Recherche fondamentale

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation de deux à quatre heures, une partie recevant des injections virales et une craniotomie, puis est maintenu tête fixée pour enregistrer l'activité cérébrale pendant l'éveil et le sommeil. Le porteur décrit une habituation progressive à la contention pour limiter le stress, et affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux modèles animaux pour étudier la perception sensorielle à l'échelle cellulaire. Les bénéfices relèvent de la recherche fondamentale, avec un lien seulement "indirect" évoqué vers l'autisme.

Objectifs

La plupart de nos expériences sensorielles relèvent d’une exploration active du monde, tels la locomotion, les mouvements oculaires, le toucher. Face à une affluence d'informations, nous sélectionnons les plus pertinentes pour une décision rapide; en fonction du contexte, seules celles nécessaires à une action adaptée sont traitées, les autres filtrées. Mieux comprendre notre perception sensorielle du monde est un enjeu majeur des neurosciences modernes. Le système des vibrisses (moustaches) du rongeur est un système de choix pour étudier le traitement des informations sensorielles car il possède une organisation anatomique très précise. Les rongeurs en outre utilisent leurs vibrisses de façon active pour explorer leur environnement en les faisant bouger volontairement. Des mouvements rapides des vibrisses sont également observés lors du sommeil paradoxal, permettant de faire un parallèle avec les mouvements rapides des yeux chez l’humain lors de cette même phase de sommeil. Les informations sensorielles relatives à la déflection des vibrisses chez le rongeur sont transmises de la périphérie au cortex par plusieurs voies. Toutefois, la nature du message codé par chacune de ces voies reste mal connue et sujet de controverse, notamment au niveau du thalamus, une structure cérébrale centrale par laquelle les informations sensorielles transitent avant d’atteindre le cortex. Dans cette étude, nous voulons révéler sous quelles conditions physiologiques les différentes voies sensorielles transmettent efficacement cette information. Pour répondre à cette question, nous proposons d'étudier les réponses sensorielles au niveau du thalamus dans un contexte comportemental pertinent pour la souris au cours des différents états de vigilance de l’animal.

Bénéfices attendus

Le thalamus est une structure essentielle au fonctionnement du cortex cérébral, où se déroulent les opérations cérébrales les plus élaborées. Il est composé de plusieurs noyaux dont la fonction dans le traitement de l’information sensorielle reste imprécise à ce jour. En combinant des enregistrements électrophysiologiques intracérébraux chez la souris et des techniques de manipulation ciblée de neurones du réseau sensoriel, nous pourrons identifier le rôle clé de ces noyaux dans ce réseau chez un animal en comportement. Les bénéfices escomptés seront une meilleure compréhension des mécanismes du traitement de l’information sensorielle par le cerveau, ce qui relève de la recherche fondamentale. De plus, le thalamus étant essentiel à la perception sensorielle et aux processus attentionnels, les résultats attendus pourront révéler la base neuronale des opérations délétères dans les troubles du spectre autistique et contribuer ainsi indirectement à une meilleure compréhension de cette maladie. Ensuite, ce projet apportera un éclairage nouveau sur la fonction du sommeil. Des travaux chez l’homme ont montré que le cerveau peut réaliser une tâche cognitive lors du sommeil paradoxal : les réponses évoquées à l’écoute de son propre nom sont différentes de celles évoquées par un nom inconnu. Cependant, nos connaissances sur ce sujet restent très limitées. Ce projet constitue une première étape vers la compréhension du traitement différentiel des informations sensorielles et des processus sensorimoteurs et cognitifs au cours des différents états d’éveil et de sommeil afin de comprendre comment sont traitées ces informations dans un cerveau éveillé versus non conscient.

Procédures

Aucun prélèvement, aucune manipulation douloureuse ne sera réalisé sur un animal vigile, toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie profonde et analgésie appropriée. Interventions sous anesthésie - Une chirurgie d’implantation (2 à 4 heures) sera réalisée sur tous les animaux sous anesthésie (n=270). - Une Injection localisée d’adéno-virus associés (AAVs) ou de traceurs conventionnels sous contrôle électrophysiologique et sous anesthésie (4 à 6 heures); cette intervention concerne n= 194/270 souris. - Une craniotomie sous anesthésie gazeuse et Buprénorphine (< 2 heures) sera pratiquée sur n= 168/270 souris. L'ensemble des trois interventions seront réalisées sur moins de la moitié (122/270) des souris. - Enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie pour 50% des souris de la procédure #2 (une journée), suivis de la perfusion de l'animal : pas de réveil de l'animal - Tous les animaux (n=270) seront anesthésiés (s'ils ne le sont pas déjà) et perfusés en intracardiaque (30 minutes). Manipulations de l'animal vigile, spécifique à la Procédure #1 - Plusieurs sessions journalières de handling (10 min) pendant tout le temps de la procédure (2 à 3 mois) - Habituation à la contention, journalière, pendant 20-30 jours. Elle dure de 1 min le premier jour à 4h les derniers jours. - Enregistrements électrophysiologiques, session de 3 à 4 heures pendant 1 à 7 jours successifs - Optogénétique, stimulation lumineuse, pulses de 20 à 100ms pendant 1 à 10 sec, répétées modérément et aléatoirement lors des sessions d'enregistrements. - Stimulations sensorielles, quelques secondes, répétées modérément et aléatoirement lors des sessions d'habituation et d'enregistrements.

Impact sur les animaux

Aucun prélèvement, aucune manipulation douloureuse ne sera réalisé sur un animal vigile, toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie profonde et analgésie appropriée. Une chirurgie d’implantation de 2 à 4 heures sera réalisée sur tous les animaux sous anesthésie. Ensuite, après 5 jours de repos, 194/270 animaux seront à nouveau anesthésiés 4 à 6 heures pour une injection localisée d’AAVs ou de traceurs conventionnels sous contrôle électrophysiologique. Quatre à 8 semaines après, une anesthésie gazeuse (avec Buprénorphine) inférieure à 2h sera pratiquée sur 168/270 animaux pour réaliser les craniotomies. Les trois interventions seront réalisées sur moins de la moitié (122/270) des souris. Ce projet nécessite des enregistrements électrophysiologiques sur la souris vigile. L’immobilisation est une source de stress pour la plupart des animaux. Dans ce projet, la souris est partiellement immobilisée : elle est placée dans un tube de carton sur un petit matelas doux et absorbant (changé régulièrement), sa tête maintenue de manière indolore par un système de contention. Contrairement aux protocoles de contention utilisés pour induire un stress, le corps et les pattes de la souris ne sont ici pas contenus ou immobilisés : elle est libre de bouger, ajuster sa posture, se toiletter. Dans le but de juguler le stress de l’animal, nous procédons à une habituation adaptée, douce et très progressive, au système de contention, que nous alternons avec de nombreuses périodes de "handling" de l’animal. La répétition des manipulations, toujours récompensées, permet à l’animal d’appréhender le caractère prédictif et non douloureux de la contention, ainsi que d’associer les sessions de travail à la récompense.

Devenir

Une perfusion intracardiaque d’une solution de paraformaldéhyde 4% sera réalisée à la fin de chacune des procédures, sur tous les animaux. Cette procédure permet de fixer le cerveau de l’animal en vue d’une étude immunohistochimique afin de valider la position des enregistrements électrophysiologiques, l’étendue de la transfection virale ou le traçage de voies anatomiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas d’alternative à l’utilisation de modèles animaux pour l’approche des mécanismes de la perception sensorielle. La neuropsychologie humaine, la modélisation théorique des fonctions cognitives de haut niveau, ainsi que les cultures de neurones ne constituent pas actuellement une alternative pour l’étude des processus de perception sensorielle et de la vigilance à l’échelle cellulaire. L’étude des mécanismes neurophysiologiques des processus cognitifs se faisait jusqu’à maintenant essentiellement chez des modèles primates non-humains. Avec cette étude nous voulons profiter des avantages qu’apporte la souris (modèles génétiques et identification des neurones plus aisée) pour raffiner notre compréhension des processus sensorimoteurs à un niveau cellulaire.

Réduction

La technique de l’animal tête-fixée est un modèle unique qui permet de réduire considérablement le nombre de souris nécessaires pour une étude donnée - un même animal participe à plusieurs sessions d’enregistrements, jusqu’à 7 jours consécutifs - les différents tests comportementaux que nous proposons pourront être réalisés sur chacune des souris, évitant la multiplication des groupes d’animaux - la multiplicité des données recueillies sur chaque animal : activité de plusieurs régions cérébrales, au cours de différents états de vigilance et comportements (et nos données sont partagées avec nos collaborateurs) - chaque souris est son propre contrôle pour toutes les procédures, divisant par deux le nombre d’animaux nécessaires et permettant d'appliquer des tests statistiques pour mesures répétées, plus puissants (donc moins de souris nécessaires), paramétriques : test-t de Student ou ANOVA (selon le nombre de groupes à comparer) ou non paramétriques au regard de la normalité de la distribution des valeurs : Wilcoxon et Friedman. Le nombre d’animaux sera également réduit par l’utilisation de tests statistiques basés sur des modèles GLM (modèles linéaires généralisés) qui prennent en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre animaux. - Les injections virales ou de traceurs sont réalisées sous contrôle électrophysiologique limitant ainsi drastiquement les erreurs de localisation, et diminuant de facto drastiquement le nombre d’animaux inexploitables car injectés en dehors de la zone d’intérêt. - La procédure #2 vise à établir sur des animaux non contraints le protocole d’injection le plus efficace de façon à réduire significativement le nombre d’animaux utilisés dans la Procédure #1. - Pour la procédure #1, nous estimons, de par notre expérience, à 20 le nombre de souris "contrôles" nécessaires pour chaque région d’intérêt et à 22 les souris transfectées (dont 15 souris porteuses du virus associé à la Rhodopsine et 7 souris "contrôle" pour le virus, virus associé au fluorophore seul) nécessaires pour chaque région d’intérêt. Ces estimations tiennent compte de la diversité neuronale dans les régions d’intérêt. Pour chaque étude, nous commençons avec un nombre restreint d'animaux (n=3 à 6), i.e. étude pilote, et poursuivons seulement si les réponses aux protocoles de transfection et de stimulation lumineuse sont optimales. Les données acquises avec le projet DR#03330 permettent de diminuer le nombre d’animaux.

Raffinement

1- La technique de la souris tête-fixée a été développée dans un souci de raffinement et avec une attention particulière au bien-être de nos souris a- pour réaliser des enregistrements au cours du cycle veille-sommeil naturel de l’animal b- sans générer de douleur. Toutes les interventions chirurgicales étant réalisées sous anesthésie c- en prenant soin de juguler le stress de l’animal par une habituation adaptée, douce et très progressive, au système de contention d- avec de nombreuses périodes de "handling" de l’animal e- des jouets sont placés dans leur cage afin qu’ils disposent d’un environnement enrichi. Après chaque manipulation (habituation ou handling) l’animal retourne dans sa cage et est récompensé. La procédure d’habituation permet à la souris de se familiariser avec la contention par la tête. La répétition des manipulations, toujours récompensées, permet à l’animal d’appréhender le caractère prédictif et non douloureux de la contention, ainsi que d’associer les sessions de travail à la récompense. e- des jouets sont placés dans leur cage afin qu’ils disposent d’un environnement enrichi. 2- Les injections virales sont classiquement réalisées uniquement sur la base de coordonnées stéréotaxiques calculées pour un individu moyen. Or, premièrement, chaque animal diffère de cette moyenne, et deuxièmement nous visons des structures sous-corticales de petit volume (d’autant plus petit chez la souris). Nous proposons donc de réaliser les injections virales sous contrôle électrophysiologique limitant ainsi drastiquement les erreurs de localisation, et diminuant de facto drastiquement le nombre d’animaux inexploitables car injectés en dehors de la zone d’intérêt.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle d'étude car il existe présentement des outils moléculaires et génétiques développés chez la souris uniquement, donc non disponibles à ce jour pour d’autres espèces animales. Par exemple, la technique d’optogénétique permet d’activer ou d’inactiver de manière spécifique une région cérébrale. L’impact d’une telle manipulation sur l’activité des régions cérébrales étudiées peut être quantifié, et le rôle fonctionnel de ces régions peut être élucidé. Nous aurons ainsi la possibilité de comparer directement l’activité électrophysiologique, les réponses sensorielles et le comportement chez les mêmes souris avant et pendant manipulation d'une région cible. Chaque animal devient ainsi son propre contrôle, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étude. Nous travaillons avec des animaux de 8 à 16 semaines c'est-à-dire de jeunes adultes ayant atteint leur maturité cérébrale.

3 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de composés par plusieurs voies et, pour une partie, une chirurgie stéréotaxique implantant une fibre optique ou une canule, avec douleur post-opératoire et risque d'infection déclarés, pour caractériser des modèles murins d'autisme et tester des traitements. Le porteur affirme que l'autisme, dont le diagnostic repose sur le comportement, "ne peut être modélisé qu'au niveau de l'animal entier". Les bénéfices thérapeutiques annoncés restent formulés comme une perspective.

Objectifs

La prise en charge des patients souffrant de troubles autistiques requière le développement de nouveaux traitements pharmacologiques permettant de soulager leurs déficits comportementaux. Le projet proposé a pour objet (1) une meilleure compréhension des substrats biologiques de ces pathologies, (2) la mise à disposition de la communauté scientifique des modèles animaux des troubles autistiques présentant une bonne homologie avec les conditions cliniques et (3) l’évaluation in vivo, dans ces modèles, de nouvelles stratégies thérapeutiques, tout ceci à des fins strictement scientifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permetra une meilleur compréhension des gènes impliqués dans le développement de l'autisme et permetra de proposer de nouvelles solution thérapeutique pour soulager la pathologie.

Procédures

Une partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale et per-nasale. Nous allons également étudiés des animaux qui recevront une administration unique de composés par voie intracerebroventriculaire. Enfin, un groupe d’animaux subUne partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale et per-nasale. Nous allons également étudiés des animaux qui recevront une administration unique de composés par voie intracerebroventriculaire. Enfin, un groupe d’animaux subiront une chirurgie stéréotaxique dans le but d’implanter une fibre optique ou une canule d’injection. Les composés seront ensuite injectés soit via la canule d’injection soit par voie intrapéritonéale dans le cadre des souris implanté avec une fibre optiqueiront une chirurgie stéréotaxique dans le but d’implanter une fibre optique ou une canule d’injection. Les composés seront ensuite injectés soit via la canule d’injection soit par voie intrapéritonéale dans le cadre des souris implanté avec une fibre optique

Impact sur les animaux

Pour le groupe d’animaux soumis à des administration répétées d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale, on ne peut pas exclure une inflammation au niveau du site d’injection. Pour les animaux subissant une administration per-nasale, à l’exception d’un inconfort, ce type d’injection n’est pas connue pour générer d’effets indésirables. L’administration de composés par voie intracérébroventriculaire sera réalisé sous anesthésie gazeuse. On peut donc s’attendre à une douleur modérée au niveau du site d’injection ainsi qu’un inconfort au réveil de l’anesthésie. Les animaux subissant une chirurgie stéréotaxique, présenteront une douleur post-opératoire, les conséquences d’une anesthésie et un risque de complication post-opératoire (hémorragie, infection).

Devenir

A la fin de chaque expérience, les animaux seront mis a mort pour des expériences ex-vivo ultérieur

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.9 pour une taille d’effet f de cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.

Raffinement

Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes que subissent les animaux au cours des expériences. Concernant l’hébergement, les souris seront hébergées en groupe sociaux de 2 à 4 individus, en leurs mettant à disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, nous testerons chaque animal dans différentes tâches et nous utiliserons les tests statistiques adéquats. Pendant les expériences, nous suivront quotidiennement le bien-être de nos animaux en particulier leurs poids, leur posture et leur point d’injection. Pour réaliser les chirurgies, nous mettront en place une procédure d’anesthésie adéquate (anesthésique associé à un analgésique) ainsi qu’un suivi post-opératoire renforcé. En effet, nous donnerons un traitement anti-inflammatoire à nos animaux pour réduire la douleur et un suivi journalier de la cicatrisation de la plaie ainsi qu’un suivi journalier du poids et de la posture des animaux sera effectué. Nous mettrons en place des points limites adaptés afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour modéliser cette pathologie au niveau préclinique. Les déficits comportementaux détectés chez ces souris modèles sont suffisamment importants et robustes pour permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

12 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sonde télémétrique est implantée par chirurgie dans un muscle de leur patte, puis l'activité musculaire est enregistrée plus de trente jours avec des séances de marche sur tapis, avant la mise à mort pour prélèvements musculaires. Le porteur décrit une simple étude de faisabilité visant à valider la tenue de l'implant, sans test statistique prévu. Il affirme qu'un tel suivi sur la durée ne peut être mené par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une étude internationale portant sur l'inactivité physique et ses effets sur les propriétés électriques musculaires. Il s’agit d’une étude de faisabilité pour valider la capacité à mesurer sur une longue période l’activité musculaire de la patte postérieure chez la souris grâce à des sondes télémétriques. La méthode télémétrique permet d’enregistrer des paramètres physiologiques ici l’électromyogramme chez un animal vigil, non contraint et dans son environnement habituel. Ce protocole a pour objectif la vérification du maintien de la sonde électromyogramme (EMG) sur le muscle avec récupération d’un signal exploitable sur plus de 30 jours. Ce suivi longitudinal permettra également de caractériser l’activité musculaire grâce à des mesures de marche rapide sur tapis de course et d’évaluer l’impact d’un implant dans un muscle de la patte postérieure sur le métabolisme de l’animal.

Bénéfices attendus

Le projet s’inscrit dans le cadre de l’étude du système musculaire squelettique et ses altérations lors de situations de dysfonctionnement ou de non-utilisation. Parmi les critères permettant de déceler les altérations musculaires, l’étude de l’activité électromyographique peut fournir des indications précieuses sur le bon fonctionnement ou non du muscle squelettique. Notre projet consiste à affiner une technique d’enregistrement électromyographique par télémétrie chez la souris en évaluant l’impact des implants sur le métabolisme de l’animal et en validant leur tenue sur plus de 30 jours. De plus, nous souhaitons proposer un référentiel pour l’analyse électromyographique avec l’étude de faisabilité sur tapis de course. Ces avancées sur la technique d’électromyographie par sondes télémétriques, permettront d’étudier plus finement les mécanismes impliqués dans l’atrophie musculaire, conséquence liée au vieillissement, à l’immobilité prolongée de certains patients ou dans des pathologies comme le cancer.

Procédures

Les animaux seront équipés par voie chirurgicale d'une sonde télémétrique permettant d'enregistrer l'électromyogramme, caractéristique de l'activité électrique musculaire. La procédure chirurgicale pour implanter la sonde sera d’une durée d’une heure environ sous anesthésie générale avec une prise en charge de la douleur par des analgésiques pendant l’opération et les 2 jours suivants. La souris recevra 3 injections sous-cutanées (SC) le jour de la chirurgie puis 1 injection SC/jour pendant 2 jours. Durée de l’injection SC 30 secondes maximum. Les animaux seront isolés le jour de la chirurgie puis 5 min les 3 jours suivants pour vérifier la présence du signal EMG puis 30 min/jour pendant 42 jours pour la mesure de l’activité musculaire. L’étude du métabolisme par calorimétrie indirecte nécessitera 2 x3 jours d’isolement. Les mesures de marche rapide sont réalisées sur un tapis de course 15 min pendant 2 jours. Les animaux seront manipulés à l’aide d’un tube de transfert pour les changements de cages.

Impact sur les animaux

Notre expérience du modèle nous permet d’avancer qu’aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’implantation des sondes électromyogrammes grâce à l’utilisation d’anesthésique et analgésiques adaptés. La sonde utilisée est constituée d’une partie contenant le module électronique et la batterie (transmetteur) et de 2 électrodes souples pour la mesure des biopotentiels. L’implantation du transmetteur de la sonde en sous cutané permet une meilleure récupération de l’animal (moins invasif qu’une implantation intra-péritonéale) et évite des tensions sur les électrodes placées sur le muscle.Le stress lié à l’isolement (mesures de calorimétrie, mesures de l’EMG) sera réduit au maximum tout en permettant une exploitation correcte des résultats. Les vitesses utilisées pour le tapis de course sont proches de la marche et n’engendreront pas d’effort intense pour la souris. Ces éléments permettent d’estimer des nuisances et effets indésirables modérés pour ce projet. Pour comparaison, cette chirurgie est similaire à celle d’un pacemaker réalisé chez l’homme sauf qu’ici, l’implant permettra seulement l’enregistrement et aucune stimulation ne sera faite sur le muscle.

Devenir

Les 12 animaux seront mis à mort selon une méthode réglementaire pour prélèvements musculaires post mortem. Ces prélèvements seront utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires et partagés avec nos différents collaborateurs pour compléter nos connaissances sur la fonctionnalité du muscle.

Remplacement

Il s'agit d'un projet portant sur un suivi longitudinal de mesures d’activité électrique musculaire qui, en plus de caractériser l’activité musculaire permettra d’évaluer l’impact d’un implant dans un muscle de la patte postérieure sur une longue période (>30jours). Un tel projet ne peut être mené avec des méthodes alternatives in vitro ou in silico.

Réduction

Ce protocole a pour objectif la vérification du maintien de la sonde électromyogramme (EMG) sur le muscle avec récupération d’un signal exploitable sur plus de 30 jours. Il n’est pas envisagé de tests statistiques pour cette étude de faisabilité. Le nombre d’animaux (12) a été réduit au minimum en tenant compte des pertes de la qualité du signal tout en permettant l’obtention de résultats satisfaisants. La méthode télémétrique contribue à limiter le nombre d’animaux utilisés en permettant un suivi continu chez un même animal.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe de 3 dans une cage standard utilisé en élevage et hébergement avec un enrichissement dans la cage (coton, igloo, paillage). Les animaux seront anesthésiés par un mélange gazeux et recevront une analgésie adaptée au préalable de la chirurgie et en post-opératoire afin de limiter la douleur liée à l’implantation des sondes. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence du réflexe oculopalpébral et du réflexe de retrait de la patte au pincement. En fin de chirurgie, les animaux seront réhydratés et surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet et dans les 4 heures suivantes. Pour limiter les risques de blessures, les ongles seront coupés sous isoflurane avant le début de la chirurgie et les points de suture seront internalisés puis sécurisés avec de la colle chirurgicale. Un gel lubrifiant sera déposé sur les yeux pour la chirurgie. Les animaux seront en cage individuelle après chirurgie avec des croquettes et de l’eau gélifiée au sol pour faciliter l’accès puis remis en groupe le lendemain limitant le stress lié à l’isolement. Les souris seront surveillées et pesées quotidiennement. Elles seront remises en cage individuelle uniquement pour le suivi des enregistrements télémétriques (30min/jour) et pour les enregistrements de calorimétrie indirecte (2 x 3 jours). Pour les enregistrements télémétriques quotidiens, nous utiliserons la même cage par groupe de 3 souris. De cette façon, les souris retrouveront les mêmes odeurs que dans leur cage d’hébergement. Au cours de la procédure, seule la litière souillée sera changée pour préserver au maximum l’odeur de la cage. Les animaux seront manipulés à l’aide d’un tube de transfert pour les changements de cages Après l’implantation des capteurs et le suivi post-opératoire, les animaux ne sont plus soumis à aucune intervention susceptible d’induire de la souffrance ou de la douleur grâce à la méthode télémétrique qui permet de suivre l’électromyogramme en continu chez l’animal vigil et non restreint.

Choix des espèces

Afin de pouvoir comparer les résultats avec les études antérieures, il est important de conserver la même espèce animale, à savoir la souris. La souche choisie : C57BL/6J est un modèle polyvalent utilisé dans de nombreux domaines d’application. Les animaux utilisés seront uniquement des mâles. Le sexe mâle a été choisi dans la mesure où ces travaux viennent en prolongement d’études antérieures. Il est donc important de conserver le même sexe pour comparer ces différentes études. Le choix d’animaux adultes de même sexe exclut toute variation possible des résultats suite à des fluctuations ou différences hormonales. Les animaux utilisés seront des mâles adultes, matures au niveau du développement, soit des souris âgées de 9 semaines au début de la phase expérimentale.

482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du côlon humain sont greffées dans leur caecum par chirurgie, puis la tumeur est suivie chaque semaine par imagerie sous anesthésie jusqu'à trois mois, 266 souris recevant en plus douze injections d'inhibiteurs dans la queue. Le porteur décrit des atteintes digestives et un amaigrissement liés au développement tumoral, et vise à valider les canaux sodiques NaV comme cible thérapeutique. Il affirme que la complexité multicellulaire du cancer ne pouvant pas être étudiée in vitro, le recours aux souris est "indispensable".

Objectifs

Il a été montré l’expression aberrante des canaux sodiques dépendants du voltage NaV dans les cellules cancéreuses et leur implication dans la progression des cancers. Ces canaux sont anormalement exprimés dans les biopsies humaines de carcinomes, et dans des cellules cancéreuses non-excitables de différentes origines épithéliales. C’est le cas de NaV1.5 qui est anormalement exprimé dans le cancer du sein et dans le cancer sporadique du côlon, et dont le niveau d’expression semble associé à un mauvais pronostic chez les patients. La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse. Quant à NaVBeta4, son niveau d’expression est réduit dans les tissus cancéreux coliques en comparaison des tissus non-cancéreux appariés. L’inhibition de l’expression de NaVBeta4 dans les cellules cancéreuses coliques SW60 et HCT116 augmente l’invasivité cellulaire in vitro. L'hypothèse de notre client est que les canaux NaV1.5, qui peuvent être inhibés par des composés pharmacologiques existants ou en cours de développement, pourraient représenter des cibles pour des nouvelles thérapies anticancéreuses. Pour valider cette hypothèse, il est important d’utiliser un modèle orthotopique de cancer colique qui consistera à greffer au niveau du caecum de souris, des cellules cancéreuses coliques humaines (HCT-116 ou SW620) bioluminescentes. Les souris que nous utiliserons seront donc des souris immunodéficientes, à phénotype dommageable, qui seront hébergées en portoir ventilé dans des conditions n'entraînant pas l'expression du phénotype.

Bénéfices attendus

La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse. La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse.

Procédures

482 souris auront des greffes de cellules tumorales au niveau du caecum (procédures 1, 2, 3, 4) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirurgie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 482 souris auront une imagerie de bioluminescence 1 fois par semaine à partir du 7ème jour post greffe sous anesthésie gazeuse Isoflurane 2% dans l’air avec injection vigile 4 minutes avant l’examen de 100µL de luciférine par voie intrapéritoléale pour le suivi de la prolifération tumorale. En parallèle une échographie sera réalisée 1 fois par semaine ou toutes les 2-3 semaines en fonction de la vitesse de prolifération des tumeurs. Ces 2 examens successifs ont chacun une durée inférieure à 10min et seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (2% dans l'air), sur support chauffé à 37°C. Par ailleurs, un monitoring cardio respiratoire est réalisé simultanément en cours d’échographie qui permet de s’assurer que l’animal supporte bien l’examen. Soit sur une durée de 3 mois (temps maximal de l’étude) chaque souris aura 11 séances d’imagerie de bioluminescence et 11 séances d’imagerie échographique au maximum. 266 souris vigiles (procédures 2, 3 et 4) recevront 3 fois/semaine pendant 4 semaines (= 12 injections par souris) 150-200μLd’inhibiteurs par voie intraveineuse au niveau de la queue.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus pour les animaux sont liés au développement d'une tumeur primaire au niveau du colon et éventuellement de métastases (problèmes digestifs, amaigrissement).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chque procédure.

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres complexes, multicellulaires et multiorganes, ne pouvant pas être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, afin de développer de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, des études pharmacologiques sur animaux sont nécessaires. Les expérimentations pourront mettre en évidence un nouvel acteur du développement métastatique, les canaux NaV, qui pourraient servir de nouveau marqueur prédictif et éventuellement de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement du cancer colique.

Réduction

La mise en oeuvre de l'imagerie permet un suivi longitudinal du même animal ce qui permet de réduire leur nombre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.

Raffinement

Le suivi de la croissance tumorale primaire et secondaire (métastases) sera réalisé par imagerie de bioluminescence in vivo et d’échographie, approches non invasives et indolores pratiquées par ailleurs sur animal anesthésié. Des antalgiques seront utilisés lors de la chirurgie et 24h après. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé et en accord avec les directives européennes. des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel observera quotidiennement les animaux afin d'anticiper la souffrance animale.

Choix des espèces

Dans notre projet, les informations attendues ne peuvent pas être obtenues in vitro car à ce jour l'animal de laboratoire reste le seul recours permettant d'étudier le développement tumoral et l'efficacité thérapeutique en tenant compte de la complexité de la physiologie d'un organisme vivant. La souris est un animal chez qui il est possible d'obtenir le développement de tumeurs d'origine murine et humaine. La souris est ainsi une espèce animale classiquement utilisée, pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), de par la possibilité d’avoir accès à des animaux immunodéprimés permettant l’implantation de cellules cancéreuses humaines, ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo (bioluminescence, échographie). Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris adulte (6 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, nous avons rencontré des difficultés pour implanter des cellules tumorales humaines avec un taux de prise de greffe moins important.

8 macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intraoculaire de vecteurs viraux, des examens oculaires répétés et des prélèvements sanguins sous anesthésie, puis leurs yeux sont prélevés après mise à mort, pour tester une restauration de la vision par optogénétique. Le porteur décrit des contentions répétées, une perte de poids postopératoire et de rares réactions inflammatoires de l'oeil. Il affirme que les rongeurs, chiens et porcs sont inutilisables faute de fovéa et que le passage à la clinique humaine "nécessite" cette phase sur primate.

Objectifs

Aujourd'hui, beaucoup de maladies oculaires héréditaires touchant la rétine peuvent entraîner une malvoyance incurable, pouvant dégénérer jusqu'à la cécité complète et pour laquelle l'émergence de nouvelles techniques de soins par thérapie génique redonne espoir car malheureusement aucun traitement permettant de redonner la vue n'existe à l'heure actuelle. Ces maladies rétiniennes héréditaires sont caractérisées par des mutations dans des gènes uniques et entrainent pour la plupart un dysfonctionnement et/ou une dégénérescence des photorécepteurs de la rétine sensible à la lumière tels que les cônes ou les bâtonnets. Aujourd'hui, les gènes responsables sont connus pour plus de 270 de ces maladies. Bien que les thérapies géniques aient fait une avancée considérable depuis ces dernières années, la complexité génétique et la diversité des maladies rétiniennes héréditaires rend difficile le développement de thérapies applicables et spécifiques à chaque maladie. De plus, il n'est pas encore certain que ces thérapies géniques à visée de modification du génome puissent être bénéfiques lorsque la rétine n’est plus fonctionnelle ou lorsqu'une neurodégénérescence consécutive est observée. C'est pourquoi, ce projet vise l'utilisation d'une approche thérapeutique permettant de restaurer la vision, indépendamment des mutations causant les maladies héréditaires, via l'utilisation d'une technique appelée optogénétique. Cette technique, considérée comme une forme de thérapie génique, peut rendre tout type de cellule sensibles à la lumière grâce à des protéines bactériennes activées génétiquement. Dans ce contexte, l’optogénétique prend tout son sens car pour beaucoup de maladies rétiniennes héréditaires, les photorécepteurs perdent leur capacité naturelle à percevoir la lumière mais ces cellules restent vivantes à un stade dit dormant et peuvent ainsi être réactivées grâce à l'optogénétique. Cette méthode permettrait donc de restaurer la vision de manière très efficace puisque les connexions rétiniennes et le traitement des informations au niveaux de l'œil et du cerveau restent intacte. Cette stratégie ciblant directement les photorécepteurs n’a encore jamais été évaluée dans des essais cliniques, c'est pourquoi l'approche proposée dans ce projet est unique. L'objectif de ce projet vise ainsi à valider la fonctionnalité de la construction optogénétique chez le primate non-humain dans l’optique de pouvoir évaluer cet outil dans de futurs essais cliniques chez l’Homme.

Bénéfices attendus

A terme, le bénéfice de cette étude sera d'établir une preuve de concept solide scientifiquement permettant de pouvoir transposer l'utilisation de cette construction génétique comme outil thérapeutique fiable de restauration de la vision pour le démarrage d'essais cliniques chez l'Homme.

Procédures

Les interventions seront menées chez le macaque cynomolgus et toutes seront réalisées sous anesthésie générale. Les interventions seront les suivantes : (1) réalisation d'examens oculaires par tomographie en cohérence optique : 1 examen réalisé pré-injection puis plusieurs examens d’environ 20 minutes par animal à raison d’un examen toutes les deux semaines pendant la phase d’incubation (minimum 3 mois) ; (2) injections intraoculaires de la construction optogénétique (une seule chirurgie par animal d’une durée d’environ 1h) ; (3) deux prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale ; (4) prélèvement des yeux réalisé sous couverture analgésique et anesthésie profonde suivi de la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture de l’animal, les contentions répétées (2x par jour pendant 7 jours post injection) pour l’administration de pommade oculaire, une légère perte de poids consécutive à l’opération et le maintien en infirmerie les jours suivant les injections intraoculaires. Une légère douleur liée à l’injection intramusculaire de l’anesthésique pour la réalisation des gestes techniques (OCT, Injection intraoculaire d’AAV sous anesthésie générale) peut être observée également. Les chirurgies, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer un leger inconfort au niveau de l'oeil le jour précédent l'injection et provoquer dans de très rare cas une légère réaction inflammatoire indolore au niveau de la sclère (autour du point d'entrée de la micropipette d'injection).

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse de tissus oculaires.

Remplacement

Les maladies rétiniennes héréditaires affectent les cellules photoréceptrices de la fovéa, c'est pourquoi l’utilisation de modèles animaux tels que les rongeurs n'est pas possible car ils ne possèdent pas de fovéa, structures oculaires cible dans cette étude. De plus, les vecteurs viraux qui seront utilisés ont été testés et validés in vitro sur des explants rétiniens humains et permettent de restaurer la sensibilité à la lumière. La technique proposée dans ce projet aura pour objectif la validation d'une preuve de concept visant à plus long terme une application pour des études cliniques chez l'homme. Ce passage à la clinique nécessite donc cette phase sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé pour ce projet a été réduit à son maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Huit macaques Cynomolgus seront ainsi utilisés sur 5 ans.

Raffinement

Pour chaque procédure réalisée, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale complétée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires. L'ensemble des méthodes expérimentales ont été pensées et choisies pour éviter toute souffrance des animaux et des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance en cas d’effets indésirables. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans des animaleries respectant les standards prévus par la réglementation et dans un environnement adapté et enrichi (enrichissements structurels, jouets, litière pour fourrager, nourrissage à la main).

Choix des espèces

Les maladies rétiniennes héréditaires sont des maladies altérant les photorécepteurs de la fovéa, partie centrale de la rétine. Cette région de l’œil contient les cônes nécessaires à la vision des couleurs et n’est pas présente chez le rongeur, les chiens ou les porcs invalidant par conséquent leur utilisation pour ce type d'étude. Le primate non-humain a ainsi été choisi car la fovéa n’est présente que chez les simiens (homme inclus). Le modèle PNH choisi et accessible est le macaque cynomolgus. Cette espèce est l’une des espèces de PNH la plus utilisée en recherche pour ce type d’étude. En effet, le macaque cynomolgus présente une structure anatomique de la rétine similaire à celle de l'Homme avec la présence de la fovéa. Ce projet sera réalisé avec des animaux adultes âgés de 3 à 10 ans de manière à ce que les structures oculaires soient développées.