Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
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- Système nerveux
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- Système urogénital
Etude longitudinale pluriannuelle de l’immunosénescence dans une population captive du lézard vivipare
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Relâchés dans leur enclos le jour même ou le lendemain, 1 500 lézards vivipares sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, sans mise à mort programmée. Chaque individu est capturé, subit une prise de sang de moins de deux minutes, puis est mesuré, photographié et débarrassé de ses ectoparasites avant d'être remis au calme dans un tube individuel. L'étude suit l'affaiblissement du système immunitaire avec l'âge dans une population captive maintenue en conditions proches du milieu naturel, sur cinq ans. Le porteur écarte toute alternative en culture ou par modélisation, la question portant selon lui sur l'organisme entier vieillissant.
Objectifs
Le vieillissement, ou sénescence, est un phénomène omniprésent dans le monde du vivant. Plusieurs mécanismes physiologiques interagissent pour causer une détérioration des performances individuelles avec l’âge, mais jusqu’à récemment ils étaient mal compris dans les populations d'animaux sauvages. L'immunosénescence, c'est-à-dire la détérioration ou la dérégulation de la fonction immunitaire avec l'âge, est considéré dans la littérature gérontologique comme un marqueur de la sénescence biologique. Cependant, nos connaissances actuelles sur l’immunosénescence proviennent presque exclusivement d’études menées sur des humains ou des animaux de laboratoire, ou, lorsqu’elles concernent les vertébrés sauvages, d’études se concentrant sur un faible nombre de composants de la défense immunitaire. Des études plus intégratives nous aideraient à comprendre les schémas de vieillissement du système immunitaire. Dans ce projet, nous proposons d’étudier la relation entre l'âge et les différentes composantes innées et acquises du système immunitaire dans une population captive du lézard vivipare (Zootoca vivipara) maintenue en conditions naturelles afin de déterminer s'il existe une immunosénescence chez le lézard vivipare, à quel rythme elle opère et sa relation avec les traits de vie individuels des lézards (croissance et longévité). Le lézard vivipare constitue un vertébré modèle pour l’étude de la sénescence en conditions naturelles du fait de sa durée de vie courte, d’études démontrant une sénescence démographique vers l’âge de 4 ans et de la pression exercée par les populations de pathogènes sur cette espèce. De plus, des travaux antérieurs des effets du réchauffement climatique sur le déclin des populations en relation avec une accélération de certains marqueurs de la sénescence biologique comme la dégradation de l'ADN.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de faire progresser notre compréhension du vieillissement chez cette espèce, et plus précisément d’en déterminer les mécanismes associés. Nos précédents travaux suggèrent qu’une boucle d’accélération de la sénescence avec le réchauffement climatique. Ce projet permettra de franchir une étape complémentaire dans la compréhension physiologique de ce processus de vieillissement, en examinant finement l’évolution du système immunitaire avec l’âge des individus dans un contexte naturel. Dans un cadre plus large, cette étude pourra aussi proposer des biomarqueurs du vieillissement accessibles lors de suivis à long terme longitudinaux. D’un point de vue fondamental, cette étude permettra également de mieux comprendre le système immunitaire des reptiles, largement encore méconnu.
Procédures
Une fois capturés, les individus feront l'objet d'une prise de sang dont la durée n'excède pas 2 minutes puis seront maintenus temporairement au calme dans des tubes individuels. Dans la même journée dans un laboratoire proche du site de capture, les individus seront identifiés, mesurés, photographiés. Un comptage des ectoparasites sera également réalisé. L'ensemble de ces mesures est très rapide (< 5 minutes environ). Les individus seront alors remis au calme dans leur tube individuel. L'ensemble des actes est effectué par un experimentateur aguerri aux gestes techniques.
Impact sur les animaux
Une première nuisance transitoire sera associée au stress induit par la capture (
Devenir
Tous les animaux sont remis en liberté dans leur enclos d'origine à la fin de la procédure.
Remplacement
Cette étude vise à comprendre comment évolue le système immunitaire avec l’âge des individus en populations naturelles afin de mieux comprendre les processus de vieillissement biologique à l’échelle de l’organisme en milieu naturel. Le vieillissement du système immunitaire implique un système intégré qui ne peut pas s’étudier en cultures cellulaires ou par modélisation. Pour ce faire, il est indispensable de travailler sur des animaux de sexes et d’âges différents et vivant dans des conditions environnementales proches du milieu naturel. Aucun remplacement n’est possible.
Réduction
L’étude en population captive sur des animaux d’âge connus en début de projet permettra de réduire significativement les effectifs nécessaires par rapport à une solution alternative de commencer un nouveau projet de suivi en population sauvage non captive. Un échantillon important d’animaux sera utilisé pour quantifier l’impact de l’âge sur les différentes composantes du système immunitaire (100 adultes environ et 200 subadultes par année) pour plusieurs raisons: (1) ces animaux présentent une forte variabilité inter-individuelle, (2) l’échantillonnage doit couvrir la gamme des âges observés en nature (de 1 à 8 ans) dans nos enclos et (3) la mortalité inter-annuelle induit la nécessité d’avoir un grand nombre d’individus initialement afin de pouvoir en recapturer un nombre suffisant d’une année à l’autre pour estimer au sein d’un même individu l’effet de l’âge. Nous pouvons estimer le nombre de suivis longitudinaux complets avec une mortalité de 50% par année et un taux de capture de 100% (tous les animaux vivants sont vus). Une cohorte de 200 subadultes par année donne 25 individus caractérisés de 1 à 4 ans d’âge et 12 individus de 1 à 5 ans d’âge. Sur les 5 années du projet, on estime ainsi seulement à quelques dizaines ou une centaine d’animaux avec des profils immunitaires complets caractérisés sur 3-4 années successives. Un test de type ANOVA en mesures répétées est alors appliquée sur les données ce qui devrait permettre des détecter des changements intra-individuels de l’ordre de grandeur de ceux suggérés par la littérature. Nous avons donc décidé de réaliser cette étude sur tous les animaux présents dans 10 enclos pour atteindre l’effectif maximal de 200 subadultes (et 100 adultes) par an proposé.
Raffinement
Pour maximiser le bien-être des animaux entre leur capture et leur mesure, ils seront maintenus dans des tubes individuels aérés, humidifiés et placés à l’ombre. Nous réduirons leur temps de captivité à un maximum d’une journée. Les mesures seront faites par un expérimentateur entraîné et assisté d’une équipe en charge de la logistique autour des mesures pour réduire les temps de contention. Les actes seront effectués selon une séquence précise, maximisant l’efficacité des procédures et limitant le temps de contention et le stress associé. Une fois l’ensemble des mesures effectuées, les individus seront relâchés dans leur enclos de capture après un temps de repos (jusqu’au jour suivant les expérimentations) dans leur tube individuel d’hébergement temporaire . Des méthodes non invasives photographiques permettront d’obtenir des informations morphologiques sans contention.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est le lézard vivipare (Zootoca vivipara, Lichtenstein 1823). Il s’agit d’un lézard de la faune française étudié depuis 30 ans dans notre laboratoire et dont les populations naturelles en France ont été bien décrites. Le modèle biologique est intéressant pour étudier la réponse des vertébrés ectothermes au changement climatique (e.g., les reptiles, les amphibiens), un groupe taxonomique particulièrement menacé par l'augmentation des températures, les vagues de chaleur et les sécheresses. Ce groupe comprend de nombreuses espèces menacées d’extinction en Europe et à valeur symbolique et écologique forte. L'espèce n’est pas menacée en Europe et est considérée comme « préoccupation mineure » par l'UICN. Elle est néanmoins protégée au titre de l’article 3 de l’arrêté du 8 Janvier 2021. Elle est également considérée comme « sentinelle du climat » en France. Les individus utilisés seront des subadultes (1 an) et des adultes (> 2 ans). Les femelles adultes auront mis bas quelques semaines auparavant. Le projet se concentrant sur le vieillissement de l’espèce, il est nécessaire d’échantillonner toutes les classes d’âges de la population à partir de la première reproduction.
Caractérisation de la neurostimulation transcranienne ultrasonore en photométrie par fibre MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris subit une injection intracérébrale de deux heures puis l'implantation d'une canule optique de trois heures sous anesthésie, avant des séances de stimulation par ultrasons. 187 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque. Le porteur qualifie pourtant la neurostimulation ultrasonore d'"indolore et non invasive", cette description ne portant que sur l'émission des ultrasons et laissant de côté la chirurgie cérébrale préalable. Les animaux sont tués pour vérifier au microscope l'expression du gène injecté et la position des canules.
Objectifs
Ce projet porte sur la neurostimulation ultrasonore. Cette technique permet théoriquement d’activer des zones du cerveau à travers le crâne de manière indolore et non invasive, offrant donc un espoir pour de nouvelles thérapies pour certains troubles neuropsychiatriques sévères. L’objectif de ce projet sera de caractériser les paramètres physiques et expérimentaux permettant une neurostimulation fiable et optimale de plusieurs zones du cerveau qui sont connues pour jouer un rôle important dans ces troubles. Cette caractérisation sera réalisée chez la souris avec une méthode de photométrie par fibre. Celle-ci permet de visualiser l’activité neuronale par imagerie chez la souris, laquelle sera soumise à différents types d’émissions d’ondes ultrasonores. La mesure de l’activité des neurones sera permise par (1) l’expression d’un gène spécial (dont la protéine dégage de la fluorescence en fonction de l’activité des neurones) qui devra être injecté (= transfecté) dans la zone du cerveau que l’on souhaite stimuler et imager, et (2) par une canule optique implantée dans la zone cérébrale dont on veut suivre l’activité neuronale, laquelle pourra être reliée par fibre optique à l’appareil de photométrie lors des mesures et des stimulations ultrasonores transcrâniennes. Le projet comprendra 2 phases : (1) une phase de développement permettant de déterminer l’expression optimale du gène transfecté pour des zone du cerveau superficiel ou profond (40 souris maximum). (2) une phase de caractérisation des effets de neurostimulation par les ultrasons dans différentes zones cibles en fonction des différents paramètres physiques et expérimentaux suivants : fréquence (2 niveaux 0.5 et 1.5 MHz), pression acoustique (10 niveaux de 0 à 500 kPa), distance de la cible (3 niveaux : rayon de 0 – 0.5 – 1 cm), niveau d’anesthésie (3 niveaux de 0.5% – 1% – 1.5% d’isoflurane). La deuxième phase nécessitera 21 souris par zone sur les 7 zones cibles donc un total de 147 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra permettre de caractériser les paramètres optimaux de neurostimulation par ultrasons. Ceci est essentiel pour une meilleure évaluation des potentialités thérapeutiques de cette méthode pour de nombreux troubles neuropsychiatriques (comme l’autisme, la dépression et les troubles anxieux)
Procédures
Dans la procédure 1 : Chaque animal sera soumis à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 2h), puis à une implantation intracérébrale de canule optique sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 3h), et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine). Dans la procédure 2 : Chaque animal sera soumis à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 2h), à une implantation intracérébrale de canule optique sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 3h), à 6 séances de stimulations transcrâniennes ultrasonores (6 séances de 30 minutes) et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine).
Impact sur les animaux
La chirurgie permettant l’injection du vecteur viral puis l’implantation de la fibre optique pour la photométrie a un impact modéré et limité dans le temps (quelques heures ou jours) sur le bien-être animal, les animaux récupérant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) étant très faibles (< 0,1 g) : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sur l’animal mobile et éveillé sans impact majeur sur le bien-être. La stimulation ultrasonore transcrânienne est une approche non invasive et indolore. L’animal sera installé sur le dispositif (permettant de calculer des coordonnées stéréotaxiques) et testé lors de chaque session à la suite d’une anesthésie gazeuse, limitant ainsi tout stress de manipulation et associé à l’installation dans le dispositif.
Devenir
Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure Procédure 2 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure. Lors des 2 procédures, cette étape de mise à mort est nécessaire pour la caractérisation histologique de l’expression du transgène et du placement des canules optiques.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.8 pour une taille d’effet f de Cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux recevront un traitement analgésique (Buprecare, Metacam) avant, juste après et 24 à 48h suivant l’intervention, puis si nécessaire un traitement antibiotique. Chaque animal est placé sur un matelas chauffant pour éviter toute hypothermie. Les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire.
Choix des espèces
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux. Les animaux seront adultes (âgés d’environ 8 semaines ou plus) au début de l’étude. Justification : il s’agit de comprendre ces phénomènes dans un cerveau adulte (8 semaines correspondant au début de l’âge adulte chez la souris.
Etude du rôle des structures auditives centrales dans la discrimination de signaux de communication dans le bruit. MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux chirurgies cérébrales d'environ une heure espacées de plusieurs semaines, puis une tâche auditive quotidienne de deux à trois mois sous restriction d'eau limitée à trois millilitres par jour : 210 souris traversent ce protocole, une partie tuée sans réveil, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les enregistrements de neurones et l'inactivation du cortex auditif servent à identifier la structure cérébrale qui permet de distinguer des sons dans le bruit. Le porteur note que les souris stressées ou douloureuses ne réalisent pas la tâche, celles-là étant alors tuées. À la fin, le cerveau de chaque animal est prélevé pour vérifier au microscope la position des électrodes.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer quelles sont la, ou les, structures du système auditif qui permettent de discriminer comportementalement, des signaux de communication dans des environnements particulièrement bruyants. Comportementalement, la discrimination peut se quantifier chez l’humain ou l’animal par la capacité à répondre différemment à deux sons distincts. En combinant des enregistrements de neurones dans les structures du système auditif, l’inactivation de certaines structures et une tâche comportementale, nous serons en mesure de déterminer quelle est la structure du système auditif qui est cruciale lorsqu’une souris arrive à discriminer deux sons de communications dans un environnement bruyant.
Bénéfices attendus
Il a souvent été affirmé que le cortex auditif était la structure qui permettait d’avoir de bonnes performances dans des environnements bruités. Pourtant, des données très récentes suggèrent que les réponses neuronales des structures sous-corticales sont plus résistantes au bruit que les réponses corticales. Grâce à ce projet, où nous obtiendrons des donnés neuronales en simultané de la tâche comportementale et nous pourrons estimer quelle structure est le plus corrélée avec la réponse comportementale et ainsi évaluer quelle structure est essentielle et joue le plus grand rôle pour permettre de discriminer des sons en situations bruitées. Avec l’inactivation du cortex auditif nous pourrons estimer si ce dernier est nécessaire ou non à cette discrimination. Il est possible qu’en condition facile (bruit à une intensité sonore plus faible que les sons cibles à discriminer) le cortex auditif ne soit pas nécessaire mais qu’en condition difficile (avec du bruit à une intensité sonore plus forte que les sons cibles), sa présence permette de discriminer correctement les sons cibles. Ce projet permettra donc d’étendre nos connaissances sur le fonctionnement du système auditif en conditions bruitées ce qui représente une grande partie de situations rencontrées au quotidien.
Procédures
Les animaux seront soumis sous anesthésie générale à deux chirurgies d’environ une heure chacune espacées de plusieurs semaines et devront réaliser une tâche comportementale de façon quotidienne pendant 2 à 3 mois allant de 30 minutes à 1 heure par jour.
Impact sur les animaux
Les nuisances que pourraient subir les animaux seraient dues aux chirurgies, potentiellement à la contention lors du comportement et à la restriction hydrique. Cependant, après chaque chirurgie un suivi post-opératoire rigoureux aura lieu et les animaux auront un examen quotidien post-chirurgie jusqu’à la fin du comportement pour s’assurer de leur santé. Lors du comportement, les animaux seront placés en contention mais installés dans un tube en plastique qui sera adapté en hauteur et orientation en fonction de chaque souris pour limiter tout inconfort de position. La souris pourra remuer les pattes et le corps dans ce tube. La dose d’eau ingéré via le comportement sera enregistrée automatiquement et les souris entraînée auront un complément individuel et adapté tout les jours en fin de journée pour qu’elles aient une dose d’eau quotidienne de 3 ml qui est la dose recommandé pour les souris de 20g. Les souris contrôles, elles, auront un accès illimité à l’eau durant la journée et ne seront privées que la nuit. La tâche comportementale en elle-même n’apporte pas de nuisances car l’intensité des sons est contrôlée (75dB, niveau d’une conversation courante) pour de pas créer de dommage au système auditif. Précisons bien que nos souris ne pourront pas faire de bonnes performances si elles sont stressées ou si elles éprouvent des douleurs. SI cela devait se produire elles seront prises en charge rapidement. Si nous n’arrivons pas à éliminer le stress et/ou les douleurs occasionnées, les animaux seront euthanasiés car ils ne pourront pas être utilisés dans la tâche comportementale.
Devenir
Pour toutes les procédures, les cerveaux des animaux sont récupérés à la fin des enregistrements pour vérifier histologiquement les positions d’implantation des electrodes, l’emplacement de la position de la fibre optique pour l’optogénétique. En récupérant les cerveaux nous apportons une preuve histologique que nous avons bien enregistré les neurones de structures désirées.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle des neurones du cortex auditif, du colliculus inférieur et du thalamus auditif dans la discrimination des signaux de communication dans le bruit. Pour cela, il est nécessaire de pouvoir travailler au niveau neuronal sur un animal engagé dans une tâche comportementale. Le recours à des modèles in vitro n’est donc pas possible. De plus le système auditif n’est pas assez connu pour avoir recours à des modèles biomathématiques et donc le modèle in silico n’est pas possible non plus. Il est nécessaire de travailler sur la souris car son système auditif est proche et comparable avec celui de l’homme. De plus nous voulons étudier les différentes structures en simultané d’une tâche comportementale ce qui seraient difficilement faisable chez un modèle invertébrés.
Réduction
Selon des méthodes d’analyses statistiques basées sur des expériences précédentes nous avons déterminé qu’il fallait 15 animaux par groupe pour avoir des résultats interprétables statistiquement. Cependant nous réaliserons un groupe de 10 souris de mise au point afin de garantir la réussite des enregistrements chez les animaux entrainées et contrôles ce qui nous permettrait de n’avoir plus que 10 animaux par groupe au lieu de 15. De plus pour la partie optogénétique, nous n’utiliseront pas de groupe contrôle car les contrôles pourront avoir lieu sur une même souris en comparant les moments avec et sans inactivation corticale. On passe donc a un groupe 10 animaux pour cette partie.
Raffinement
Toutes les chirurgies seront réalisés dans des conditions d’anesthésie et analgésie adaptées afin de minimiser au maximum la douleur des animaux. Suite aux procédures chirurgicales, un suivi post-opératoire adapté aura lieu et le suivi continuera sur toute la durée de entraînement comportementale (animaux pesés tous les jours et comportement en cage avec leur congénère observé: vivacité, contact, isolement, harcèlement dans un même cage...). Des points limites strictement définis dans les différentes procédures seront utilisés afin de ne pas continuer l'expérience sur des animaux présentant des signes de souffrance. L’animalerie dans laquelle les animaux seront hébergés est agrée et les animaux seront minimum 2 et maximum 5 par cage. Dans chaque cage des enrichissement adaptés et recommandés par les réglementations seront mis (tunnel, maison en carton, matériel pour des
Choix des espèces
Les rongeurs ont un système auditif similaire au système auditif humain et la souris est capable de discriminations fines entre les signaux de communication acoustique qu’ils soient conspécifiques ou hétérospecifiques. Les outils génétiques étant bien développés chez cette espèce, il sera possible de poursuivre ces expériences en utilisant des modèles transgéniques pour mieux cerner les mécanismes impliqués dans certains des résultats obtenus. Les animaux utilisés subiront une première chirurgie à 8 semaines et commenceront l’apprentissage à 9 semaines. La souche de souris utilisée (CBA) conserve une audition normale jusqu'à plus de 6 mois. Ainsi en commençant entre 2 et 3 mois, les souris sont considérées comme adultes et cela nous permet de réaliser l’apprentissage et les enregistrements neuronaux avant que des pertes auditives ne surviennent.
Différenciation cellulaire chez l’embryon précoce de souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
La plupart des 517 souris femelles sont tuées pour collecter leurs embryons, tandis que les femelles non gestantes issues de superovulation retournent à l'élevage pour être réaccouplées. Elles subissent des injections et, pour l'une des procédures, une ovariectomie de vingt-cinq minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. L'étude vise la différenciation des toutes premières cellules de l'embryon, avant l'implantation, à l'aide de souris génétiquement modifiées. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit ces étapes précoces, y compris les embryons synthétiques, ce qui rend selon lui la souris "indispensable".
Objectifs
Notre recherche cherche à comprendre comment les toutes premières cellules d’un embryon de souris se transforment pour former différents types de cellules, juste après la fécondation, avant que l’embryon ne s’accroche à l’utérus. Au tout début du développement, les cellules de l’embryon commencent à se spécialiser pour former : 1) celles qui construiront le futur corps de l’animal, 2) celles qui formeront des tissus de soutien, 3) celles qui deviendront le futur placenta. Ces étapes se passent pendant les trois premiers jours chez la souris, ce qui correspond à environ six jours chez l’humain. Comprendre ce qui contrôle cette transformation est très important, car cela aide à mieux connaître les débuts de la vie, à améliorer la fécondation in vitro, et développer des traitements médicaux utilisant des cellules souches pour réparer des organes ou des tissus. Comme on ne peut pas encore reproduire ces étapes précoces du développement en laboratoire, l’étude sur la souris reste indispensable. Pour cela, nous utilisons des souris génétiquement modifiées : cela nous permet de tester le rôle de certains gènes en les supprimant ou en les activant, afin de voir comment cela influence la formation des premières cellules de l’embryon.
Bénéfices attendus
Ce projet se propose d'étudier des différenciations cellulaires présentes uniquement chez les mammifères. Ces analyses sont inédites et permettront à non seulement d'accroître nos connaissances en embryogénèse (à court terme) mais aussi d'apporter des améliorations de conditions de cultures (à long terme) lors de fécondations in vitro humaines ou cultures de cellules souches embryonnaires humaines au gros potentiel thérapeutique. A l'heure actuelle, il n'y a pas de solution de remplacement par des cultures cellulaires (malgré l'avènement des blastoïdes) sur les types/différenciations cellulaires que nous étudions.
Procédures
Pour toutes les procédures des injections seront pratiquées. Une seule procédure comprend un acte chirurgical, une ovariectomie, d'une durée de 25 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont de la douleur légère associée aux injections et potentiellement des douleurs modérées post-opératoires pour une des procédures.
Devenir
Pour toutes les procédures, les femelles seront mises à mort pour collecter les embryons. Les femelles non gestantes issues des expériences de superovulation seront remises avec le pool commun de femelles de même génotype et réaccouplées après un délai de 15 jours.
Remplacement
Pour certains projets se déroulant après l'implantation de l'embryon dans l'utérus, nous avons mis en place des modèles de différenciation cellulaire in vitro à base de cellules souches embryonnaires ES. Ceci réduit drastiquement le nombre de souris utilisées. Néanmoins, pour les projets portant sur des analyses avant l'implantation, l'utilisation de souris est indispensable car à ce jour aucun modèle cellulaire ne peut récapituler ces différenciations, même depuis l'avènement des embryons synthétiques produits à partir de cellules ES car nous étudions des différenciations cellulaires qui surviennent avant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum afin obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Nous utilisons des combinaisons génétiques qui permettent d'obtenir le génotype voulu avec une plus grande efficacité (systèmes inductibles).
Raffinement
Nous utilisons des animaux avec des systèmes inductibles pour réduire les contraintes. Ces modifications génétiques n'occasionnent aucun stress ni douleur. Les animaux seront observés quotidiennement afin de suivre leur état général (perte de poids, comportements anormaux) et seront mis à mort en cas de points limites atteints et après consultation de la SBEA ou une dose supplémentaire d'analgésique pourra être administrée dans le cas d'acte chirurgical. Dans le cas d'injections répétées, le côté de la piqûre sera alterné. Lors des ovariectomies, la souris sera traitée en amont avec un analgésique et elle sera placée sur un matelas chauffant lors de l'acte chirurgical
Choix des espèces
Nous travaillons sur les premières différenciations cellulaires chez les mammifères qui ne peuvent être effectuées dans des modèles d'autres classes de vertébrés. La souris est le choix idéal principalement pour les outils génétiques qui y ont été développés.
Caractérisation des gènes du moustique hématophage, Anopheles, impliqués dans la réponse immune de l’insecte contre le parasite Plasmodium adapté au rongeur de laboratoire.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Trente minutes de nourrissage de moustiques sur leur corps anesthésié : 630 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal est infecté par un parasite du paludisme du rongeur, subit un prélèvement sanguin, puis les moustiques se nourrissent de son sang quatre jours après l'infection. L'étude porte sur les gènes qui rendent le moustique résistant au parasite, dans une visée de lutte contre le paludisme humain. Le porteur explique tuer les souris parce que le nourrissage exige un niveau de parasites et un âge précis, ce qui écarte toute réutilisation.
Objectifs
Des études antérieures ont permis d’identifier un gène associé à une résistance vis-à-vis du parasite Plasmodium responsable du paludisme. Des résultats préliminaires montrent que dans certains cas, le moustique utilise différentes formes de ce gène pour se protéger contre le parasite humain et contre le parasite de rongeur. Nous nous intéressons aux mécanismes sous-jacents à cette spécificité de la réponse immunitaire vis-à-vis d’un pathogène avec lequel le moustique a partagé une histoire évolutive ou avec un nouveau pathogène (qu’il n’aurait jamais rencontré) tels que les parasites de rongeurs. L’objectif de ce projet est d’identifier les gènes candidats et régulateurs potentiels présents de ce gène chez ce moustique qui concourent à ce statut réfractaire vis-à-vis de différents parasites. Plus précisément, 10 gènes candidats et 10 candidats « ARN non-codants » régulateurs seront testés. De plus, les moustiques sauvages devenant de plus en plus résistants aux insecticides, nous avons également généré une lignée de moustique résistante à la deltaméthrine (un insecticide très utilisé sur le terrain). Nous aborderons dans ce projet le rôle des 20 candidats dans un fond génétique de moustiques résistants à la deltaméthrine. Enfin, la flore bactérienne des moustiques jouant un rôle sur leur capacité à transmettre le parasite Plasmodium, nous évaluerons si les gènes protecteurs interagissent avec le microbiote bactérien. En effet en piquant un hôte mammifère traité aux antibiotiques, les moustiques seront à leur tour soumis à cet antibiotique susceptible de modifier l’ensemble de leur flore bactérienne. Ce dernier point permet d’aborder et de mimer, sur un modèle murin, l’impact de piqûres du moustique sur des individus traités aux antibiotiques (commune sur le terrain) sur la modulation de la compétence vectorielle des moustiques au parasite Plasmodium, ainsi que sur la réponse immunitaire de ces insectes vis-à-vis du parasite.
Bénéfices attendus
Les moustiques constituent les vecteurs les plus dangereux pour l'humanité, responsables de plus de 700 000 décès annuels selon l'OMS. Ce fardeau sanitaire s'aggrave avec le changement climatique qui favorise l'expansion de ces insectes vers des zones tempérées autrefois épargnées, où des cas autochtones de maladies tropicales émergent désormais. Parallèlement, l'efficacité des stratégies actuelles fondées sur les insecticides est gravement compromise par le développement de résistances généralisées chez les populations de vecteurs. Ce projet propose une approche fondamentale novatrice visant à identifier les composantes moléculaires et génétiques du système immunitaire des moustiques qui permettent à certains individus de bloquer naturellement le développement du parasite du paludisme. Cette compréhension permettra de concevoir des stratégies de lutte biologique consistant à renforcer ces mécanismes de défense naturels au sein des populations de vecteurs. Contrairement aux insecticides chimiques, ces approches cibleraient spécifiquement la capacité de transmission sans éliminer les insectes, préservant la biodiversité et limitant l'impact écologique. Les connaissances acquises sur les interactions complexes entre hôte, parasite et vecteur, nécessitant l'étude du cycle infectieux complet qui justifie ce recours indispensable et strictement limité à l'expérimentation animale, ouvriront la voie à des outils de contrôle génétique ou biologique durables et transférables à d'autres systèmes vectoriels (dengue, zika). Les bénéfices attendus sont majeurs pour la santé publique mondiale, particulièrement pour les populations vulnérables des régions tropicales, et permettront d'anticiper proactivement les risques sanitaires émergents sur le territoire européen.
Procédures
- Injection de parasites responsable du paludisme de rongeur durée quelques secondes (degré de gravité modérée) une fois dans la vie la souris - Injection pour anesthésie, durée de quelques secondes, une seule fois dans la vie de la souris, 4 jours après injection de parasites. - Prélèvement sanguin, veine caudale, durée (moins d’une minute), une seule fois dans la vie de la souris, 4 jours après injection de parasites. - Nourrissage des insectes sur souris anesthésiées, durée : 30 minutes, une seule fois dans vie de la souris, 4 jours après injection de parasites.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent ressentir un stress temporaire lié à la manipulation (préhension) et aux injections et prélèvement nécessaires pour le projet. Une douleur légère et ponctuelle de courte durée peut survenir au moment de l’injection. L’injection de parasites entraîne une augmentation de la parasitémie dans le sang, ce qui peut provoquer un état de fatigue de courte durée (3 jours), une locomotion ralentie, une baisse de vivacité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, le nourrissage par les moustiques doit se faire à un niveau de parasites bien déterminé et à un âge de souris bien déterminée. En d’autres termes, nous ne pouvons pas utiliser des souris plus vieilles et chez lesquelles le niveau de parasites dans le sang serait certainement plus élevée ; cela influencerait le niveau et l’efficacité d’infection de nos moustiques.
Remplacement
Pour étudier l’infection des parasites Plasmodium (responsables du paludisme) chez les moustiques, nous avons exploré des méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, ces approches présentent des limites majeures pour notre projet. Une première méthode consiste à nourrir les moustiques sur une membrane artificielle chauffée à température corporelle (37°C), contenant du sang infecté. Malheureusement, cette technique ne permet pas aux moustiques de s’infecter de manière suffisamment efficace. Les résultats obtenus sont trop variables pour garantir une analyse fiable des effets étudiés, ce qui rend cette approche incompatible avec nos objectifs scientifiques. Par ailleurs, notre question de recherche exige que les parasites soient transmis aux moustiques dans des conditions aussi proches que possible de leur cycle naturel. En effet, lors d’une infection naturelle, les parasites interagissent avec les composants du sang (comme les anticorps ou les facteurs immunitaires) et évoluent dans un environnement complexe, essentiel à leur développement. Une méthode artificielle ne peut pas reproduire ces interactions, ce qui risquerait de fausser nos observations. Nous avons également envisagé l’utilisation de cellules de moustiques en culture, mais cette solution n’est pas adaptée. Les stades infectieux du parasite ne peuvent pas se développer correctement dans ces cellules, et ce système ignore le rôle clé du microbiote intestinal du moustique, indispensable à la maturation du parasite. Sans ces éléments, les résultats ne refléteraient pas la réalité biologique de l’infection. Ainsi, pour répondre de manière rigoureuse à notre problématique, nous devons recourir à des souris préalablement infectées par Plasmodium. Ces modèles, bien que minimalistes, sont les plus petits mammifères permettant de reproduire fidèlement les mécanismes de l’infection humaine. Ils offrent un compromis éthique et scientifique optimal pour étudier les interactions entre le parasite, le vecteur et l’hôte, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet est strictement limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. Chaque expérience est conçue de manière à optimiser l’utilisation des animaux, avec une seule souris utilisée pour permettre l’infection d’un nombre élevé d’insectes, ce qui limite le recours à des animaux supplémentaires. Par ailleurs, le choix d’utiliser exclusivement des souris femelles permet de réduire la variabilité entre les individus. Les mâles présentent plus fréquemment des comportements agressifs pouvant entraîner du stress ou des blessures, susceptibles d’influencer les résultats expérimentaux. L’utilisation de femelles favorise ainsi des conditions plus homogènes et fiables, ce qui contribue à limiter le nombre total de souris nécessaires au projet, conformément au principe de réduction des 3R.
Raffinement
Pour réduire au maximum la douleur et le stress des souris lors du nourrissage des insectes, les animaux sont placés sous anesthésie générale. Cette mesure empêche que les piqûres des insectes provoquent une souffrance. Les souris sont hébergées dans des conditions optimales à l’animalerie, avec un nombre de souris
Choix des espèces
Les expériences visant à suivre l’évolution de l’infection parasitaire (Plasmodium berghei ou Plasmodium yoelii) chez les insectes ont été développées et optimisées chez la souris. L’utilisation d’une autre espèce de rongeur nécessiterait de refaire entièrement ces travaux de mise au point, sans garantie de succès, ce qui rallongerait considérablement la durée des expériences et pourrait augmenter le nombre d’animaux utilisés. La souris est donc l’espèce la mieux adaptée pour obtenir des résultats fiables tout en limitant le recours à des animaux supplémentaires. Ce stade a été sélectionné sur la base de données de validation expérimentale préalable établissant que la dose infectante de parasites et la cinétique d'évolution de la parasitémie sont caractérisées de manière optimale, et reproductibles chez des animaux de cet âge. L'utilisation de souris plus jeunes (stade juvénile, croissance en cours) ou plus âgées (adultes matures) présenterait une variabilité de la volémie et du poids corporel significative, rendant nécessaire une recalibration complète des quantités de parasites à administrer et une réévaluation de la cinétique de développement parasitaire propre à chaque classe d'âge. Cette standardisation à 4-5 semaines garantit la robustesse méthodologique et la reproductibilité des résultats tout en évitant la multiplication de séries expérimentales préliminaires, ce qui augmenterait le nombre total d'animaux utilisés, conformément au principe de réduction.
Etude de la biodistribution in vivo d’un anticorps pour le diagnostic et la thérapie des cancers du pancréas dans un modèle souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Aux défenses immunitaires réduites pour accepter des cellules cancéreuses humaines, 337 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit une greffe de tumeur du pancréas par injection guidée sous échographie, subit jusqu'à douze échographies et cinq séances d'imagerie sous anesthésie, ainsi que des incisions de la queue pour prélever le sang. La greffe pancréatique induit une maladie tumorale sévère pouvant dégrader l'état général, avec amaigrissement et perte d'activité. Les animaux sont tués pour prélever la tumeur et de nombreux organes, cette étape de biodistribution précédant un projet ultérieur d'évaluation thérapeutique.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer agressif avec un des plus mauvais pronostique suivant l’annonce. Moins de 10% des patients ont une survie de 5 ans après le diagnostic. Des chimiothérapies existent mais il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies ciblées pour permettre une meilleure survie des patients. La médecine nucléaire offre une alternative en plein essor pour le diagnostic et le traitement du cancer. Des éléments radioactifs peuvent être couplés à une molécule capable de se lier spécifiquement aux cellules cancéreuses. En fonction de l’élément radioactif utilisé, il est possible de diagnostiquer et localiser par imagerie la tumeur chez le patient, ou de la détruire. Cette approche est dite « théranostique ». Nous avons identifié la protéine X comme un marqueur précoce du cancer pancréatique et avons développé un anticorps capable de s’y lier. Nous souhaitons attacher un radioélément à cet anticorps et évaluer son potentiel pour diagnostiquer et traiter le cancer du pancréas. Pour évaluer le potentiel de cette approche, nous devons mettre au point le modèle d’étude, en déterminant la vitesse de croissance des tumeurs chez l’animal. Nous utiliserons des cellules cancéreuses humaines dont nous décrirons les vitesses de croissance en présence et en absence de la protéine X. Nous disposons aussi de cellules cancéreuses provenant directement de tumeurs de patients exprimant la protéine X dont nous décrirons aussi la cinétique de croissance. Ces modèles nous permettront ensuite d’évaluer la capacité de plusieurs agents d’imageries développés à partir de l’anticorps à se lier aux tumeurs chez la souris. Ces résultats nous permettront d’identifier à la fois les meilleurs modèles d’études et la meilleure combinaison en vue de son évaluation en thérapie anticancéreuse. L’évaluation de l’efficacité pour détruire les tumeurs fera l’objet d’un projet ultérieur.
Bénéfices attendus
Le cancer du pancréas est un des cancers avec le plus mauvais pronostic suivant l’annonce du diagnostic et dont l’incidence augmente en France et en Europe. Les traitements disponibles ne permettent pas aux patients de survivre au-delà de quelques années. Il est primordial d’identifier de développer de nouveaux traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet présente un enjeu majeur car l’identification d’une molécule présente de manière spécifique à la surface des cellules de cancer du pancréas, la protéine X, pourrait permettre de développer une alternative thérapeutique dans cette maladie. La présence de cette protéine X est liée à un mauvais pronostic chez le patient. Son apparition à la surface des cellules cancéreuses arrive très tôt dans le développement de la maladie. Cette protéine semble donc être un candidat idéal pour diagnostiquer précocement les tumeurs. Le développement d’un agent théranostique basé sur un anticorps capable de se lier à la protéine X, permettra à la fois de diagnostiquer les patients avec un mauvais pronostic en y attachant un élément radioactif d’imagerie, mais également de traiter ces patients, en y attachant un élément radioactif thérapeutique. Les données accumulées dans le cadre de ce projet permettront également d’en apprendre plus sur cette protéine peu décrite qui semble jouer un rôle important dans cette maladie.
Procédures
85 souris maximum recevront 1 injection dans le pancréas sous guide échographique sous anesthésie (20 minutes maximum), 12 examens maximum par échographie sous anesthésie (20 min maximum). 126 souris maximum recevront 1 injection dans le pancréas de cellules cancéreuses sous guide échographique sous anesthésie (20 min maximum), 12 examens maximum par échographie sous anesthésie (20 min maximum), puis une injection intrapéritonéale sous anesthésie (2 min maximum), puis une injection intraveineuse sous anesthésie (5 min maximum), puis 5 analyses d’imagerie sous anesthésie (30 min) et 5 prélèvements de petit volume sanguin par incision de la veine de la queue (1 min). 126 souris maximum recevront 1 injection sous-cutanée de cellules cancéreuses sous anesthésie (2 min), 12 mesures de la taille de la tumeur à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile (2 min), puis une injection intrapéritonéale sous anesthésie (2 min maximum), puis une injection intraveineuse sous anesthésie (5 min maximum), puis 5 analyses d’imagerie sous anesthésie (30 min) et 5 prélèvements de petit volume sanguin par incision de la veine de la queue (1 min).
Impact sur les animaux
La greffe de cellules cancéreuses dans le pancréas des souris induit une maladie tumorale sévère qui peut induire une dégradation de l’état général (amaigrissement, perte d’activité) de l’animal. Pour la greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, les animaux peuvent présenter une gêne due à la présence d’une grosseur externe. L’anesthésie par inhalation utilisée lors des échographies abdominales de surveillance de croissance tumorale et lors des expériences d’imageries peuvent entraîner des nuisances telle qu’un abaissement de la température corporelle. De même, les manipulations pour surveiller l’état général et réaliser les pesées de suivi, ainsi que les mesures de croissance des tumeurs au pied à coulisse, peuvent être source de stress chez les animaux. L’anticorps que nous avons développé n’a jamais été administré chez l’animal. Les doses que nous avons prévu d’administrer sont très faibles et ne devrait pas causer de nuisance majeure, autre qu’une légère augmentation de la température corporelle, et une gène au site d’injection. L’incision réalisée sur la queue pour les prélèvements sanguins est petite et peu profonde, mais pourrait entraîner des douleurs temporaires.
Devenir
Pour la procédure 1, tous les animaux sont euthanasiés sous anesthésie gazeuse en fin de procédure pour le prélèvement du pancréas et d’organes supplémentaires (foie et des poumons). A la fin des procédures 2 et 3, tous les animaux sont euthanasiés sous anesthésie gazeuse en fin de procédure pour le prélèvement de la tumeur et d’organes supplémentaires (cerveau, rate, foie, reins, intestins, foie, poumons, coeur, tibia, peau, pancréas).
Remplacement
Les modèles in vitro de lignées cancéreuses ne permettent pas d’évaluer la distribution d’un candidat médicament dans l’organisme. Le modèle de greffe de cellules cancéreuses pancréatiques dans le pancréas des souris permet de se rapprocher d’un contexte proche de celui des patients ce qui est impossible in-vitro. La greffe de cellules cancéreuses pancréatiques sous la peau des souris présente l’avantage de pouvoir isoler facilement le signal radioactif accumulé dans la tumeur sans la perturbation liée au signal émis dans les autres organes proches du pancréas. L’utilisation de cellules dérivées de tumeurs de patients, nous permettra de récapituler les caractéristiques des tumeurs pancréatiques humaines afin de reproduire plus fidèlement la pathologie observée chez les patients, notamment du point de vue du niveau d’expression de la protéine X.
Réduction
Pour évaluer la distribution de nos candidats médicaments chez la souris au cours du temps nous utiliserons l’imagerie isotopique, qui permet un suivi dans le temps de la distribution du radiotraceur sur les mêmes animaux, là où la plupart des techniques nécessite de mettre à mort les animaux à chaque temps de mesure. Ceci nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, ce projet permettra de sélectionner les modèles d’études les plus pertinents, ainsi que le médicament le plus performant, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le projet futur d’évaluation de son potentiel thérapeutique.
Raffinement
Nos animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température: 20- 22°C; renouvellement d’air: 15 volumes/heure; cycle jour/nuit: 12h/12h). Les conditions d’hébergement de notre animalerie respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les personnes habilitées pour ce projet et le personnel de l’animalerie assurerons le suivi quotidien des animaux. Les animaux auront l’eau et la nourriture à volonter. Les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage en portoir ventilé. Nous mettrons des enrichissements à disposition des animaux (dôme, bûchette, du coton pour nidification). Nos animaux ont des défenses immunitaires réduites, nécessitant de travailler en environnement aseptisé. Nous travaillerons avec des souris mâles qui nécessitent une vigilance sur une potentielle agressivité entre les animaux dans les cages. Nous envisagerons d’isoler certains individus si nous observons des comportements de domination. Les animaux seront suivis quotidiennement à partir de la procédure de greffe de cellules cancéreuses. Pendant les échographies, les yeux des animaux seront protégés avec l’application d’un gel empêchant le désèchement. Les animaux ayant été greffés seront réchauffés et retrouveront leurs congénères après l’injection pour éviter le stress de l'isolement. Le degré de douleur sera évalué au cours de la procédure avec une grille de score tenant compte de l’aspect des tumeurs sous-cutanées (blessures/nécrose), l’observation du comportement (toilettage, alimentation, hydratation, activité) des animaux et des pesées régulières. Selon la grille de score à partir de 15% de perte de poids une alimentation gélifiée sera mise à disposition avec une réhydratation sous-cutanée. Nous réaliserons des mesures régulières de croissance de la tumeur soit au pied à coulisse ou par échographie abdominale, et avons fixé une taille limite (500 mm3 pour une tumeur sous-cutanée, 200 mm3 pour les tumeurs dans le pancréas). Les injections de cellules cancéreuses, prélèvements sanguins, les injections iv et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale par inhalation, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal et un réveil rapide.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé pour étudier les processus de croissance des tumeurs. Le modèle murin présente une forte homologie génétique avec l’homme et permet de s’affranchir de la limitation d’accès à du matériel humain. Les tumeurs pancréatiques induites chez la souris montrent de nombreuses similarités avec ce qui peut être observé dans les tumeurs humaines, faisant de la souris un bon modèle d’étude. Nous utiliserons des souris adultes pour tout le projet, elles seront âgées de 6 semaines au moment des procédures de greffes. Cet âge est choisi car nous étudions le cancer du pancréas qui affecte des patients adultes.
Validation d’un dispositif de mesure non invasive de la pression artérielle chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rendus hypertendus par administration chronique de L-NAME dans l'eau de boisson pendant six semaines, 32 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le protocole ajoute des mesures répétées de pression artérielle sous contention, des prélèvements sanguins sous anesthésie, puis le prélèvement du cœur, de l'aorte et des reins. L'objectif déclaré est de valider en interne un appareil de mesure déjà validé par son fabricant, l'établissement invoquant des variations locales de température, de bruit et de manipulation. Le porteur relie ce développement aux "besoins de nos partenaires académiques et industriels" et à la mise à disposition du dispositif à la communauté scientifique.
Objectifs
Le but de ce projet est de vérifier si le système BP-2000 (fabriqué par Visitech systems®) est un outil fiable pour mesurer la pression artérielle chez le rat. Pour cela, nous allons tester sa capacité à détecter avec précision une augmentation de la tension artérielle. Cette augmentation sera provoquée chez l'animal à l'aide d'un produit appelé L-NAME, qui est couramment utilisé en recherche pour induire une hypertension artérielle (HTA) de manière contrôlée.
Bénéfices attendus
Ce projet vise principalement la validation méthodologique d’un dispositif de mesure non invasive de la pression artérielle, le système BP-2000 (fabriqué par Visitech systems®) dans un contexte expérimental contrôlé d’hypertension artérielle induite chez le rat. Les bénéfices attendus sont multiples et concernent à la fois la qualité des données scientifiques, le raffinement des pratiques expérimentales et la réduction de l’impact sur le bien-être animal. Sur le plan scientifique et technique, l’étude permettra d’établir la fiabilité, la répétabilité, la reproductibilité et la sensibilité du système BP-2000 à détecter des variations tensionnelles physiopathologiquement pertinentes. La démonstration de sa capacité à discriminer de manière robuste des animaux normotendus et hypertendus constituera une référence méthodologique pour les études cardiovasculaires futures utilisant des mesures non invasives de la pression artérielle chez le rat. Sur le plan méthodologique, la validation du BP-2000 contribuera à la standardisation des procédures de mesure hémodynamique au sein des plateformes d’exploration fonctionnelle, en définissant des critères de qualité du signal, des conditions optimales d’habituation et des paramètres d’acquisition reproductibles. Ces éléments permettront d’améliorer la comparabilité inter-études et inter-laboratoires, et de renforcer la robustesse des résultats expérimentaux. Sur le plan éthique et réglementaire, ce projet s’inscrit pleinement dans le principe des 3R. La validation d’un outil non invasif constitue un bénéfice direct en termes de raffinement, en limitant le recours à des méthodes invasives ou chirurgicales telles que la télémétrie ou le cathétérisme artériel. À moyen terme, cette approche permettra également une réduction du nombre d’animaux nécessaires grâce à une diminution de la variabilité des mesures et à une meilleure exploitation des données longitudinales chez un même animal. Enfin, les résultats attendus de ce projet auront un impact translationnel indirect, en facilitant l’évaluation préclinique de modèles d’hypertension et de stratégies thérapeutiques à l’aide d’outils fiables, reproductibles et respectueux du bien-être animal. La validation du BP-2000 renforcera ainsi l’acceptabilité scientifique et éthique des études cardiovasculaires futures.
Procédures
Trente deux rats adultes (Rattus norvegicus), répartis équitablement entre mâles et femelles et randomisés en groupes contrôle et L-NAME, seront soumis aux interventions suivantes : 1- Acclimatation : 1 semaine pour permettre l’adaptation aux conditions de laboratoire et réduire le stress initial. 2- Habituation au système BP-2000 : 3–5 jours de contention douce, thermorégulation de la queue et pose répétée du manchon caudal, afin de stabiliser les paramètres physiologiques et réduire le stress avant les mesures. 3- Mesures hémodynamiques et prélèvements sanguins (rats anesthésiés) : à S0 (baseline), semaine 3 (S3) et semaine 6 (S6) pour évaluer la pression artérielle et les marqueurs biochimiques liés à l’hypertension (activité Super Oxyde Dismutase SOD, angiotensine II). 4- Induction de l’hypertension : administration chronique de L-NAME (75 mg/L) dans l’eau de boisson sur 6 semaines pour les groupes expérimentaux, tandis que les contrôles reçoivent de l’eau standard. 5- Euthanasie et prélèvements tissulaires : à la fin de l’expérience (semaine 6), pour l’analyse des atteintes tissulaires (cœur, aorte, reins) liées à l’hypertension . L’ensemble de ces interventions permettra de valider le système BP-2000 de manière non invasive, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux et en garantissant une observation longitudinale fiable des paramètres hémodynamiques, biochimiques et tissulaires.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus dans le cadre de ce projet sont limités, transitoires et majoritairement liés aux contraintes expérimentales, sans recours à des procédures chirurgicales ou invasives. L’administration chronique de L-NAME par voie orale dans l’eau de boisson peut entraîner l’apparition progressive d’une hypertension artérielle modérée, susceptible d’être associée à des effets physiologiques tels qu’une légère diminution de la prise de poids, une augmentation de la résistance vasculaire périphérique et, à plus long terme, des adaptations cardiovasculaires (hypertrophie vasculaire ou cardiaque modérée). Ces effets sont attendus, bien documentés dans la littérature et constituent le fondement physiopathologique du modèle utilisé. Ils restent généralement bien tolérés sur la durée prévue de l’étude. Les procédures de mesure de la pression artérielle à l’aide du système BP-2000 (Visitech Systems) sont non invasives, mais peuvent induire un stress transitoire lié à la contention douce dans le restrainer, à la manipulation de la queue et à l’environnement de mesure. Ce stress est principalement observé en début de protocole et tend à diminuer significativement après la phase d’habituation progressive prévue avant les acquisitions officielles. Aucun stimulus douloureux n’est associé à cette procédure. De manière plus générale, les nuisances potentielles incluent : une manipulation répétée des animaux lors des sessions de mesure, une immobilisation temporaire pendant quelques minutes, une exposition modérée à la chaleur au niveau de la queue, nécessaire à la vasodilatation pour la mesure, maintenue dans des limites strictement contrôlées. Aucune douleur aiguë, aucune atteinte tissulaire directe ni procédure chirurgicale ne sont prévues dans ce projet. L’état général, le poids corporel et le comportement des animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter précocement tout signe de détresse excessive ou d’effet indésirable inattendu. Des points limites clairement définis permettront, le cas échéant, l’arrêt anticipé du traitement ou le retrait d’un animal de l’étude. Au regard de ces éléments, le niveau de nuisance global attendu est classé comme modéré, conformément à la Directive européenne 2010/63/UE.
Devenir
1- Acclimatation et phase d’habituation au BP-2000 : Les animaux restent en vie et sont suivis tout au long de l’expérience pour la réalisation des mesures hémodynamiques et des prélèvements sanguins. Ces interventions sont non invasives et ne présentent pas de risque majeur pour leur bien-être. 2- Mesures hémodynamiques et prélèvements sanguins intermédiaires : Les animaux sont maintenus en vie après chaque prélèvement, qui est réalisé selon des procédures minimisant douleur et stress. Les rats continuent le suivi longitudinal pour la mesure de la pression artérielle et l’analyse des marqueurs biochimiques. 3- Induction de l’hypertension par L-NAME : Les animaux restent en vie tout au long du traitement pour permettre le suivi longitudinal des effets sur la pression artérielle et les marqueurs biochimiques. Le traitement est choisi pour induire une hypertension modérée et progressive sans entraîner de détresse excessive. 4- Euthanasie et prélèvements tissulaires finaux : À la fin de l’expérience (semaine 6), tous les animaux sont euthanasiés selon des méthodes conformes à la réglementation et aux bonnes pratiques en matière de bien-être animal. Les tissus (cœur, aorte, reins) sont prélevés pour analyse histologique et biochimique afin de confirmer les effets de l’hypertension et de valider le système BP-2000.
Remplacement
Le projet ne vise pas à établir un nouveau modèle pathologique, mais à procéder à la validation interne d’un dispositif de mesure non invasive de la pression artérielle chez le rat, dans les conditions spécifiques de notre établissement. Bien que le matériel ait été validé par le fournisseur, des variations liées à l’environnement expérimental (température, bruit), aux pratiques de manipulation, aux caractéristiques des animaux ou à l’organisation locale peuvent influencer les résultats. Une validation au sein de l’institut est donc requise afin d’assurer la fiabilité, la reproductibilité et la comparabilité des mesures, d’établir des valeurs de référence internes et de garantir la robustesse méthodologique des études ultérieures. À ce jour, aucune méthode alternative in vitro ne permet de reproduire de manière satisfaisante l’hémodynamique systémique nécessaire à l’évaluation des performances d’un dispositif de mesure de la pression artérielle. La régulation tensionnelle reposant sur des interactions intégrées entre les systèmes cardiovasculaire, nerveux et rénal, l’étude de l’organisme entier demeure indispensable. Le recours au modèle rat est ainsi scientifiquement justifié et strictement limité à la validation fonctionnelle du dispositif, conformément aux principes de nécessité et de proportionnalité. Le nombre d’animaux (n=32) a été déterminé sur la base d’une estimation statistique visant à garantir la fiabilité et l’interprétabilité des résultats, tout en respectant le principe de réduction.
Réduction
Le principe de réduction est intégré dès la conception du projet. La taille des groupes expérimentaux est déterminée a priori sur la base d’un calcul statistique permettant de définir l’effectif minimal nécessaire à l’obtention de résultats scientifiquement valides et interprétables. Cette démarche garantit l’adéquation entre la question posée et le nombre d’animaux inclus. Les différentes évaluations prévues dans le protocole sont réalisées de manière répétée chez les mêmes animaux, selon une approche longitudinale. Cette organisation expérimentale permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés en évitant la constitution de cohortes distinctes pour chaque étape de validation. Les manipulations sont regroupées et optimisées afin de recueillir un maximum de données pertinentes à partir d’un même individu, sans augmentation de la contrainte expérimentale. Par ailleurs, la validation interne du système BP-2000 (Blood Pressure Analysis System) contribuera à améliorer la qualité, la fiabilité et la reproductibilité des mesures hémodynamiques réalisées au sein de l’établissement. En réduisant la variabilité expérimentale et en permettant des mesures longitudinales répétées chez un même animal, le dispositif optimisera la puissance statistique des études ultérieures. À terme, cette amélioration méthodologique devrait conduire à une diminution du nombre d’animaux requis dans les projets futurs, en limitant le recours à des cohortes supplémentaires
Raffinement
Le projet repose sur l’utilisation exclusive de méthodes non invasives, tant pour l’induction du phénotype hypertendu (administration orale de L-NAME) que pour la mesure de la pression artérielle (BP-2000, Visitech Systems). Une phase d’habituation progressive au dispositif est intégrée afin de réduire le stress lié à la contention et d’améliorer la fiabilité des mesures. L’absence de procédure chirurgicale, la surveillance régulière du bien-être animal et l’application de points limites stricts contribuent à limiter la douleur, la détresse et l’inconfort des animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Le choix se porte sur le rat (Rattus norvegicus) car ce modèle est plus complexe que la souris et se rapproche de l'homme sur le plan cardiovasculaire. Par ailleurs, dans le cadre de l'amélioration continu et pour répondre à des besoins de nos partenaires académiques et industriels, nous avons décidés de développer le système de mesure de la pression artérielle chez le rat et de le mettre à disposition de la communauté scientifique. On utilisera des rats adultes jeunes de 6 semaines qui correspond à un stade de développement post-pubère avec un système cardiovasculaire pleinement mature. Le recours à des animaux jeunes (6 semaines d’âge) est justifié par la nécessité d’étudier une régulation hémodynamique stable et représentative de la physiologie cardiovasculaire, condition indispensable à la validation méthodologique du système de mesure de la pression artérielle BP-2000. L’utilisation de ce stade de développement permet également d’assurer une réponse reproductible au traitement par L-NAME, tout en évitant les variations liées à la croissance ou au vieillissement, et contribue ainsi à la fiabilité des résultats obtenus.
Effets de la consommation d’édulcorants sur la perception sucrée et la régulation du métabolisme du glucose.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour mesurer si une consommation régulière d'édulcorants altère la perception du glucose, 208 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Pendant quinze semaines, elles sont exposées à des édulcorants, soumises à des jeûnes répétés, à des tests au gustomètre, à des prélèvements de sang à la queue et à l'application linguale d'un lentivirus sous anesthésie jusqu'à six fois. Les animaux subissent un stress chronique lié à l'isolement et à chaque mise à jeun pouvant durer quinze heures, tout écart clinique entraînant leur retrait puis leur mise à mort. Le projet revendique une portée pour les politiques publiques sur l'usage des édulcorants, un bénéfice large au regard d'une question posée sur la seule perception gustative du sucre.
Objectifs
Dans notre société moderne, la nourriture riche en sucres ajoutés est présente partout et facilement accessible. L’attrait pour cette nourriture fait qu’elle est souvent consommée en absence de besoin énergétique, contribuant à l’émergence dans le monde de l’obésité et du diabète. Pour contrer ce phénomène, les sucres ajoutés sont remplacés par des édulcorants, qui produisent une perception sucrée sans apporter de calories. Cependant, les effets de la consommation régulière des édulcorants sur la santé humaine ne sont pas bien compris. Notamment, déterminer si les édulcorants produisent un goût sucré sans induire de complication métabolique, même sans apporter de calories, est l’une des problématiques les plus controversées dans la littérature. Chez les mammifères, la perception du goût sucré est médiée par un récepteur qui lie entre autres les sucres et les édulcorants. Cependant, il a été montré au niveau du système gustatif que pour le sucre simple glucose spécifiquement, ce récepteur n’est pas la seule voie de détection. Dans le corps, différents senseurs du glucose ont été caractérisés et leur rôle dans la détection et la régulation du métabolisme de ce nutriment a été défini. Récemment, la présence de ces mêmes senseurs spécifiques du glucose a été décrite dans le système gustatif, où ils sembleraient jouer un rôle dans l’intégration du signal sucré avec la prise alimentaire et/ou les réponses métaboliques. Cependant, l’impact de la consommation régulière des édulcorants sur les voies gustatives impliquant ces senseurs spécifiques au glucose n’est pas connu. Les objectifs du projet sont donc de vérifier si les voies gustatives mettant en jeu ces senseurs du glucose sont impactées par une consommation régulière d’édulcorants à l’âge adulte, amenant à une altération de la perception du glucose et du métabolisme glucidique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre les effets de la consommation régulière d’édulcorants sur la perception gustative et la santé métabolique. Cette étude sera l'une des premières à analyser le rôle que jouent les senseurs du glucose présents dans le système du goût dans les troubles comportementaux induits par une exposition chronique aux édulcorants à l'âge adulte. Dans l'ensemble, ce projet contribuera à établir une base scientifique qui informe sur l'utilisation des édulcorants, afin d'alimenter les décisions en matière de politiques publiques.
Procédures
Exposition aux édulcorants ou saccharose en plus de la nourriture habituelle et de l’eau : dose journalière admissible fixée par l’Union Européenne pendant 15 semaines ; Mise à jeun alimentaire de 12h à 15h en phase nocturne : 7 fois par souris ; Entrainements et tests dans le gustomètre : 20 minutes – 7 fois par souris ; Mise à jeun alimentaire de 5h en phase diurne : 7 fois par souris ; Prélèvements de sang à la queue sur animal vigile : 1 minute – 2 x 5 par souris (car deux tests) ; Administration linguale de lentivirus sous anesthésie générale gazeuse : 10 minutes maximum – 6 fois par animal concerné ; Injections intrapéritonéales : 30 secondes – 3 par animal
Impact sur les animaux
Les effets sur les animaux seront : - Une perturbation de la tolérance au glucose lors de l’exposition aux édulcorants/sucres. - Un stress chronique pour les animaux individualisés (procédures 1 et 3), qui sera atténué par un enrichissement supplémentaire dans la cage d’hébergement. - Un stress (maximum une demi-journée) au réveil de l’anesthésie générale effectuée pour l’application sur la langue du lentivirus induisant une diminution d’expression de la protéine d’intérêt. - Une douleur locale et passagère (maximum 5 minutes) lors des injections systémiques ainsi que lors de prélèvements sanguins. - Un stress chronique et une perte de poids à chaque mise à jeun alimentaire des animaux lors des tests comportementaux (maximum 15 heures chacune).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par injection d’un euthanasiant, puis les tissus seront prélevés rapidement après arrêt cardiaque pour analyse.
Remplacement
L’étude du rôle précis des senseurs linguaux du glucose dans les modifications comportementales induites par la consommation d’édulcorants ne peut être réalisée que sur des animaux vivants. La motivation à consommer des aliments ainsi que la régulation du métabolisme impliquent une communication entre différents organes. Il n’existe pas actuellement de modèle de substitution permettant d’étudier les dialogues inter-organes. Ce projet sera donc réalisé chez la souris, modèle de référence pour les études métaboliques et de physiologie alimentaire.
Réduction
Le nombre optimal d’animaux, c’est-à-dire nécessaire à l’obtention de résultats significatifs sans être trop élevé, est calculé grâce à des analyses de puissance statistique. Les tests statistiques de type t-test ou ANOVA et tests de comparaison à posteriori seront utilisés pour analyser les différences significatives entre les groupes expérimentaux. Lorsque cela est possible, les mêmes animaux sont utilisés pour plusieurs tests comportementaux, après une période de repos et de récupération.
Raffinement
Dès la réception des animaux à l’animalerie, tout est mis en place pour réduire leur stress et inconfort. A leur arrivée, une semaine d’acclimatation au nouvel environnement et personnel, sans expérimentation, sera observée. Les animaux individualisés (procédures 1 et 3) seront élevés en environnement enrichi grâce à un dôme de nidation, un bâton et un carré de coton par cage. Un suivi quotidien par le personnel compétent sera effectué. Les animaux seront manipulés régulièrement par les expérimentateurs dans le but de réduire le stress. Le poids corporel et la prise alimentaire seront également contrôlés trois fois par semaine pour s’assurer de l’état de santé des animaux. Les différentes manipulations seront réalisées par du personnel compétent, conformément à la législation. Lors des prélèvements de sang, la douleur des animaux sera diminuée grâce à l’application locale d’un analgésique. A la fin des expériences, les animaux seront mis à mort. Tout au long des expérimentations, si un animal présente un comportement anormal (perte de poids, prostration, piloérection, activité ralentie, …), il sera surveillé avec attention et retiré de l’étude. Si son état clinique ne s’améliore pas, il sera mis à mort selon le tableau des points limites mis en place avec la SBEA de l’établissement.
Choix des espèces
Les résultats préliminaires obtenus ainsi que les données bibliographiques dans ce domaine d’étude sont pour la grande majorité réalisés avec le modèle souris. Afin d’éviter la duplication inutile de travaux déjà publiés, et de pouvoir effectuer des comparaisons avec les travaux précédents, il est important de continuer sur des modèles similaires. Des souris seront donc utilisées dans ce projet de recherche. Des souris âgées de 9 semaines seront utilisées. Cela correspond au stade de l’état jeune adulte, la maturité sexuelle est atteinte par les deux sexes. Il n’y aura pas d’effet confondant sur les résultats dû au développement du système du goût ou du système nerveux central lors de la phase juvénile et adolescente de la souris.
Régulation de l’autophagie, inflammation et axe microbiote-intestin-cerveau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Ce projet prévoit 4 896 souris, un effectif parmi les plus élevés du corpus, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Dès l'âge de huit jours, les souriceaux reçoivent des injections de composés pro-inflammatoires, sont séparés de leur mère, subissent des prélèvements de sang et de fèces puis quatre tests comportementaux, avant le prélèvement de leurs tissus. Le modèle vise à relier autophagie, inflammation et troubles du neurodéveloppement, les retombées thérapeutiques étant annoncées comme un simple "point de départ" pour de futurs tests précliniques. Le porteur justifie l'ampleur du dispositif par la combinaison de plusieurs approches sur une même lignée, sans détailler ce qui fonde le total de 4 896 individus.
Objectifs
La complexité des troubles neurodéveloppementaux (TND) suggère l’implication d’une combinaison de type « gènes × environnement ». De plus en plus de données indiquent que ces troubles sont influencés par l’axe microbiote-intestin-cerveau, via des interactions complexes entre l’inflammation, l’autophagie (système de recyclage intracellulaire) et le développement neuronal. La littérature a permis de mettre en évidence le rôle de l’autophagie dans certains de ces troubles. L’autophagie est un mécanisme par lequel les cellules immunitaires cérébrales éliminent les connexions neuronales surnuméraires au cours du développement, et son dysfonctionnement peut influencer la communication entre intestin et cerveau, contribuant aux TND. Par ailleurs, la littérature scientifique indique qu’une exposition précoce à des composants environnementaux pro-inflammatoires est impliquée dans la survenue de TND. Dans ce contexte, et sur la base de résultats préliminaires obtenus sur des populations de patients TND, nous avons choisi de travailler sur l’un des gènes impliqués dans l’autophagie et dans l’inflammation. L’utilisation de modèles murins de déficience du système autophagique a permis de conclure à un lien entre l’autophagie et la survenue d’anomalies comportementales. Le modèle de souris présente des perturbations des réponses inflammatoire et autophagique. Ce modèle est donc pertinent dans l'étude du processus autophagique, de la régulation de l’inflammation et de la susceptibilité génétique aux composés pro-inflammatoires, tout en permettant d’étudier les mécanismes influençant l’axe intestin-cerveau. Ces données originales permettront d’enrichir la caractérisation de la lignée au niveau de l’axe microbiote-intestin-cerveau, un axe central dans lequel l’inflammation et les dysfonctionnements de l’autophagie peuvent contribuer à l’apparition et à la sévérité des TND. Cette approche intégrative permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes liant autophagie, inflammation et TND.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central, la survenue de troubles du neurodéveloppement, et l'implication de l'axe intestin-cerveau dans ces troubles, qui sont en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour réduire la survenue ou atténuer la sévérité de ces troubles.
Procédures
Une injection unique de composé pro-inflammatoire (durée du geste d’environ 10 secondes, animaux vigiles) ou deux injections répétées sur un maximum de quatre jours (durée du geste d’environ 5 minutes, sous anesthésie générale). Deux prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire pourune partie des animaux (durée du geste environ 10 secondes, animaux vigiles). Deux prélèvements parsemaine des fécès pendant 3 semaines après sevrage lors des pesées (durée du geste environ 1 à 2 minutes, animaux vigiles). Au total, les animaux sont soumis à 4 tests de comportements réalisés tous les deux jours (2 heures maximum au total).
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables classés comme modérés sont attendus, en lien avec notamment la séparation de quelques minutes entre la mère et les petits lors des injections (stress pour la mère), l’anesthésie générale (chute de la température corporelle et détresse respiratoire), le stress induit par les tests de comportement, la réalisation de contention et l'injection de molécules anesthésiques, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile.
Devenir
L’ensemble des 4896 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt pour traitement par biologie molécule ou histologie.
Remplacement
Notre étude a pour but la compréhension des mécanismes impliqués dans les interactions gène x environnement dans l’apparition des troubles neurodéveloppementaux après une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires chez une lignée murine déficiente en autophagie. Ces explorations nécessitent une évaluation sur l’individu. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle animal, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 4896 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé pour différentes études de biologie moléculaire et-ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés plusieurs fois par semaine et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les paramètres environnementaux sont contrôlés conformément à la règlementation en vigueur. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification (coton) et d’une maison rouge. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements anormaux, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant 12h, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés immédiatement. Le stress induit par la séparation maternelle au moment de l’injection des animaux à 8, 10, 13, 14, 15 ou 17 jours est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation avec la mère. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter tout stress lié à la température. Les animaux seront particulièrement observés après les injections. Afin d’éviter une souffrance, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins notre modèle existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement et ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Les injections de composés pro-inflammatoires seront réalisées à 8, 10, 13 et 14 jours ou 15 et 17 jours de manière à modéliser l’exposition de l’enfant à ses composés, pendant sa première année de vie. Les injections de molécules pro-inflammatoires (modèle classique de stimulation pro-inflammatoire) seront réalisées à 8, 20, 34 et 89 jours, de manière à nous rapprocher des précédents projets mis en place sur cette thématique et à couvrir différents stades de la vie de l’animal : néonatal (injection à 8 jours de vie), jeune (injection à 20 jours de vie), adolescent (injection à 34 jours de vie) et adulte (injection à 89 jours de vie).
Étude du recablage axonal par un outil photo-inductible remodelant le cytosquelette des neurones.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
858 souris vont être utilisées, une partie opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil, les autres tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale de vingt à quarante minutes pour implanter une fibre optique, puis des stimulations lumineuses qui remodèlent les connexions des neurones, avant des tests de coordination motrice et le prélèvement du cerveau. L'objectif est de comprendre le recâblage du cerveau pendant l'apprentissage, les retombées médicales pour des maladies neurologiques ou psychiatriques restant lointaines et hypothétiques. Sur le remplacement, le porteur décrit un modèle de cerveau sur puce ayant réduit les conditions à tester, tout en concluant que l'animal reste "indispensable".
Objectifs
Apprendre un nouveau geste, comme faire du vélo ou jouer d’un instrument, repose sur la capacité du cerveau à se transformer. Cette capacité, appelée plasticité cérébrale, permet aux neurones de modifier leurs connexions pour s’adapter à de nouvelles situations. Ce projet de recherche s’intéresse à un réseau précis du cerveau, essentiel pour le contrôle des mouvements et l’apprentissage moteur. Dans ce réseau, les neurones peuvent parfois créer de nouvelles connexions ou, au contraire, en supprimer. Ce phénomène de « recâblage » du cerveau a été identifié récemment et reste encore mal compris. Pour mieux étudier ce mécanisme, les chercheurs ont développé une technologie innovante, qui permet de contrôler ce recâblage à l’aide de la lumière. Selon la version utilisée, cette technologie peut soit favoriser la croissance de nouvelles connexions entre neurones, soit provoquer leur disparition. Plusieurs versions de cet outil ont été conçues et testées, certaines encourageant la formation de connexions, d’autres leur retrait. L’objectif principal du projet est d’observer, chez l’animal vivant, comment ces outils influencent l’organisation des connexions cérébrales, comment ces changements évoluent dans le temps, et quelles sont leurs conséquences sur l’activité du cerveau et sur les mouvements. Dans un second temps, les chercheurs étudieront l’impact de ces modifications cérébrales sur l’apprentissage d’une tâche motrice. Ils chercheront à déterminer si certaines formes de recâblage facilitent l’apprentissage, tandis que d’autres pourraient le ralentir ou le perturber. Finalement, ce projet vise à mieux comprendre comment les changements de connexions dans le cerveau influencent nos capacités motrices, et à explorer le potentiel d’une nouvelle technologie permettant de moduler de façon ciblée les réseaux cérébraux.
Bénéfices attendus
LLe cerveau a une capacité remarquable à se transformer lorsqu’on apprend : ses cellules nerveuses peuvent modifier leurs connexions pour s’adapter à de nouvelles expériences. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment ces changements se produisent et comment ils influencent nos capacités sensorielles et motrices. Pour cela, les chercheurs ont mis au point une technologie innovante qui permet de contrôler, à l’aide de la lumière, la façon dont certaines connexions entre neurones se forment ou disparaissent. Cette technologie, agit sur des réseaux cérébraux bien définis, impliqués à la fois dans la perception et dans le mouvement. En utilisant cet outil dans le cerveau de souris adultes, le projet cherche à établir un lien direct entre les modifications des connexions neuronales, le fonctionnement des réseaux cérébraux concernés, et les performances individuelles dans des tâches comportementales. Ce lien est aujourd’hui largement soupçonné par la communauté scientifique, mais n’a jamais pu être démontré directement, faute d’outils adaptés. Notre technologie offre pour la première fois la possibilité de tester cette relation de manière directe. La validation de cet outil chez l’animal permettra d’explorer de façon nouvelle et ciblée la capacité du cerveau à se réorganiser. Au-delà de la recherche fondamentale, cette approche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour mieux comprendre les dysfonctionnements des circuits cérébraux et, à plus long terme, contribuer à l’identification de pistes thérapeutiques pour certaines maladies neurologiques ou psychiatriques, lorsque la plasticité du cerveau est altérée.
Procédures
Ce projet expérimental sera mené exclusivement sur des souris. Les animaux seront répartis en plusieurs groupes selon les procédures prévues. Un premier groupe sera soumis à une intervention chirurgicale d’une durée variant entre 20 et 40 minutes, sans réveil. Tous les groupes suivants seront tous soumis à la même intervention chirurgicale mais avec réveil, pour une période d'environ 2 semaines. A ce stade, les interventions pourront inclure, selon les besoins expérimentaux, des procédures terminales ou des manipulations préparatoires au cours desquelles les souris seront stimulées par la lumière, libres de leur mouvement dans une cage de test enrichie. Ces différentes expérimentations pourront induire un risque d’infection, un risque d’inflammation ou encore du stress. Les souris seront testées sur leurs performances afin d’évaluer leur coordination motrice ou sur leur motricité fine.
Impact sur les animaux
Les manipulations courantes (prise en main, transport, changement d’environnement) seront quotidiennes dès l’arrivée des animaux. Les chirurgies sont associées à un degré de sévérité modéré (risque d’infection, risque d’inflammation, stress), limité à la période autour de l’opération. Lors de la chirurgie, les animaux peuvent présenter du stress et un risque d’inflammation pendant plusieurs jours. Les tests comportementaux sont non invasifs, induisent un stress léger et temporaire lié à la mise en situation expérimentale, et seront réalisés une fois par jour pour chaque test lors des périodes expérimentales. Les procédures de stimulation par la lumière et un risque d’échauffement local du tissu. Aucun effet indésirable durable n’est attendu. Les expérimentations seront interrompues et l’animal retiré du protocole si un point limite clinique est atteint.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. Cet acte est justifié par l’un des points clés du présent projet, le but est de prélever le cerveau et d’identifier le degré de réarrangement du cerveau avec notre technologie.
Remplacement
Une phase de validation approfondie de notre technologie a été réalisée en laboratoire, à l’aide d’un modèle de cerveau sur puce développé sur place. Cette étape a permis de : • sélectionner les versions les plus efficaces de notre technologie, • déterminer les niveaux pertinents pour l’intensité lumineuse, • définir les modes de stimulation efficaces, • et optimiser les durées d’illumination (les durées longues étant plus efficaces que les courtes). Cette optimisation en laboratoire a considérablement réduit le nombre de conditions à tester chez l’animal. Cependant, l’objectif du projet est d’étudier l’effet du réarrangement des cellules nerveuses sur des comportements moteurs et des processus d’apprentissage, qui ne peuvent pas être reproduits de façon fiable sur des systèmes en laboratoire ou informatiques. L’utilisation d’un modèle animal demeure donc indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées.
Réduction
Le projet a été conçu pour limiter le nombre d’animaux grâce à plusieurs leviers : • Optimisation préalable en laboratoire : La présélection des prototypes et des paramètres sur des modèles sans animaux permet de réduire le nombre de groupes à tester chez l’animal. • Contrôle interne bilatéral (lorsque possible) : Pour certaines analyses, une expression de notre technologie et une stimulation unilatérale permettront d’utiliser un hémisphère du cerveau comme condition test et l’autre comme contrôle, diminuant ainsi le nombre d’animaux. • Contrôle longitudinal individuel en comportement : Les souris seront testées en comportement avant la stimulation puis à différents temps après, ce qui permet d’utiliser chaque animal comme son propre contrôle pour les mesures comportementales. • Mise au point technique sur un nombre limité d’animaux : Trois souris par groupe seront utilisées pour calibrer les conditions d’expression et d’implantation lors des phases de mise au point. • Calculs de puissance statistique : Pour nos études, les données préliminaires indiquent un effet attendu d’environ 25 % avec une variabilité d’environ 10 %. Une analyse de puissance montre qu’un minimum de 15 souris par groupe est nécessaire pour détecter cet effet. Pour les études comportementales, les données suggèrent un effet d’environ 20 % sur la performance motrice, avec une variabilité d’environ 10 %. Les analyses de puissance indiquent qu’un minimum de 20 souris par groupe est requis pour atteindre la significativité.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie conventionnelle, dans des pièces où la température est contrôlée et dans des cages avec environnement enrichi. Le nombre optimal d’animaux par cage sera respecté et les animaux auront accès à l’eau et la nourriture sans limite. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures chirurgicales. Cette anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards, en ce qui concerne les pourcentages de gaz dans l’air lors des phases d’induction et de maintien. Elle sera accompagnée d’une analgésie locale et systémique afin de couvrir la douleur induite par ces interventions. Le maintien de la température corporelle sera assuré par un monitorage rectal associé à un tapis chauffant, et l’application d’un gel ophtalmique permettra de protéger les yeux des animaux pendant l’intervention. Un suivi post-opératoire rigoureux d’une durée de 7 jours, incluant une fiche individuelle de suivi, sera mis en place. Les fibres optiques implantées sont miniaturisées et adaptées à une utilisation murine. Leur conception limite la gêne potentielle lors des déplacements de l'animal dans la cage. Les tâches comportementales motrices présentent un stress léger chez l'animal, principalement dû à leur manipulation. Lors de chaque session, les animaux sont soigneusement manipulés et calmés par l’expérimentateur, constituant ainsi une interaction sociale positive pouvant être assimilée à une récompense. Tout le protocole vise à renforcer le confort de l’animal durant la réalisation des tâches et des interventions.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce projet. La zone cible de l’étude est bien caractérisé chez la souris et présente une organisation comparable à celle des mammifères supérieurs, permettant une analyse fiable du réarrangement des cellules nerveuses et de ses conséquences fonctionnelles. Les outils génétiques utilisés sont largement validés et couramment employés chez la souris, assurant une expression spécifique, stable et reproductible. Le petit gabarit de l’animal facilite les chirurgies et l’implantation d’une fibre avec un risque limité. Les tests comportementaux moteurs sont standardisés et bien établis chez la souris, garantissant des mesures robustes des effets. La majorité des lignées transgéniques pertinentes pour de futurs développements du projet sont disponibles chez la souris. Optimiser dès à présent l’ensemble des paramètres techniques dans cette espèce évitera de devoir réimplémenter les protocoles dans un autre modèle, limitant ainsi la durée et le nombre total d’animaux utilisés à long terme. Les animaux utilisés auront entre 30 et 90 jours, correspondant à des stades de jeune adulte. Les injections seront effectuées après le sevrage. À l’issue des différentes procédures expérimentales, les animaux seront âgés au maximum de 90 jours. À cet âge, le cerveau possède encore un degré de plasticité suffisant pour étudier le réarrangement des cellules nerveuses tout en présentant une organisation fonctionnelle stable. Ces caractéristiques en font une période optimale pour évaluer l’effet de notre technologie.
Protocole d’infection expérimentale de poissons par bain et/ou injection pour le développement de nouvelles stratégies vaccinales et antivirales
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour protéger la filière piscicole de virus réglementés, 10 000 truites arc-en-ciel vont être infectées par voie de bain ou d'injection, dans des procédures dont la moitié, soit 5 000 poissons, relève d'un niveau de souffrance sévère. Les souches virulentes utilisées sont mortelles, avec des taux de mortalité de 30 à 100 % chez les jeunes alevins, longs de un à dix centimètres. Les poissons sont manipulés sous anesthésie, mis à jeun, puis tués par prélèvement sanguin terminal. Le porteur situe l'enjeu du côté des pertes économiques des élevages français et européens.
Objectifs
Ce projet permet l’étude des agents pathogènes et du dialogue hôte/pathogène et le développement de nouveaux vaccins chez la truite. Il vise à : - mieux comprendre ces virus d’importance majeure pour la filière piscicole nationale et réglementés au niveau européen. - mieux appréhender les marqueurs génétiques (variations dans les gènes) à l’origine de la virulence et du franchissement de la barrière d’espèce (ici adaptation à la truite de nouvelles souches virales présentes chez d’autres espèces de poisson) afin de développer des outils de diagnostic discriminant permettant à terme une meilleure gestion sanitaire. - développer des candidats vaccins efficaces et sûrs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - une meilleure connaissance des déterminants moléculaires (variations dans les protéines virales) responsable de la virulence et du franchissement de la barrière d’espèce (ici adaptation à la truite de nouvelles souches virales présentes chez d’autres espèces de poisson) de ces virus d’importance majeure pour la filière piscicole. Ce projet permettra à terme de développer des outils de diagnostic discriminant pour une meilleure gestion sanitaire et des candidats vaccins efficaces et sûrs utilisables par bain pour l’immunisation des alevins dont la vaccination à grande échelle par injection est impossible sur le terrain et par injectionchez les adultes et les reproducteurs pour lesquels cette méthode est utilisée en élevage. Nous espérons que ce projet permettra d’améliorer la santé des poissons face à ces infections virales et de limiter les pertes économiques dans les élevages français et européens.
Procédures
Les interventions réalisées sur les truites seront les suivantes : -Deux manipulations des alevins lors des tris, des transferts et des pesées réalisées sous anesthésie en début et parfois en fin de procédure (durée de l’ordre de la minute). -Mise à jeun de 24h -Injections réalisées sous anesthésie : 2 maximum par expérimentation espacées de 21 jours (durée d’environ 30 secondes par poisson). -L’infection par bain d’une durée de deux heures sera réalisée deux fois maximum -Une prise de sang terminale sur animal anesthésié (environ 1 min).
Impact sur les animaux
Les manipulations (tri, pesée, transfert) ainsi que la mise à jeun 24 heures avant les infections engendrent un stress chez les animaux. L’infection des truites arc-en-ciel par les souches virales virulentes de ces virus est fatale avec des taux de mortalité très élevés chez les jeunes alevins comme observé dans les piscicultures (de 30 à 100 %). Les souches virulentes sont utilisées pour mesurer la sensibilité des truites. Il faut noter qu’une grande majorité des souches virales que nous testons in vivo chez la truite sont des souches virales atténuées (taux de mortalités très variables mais inférieurs à ceux induit par la souche virulente) ou à vocation vaccinale (absence de mortalité résiduelle recherchée) et que dans nos expérimentations la moitié des poissons utilisés sont reclassés en gravité « légère » ou « modérée ».
Devenir
Tous les animaux de ce projet qui rentreront dans un protocole d'infectiologie ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Les procédures décrites dans ce projet sont complémentaires aux expériences sur des lignées cellulaires de poissons (in vitro) car elles visent à comprendre les interactions virus-hôte dans leur intégralité (virulence, réponse immunitaire, résistance à l’infection…). L’étude de la réponse immunitaire et de la protection induites par un vaccin ne peut être réalisée autrement que sur animal vivant. De plus, l’apparition ou non de symptômes chez les poissons après infection expérimentale est le seul critère sur lequel il est possible de se baser pour définir les notions de virulence et d’atténuation des souches virales. A ce jour, aucun système in vitro ne permet de prédire le niveau de virulence ou d’atténuation d’une souche virale chez l’animal infecté et encore moins son immunogénicité (son efficacité à induire une réponse immunitaire protectrice) chez l’animal vacciné.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus est justifié par le besoin de s’affranchir de la variabilité inter-animale au sein d’un même groupe et permet une analyse statistique rigoureuse des résultats obtenus. Ce nombre d’animaux est également dicté par la très petite taille des alevins (1 à 5 cm) et la nécessité d’effectuer des prélèvements en quantité suffisante pour valoriser scientifiquement les résultats. Ces dernières années, nos modèles d’infection ont été rigoureusement standardisés et nous veillons à réduire les effectifs de poissons autant que possible pour obtenir des résultats significatifs..
Raffinement
Nous effectuons les expériences dans un environnement optimal pour les animaux. La manipulation des animaux se fait sous anesthésie afin de limiter leur stress. Les animaux sont gardés en lots, aucun animal n’est isolé ce qui est très important pour le bien-être des poissons. La présence de congénères constitue un élément important d'enrichissement du milieu, car c’est la seule possibilité dont nous disposons, puisque l’ajout d’objet dans les aquariums peut provoquer des blessures et rendre les observations des animaux très difficiles. Toutefois, chaque aquarium est équipé d’un bulleur (Colson et al. Sci Rep. 2022) et le sol des aquariums est de couleur foncée. Le bien-être et l’état de santé des animaux est suivi 2 fois par jour minimum pendant toute la durée des expérimentations. Des critères d’arrêt ont été définis rigoureusement : nage erratique et non réponse à des stimuli externes ; les animaux les ayant atteints sont euthanasiés pour limiter toute souffrance.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est l’hôte naturel des virus étudiés dans ce projet. Cette espèce est également, au niveau économique, la principale espèce aquacole produite sur le territoire. Les épidémies virales au niveau des piscicultures françaises peuvent engendrer la destruction totale de l’élevage. Le développement de vaccins efficaces est donc dédié à cette espèce d’intérêt. Stade juvénile pour la truite entre 0,3 et 10 g, ce qui correspond à des tailles allant de 1 à 10 cm. Les poissons juvéniles de poids inférieur à 3 g (taille inférieure à 3 cm) sont généralement plus sensibles à l’infection virale que les adultes.
Étude de l’effet d’une nouvelle molécule thérapeutique en association avec une thérapie substitutive dans un modèle murin de maladie hémorragique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées sans réveil pour la plupart des actes finaux, faute de survie possible après une collecte importante de sang, 511 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sans réveil. Elles portent un modèle de la maladie de Willebrand, une maladie hémorragique humaine, et subissent des tests de saignement de trente minutes sous anesthésie. Le projet teste l'association d'une nouvelle molécule avec une thérapie substitutive. La preuve de concept annoncée pour de futurs essais cliniques reste au stade de perspective.
Objectifs
Les maladies hémorragiques familiales, telles que la maladie de Willebrand, restent assez méconnues. Ces maladies empêchent l’arrêt des saignements. En fonction des différentes anomalies génétiques, les patients présentent des formes plus ou moins sévères. Les traitements disponibles sont lourds (injections intraveineuses répétées) et pas toujours efficaces. Récemment, une nouvelle molécule thérapeutique administrée par voie sous-cutanée a été développée, pouvant augmenter la demi-vie des facteurs de coagulation, facteur Willebrand et facteur VIII, déficitaires dans la maladie de Willebrand. Par contre, la co-administration de cette molécule avec un concentré de FW/FVIII n’a jamais été testée. Notre projet va consister à tester chez un modèle de souris mimant la maladie de Willebrand humaine l’efficacité de cette nouvelle double thérapie en utilisant des tests de saignement bien standardisés.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de cette étude doivent permettre d'établir la preuve de concept de l'efficacité de cette double thérapie dans la maladie de Willebrand. A terme, ce projet devrait pouvoir servir de base pour la mise en place d'essais cliniques visant à déployer cette double thérapie , moins lourde que les thérapies actuelles, chez les patients.
Procédures
Toutes les souris sont anesthésiées. Un groupe reçoit un seul prélèvement rapide (moins d’une minute). Un groupe reçoit une ou deux injections rapides (moins de 15 secondes) suivies d’un test de saignement (30 minutes). Un groupe reçoit uniquement un test de saignement (30 minutes). Toutes les souris sont euthanasies en fin d’expérimentation selon une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Stress léger lors de la préhension des animaux. Douleur légère et transitoire après les injections et après les prélèvements du sang.
Devenir
Les actes expérimentaux finaux sont sans réveil du fait de la collecte de quantités importantes de sang, indispensables pour nos recherches scientifiques.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Afin de déterminer le plus petit nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse mathématique de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience en utilisant ces modèles en prenant en compte les variabilités de chaque test.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. Les animaux ne sont jamais seuls dans les cages d’hébergement et ils ont un accès libre à la nourriture et à l'eau. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et l'acte expérimental aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les souris sont sous observation quotidienne (une fois pendant le weekend) et la quantification des points limites, susceptibles d'entraîner une procédure d’euthanasie immédiate de l'animal, sont strictement appliquée.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à un modèles murin des maladie hémorragique familiale permettant de tester un thérapie déjà utilisé chez les patients. Ces modèle ne manifestent pas des saignements spontanées. Les souris adultes, entre 8 et 30 semaines d’âge seront utilisées.