie sur animal entier, ne sont absolument pas applicables en routine sur d'autres modèles vertébrés ce qui fait du poisson zèbre un modèle vertébré idéal. Les études préalables ont été réalisées sur les larves âgées de moins de 5 jours. Les études seront poursuivies sur des individus plus âgés de 7 et 14 jours pour mieux comprendre l'habituation à un stade de développement ultérieur du cerveau, plus proche d'un cerveau adulte.
Elevage de souris transgéniques SOD1G93A
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 467 souris transgéniques vont être élevées comme modèle de sclérose latérale amyotrophique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ne subissent aucune intervention dans l'élevage lui-même mais sont produites pour alimenter d'autres projets, transférées vers l'établissement expérimentateur ou euthanasiées à 100 jours si elles ne le sont pas. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne permet pas d'appréhender la complexité du système moteur et que ce modèle est le plus utilisé pour cette maladie. Les animaux gardés jusqu'à 100 jours restent asymptomatiques, une surveillance quotidienne devant repérer d'éventuels tremblements ou faiblesses musculaires.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une pathologie humaine létale et rare, dans laquelle on observe une dégénérescence et donc une disparition progressive des neurones du cortex moteur , du bulbe et de la corne antérieure de la moelle épinière. Ceci induit des paralysies pouvant toucher les muscles des membres ou de la sphère ORL (et conduire à un handicap sévère) et/ou une atteinte respiratoire (par paralysie du muscle diaphragmatique) qui est le plus souvent responsable de complication mortelle. Si la majorité des malades n'a aucune anomalie génétique, environ 5% des patients sont atteints d'une forme familiale notamment liée à des mutations sur le gène d'une protéine appelée la Super Oxyde Dismutase1 (SOD1). Dans l'objectif d'étudier les mécanismes de la maladie et de développer de nouveaux traitements, un modèle murin de cette maladie à été développé . Ces animaux contiennent une mutation dans le gène SOD1 et développe une pathologie dégénérative motrice pure qui possède beaucoup d'analogie avec la pathologie humaine. Cette lignée transgénique animale est, à ce jour, le modèle animal le plus utilisé pour la recherche sur la SLA. Notre objectif est de constituer un élevage de ces animaux qui seront utilisés pour différents projets de recherche. Un total de 4467 animaux est prévu pour l'ensemble des projets issus de cet élevage. Pour toutes ces recherches la règle des 3R sera strictement respectée. Ainsi le nombre d'animaux produit par cet élevage correspond très exactement à tous les projets de recherche qui ont été déclarés par les établissement expérimentateurs. Par ailleurs, les souris produites par l’élevage seront transmises à l’établissement expérimentateur avant l’apparition des symptômes de la maladie. Aucune douleur, souffrance ou angoisse n’est donc infligée aux animaux.
Bénéfices attendus
L'utilisation de modèles murins SOD1 G93A est nécessaire pour la recherche des mécanismes physiopathologiques de la SLA, ainsi que pour l'étude de molécules et de stratégies thérapeutiques nouvelles.
Procédures
Les animaux ne sont soumis a aucune intervention au seins de l’etablissement d’élévage. Ils seront transférés à l’etablissement expérimentateur à des âges dépendant des procédures expérimentales.
Impact sur les animaux
Tous les animaux sont euthanasiés à l'age de 100 jours s'ils ne sont pas transmis à l'établissement expérimentateur. Avant cet age, ils sont asympotmatique, toutefois les animaux sont surveillés quotidiennement dans le cas ou un symtpome précoce venait a apparaitre (tremblements ou faiblesses musculaires). Si un seul de ces symptomes se manifestait, le responsable du projet sera immediatement contacté pour décider s'il convient de transférer l'animal à l'etablissement expérimentateur ou s'il convient de l'euthanasier par inhalation de C02.
Devenir
Les animaux sont soit transférés vers l’établissement expérimentateur soit sacrifiés.
Remplacement
Aucune autre méthode comme la culture de lignées cellulaires ne permettent d'appréhender la complexité du système moteur et d'évaluer la pertinence thérapeutique de nouvelles molécules et son intérêt dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA).
Réduction
Le nombre d’animaux produit par cet élevage correspond au nombre d’animaux nécessaire pour entretenir l’élevage et pour réaliser les projets ayant fait l’objet d’une validation par le comité d’éthique. Le nombre d’animaux produit par l’élevage sera revue à la baisse en fonction de l’évolution de ces projets .
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages enrichies (carré de cellulose lab'nest ). Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle lumière inversé. L'accès à la nourriture et à l'eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine.
Choix des espèces
La souris SOD1 G93A est un modèle de choix afin de réaliser des études précliniques car c’est le modèle le plus couramment utilisé pour étudier la SLA et par conséquent c’est le modèle le plus caractérisé. Pour la reproduction les animaux seront utilisés entre 7 et 12,5 semaines pour les mâles et 7 et 24 semaines pour les femelles afin d'assurer une reproduction efficace.
Role des circuits inhibiteurs impliques dans la cognition
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion transcardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des injections virales par stéréotaxie et l'implantation d'une fibre optique ou d'une électrode, puis est mis à jeun pour être motivé lors de tâches cognitives sous imagerie cérébrale. Le porteur invoque la déclaration de Bâle et affirme qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit le cerveau intact. Les bénéfices annoncés pour la schizophrénie ou l'autisme relèvent de perspectives de recherche fondamentale.
Objectifs
Des preuves expérimentales de plus en plus nombreuses indiquent que le dysfonctionnement du cortex préfrontal est à l'origine de déficiences cognitives et d'autres symptômes de la schizophrénie, de l'autisme, de la dépression, de la douleur chronique et d'autres troubles. Cependant, nous ne comprenons pas comment les circuits du cortex préfrontal fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nos objectifs sont 1) de caractériser les schémas anormaux d'activité des circuits qui peuvent se produire dans le cortex préfrontal et contribuer aux symptômes de ces troubles, et 2) d'identifier les mécanismes tels que la neuromodulation, la connectivité synaptique, les oscillations cérébrales, etc. qui contribuent aux schémas d'activité normaux et pathologiques. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Ce projet se subdivise en 2 objectifs : 1. Analyser la dynamique neuronale et 2. l’importance fonctionnelle d’interneurones spécifiques pendant des comportements dépendant du cortex préfrontal in vivo.
Bénéfices attendus
Les maladies du cerveau ont des répercussions majeures sur la santé des individus, leur autonomie, leur éducation, leur emploi, leur mobilité et leurs relations personnelles, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est d'une importance fondamentale de comprendre les propriétés de base qui régissent la force, la gamme dynamique, l'étendue spatiale, la localisation anatomique et les composants moléculaires des connexions synaptiques entre des types de neurones spécifiques formant un réseau neuronal dans des états normaux et pathologiques. Plus précisément, on pense que le dysfonctionnement du cortex préfrontal est à l'origine de déficiences cognitives et d'autres symptômes de la schizophrénie, de l'autisme, de la dépression, de la douleur chronique et d'autres troubles. Cependant, nous ne comprenons pas comment les circuits du cortex préfrontal fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nos objectifs sont 1) de caractériser les schémas normaux et anormaux d'activité des circuits qui peuvent se produire dans le cortex préfrontal et contribuer aux symptômes de ces troubles, et 2) d'identifier les mécanismes tels que la neuromodulation, la connectivité synaptique, les oscillations cérébrales, etc. qui contribuent aux schémas d'activité normaux et pathologiques. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Grâce à l'utilisation de souris génétiquement modifiées, nous serons en mesure de cibler des types de cellules et des réseaux spécifiques afin de fournir un cadre physiopathologique permettant de comprendre les maladies du cerveau.
Procédures
Procedure 1 : Imagerie calcique in vivo avec ou sans enregistrement électrophysiologique d'animaux éveillés se déplaçant librement pendant des tâches cognitives. Cette procédure utilisera 300 souris transgéniques, toutes les souris subiront insertion de gènes dans des souris adultes en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie (pour 30-40 minutes par animal), implantation de fibre optique pour imagerie et/ou d'un electrode (pour 30 minutes d’intervention), imagerie calcique in vivo et enregistrement de l’activité électrophysiologie sur des animaux libres de leurs mouvements s’il y a une electrode pendant la tâche de flexibilité cognitive (pour 1 à 3 heures d’intervention), et perfusion transcardiaque pour fixation de tissus. Procedure 2 : Stimulation in vivo avec ou sans enregistrement électrophysiologique d'animaux éveillés et libres de leurs mouvements pendant des tâches cognitives. Cette procédure utilisera 320 souris transgéniques, toutes les souris subiront insertion de gènes dans des souris adultes en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie (pour 30-40 minutes par animal), implantation de fibre optique pour imagerie et/ou d'un electrode (pour 30 minutes d’intervention), in vivo calcium imagerie et enregistrement de l’activité électrophysiologie sur des animaux libres de leurs mouvements s’il y a une electrode pendant la tâche de flexibilité cognitive (pour 1 à 3 heures d’intervention), et perfusion transcardiaque pour fixation de tissus. Ces expériences peuvent impliquer des injections IP de substances pharmacologiques, la mise à jeun des animaux pour les motiver associée à une tache comportementale (6 jours; n = 300)
Impact sur les animaux
En général, toutes les interventions sont bien tolérées par l'animal et n'affectent pas le phénotype général de la souris. Concernant la chirurgie des implants les nuisances comprennent douleur post opératoire, risque potentiel d’infection et de perte de l’implant. En ce qui concerne les expériences comportementales, les nuisances peuvent inclure stress de la msie à jeun associés à l’isolement et, stress de la manipulation.
Devenir
Procedure 1: Nous enregistrerons l'activité du cerveau de souris (300 souris) éveillées liée à des comportements normaux ou pathologiques. Procedure 2 : Nous manipulerons l'activité du cerveau de souris éveillées (320 souris) liée à des comportements normaux ou pathologiques. Ces expériences nécessitent des analyses anatomiques post-mortem (localisation anatomique des implants, injection de virus, expression de différents gènes). Il est donc nécessaire de prélever le cerveau. Dans ce but, tous les animaux seront mis à mort après fixation par perfusion transcardiaque.
Remplacement
Il n’y a pas d’autres alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car des modèles adéquats du circuit cortical contenant le nombre, les types et la localisation appropriés de récepteurs dans les réseaux excitateurs et inhibiteurs ne sont pas disponibles. L'objectif de nos expériences est de découvrir les actions des gènes, des neuromodulateurs et des médicaments sur les circuits neuronaux dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles avec la culture cellulaire. De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les phénomènes comportementaux et cognitifs proposés ici. Les procédures expérimentales maximiseront donc le bien-être des animaux en appliquant les principes de remplacement, de réduction et de raffinement. Plus précisément, le remplacement partiel/relatif des animaux sera exercé par la mise en œuvre de plusieurs techniques employées à partir d'un seul animal (c'est-à-dire l'imagerie calcique in vivo et les enregistrements électrophysiologiques) afin de maximiser la collecte de données.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 620) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux seront implantés pour l'électrophysiologie et la photométrie par fibre simultanément, ou l'électrophysiologie et l'optogénétique simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de victimes chez les animaux et de minimiser les dommages durables. Toutefois, les avantages de la réutilisation des animaux seront mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte de l'expérience de toute une vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris à la tâche de flexibilité cognitive réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Toutes les mesures visant à atténuer ou à minimiser la douleur, la souffrance, l'angoisse ou les dommages durables subis par l'animal seront prises. Les protocoles expérimentaux ont été affinés en faisant appel aux pratiques vétérinaires les plus modernes et en prévoyant des périodes de récupération pour réduire le stress et la souffrance des animaux. Plus précisément, la souffrance des animaux est évitée ou réduite au minimum. La douleur et/ou la détresse des animaux seront, le cas échéant, réduites par la sédation, l'analgésie, l'anesthésie ou tout autre moyen approprié pour réduire la douleur ou la détresse, conformément aux pratiques vétérinaires reconnues. Cette action respectera les principes de la déclaration de Bâle (www.basel-declaration.org), qui défend l'idée que les expérimentations animales dans la recherche fondamentale et appliquée doivent être planifiées et réalisées avec un soin extrême et qui contribue à fournir à la société des informations ouvertes et transparentes sur les expérimentations animales.
Choix des espèces
Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Les phénotypes sont normaux, non dommageables. Les animaux reproducteurs sont maintenus au stade homozygote donc il n’y a pas la nécessité de les génotyper. Si jamais le besoin se crée, il consiste en un prélèvement de queue sur des animaux anesthésiés par isoflurane et marqués par un tatouage au niveau des phalanges avant sevrage. Pour les expérimentations des males transgéniques homozygotes sont croisées avec des femelles commerciales. En effet il est recommandé de réaliser les expérimentations sur des animaux hétérozygotes. Animaux adultes seront utilisés pour toutes le procedures. Toutes les procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. En outre, toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, lorsque les circuits corticaux préfrontaux ont atteint un stade de maturation final. Nos animaux sont identifiables par tatouage des phalanges selon la nomenclature universelle. Aucun animal ne sera genotype pour ce projet.
Rôle de l’Amphiréguline dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un choc cardiogénique post-arrêt cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant de l'anesthésie sans réveil ou un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est posé sous anesthésie, puis un arrêt cardiaque de huit minutes est provoqué et suivi d'une réanimation, certaines étant tuées une heure après pour prélèvements, d'autres suivies pour évaluer leur survie. Le porteur soutient, littérature à l'appui, que le coma consécutif à l'arrêt cardiaque n'entraîne pas d'inconfort, et prévoit une analgésie préventive. Il présente le contrôle de la fuite capillaire comme répondant à un "besoin médical majeur".
Objectifs
Ce projet de recherche fondamentale vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire (fuite de plasma au travers des vaisseaux) au cours des états de choc cardiogénique chez l’homme. Les états de choc constituent un enjeu de santé publique. Les admissions pour états de choc représentent un tiers des admissions en réanimation (environ 20.000 patients par an), et la mortalité associée reste de l’ordre de 40% actuellement. Il existe au cours des états de choc une fuite capillaire importante). Cette fuite capillaire est due à une augmentation de la perméabilité des vaisseaux du fait de l’activation de l’inflammation (syndrome de réponse inflammatoire systémique : SRIS). Lorsqu’elle est généralisée, cette fuite capillaire aggrave l’insuffisance circulatoire du fait de la baisse du volume sanguin, et participe à l’apparition de lésions sur l’ensemble des organes (syndrome de défaillance multiviscérale). Le contrôle de la fuite capillaire s’est avéré très bénéfique dans plusieurs modèles de choc chez l’animal. Cependant, les déterminants de cette fuite capillaire au cours des états de choc restent très peu connus chez l’homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons isolé plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire chez 19 patients atteints de SRIS. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’amphiréguline comme cible d’intérêt particulier du fait de son tropisme vasculaire. L’association entre la concentration plasmatique d’AMPHIREGULINE et la fuite capillaire a été confirmée dans une cohorte indépendante de 77 patients. Notre objectif est de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’AMPHIREGULINE permet de diminuer la fuite capillaire et la mortalité au cours du SRIS.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de caractériser le rôle de l’AMPHIREGULINE dans la fuite capillaire associée au choc cardiogénique post-arrêt cardiaque, et le potentiel intérêt de sa modulation. Le contrôle de la fuite capillaire au cours de ce syndrome est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, l’arrêt cardiaque restant associé à plus de 50% de mortalité actuellement, et la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients.
Procédures
Chaque animal ne sera inclus que dans une procédure. Ces procédures comprendront : - la pose d'un abord vasculaire (cathéter veineux) qui sera réalisé sous anesthésie générale après une analgésie prophylactique. - un arrêt cardiaque long (8min) puis une réanimation cardiopulmonaire - une surveillance de l'animal après cardiaque avec soit une euthanasie à 1h de l'arrêt cardiaque pour quantification de la fuite capillaire, soit une évaluation de la survie. - une surveillance continue du bien être animal avec si nécessaire une analgésie supplémentaire L'ensemble de l'intervention dure entre 1 et 24 heures en fonction de la procédure.
Impact sur les animaux
L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Ceci est confirmé par notre suivi des animaux au cours de la mise au point du modèle (DAP 23817). Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : Pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours de ces cinq procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure. Pour les procédures 2, 3 et 5, l’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures (soit jusque H+8 de l’arrêt cardiaque puis toutes les 4 heures le jour et toutes les 8h la nuit.) L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin.
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sérum et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS. La fuite capillaire est en effet d’origine multi-factorielle et l’AMPHIREGULINE régule de nombreuses voies physiologiques. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le nombre d’animaux nécessaires est calculé a priori. - Procédure 1 : Effectif fixé à 117 souris - Procédure 2 : Effectif fixé à 92 souris - Procédure 3 : Effectif fixé à 40 souris - Procédure 4 : Effectif fixé à 117 souris - Procédure 5 : Effectif fixé à 92 souris Le plan expérimental a été optimisé de façon à combiner les données obtenues pour chaque animal et réduire l’effectif nécessaire - Une analyse échographique sera couplée à l’analyse lors de la procédure 1 - Les analyses sanguines et histologiques seront effectuées sur le sang et les organes non prélevés 3) Notre équipe poursuit une veille bibliographique continue sur le sujet et le modèire : le, de façon à ne par duppliquer d’éventuelles nouvelles données. De la même façon, l’ensemble des résultats du projet sera publié, pour les rendre accessibles aux autres équipes.
Raffinement
Nous tendrons vers les objectifs préconisés de raffinement. L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : - Pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours de ces cinq procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure. - L'ensemble de la procédure de pose d'abord vasculaire sera réalisée sous anesthésie générale - Les procédures 1 et 4 sont entièrement réalisées sous anesthésie générale - Pour les procédures 2, 3 et 5, l’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures (soit jusque H+8 de l’arrêt cardiaque puis toutes les 4 heures le jour et toutes les 8h la nuit. - L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin. - Les euthanasies seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS secondaire à un arrêt cardiaque est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de notre cible d’intérêt dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si le gène d’intérêt peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement, ainsi que lors de nos expérimentations préliminaires sur ce modèle (APAFIS#23817)
Etude d’un apport de provitamine A chez des animaux carencés en vitamine A
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
28 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont soumises pendant huit semaines à des régimes carencés ou enrichis en provitamine A, la seule intervention déclarée douloureuse étant l'injection anesthésique terminale, pour évaluer si des larves d'insectes peuvent servir de source de vitamine A. Le porteur présente ce débouché alimentaire comme pertinent pour les pays où la carence persiste. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'analyser la digestion et le métabolisme des vitamines chez un mammifère.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier la conversion de précursseurs de la vitamine A en vitamine A chez la gerbille consommant des aliments enrichis en précursseur (provitamine A). Ceci afin de pouvoir considérer les insectes riches en caroténoïdes comme de futurs aliments pour l’homme. Des études antérieures ont montré que les larves de l’insecte Hermetia Illucens (mouche soldat noire) sont capables de bioaccumuler de fortes concentrations de provitamine A quand elles sont élevées sur des substrats riches en cette provitamine. Mais on ne sait pas si ces larves pourraient servir de source de vitamine A chez l’homme ou l’animal de rente. L’objectif est donc de déterminer, en utilisant le modèle gerbille qui est un modèle reconnu pour étudier l’activité provitaminique A de caroténoïdes, si des larves enrichies en provitamine A sont capables de rétablir le statut vitaminique A de gerbilles carencées en cette vitamine.
Bénéfices attendus
Des nombreuses recherches sont axées depuis une vingtaine d’années sur la biodisponibilité des caroténoïdes. Dans le contexte du changement climatique et des changements des habitudes alimentaires qu’il implique, il est particulièrement pertinent d’étudier la capacité des insectes comestibles à être des sources complémentaires et durables de caroténoïdes provitaminiques A. En effet, la carence en vitamine A persiste dans de nombreux pays en développement et pouvoir utiliser des insectes comme source de cette vitamine serait très intéressant à la fois pour l’alimentation des animaux de rente dans ces pays, et pour certaines populations qui consomment des insectes depuis de nombreuses générations. Par ailleurs, l’insecte que nous allons utiliser dans ce projet est un insecte qui a la capacité de croitre sur des déchets organiques et qui est utilisé pour les recycler et les valoriser. Montrer que l’on peut aussi l’utiliser pour recycler des déchets de fruits ou légumes riches en caroténoïdes provitamine A, e.g. patate douces oranges, et obtenir des larves riches en caroténoïdes provitamine A capables de rétablir le statut vitaminique A d’un animal modèle serait très intéressant pour cette filière de l’entomoconversion. Utiliser des insectes comme source de caroténoïdes pour l’homme pourrait être envisageable à long terme pour certains pays en voie de développement ou les carences en vitamine A sont toujours d’actualité pour certaines populations.
Procédures
Cinq jours d’acclimatation sont prévus à l’arrivée des animaux – Pendant cette période l’habituation progressive des animaux à être pesé sera réalisée. Ces pesées auront lieu 2 fois à 3 fois par semaine afin d’assurer le suivi de croissance. La seule intervention que subiront les animaux est l'anesthésie finale. La modification du régime alimentaire n’a aucun effet sur la croissance normale des gerbilles, et n’occasionnent aucune souffrance. Les gerbilles des groupes dits « carencés en vitamine A » sont en fait nourries pendant 5 semaines avec un régime classique avec un apport faible en vitamine A (1050 UI). Ces témoins ont déjà étaient utilisés et les résultats publiés ont indiqués une croissance et une consommation normale.
Impact sur les animaux
Il s’agit de tester plusieurs régimes alimentaires, éventuellement carencés en vitamine A, sur une durée maximale de 8 semaines. Il n’y a pas d’effets indésirables graves ni de perte de poids prévus sur la durée de l’expérience, relativement courte. Les effets indésirables attendus sont le stress des animaux liès à la manipulation (pésée) et à l'injection terminale d'anesthésique
Devenir
A l'issue des 8 semaines de régime alimentaire carencé ou non les animaux sont euthanasiés
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives permettant d’analyser les capacités nutritionnelles d’un aliment pour mammifères, comprenant la digestion et le métabolisme des vitamines.
Réduction
Il s’agit d’une étude pilote permettant d’évaluer, en 8 semaines, l’interêt potentielle d’une source alimentaire permettant de lutter contre les carences en vitamine A. Afin d’éviter de multiplier le nombre d’expériences, deux suppléments alimentaires sont testés en parallèle : les patates douces et les insectes, permettant ainsi de limiter les groupes témoins.
Raffinement
Aucune douleur n’est attendue au cours de l’expérimentation. Des maisons en cartons et bâtons de peuplier sont ajoutés dans les cages.
Choix des espèces
La gerbille est un modèle animal très intéressant pour les chercheurs qui veulent mimer le taux de bioconversion des caroténoïdes provitaminiques A en vitamine A chez l’homme. En effet, contrairement à l’homme et à la gerbille, le rat et la souris ont des taux de conversion très élevés, proche de 100%, et quand on leur fait consommer de la provitamine A on ne retrouve pratiquement que de la vitamine A dans leur organisme. Chez l’homme et la gerbille, le taux de conversion est compris entre quelques % et 80% (ce taux dépend de nombreux facteurs dont le statut vitaminique A, le sexe et la matrice alimentaire dans laquelle est la provitamine A) et on retrouve donc dans l’organisme à la fois de la vitamine A et de la provitamine A absorbée mais non convertie en vitamine A. Gerbilles de 7 semaines âge minimum pour être sevrées
Évaluation de l’impact de l’activité physique sur la réponse à l’immunothérapie dans un modèle de tumeur sous cutanée induite par injection de cellules cancéreuses prostatiques (APICaP).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, quarante étant classées en gravité sévère. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses prostatiques puis sont soumises à un exercice forcé, pour voir si l'activité physique lève la résistance à une immunothérapie. Le porteur prévoit une anesthésie sans réveil pour la totalité des animaux en fin de projet, afin de prélever tumeur et organes. Il affirme qu'aucune alternative in vitro n'existe et que la recherche "rend incontournable" le recours à la souris.
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact d'une activité physique régulière sur la réponse à l'immunothérapie et de décrypter les mécanismes moléculaires impliqués, dans un modèle murin de cancer de la prostate. L’anti-PD1 utilisé est celui décrit dans de nombreuses publications : BioXCell, InVivoPlus anti-mouse PD-1 (CD279). Dans notre modèle, cette immunothérapie n’a pas d'efficacité et nous cherchons à déterminer si l’activité physique peut lever cette résistance à l’immunothérapie. Le modèle TRAMP-C2 n’engendre pas de métastases.
Bénéfices attendus
L'activité physique sur tapis roulant pourrait ralentir la croissance tumorale comparativement aux souris ne pratiquant pas d'AP. Cela rejoindrait des résultats précédemment obtenus. L'activité physique pourrait améliorer la perfusion tumorale et donc améliorer les effets de l'immunothérapie (anti-PD1) dans le modèle de souris TRAMP-C2. Il s’agit de nouveaux traitements et de nouvelles alternatives de prise en charge de patients avec cancer de la prostate. Le tout, sur un modèle déjà bien utilisé dans notre laboratoire.
Procédures
Les animaux sont soumis à une injection en sous cutanée (aiguille 26G) de 100µl d'une solution contenant un million de cellules TRAMP-C2 de cancer de prostate. Aucune procédure chirurgicale, ni prélèvement sur animaux vigiles, ne seront effectués.
Impact sur les animaux
De possibles problèmes de locomotion chez les animaux porteurs de la tumeur peuvent être observés. Nous analyserons donc la mobilité, le toilettage, la perte de poids (ne doit pas être inférieure à 20% du poids initial à aucun moment, pendant la durée de la procédure), et le volume de la tumeur qui ne doit pas excéder 1500mm3. Dans ce modèle de TRAMP-C2, aucune perte de poids supérieur à 20% n’a été documentée sur la durée du projet. Si ces changements sont observés, ils seront considérés comme un point limite et les animaux seront euthanasiés.
Devenir
A l'issue de la procédure 1-4, les animaux sont gardés en vie. A la fin du projet une anesthésie sans réveil est prévue pour la totalité des animaux. En fait, nous avons besoin de prélèvements sanguins ( Il s'agit de 0.3-0.5 ml de sang que nous récupérons à l'aide d'une seringue dans la cavité du coeur de l'animal, aprés avoir été euthanasié) , de prélever la tumeur,le foie, la rate, les intestins, les poumons, les reins, les muscles gastrocnémiens, tibialis antérieurs, extensor digitorum longus et soleaires pour les analyses ultérieures. Ces analyses nous permettront d'identifier l'impact d'une activité physique régulière sur la réponse à l'immunothérapie et de décrypter les mécanismes et les acteurs moléculaires impliqués.
Remplacement
L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact d'une activité physique régulière sur la réponse à l'immunothérapie et de décrypter les mécanismes moléculaires impliqués. Ceci n'est pas démontrable "in vitro". Nous cherchons ici à étudier les interactions entre la tumeur, le plasma et le muscle. Il n'existe donc pas d'altérnative in vitro pour ce type d'évaluation. La nécessité de la recherche biologique, en vue de contribuer à améliorer la prise en charge médicale, rend incontournable le recours à l'expérimentation animale pour faire progresser les connaissances et améliorer la prise en charge et la survie de patients atteints de cancer de la prostate.
Réduction
Les cohortes seront constituées de 10 souris par groupe afin d’obtenir un nombre d'animaux suffisant pour juger du caractère significatif des résultats. La taille de l’échantillonnage de chaque groupe a été définie à partir d’un test statistique (Sample size test). Afin de juger des effets de l'activité physique et de l'immunothérapie sur le cancer de la prostate, des ANOVA à deux facteurs seront utilisées. En cas de différences significatives sur ce test, un Bonferroni post hoc test sera employé pour isoler les effets et les interactions entre les différentes conditions expérimentales.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent un hébergement en cage individuelle car il est indispensable de mesurer la consommation quotidienne de nourriture mais des précautions sont prises. Les animaux seront hébergés dans des cages transparente, individuelle, côte à côte et enrichies avec des jouets et du matériel adapté ce qui permet de limiter l'isolement social et le stress. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel des animaux. Un questionnaire pour mesurer le niveau de souffrance des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire demande de suivre et de noter les signes visibles d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procéderons à la sortie de l'animal du protocole.
Choix des espèces
Le modèle de souris syngéniques C57/BL6 est un modèle pertinent pour étudier le cancer de la prostate car il va permettre l'injection de cellules cancéreuses prostatiques murines et l'evolution de la tumeur. De plus, c'est un modèle de souris immunocompétent. L'implantation de la lignée cellulaire TRAMP-C2 dans ce modèle permet de développer un modèle de cancer de la prostate similaire à ceux observés chez l'Homme. C'est-à-dire qu’il s’agit d’un modèle de tumeur sous cutanée induite par injection de cellules cancéreuses prostatiques. Les cohortes seront constituées de 10 animaux par groupe afin d'obtenir un nombre de sujets suffisant pour juger de la significativité de notre étude. Dans le cas présent, nous avons fait le choix d’une injection sous-cutanée afin de suivre la croissance tumorale plus aisément et comparer les résultats avec ceux déjà obtenus dans notre laboratoire. Mâles, agés de 8 semaines.
Evaluation pré-clinique de nouvelles cibles et molécules anticancéreuses seules ou associées dans les modèles murins de mélanome uvéal (MU)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
743 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de mélanome de l'œil humain leur sont injectées pour générer tumeurs et métastases, suivies par imagerie et prélèvements sanguins, la mise à mort intervenant quand la tumeur atteint sa taille maximale ou quand les métastases couvrent 40 % du péritoine. Le porteur indique qu'entre 20 et 50 % des animaux dont la tumeur ne prend pas sont aussi tués. Il présente ces essais précliniques comme "indispensables" pour augmenter la survie des patients, aucun traitement n'existant contre la forme métastatique.
Objectifs
Le cancer reste parmi les premières causes de décès dans le monde. Le mélanome de l’uvée est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Même s’il existe des traitements efficaces pour éliminer la tumeur primaire (chirurgie ou radiothérapie), aucun traitement n’existe actuellement contre la phase métastatique de la maladie. L'évaluation des nouvelles thérapies disponibles aujourd'hui nécessite le développement des modèles pertinents. Un modèle métastatique a été développé dans le laboratoire suite à l’injection de cellules tumorales humaines sur souris ce qui permet la réalisation d’études pharmacologiques dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ce modèle nous a permis d’observer le développement de métastases principalement au niveau hépatique mais également au niveau péritonéal dans certains cas. Ainsi elles constituent un outil primordial pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ou encore de nouvelles combinaisons ou schémas d'administration de médicaments. Ces essais précliniques ont différents objectifs : déterminer le type tumoral qui présentera le plus de bénéfice au traitement, déterminer les combinaisons et les fréquences d’administration qui seront les plus efficaces mais également effectuer des études moléculaires de la tumeur qui permettront d’expliciter le mécanisme d’action des molécules testées ou encore les mécanismes de résistance de ces tumeurs par rapport à ces thérapeutiques. Ces essais précliniques sont des phases préliminaires aux phases cliniques. Ils permettent d’orienter les développements futurs des nouvelles molécules et d’optimiser des traitements qui seront ensuite utilisés chez l’homme. Les modèles murins de mélanome uvéal de notre laboratoire représentent des tumeurs générées par injection de lignées cellulaires humaines tumorales. Ces tumeurs représentent la diversité de la maladie chez l’homme et sont utilisées dans le cadre de collaboration avec des partenaires pour évaluer des nouvelles drogues. L’évaluation de l’effet de ces molécules comprend l’étude de la tolérance qui permet de déterminer la dose des molécules ou des associations de molécules sur de petits groupes d’animaux jusqu’à l’étude de l’efficacité anticancéreuse de ces mêmes molécules.
Bénéfices attendus
Le mélanome uvéal (MU) est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Dans la grande majorité des cas, le mélanome uvéal apparait suite à une surprolifération des mélanocytes au niveau de la choroïde, qui est une des couches de la paroi du globe oculaire. Mais il peut également survenir dans deux autres couches de l’œil, l’iris ou le corps ciliaire. Il représente 5% de tous les mélanomes et se distingue du mélanome cutané au niveau biologique et génétique. Il existe des thérapies efficaces comme la chirurgie et la radiothérapie pour éliminer la tumeur primaire. Cependant plus de 30% des patients développent des métastases principalement au niveau hépatique et péritonéal. Malheureusement il n’existe actuellement aucun traitement de référence contre la phase métastatique de la maladie. A la fin de l’expérience la tumeur primaire et les métastases seront prélevées pour étude post-mortem. Une partie sera congelée à sec pour analyse génomique et une autre sera fixée pour analyses histologiques. Le but de ces expériences in vivo est donc dans un premier temps de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du MU (croissance de la tumeur primaire ainsi que des métastases). Cette étude a également pour but de trouver un traitement afin de lutter contre la croissance de la tumeur au niveau de sa localisation initiale mais surtout d’évaluer l’efficacité de différentes « molécules actives » ou nouvelles cibles thérapeutiques sur le développement métastatique de la maladie. Ces avancées sont indispensables et majeures afin d’augmenter le pourcentage de survie des patients.
Procédures
>Injection intradermique sur animal vigile de cellules dans un volume de 100µL de tampon dans le derme de la souris au niveau du flanc droit / 1 fois en début d’expérience >Injection intrasplénique sur animal anesthésié de cellules dans un volume de 50µL de tampon / 1 fois en début d’expérience. Durée de l’anesthésie : 30 minutes >Imagerie sur souris anesthésiées en gazeuse après injection de sonde colorimétrique en IP sous un volume de 100µL / 1 fois toutes les 2 semaines puis une fois par semaine tout au long de la procédure. Durée de l’anesthésie : 15 minutes >Prélèvements sanguins sur animal vigile au niveau du sinus rétro-orbital / 1 fois en début d’expérience et 1 fois en fin d’expérience avant sacrifice >Injection/ingestion de molécules chimiques sur animal vigile (dont le volume maximal ne dépassera pas 10% du volume sanguin total de l’animal) / de 1 fois par semaine à 2fois par jour selon le traitement tout au long de la procédure
Impact sur les animaux
Avant passage chez l’animal tout effet antitumoral d’une molécule est validé sur des modèles cellulaires in vitro. Afin d’évaluer l’effet de différentes molécules actives sur le développement du mélanome uvéal, l’apparition de tumeurs de MU chez la souris doit être induite. Ces tumeurs sont générées au début de l’expérience par injection de cellules tumorales humaines. Cette étape est indispensable pour l’étude de potentiel anti-cancéreux au niveau de la localisation initiale de la tumeur Pour l’étude de la croissance métastatique un modèle d’injection représentant le développement métastatique de la maladie chez le patient (c’est-à-dire apparition de métastases au niveau hépatique et péritonéal) doit également être utilisé. Un système luminescent permet alors de suivre la dissémination métastatique chez la souris vivante au cours du temps. Les animaux seront pesés et leur état général sera contrôlé toutes les semaines. Les tumeurs seront mesurées et les souris seront sacrifiées lorsque la taille éthique atteinte. L’évolution des métastases sera également suivie par imagerie tous les 15jours au début de l’expérience puis toutes les semaines quand les métastases commenceront à se développer. Les souris seront sacrifiées lorsque le pourcentage de métastases aura atteint 40% de la surface du péritoine de l’animal. Pour chaque procédure, si un animal montre des signes de douleur, des antalgiques lui seront administrés.
Devenir
Dans chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem dès l’apparition des points limites (taille de la tumeur primaire maximale atteinte ou pourcentage métastatique atteint) ou bien en fin de l’expérience (durée de traitement prévu). Les animaux dont la tumeur ne s’est pas développée après l’injection seront mis à mort. Ce nombre est très variable d’une tumeur ou d’une injection de lignées à l’autre et en moyenne de l’ordre de 20% des animaux suite aux injections intradermique ou de l’ordre de 40-50% suite aux injections intrasplénique. Le délai de la décision de sortie des souris dépend de la vitesse de pousse des tumeurs et peut aller de 2 à 8 semaines selon le type d’injection.
Remplacement
L’efficacité antitumorale de tous les traitements est préalablement évaluée sur des cultures cellulaires (système in vitro). Seules les molécules ayant montré une efficacité in vitro sont alors ensuite utilisées in vivo. En effet il est nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré et tenant compte de la complexité d’un organisme vivant avec les multiples interactions, la toxicité possible ou encore la difficulté de la molécule à atteindre sa cible. L’injection de lignées cellulaires tumorales constitue l’outil d’analyse pharmacologique des nouveaux composés le plus proche de l’utilisation clinique aujourd'hui. Pour sélectionner les meilleurs composés antitumoraux, l'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation clinique. Cette évaluation conduit à optimiser les modalités thérapeutiques, prédire les effets du médicament en association et identifier des marqueurs de réponse ou de résistance. Les effets des thérapies testées sur la dissémination métastatique et sur les cellules initiatrices de tumeurs sont également étudiés.
Réduction
En se basant sur notre expérience, pour les expériences de toxicité, l’utilisation de 3 souris/dose est le minimum suffisant pour déterminer les effets secondaires des molécules. Dans les expériences d’efficacité, le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence de réponse de 20% (= biologiquement significative via les tests statistiques t-test ou ANOVA) entre les groupes traités et contrôles. Ce nombre tient compte du taux de prise tumorale et l’hétérogénéité des réponses des animaux.
Raffinement
Les injections de cellules tumorales par voie intradermique sont peu invasives, avec un suivi de croissance tumorale facile et avec peu de manipulation. Pour les injections par voie intrasplénique, les souris reçoivent des antalgiques avant et après la chirurgie La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Les précautions suivantes seront prises : - Réduction de l’hypothermie lors de la chirurgie : tapis ou lampe chauffante dès l’anesthésie des animaux et jusqu’à leur réveil - apport gel nutritif(dans la cage , en post chirurgie Evaluation de l’état général de la souris : une grille de score déterminera le point limite. Les animaux sont mis à mort dès atteinte d’un point-limite Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront à nouveau administrés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : - La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l'Homme. - La réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première instance et il permet d’acquérir un grand nombre d’informations pour un investissement contrôlé. - L’existence de souches immunodéficientes chez la souris permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Cette greffe de cellules humaines est plus difficile dans d’autres espèces (le Zebrafish est moins permissif) Jeune adulte : L’injection a lieu entre 5 à 8 semaines. Les souris ont ainsi fini leur croissance mais sont suffisamment jeunes pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux car l’immunodéficience pourrait diminuer avec l’âge. De plus le temps de croissance des cellules tumorales MU est long ainsi que l’apparition des métastases. Les animaux à cet âge supportent également mieux le transport à partir de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements
Recherche d’un traitement pour une maladie neurologique rare MCOPS12.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Porteuses ou non d'une mutation liée à une maladie neurologique rare, elles reçoivent quatre traitements par injection, gavage ou alimentation, suivis de tests comportementaux répétés, avant d'être tuées par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque. Le porteur affirme que le modèle murin "n'est pas remplaçable" et que la mutation "n'engendre aucune souffrance". Les doses testées sont décrites comme faibles, très en deçà de la dose létale.
Objectifs
Des mutations ponctuelles du recepteur à l’acide rétinoique beta (Rarb) sont à l’origine d’une maladie neurologique rare responsable de symptomes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodeveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostique vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations ponctuelles. Les souris mutantes présentent des symptomes moteurs similaires à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle du récepteur dans le dévelopement et dans l’homéostasie de striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire RARb contrôle le développement d’une sous-population de neurones dans le striatum exprimant le récepteur à la dopamine 1 (Drd1+), alors que à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une sous population de neurones exprimant le récepteur à la dopamine 2 (Drd2+). Notre premier objectif est de normaliser les symptomes moteurs et cognitifs en modulant la signalisation dopaminergique de deux manières : - Par l’augmentation simultanée de l’activité de la signalisation par les neurones Drd1+ et Drd2+, à la suite de l’administration du traitement L-DOPA, un précuseur de la dopamine, utilisé pour le traitement de la maladie de Parkinson. - Par l’augmentation de l’activité dopaminergique liée aux neurones Drd2+ par l’administration de pramipexol. Notre deuxième objectif est d’utiliser des traitements précoces, déjà utilisés dans la maladie de Parkinson, afin de prévenir l’apparition des symptomes : - L’utilisation de la molécule cGP connue pour son implication dans le neurodégénrescence lorsque qu’elle est dérégulée. C’est un traitement qui est déjà utilisé dans la maladie de Parkinson pour favoriser la survie neuronale. - L’utilisation de rétinyl acetate permettra quant à elle la normalisation de la voie de l’acide rétinoïque qui est extrêmement importante pour le développments et les fonctions striatales.
Bénéfices attendus
Pour chacun des quatre traitements (pramipexol, L-DOPA, cGP et rétinyl acetate), nous testerons des doses faibles afin de normaliser la signalisation dopaminergique dans le striatum ou de prévenir l’apparition des premiers symptomes liés à la neurodégénérescence. Dans ce but, le pramipexol sera injecté (et comparé à des injections de salin (véhicule), qui permettra de contrôler les effets de l’injection) à une dose très faible de 0.2 mg/kg et à une dose faible de 2 mg/kg avant des tests comportementaux (5 differents). Ces traitements seront réalisés sur le même lot d’animaux à 1 semaine d’écart afin d’étudier l’effet dose réponse du traitement. En résumé, la procédure se déroulera comme suit : J 1 : Injection n°1 (0.2mg/kg) suivie des tests 1 (30min) et 2 (3 x 5min) J 4 : Injection n°2 (0.2mg/kg) suivie du test 3 (32h) J 7 : Injection n°3 (0.2mg/kg) suivie du test 4 (30min) J 9 : Injection n°4 (0.2mg/kg) suivie du test 5 (30min) Une semaine de battement entre les injections J 17 : Injection n°1 (2mg/kg) suivie des tests 1 (30min) et 2 (3 x 5min) J 20 : Injection n°2 (2mg/kg) suivie du test 3 (32h) J 23 : Injection n°3 (2mg/kg) suivie du test 4 (30min) J 26 : Injection n°4 (2mg/kg) suivie du test 5 (30min) Toutes les injections seront effectuées avec des aiguilles fines. Les molécules sont injectées à des doses pharmacologiques faibles. Ce dosage est couramment utilisé dans les tests comportementaux chez les souris sans poser de problème. Il est d'ailleurs très largement en deça à la dose létale murine de 168,8mg/kg par injection intra-veineuse. L’administration de L-DOPA se fera par gavage des animaux à une dose de 10mg/kg, qui se fera avant chaque test comportemental. Ces tests seront réalisés de la même manière et dans le même ordre que pour le pramipexol. Le traitement cGP se fera par l’eau des biberons à une dose de 3mg/kg pendant 8 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux. Le traitement se fera donc par l’intermédiaire des mamans qui allèteront les jeunes souris. A la suite du traitement, les cinq différents tests comportementaux se feront dans le même ordre et de la même manière que décrit pour les traitements au L-DOPA. Enfin, le traitement au rétinyl acetate se fera grâce à une supplémentation de la nourriture avec du rétinyl acetate (1.8mg/kg). Ce traitement sera effectué pendant 8 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux et sera suivi des mêmes tests comportementaux indiqués pour lestraitements au L-DOPA.
Procédures
Tous les traitements notifiés ci-dessous se feront sur 3 groupes distincts d’animaux porteurs, ou non, d’une mutation agés de 15 à 30 semaines pour les traitements au pramipexol et L-DOPA et agés de 6 à 10 semaines pour les traitements au cGP et rétinyl acetate. Dans un premier temps, un traitement au pramipexol (5 secondes par traitement, 12 animaux traités/groupe à 0.2 et 2 mg/kg) et d’un traitement contrôle (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 54 mâles et 54 femelles = 108 animaux au total. Ce traitement sera suivi d’un test comportemental et sera réitéré avant chaque nouveau test comportemental (test 1 = 30min; test 2 = 3 x 5min; test 3 = 32h; test 4 = 30min; test 5 = 30min). Les tests comportementaux 1 et 2 feront suite à la même injection. Les souris changeront de groupe pramipexole-véhicule à chaque test selon un roulement et recevront donc au maximum 8 injections, dont 6 maximum de pramipexol. Dans un deuxième temps, un traitement au L-DOPA (15 secondes par traitement), admisnistré par gavage, (12 animaux traités/groupe) et d’un traitement avec de la solution saline (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 54 mâles et 54 femelles = 108 animaux au total. Ce traitement sera suivi d’un test comportemental et sera réitéré avant chaque nouveau test comportemental (voir ci-dessus). Les souris changeront de groupe L-DOPA-véhicule à chaque test selon un roulement et recevront donc au maximum 4 traitements, dont 3 maximum de L-DOPA. Dans un troisème temps, un traitement au cGP administré dans l’eau des biberons pendant 6 à 10 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux (12 animaux traités/groupe) soit un total de 36 mâles et 36 femelles = 72 animaux. Ce traitement sera suivi par 5 tests comportementaux visant à évaluer la motricité et la cognition des animaux traités (identiques aux autres traitements). Dans un quatrième temps, un traitement au rétinyl acetate administré par l’intermédiaire de la nourriture pendant 6 à 10 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux (12 animaux traités/groupe) soit un total de 36 mâles et 36 femelles = 72 animaux. Ce traitement sera suivi par 5 tests comportementaux (identiques aux autres traitements). La moitié des animaux de chacun des quatre traitements = 180 animaux, sera ensuite euthanasiée par perfusion intracardiaque après anesthésie générale. Une vérification de la perte des reflexes au niveau des membres et palpébral est réalisée avant tout acte chirurgical.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne dépasseront pas la douleur occasionnée par l’introduction d’une aiguille dans l’abdomen de l’animal. En effet, les tests comportementaux moteurs effectués avant et après les traitements ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive est à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement. De plus, la mutation n’engendre aucune souffrance chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permettent de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires. D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque sera effectuée pour la réalisation de marquages immuno-histochimiques qui nécéssitent une fixation complète et homogène de l’échantillon prélévé, permise par le PFA4% administré de manière sistémique par voie intracardiaque.
Remplacement
Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique des signalisations dopaminergique et rétinoïdiennes ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.
Réduction
Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés : le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues chez des souris à la suite du test qui est le moins discriminant parmis les tests effectués ici, ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques provenant d’autres laboratoires. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée par application d’un test statistique cohérent avec les analyses effectuées. De plus, les animaux traités avec le vehicule (contrôle de l’effet des traitements pramipexol et L-DOPA) seront reparti dans deux groupes de 6 animaux (et pas 12 comme pour les autres groupes). En effet la méthode de traitement ne devrait pas modifier le comportement de l’animal, ce qui permettra de regrouper les deux sous groupes lors des analyses.
Raffinement
En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses. Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans injection préalable de composés pharmacologiques. Les molécules pharmacologiques sont utilisées à des doses faibles permettant simplement de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Des plus, les points d’injections de promipexol seront alternés entre les côtés gauche et droit de l’abdomen de l’animal. Ils seront attentivement surveillés pendant les heures suivant l’injection afin d’éviter toute infection.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de les mutations du gène RARb (identifiée chez l’homme) dans la mise en place et la progression de la maladie MCOPS12, les performances comportementales et les fonctions du système dopaminergique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans la plupart des cas des animaux adultes d’entre 15 et 30 semaines afin d’oberver les changements de comportements des animaux à la suite des traitements et de diminuer l’hétérogénéité des résultats qui pourraient être apporté par l’augmentation de l’âge des souris. Pour les tests au cGP et au rétinyl acetate, les animaux seront testés entre 6 à 10 semaines pour évaluer l’effet des traitements directement après l’arret de ces derniers.
Impact du stress prenatal sur le développement des troubles anxieux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
371 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de l'anesthésie sans réveil à modéré. Des femelles gestantes sont soumises à un stress répété, trois séances de 45 minutes par jour pendant sept jours, pour induire chez leurs descendants un phénotype anxieux étudié par des tests comportementaux d'exploration. Le porteur indique ne pas pouvoir limiter ce stress puisqu'il est "le but recherché", et que tous les animaux sont ensuite tués pour analyser leur cerveau. Il décrit le modèle rongeur comme "incontournable", les bénéfices pour l'humain étant renvoyés au long terme.
Objectifs
Le projet a pour but d'étudier l'émergence des troubles anxieux dans un modèle de stress précoce. Nous avons précédemment montré que les souris soumises à un stress développemental in utero (stress prénatal) présentent à l'âge adulte de nombreux troubles comportementaux caractérisés notamment par un phénotype de type anxieux. Sur la base de ces résultats, notre objectif est de déterminer à quel moment du développement ces troubles se mettent en place et d'en étudier les substrats neuroanatomiques. En particulier, nous nous interessons aux neurones granulaires du gyrus denté dont nous avons montré par ailleurs qu'ils étaient impliqués dans les troubles anxieux. Nous testerons donc l'hypothèse que le stress prénatal modifie la genèse ou l'activité des ces neurones, et que ces modifications sont associées à une augmentation de l'anxiété.
Bénéfices attendus
Ces expériences fourniront des informations uniques sur l'émergence des troubles anxieux et sur les processus neuronaux impliqués. Elles permettront à moyen terme d'identifier des marqueurs biologiques précoces prédictifs d'une vulnérabilité comportementale ultérieure. La transposition à l'humain, à plus long terme, permettra la prise en charge des individus à risque.
Procédures
Trois groupes d'animaux sont à considérer: le premier est constitué de femelles dont le niveau d'anxiété sera évalué par deux tests comportementaux d'une durée de 10 min et 5 min, respectivement à 2 jours d'intervalle (n=173) et dont une partie sera soumise à un stress comportemental léger durant la gestation (n= 40 souris; stress divisé en 3 sessions quotidiennes de 45 min pendant 7 jours); le deuxième est constitué de leurs descendants qui seront soumis à des tests comportementaux basés sur l'exploration spontanée avant étude des structures cérébrales impliquées (n=168 souris: un lot subit 3 tests comportementaux de 10 min maximum à raison d'un test par jour pendant 3 jours et le deuxième lot subit 1 test de 10 min); le troisième est constitué des descendants servant de population témoin puisqu'ils ne subissent aucun test comportemental (n=60). Pour analyser les structures cérébrales, tous les descendants (groupe 2 et 3) subiront au jour postnatal P1 une injection intrapéritonéale d'un marqueur de division cellulaire.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes sont soumises à des stress répétés qui vont générer un état de léger stress chronique. Il ne nous est pas possible de limiter ce stress ou de compenser cet état puisqu'il est le but recherché, et qu'il a pour objectif de mimer la situation observée chez l'humain (le modèle a été établi pour comprendre les mécanismes impliqués dans les troubles comportementaux observés dans la population humaine soumise à des situations environnementales délétères durant la vie intra utérine). Les tests comportementaux qui seront effectués sur les descendants sont quant à eux non invasifs et basés sur le comportement exploratoire naturel de la souris. Nous n'attendons pas d'effet indésirable de leur mise en oeuvre.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis mort à l'issue des procédures pour une étude de l'impact du stress sur les structures cérébrales.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation de souris de laboratoire. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons : 1) les troubles anxieux que nous analysons sont des troubles du comportement; à ce titre, ils nécessitent une approche intégrée prenant en compte l'ensemble de l'organisme et ils ne peuvent pas être récapitulés sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux.
Réduction
Nous avons travaillé sur la réduction du nombre d'animaux sur 2 plans: 1) lorsque cela est possible (pas d'impact attendu sur les résultats obtenus), les souris seront utilisées dans plusieurs tests comportementaux afin de réduire le nombre total d'animaux nécessaires; 2) Un effectif de 14 souris par groupe représente un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, compte tenu de la variabilité comportementale attendue chez les souris, il faut obtenir un effectif final minimum de 12 individus. Etant donné que le pourcentage de perte liée aux aléas expérimentaux est estimé à 20% en fin d’expérience, il nous faut démarrer l’expérience avec un groupe de 14 souris.
Raffinement
Dès leur arrivée les souris sont hébergées en cages transparentes munies d’enrichissement (carrés de coton et de cellulose permettant l'élaboration d'un nid et tunnels). Durant les sessions de stress, les souris sont observées et manipulées 3 fois par jour et pesées tous les 2 jours. Hors périodes de stress les femelles et leurs descendants sont observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect du pelage) et une pesée hebdomadaire est réalisée. Dans tous les cas, dès qu’un animal présent un signe de mal-être (pour les adultes: poil hérissé, prostration, plaie , perte de poids de plus de 15% par rapport à la pesée précédente; pour les jeunes: absence de poche de lait, corpulence anormale par rapport à la portée, couleur des muqueuses anormale, comportement aggressif de la mère), il sera isolé.
Choix des espèces
Le modèle d’étude employé doit permettre de reproduire un système biologique fonctionnel et complexe, dont les mécanismes ontogénétiques sont comparables à ceux qui régissent le développement des mêmes fonctions chez l’humain. Dans ce cadre, le modèle rongeur constitue un outil incontournable. Nous avons opté pour l'utilisation de souris dans un souci d'homogénéité de l'ensemble de nos expériences, ce qui permet une réduction du nombre d'animaux utilisés. Le but du projet étant d'étudier l'émergence des troubles anxieux au cours du développement, les souris seront étudiées à 3 stades de développement: période juvénile (entre 3 et 4 semaines) , période adolescente (entre 6 et 7 semaines), et âge adulte (entre 12 et 13 semaines).
Etude du pouvoir anti-inflammatoire de nanoparticules de methotrexate dans un modèle murin de psoriasis induit par l’application repetée d’imiquimod
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation cutanée de type psoriasis est induite sur leur dos rasé par application répétée d'imiquimod, puis des nanoparticules de méthotrexate y sont appliquées, avant la mise à mort pour analyser la réponse immunitaire. Le porteur affirme qu'aucun test in vitro n'intègre la réaction immunitaire de la peau dans son ensemble. Les bénéfices annoncés, une nouvelle formulation réduisant les effets secondaires, sont renvoyés au "long terme".
Objectifs
Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui évolue par poussées dont la fréquence et l'intensité sont imprévisibles. Si des traitements permettent aujourd'hui de soulager les poussées, le psoriasis reste toutefois une maladie qui, selon sa localisation et son étendue, peut avoir des conséquences esthétiques et nuire à la vie relationnelle et professionnelle. Le méthotrexate est un agent anti-inflammatoire qui diminue la prolifération des cellules. C’est l’un des traitements de référence du psoriasis modéré à sévère. Il se prend de manière systémique, par voie orale ou en injection, le plus souvent sous-cutanée, ce qui peux engendrer des effets secondaires importants. Dans ce projet, nouvelle formulation de ce traitement appliqué directement sur la peau sera testée . Ce type d’application, ciblant directement la zone à traiter, devrait diminuer fortement les effets secondaires en comparaison des traitements déjà présents sur le marché.
Bénéfices attendus
Il est attendu que l'application topique de methotrexate inhibe le développement de l'inflammation dans ce modèle de psioriasis. Ce projet sur le long terme, devrait permettre la mise sur le marché potentielle d'une nouvelle formulation pour le traitement actuel contre le psoriasis, et donc aune amélioration de la prise en charge des patients avec une diminution des effets secondaires .
Procédures
Un modèle standard d'inflammation de type psoriasis, induit par l'application répétée de crème à base d'Imiquimod sera utilisé. Pour ce faire, les animaux seront rasés sur le dos, puis la crème contenant l'Imiquimod sera appliquée sur le dos sur souris vigile pendant 3 jours consécutifs. Les différents traitements seront egalement appliquées sur le dos en topique, dès le premier jours, avec des animaux anesthesiés à l'isofluorane et ce, pendant 5 jours consecutifs.
Impact sur les animaux
Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux sont surveillés 5 jours par semaine et tout animal qui présenterait des signes physiologiques anormaux (souris prostrées ou encore apparition de nécrose cutanée) suite à l’application cutanée des composés, serait mis à mort. A noter que l'induction de psoriasis chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente et ne conduit pas les souris à se gratter. Le poids des animaux sera egalement suivi tout au long de l'experience, et si des animaux perdaient du poids (+ de 5% de leur poids), des croquettes humides seraient mises dans le fond de la cage.
Devenir
tous les animaux sont mis à mort et certains organes sont utilisés pour analyse de la reponse immunitaire
Remplacement
Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de l’allergie
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 9 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes (tests non paramétriques de Kruskal-Wallis pour comparer l’ensemble des groupes ainsi que tests de Mann-Whitney en comparaison deux à deux). La pénétration des nanoparticules d'or contenant le methotrexathe a été évalué en amont dans un systeme ex vivo.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédeure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié. Le poids des animaux sera egalement suivi tout au long de l'experience, et si des animaux perdaient du poids (+ de 5% de leur poids), des croquettes humides seraient mises dans le fond de la cage.
Choix des espèces
L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou encore l’induction de des différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.