Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
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MODIFICATION Mise en place et caractérisation d’un nouveau modèle d’adversité précoce chez la souris C57Bl/6.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
510 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée, les autres tuées. Les mères et leurs petits sont soumis à un protocole de stress précoce, les mâles adultes servant d'agresseurs dans des séances de défaite sociale, et les petits sont tués pour prélever leur cerveau. L'objectif est de mettre au point chez la souris un modèle de traumatisme de l'enfance transposé de l'humain, en vue de futurs travaux sur des lignées génétiquement modifiées. Cette version modifiée ajoute trois tests comportementaux que le porteur qualifie d'"essentiels" pour affiner les mesures.
Objectifs
L’hypothèse de la programmation précoce des maladies de l’adulte souligne l’importance de la période périnatale comme fenêtre critique de sensibilité aux facteurs environnementaux. Ainsi, la littérature scientifique a révélé que l’adversité dans l’enfance (trauma, abus, négligence) augmente le développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte chez l’humain. Le modèle de séparation maternelle chez le rat engendre des altérations physiologiques et comportementales chez la descendance adulte, permettant ainsi l’étude des mécanismes physiologiques sous-tendant les effets à long terme du stress précoce. Cependant, ce modèle a donné des résultats inconsistants chez la souris, limitant grandement l’accès à des modèles génétiquement modifiés, et ainsi à la compréhension des mécanismes sous-jacents. Une des limites des études antérieures est l’utilisation systématique chez la souris du paradigme utilisé chez le rat, alors qu’il s’agit de 2 espèces distinctes. Nous proposons ainsi dans ce projet de caractériser et valider un nouveau protocole de stress précoce chez la souris en nous basant sur le modèle de défaite sociale déjà caractérisé et validé chez cette même espèce. Les conséquences de ce nouveau protocole seront étudiées chez la descendance mâle et femelle à l’âge adulte en évaluant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs ». Ce protocole sera comparé à un nouveau protocole de séparation maternelle couplé à un sevrage précoce publié récemment pour identifier le protocole de stress précoce entrainant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs » les plus robustes. L’objectif à plus long terme de ce projet sera de réemployer ce nouveau protocole en utilisant des modèles génétiquement modifiés qui permettront une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la vulnérabilité émotionnelle dans un contexte d’adversité précoce.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de stress précoce chez la souris. En effet les souris sont résistantes aux modèles couramment employés aujourd’hui (notamment la séparation maternelle), bloquant ainsi le potentiel accès à des modèles transgéniques. Cependant ces souris constituent le fond génétique de la plupart des modèles transgéniques de la littérature. Il est donc essentiel de valider une procédure robuste et reproductible de stress précoce. Ce projet servira ainsi de base pour de futurs projets s’intéressant à l’adversité dans l’enfance et nécessitant l’emploi du modèle murin. Ce dernier permet en effet d’accéder à des modèles génétiquement modifiés qui permettraient de mieux comprendre les bases moléculaires des liens entres stress précoce et développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte.
Procédures
Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue sur une partie des animaux vigiles pour mesurer les niveaux de stress des animaux. Le volume de sang sera adapté au poids de l’animal et il y aura un maximum de 2 prélèvements par animal. Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire, qui n’entrainera qu’une légère perte de poids surveillée tout au long de la procédure. MODIFICATIONS 3 TESTS COMPORTEMENTAUX SONT AJOUTES SUR LES MEMES ANIMAUX DE LA PROCEDURE 1 (MARBLE TES (TEST ENFOUISSEMENT BILLES FREQUENCE 1FOIS DUREE 20 MIN) OU DE LA PROCEDURE 3 (TEST DE MEMOIRE SOCIALE DUREE 20MIN ET TEST D’INTERACTION SOCIALE DIRECTE DUREE 6 MIN). ILS SONT ESSENTIELS POUR AFFINER LES MESURES COMPORTEMENTALES ILS SERONT EFFECTUES 1 SEULE FOIS CHACUN.
Impact sur les animaux
- De par sa nature et son objectif le protocole de stress social que nous allons utiliser pour modéliser les pathologies psychiatriques entraine un stress chez la souris. Celle-ci présente une élévation des comportements de types anxieux. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré d’après notre expérience au laboratoire et la littérature disponible. En effet, les animaux ne perdent pas de poids au cours du protocole et leur activité locomotrice n’est pas affectée. Les animaux sont observés durant les tests et après les tests et des soins appropriés sont mis en place en cas de besoin - Concernant la descendance, les protocoles de stress précoce visent à générer des comportements émotionnels de type « anxieux » et « dépressifs », qui sont l’objet de cette étude. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Enfin, les procédures de conditionnement opérant nécessitent une restriction alimentaire légère limitée à la phase d’apprentissage (maintien à 90% du poids ad libitum).
Devenir
Pour les procédures 1, 2 et 3 : - Les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale et les mères seront soit mises à mort soit réutilisées par des membres du laboratoire dans d’autres expériences à chaque fois que ce sera possible pour répondre aux besoins de réduction de la règle des 3R. - Les petits seront euthanasiés à la fin de la procédure par raison scientifique afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
L’objectif du projet étant de caractériser et de valider un nouveau protocole de stress précoce dans un modèle murin et d’étudier les conséquences de ce stress sur le développement de troubles anxieux et dépressifs chez la progéniture à l’âge adulte. L’emploi de modèle animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie pour les prochaines étapes du projet qui nécessiteront l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements.
Réduction
Pour respecter la règle de réduction du nombre d'animaux utilisés, les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale seront employées durant plusieurs sessions consécutives de ce protocole. Ces animaux seront proposées aux autres utilisateurs puisqu'ils n'auront pas reçu de traitements particuliers. De la même manière, les mères pourront être proposées aux autres utilisateurs. Le nombre total maximal d’animaux prévus dans le projet est de 510, mais ce nombre est susceptible d’être revue à la baisse, en fonction du succès des reproductions réalisées.
Raffinement
- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et dans un environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille qui peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet. - Les femelles seront achetées directement gestantes auprès du fournisseur. - Les souris utilisées pour la défaite sociale seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte (après 4 mois). - Les expériences de comportement sur la descendance démarreront sur des animaux âgés de 12 semaines et plus car le phénotype apparaît à l’âge adulte.
Rôle des macrophages dans l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Opérées du cœur pour déclencher un infarctus, 2 920 souris vont toutes être tuées à l'issue, dont 2 400 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 520 sévère. Chacune peut aussi subir jusqu'à dix-huit gavages, autant d'injections et trois échocardiographies sous anesthésie. Le porteur juge le modèle animal "indispensable" au motif que la réparation cardiaque met en jeu plusieurs organes. Les bénéfices, de possibles cibles thérapeutiques, restent au conditionnel face à un infarctus provoqué chez près de 3 000 souris.
Objectifs
L’infarctus du myocarde (communément appelé "attaque cardiaque") est une cause de mortalité et d’invalidité majeure. Les mécanismes gouvernant la réparation du cœur après un infarctus ne sont pas entièrement connus. L’inflammation joue un rôle important dans la réparation du coeur après un infarctus, mais les types cellulaires et voies moléculaires impliqués restent méconnus. Ce projet a pour but de comprendre le rôle de certaines cellules de l’inflammation, les macrophages, dans la réparation du cœur après l'infarctus. Une opération permettra de déclencher de manière contrôlée un trouble cardiaque chez les souris. La fonction cardiaque des souris sera analysée par échocardiographie, et la réparation du coeur après l'infarctus du myocarde sera étudiée. Ce projet permettra d’identifier des nouveaux acteurs inflammatoires de la réparation du coeur après un infarctus et de potentielles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre une meilleure compréhension des mécanismes de la réparation du coeur après infarctus, ce qui constitute une étape essentielle pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l'infarctus du myocarde.
Procédures
Gavages (jusqu'à 18 fois, quelques secondes) ; Intervention chirurgicale sous anesthésie (1 fois, 30 minutes); Echocardiographie sous anesthésie (3 fois, 15 minutes); Injections (jusqu’à 18 fois, quelques secondes); prélèvement sanguin (1 fois, quelques secondes)
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, inconfort lié au gavage, potentielle douleur au point d'injection, stress et hypothermie liés à l'anesthésie, stress lié à l’isolement de courte durée dans la phase post-opératoire et post-échocardiographie ; Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire.
Devenir
Tous les animaux sont mis à morts à la fin de la procédure.
Remplacement
Bien que des études bio-informatique et de culture cellulaire soient menées pour étudier les hypothèses de ce projet, la réparation cardiaque après infarctus du myocarde impliquent l’interaction complexe de différents types cellulaires et une interaction entre différents organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers, rendant le modèle animal indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est déterminé par d’utilisation d'outils statistiques adaptés. Les différences de mortalité liées au sexe existant dans ce modèle (mortalité accrue chez les mâles comparés aux femelles) ont été prises en compte dans le calcul du nombre d'animaux. Des tests statistiques appropriés pour l’analyse des données obtenues ont été prédéfinis. Des mesures spécifiques sont mises en oeuvre pour éviter les biais expérimentaux: randomisation, analyse des données "en aveugle". L'information qui peut être récupérée à partir d'un seul animal est optimisée.
Raffinement
Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et anti-douleurs adaptés et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure chirurgicale et l’échographie, les animaux sont placés sur une plaque chauffante à 37°C dès l’induction de l’anesthésie pour maintenir la température corporelle puis placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie anti-douleur sera systématiquement poursuivie en post-opératoire pendant 72 heures, avec administration d'anti-douleurs. Tout au long de la procédure, les animaux feront l’objet d’une surveillance continue par les expérimentateurs, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’inflammation et de la réparation cardiaque post-infarctus du myocarde dans un organisme biologique complexe. Le modèle d’infarctus du myocarde utilisé dans ce projet représente un modèle communément utilisé dans ce domaine de recherche, permettant une intégration et comparaison des résultats obtenus à la littérature scientifique existante. L'infarctus du myocarde se manifeste à l'âge adulte: l’infarctus du myocarde sera induit chez des souris âgées entre 8 et 16 semaines, chez lesquelles le système cardio-vasculaire est à maturité.
Différences de sensibilité rénale entre les différentes souches de souris de laboratoire
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
L'ischémie rénale provoquée tue jusqu'à 30 % des animaux dans les trois jours suivant l'opération. 810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chacune subit une interruption de la circulation dans les deux reins, une irradiation corporelle totale, une greffe de moelle et des gavages répétés. L'étude compare la sensibilité rénale de deux sous-souches de souris de laboratoire, en n'utilisant que des mâles, les femelles étant écartées car naturellement protégées.
Objectifs
La souche B6 de souris noires a été développée dans les années 1950 au Jackson Laboratory, puis transférée au National Institutes of Health (NIH). Au fil du temps, une dérive génétique a conduit à la formation de deux sous-souches distinctes, les souris B6J et B6N. Une analyse génomique effectuée en 2013 a identifié plus de 34 mutations génétiques entre ces deux sous-souches. Certaines mutations spécifiques, notamment dans le gène Nlrp12, présentes uniquement chez les B6J, ont été associées à des différences phénotypiques significatives entre les deux sous-souches. Dans ce contexte, nos travaux récents ont mis en évidence une variation de sensibilité entre les B6J et les B6N au développement d’une dysfonction rénale aiguë suite à une atteinte rénale ischémique. Ainsi, les B6J développent des lésions rénales aiguës sévères avec un taux de mortalité accru après une ischémie-reperfusion rénale bilatérale, alors que les B6N semblent protégées. Ces observations suggèrent que des différences phénotypiques majeures existent dans la réponse au stress ischémique rénal entre les sous-souches de souris noires. D'après la littérature, une hypothèse génétique majeure peut être avancée pour expliquer les différences observées entre les souris B6J et B6N. Il a été démontré qu'une mutation du gène Nlrp12 chez les souris B6J altère le recrutement des neutrophiles dans les tissus inflammatoires. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail sera d’identifier si un défaut de recrutement des neutrophiles en lien avec la mutation de Nlrp12 peut être responsable de l'hypersensibilité rénale post-ischémique des souris B6J comparativement aux B6N.
Bénéfices attendus
Ce travail offrira une meilleure compréhension des différences phénotypiques de lésions rénales entre les deux sous lignées les plus utilisées dans la littérature de souris noires. Ces deux sous lignées ont accumulé des variations génétiques influençant leur sensibilité aux atteintes rénales. Ces différences peuvent modifier de manière significative les résultats obtenus par la communauté scientifique dans les modèles d’atteinte rénale aiguë et chronique. Leur caractérisation contribuera à améliorer la reproductibilité expérimentale, à éviter les biais d’interprétation des modèles transgéniques et à renforcer la fiabilité ainsi que la pertinence translationnelle de la recherche préclinique en néphrologie.
Procédures
Chaque animal subira les interventions suivantes : A. Procédures chirurgicales ou prélèvement invasif sur animal anesthésié au nombre de quatre : 1. Modèle d'insuffisance rénale par ischémie rénale bilatérale (1 fois, durée : 30 min) 2. Mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) (3 fois max, durée : 2h) 3. Prélèvement de sang par la veine cave (1 fois, durée : 2 min). B. Procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de trois : 1. Échographie rénale sur animal anesthésié (3 fois max, durée : 20 minutes) 2. Irradiation corporelle totale sur animal vigile (1 fois, durée : 15 min) 3. Greffe de cellules mononuclées de la moelle osseuse en rétro-orbitaire sur animal anesthésié (1 fois, 5 min) 4. Prélevement de sang à la queue sur animal vigile (1 fois, durée 5 min) 5. Gavage avec l'inhibiteur de MPO ou au solvant sur animal vigile (18 fois max à raison deux fois par jour; durée : 20 secondes) 6. Injection intrapéritonéale d'un anticorps neutralisant des neutrophiles ou d'un isotype contrôle (1 injection; durée : 20 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables sont ceux liés à la contention/manipulation des animaux pouvant engendrer du stress ou ceux liés à la récupération post-irradiation ou post-chirurgie (modèle d’insuffisance rénale post-ischémique) ; pouvant conduire à une perte de poids dans les 24 premières heures (10%), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite). De notre expérience, l'irradiation corporelle totale des souris est très bien tolérée une fois que la greffe des cellules médullaires d'une souris donneuse a été effectuée. L'ischémie rénale bilatérale peut conduire dans les trois premiers jours suivant l’opération à une atteinte rénale aiguë avec une mortalité accrue pour les animaux les plus atteints (30%). Dans notre expérience, passées les premières 72h, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une ischémie rénale bilatérale, suggérant que la période critique douloureuse est limitée à ce temps court après la chirurgie.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
Afin de tester l'hétérogénéité du recrutement des neutrophiles entre les deux sous souches de souris noires, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Néanmoins, pour répondre à notre question biologique, le remplacement total des animaux par de la culture cellulaire n'est pas réaliste car les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre le système immunitaire et le rein in vivo. L'utilisation de modèles animaux pour étudier les variations de sensibilité rénale en lien avec le recrutement des neutrophiles reste nécessaire pour atteindre les objectifs de notre projet de recherche. Dans ce contexte, la souris est le modèle de choix en raison des similitudes physiopathologiques avec les maladies rénales humaines.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (échographie rénale, mesure du débit de filtration glomérulaire) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie, mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses fonctionnelles, histologiques et moléculaires compte tenu de la variabilité interindividuelle et de la mortalité post-opératoire dans notre modèle chirurgical (ischémie rénale bilatérale).
Raffinement
Pour raffiner, les animaux importés de deux éleveurs différents pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. La souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les échographies et les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées, placée sur plaque chauffante à 37°C pour éviter toute hypothermie et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Dans la semaine suivant la chirurgie, la surveillance des animaux sera renforcée avec un examen bi-quotidien par du personnel compétent afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
Dans cette étude, notre objectif est de comparer la sensibilité au stress rénal ischémique dans les deux sous souches de souris noires les plus couramment utilisées au laboratoire. La souris offre également l'avantage d'être de petite taille et nous maitrisons les outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles rénales in vivo ainsi que ex vivo dans ce modèle de stress rénal aigü chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes de 7 à 10 semaines pour notre étude. A ce stade, le rein est parfaitement formé et nous possédons déjà tous les paramètres fonctionnels et structurels de ces deux organes pour l'ensemble des génotypes à tester. Nous n'utiliserons que les mâles dans cette étude car les femelles sont naturellement protégées de lésion rénale post-ischémique ne nous permettrant pas d'étudier les différences de sensibilité entre les deux sous-souches de souris noires.
Ouverture des barrières hémato-médullaire et hémato-encéphalique combinée à un traitement anti-inflammatoire dans plusieurs modèles murins de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
416 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à vingt-trois injections sur dix semaines, dont 336 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 40 opérées puis tuées sans réveil. S'y ajoutent l'ouverture répétée des barrières entre le sang et le système nerveux central par ultrasons sous anesthésie, des électromyographies et, pour certaines, une biopsie. Les modèles murins portent une sclérose latérale amyotrophique qui entraîne une paralysie progressive. Le porteur espère ralentir la maladie en faisant pénétrer des cellules immunitaires dans le système nerveux, un bénéfice pour les patients formulé au conditionnel.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative grave qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones au niveau du cortex et de la moelle épinière et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Le seul traitement utilisé en clinique, le Riluzole, ne permet de prolonger la survie que de 2 mois en moyenne. Les barrières entre le sang et le cerveau, hémato encéphalique et entre le sang et la moelle épinière, hémato médullaire sont des structures limitant le passage des molécules du sang vers le système nerveux central et représentent donc un challenge dans le traitement des maladies neurologiques et particulièrement de la sclérose latérale amyotrophique, qui ne trouve à ce jour pas de traitement satisfaisant. Il est aujourd’hui possible d’ouvrir cette barrière de manière transitoire et sans danger. Il a été montré que certaines cellules immunitaires dans des modèles murins de sclérose latérale amyotrophique permettaient de ralentir la progression de la maladie. L’objectif de notre étude sera de réaliser une approche combinée, avec une stimulation de ces cellules immunitaires associée à une ouverture transitoire des barrières hémato-médullaire et encéphalique, permettant d’augmenter leur infiltration dans le système nerveux central pour ralentir d’autant plus la progression de la maladie.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de chercher à ralentir la progression de la maladie, en induisant une immunomodulation locale par ouverture des barrières hémato-médullaire et encéphalique, et stimulation de certaines cellules immunitaires. A plus long terme, en cas d’efficacité, un passage en essai clinique chez l’homme est envisagé. Des méthodes existent déjà chez l’homme pour ouvrir la barrière hémato encéphalique et un dispositif d’ouverture adapté aux patients atteint de sclérose latérale amyotrophique pourrait voir le jour si l’étude préclinique s’avère positive.
Procédures
Les modèles murins de sclérose latérale amyotrophique et les souris non génétiquement modifiées commerciales seront soumis à plusieurs injections d’un traitement immunomodulateur (animal vigil, 23 injections sur 10 semaines, 1 minute), des prélèvements sanguins (animal vigil, 10 maximum sur 10 semaines, 1 minute), des mesures de force musculaire et ou d’endurance (animal vigil, 17 fois sur 17 semaines, 5 minutes), contrôle du poids (animal vigil, 1 fois par semaine pendant 17 semaines, 2 minutes). Une biopsie sera réalisée pour unne vérification du génotype des souris provenant de fournisseurs extérieurs (animal anesthésié/analgésie lors de la première anesthésie pour ultrasons, 1 seule fois, 30 secondes) Ouverture des barrières hémato-médullaire ou encéphalique (animal sous anesthésie générale et analgésie, pendant 1h, 1 fois toutes les 2 semaines pendant 7 semaines, 5 minutes pour la procédure d’ouverture). Mesures électromyographiques pour tester la fonctionnalité des neurones moteurs au stade symptomatique de la maladie sous anesthésie générale, avec une analgésie (procédure durant 8minutes).
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à plusieurs injections qui pourront engendrer une douleur légère, de courte durée. Dans de rares cas, les injections répétées pourront, par exemple, engendrer une péritonite ou une inflammation au niveau oculaire. Les tests de mesure de force pourront engendrer un léger stress. Les prélèvements sanguins pourront créer un hématome. Le phénotype des animaux pourra entrainer une faiblesse musculaire conduisant à une paralysie. L’exposition aux ultrasons requiert un rasage et pourra engendrer un léger stress aux animaux. Cependant, toute la procédure, rasage et exposition aux ultrasons, se fait sous anesthésie générale. L’anesthésie pourra engendrer une hypothermie et un risque de détresse cardio-respiratoire. Le phénotype des modèles murin de sclérose latérale amyotrophique (SLA) se traduit par une perte de poids, une perte de force musculaire et une paralysie progressive, au cours de la maladie. Les sites d’injection et de prélèvement peuvent s’infecter. La manipulation des animaux pourra induire un stress. Les biopsies réalisées chez les souris provenant de fournisseurs extérieurs (sous anesthésie générale, lors de la première anesthésie pour ultrasons) pourront induire une douleur légère et de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour permettre le prélèvement des différents tissus d’intérêt qui sont affectés par la maladie, notamment le tissus nerveux, les nerfs, les muscles et les cellules sanguines, pour des analyses histologiques ou transcriptomiques.
Remplacement
Ces modèles animaux sont actuellement les seuls qui permettent de reproduire la paralysie progressive chez l’adulte dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique et donc de modéliser la physiopathologie humaine. Ils sont aussi le seul modèle permettant d’étudier un effet sur la progression de la maladie, raisons pour lesquelles notre projet nécessite l’utilisation de modèle de souris à progression rapide et lente. Divers travaux ont déjà mis en œuvre des expériences utilisant des cultures cellulaires pour montrer l’intérêt des molécules que nous souhaitons tester. Dans le cadre de ce projet combinant l’administration d’un traitement anti-inflammatoire et l’ouverture transitoire des barrières hémato-médullaire et encéphalique, il n’est pas possible d’évaluer leurs effets sur la progression de la maladie et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central avec de telles cultures cellulaires. L’intérêt du projet est de mesurer un effet de l’entrée de ces cellules protectrices dans le système nerveux central, par rapport à l’effet de la périphérie, afin de pouvoir augmenter l’effet bénéfique. Nous avons donc besoin d’un modèle ayant un système nerveux central, un système vasculaire et un système nerveux périphérique, donc, un système animal. Nous utilisons la souris car, c’est dans cette espèce que le modèle de SLA est le plus représentatif de la progression de la maladie qui se développe chez les patients atteints de SLA.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 416 souris dans ce projet, la taille des effectifs a été établie de façon à obtenir un résultat statistiquement significatif et d’obtenir une conclusion scientifique à l’ensemble de nos travaux. Le nombre de souris par groupe sera déterminé par un calcul de puissance utilisant les mêmes aspects méthodologiques nous ayant permis d’obtenir des résultats significatifs pour nos travaux précédents.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Acclimatation minimale de 7 jours pour les animaux provenant des fournisseurs extérieurs. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères du même sexe (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et l’état des animaux est vérifié quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Des petites maisons en carton et des carrés de coton seront intégrés dans les cages pour permettre de faire des nids. Si la maladie des souris n’est pas synchrone d’une souris à l’autre, les souris ayant du mal à se déplacer (pour cause de paralysie engendrée par la maladie) seront séparées pour éviter que les souris plus vives ne les piétinent. Elles seront alors placées en hébergement individuel ou avec les autres souris paralysées (2 à 5 souris par cage sauf cas exceptionnel et peu probable où il n’y aurait qu’une souris dans cet état). Un mélange de poudre de nourriture et d'eau (bouillie) sera proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une déshydratation et une dénutrition. Une attention particulière sera portée aux yeux des souris qui seront fréquemment nettoyés (à l’eau stérile) en cas de suintement, pour éviter toute infection. De la solution antiseptique sera utilisée si les yeux paraissent trop souillés comme désinfectant. Proche du stade terminal, les souris seront surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours de la semaine (week-ends inclus). Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées et nous avons, pour chaque procédure, défini un point limite.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la sclérose latérale amyotrophique (SLA), souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre différents types cellulaires et la communication entre des cellules immunitaires infiltrant depuis la périphérie, dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons, mouches, vers ne sont pas de bons modèles pour répondre à nos questions. Nous utilisons aussi des cultures cellulaires mais, celles-ci ne peuvent pas permettre d’évaluer un effet sur la progression de la maladie dans un modèle intégré et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central. Nous avons donc besoin d’un modèle ayant un système nerveux central, un système vasculaire et un système nerveux périphérique, donc, un système animal. Nous avons une grande expérience des souris et le modèle est mieux établi chez la souris que chez le rat, c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. C’est dans l’espèce souris que le modèle de SLA est le plus représentatif de la progression de la maladie qui se développe chez les patients atteints de SLA. Les souris SLA seront utilisées à l’âge adulte entre 7 semaines et 24 semaines pour les modèles à progression rapide et entre 7 semaines et 52 semaines pour le modèle à progression lente. L’utilisation de modèles murins dans ce projet va donc permettre d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la maladie, et évaluer la possibilité d’un essai thérapeutique chez l’homme.
Etude du rôle et de la régulation de l’IL-33 chez la souris humanisée dans un contexte tumoral.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 040 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, dont le développement peut causer douleur et dégradation de l'état général, puis un prélèvement de sang. L'étude porte sur une souris dite humanisée, modifiée pour exprimer une protéine humaine, l'IL-33, à la place de la version murine. Elle vise à préciser le rôle de cette protéine dans la progression des tumeurs, les organes étant prélevés après la mise à mort.
Objectifs
L’IL-33 est une protéine qui alerte notre système immunitaire en cas de danger, notamment lorsque nos cellules sont agressées (infection, traumatismes, cancer). Elle est présente chez l’homme à l’état basal dans les vaisseaux sanguins ainsi que dans d’autres tissus mais elle peut être induite dans certaines situations pathologiques. Chez la souris, l’IL-33 n’est pas retrouvée dans les mêmes cellules que chez l’Homme, par exemple dans les vaisseaux sanguins. C’est pourquoi afin de mieux représenter la physiologie humaine nous utiliserons un nouveau modèle murin « humanisé » dans lequel la protéine IL-33 humaine est exprimée à la place de la protéine murine, avec une expression et une localisation qui miment celles connues chez l’Homme (souris hIL-33). L'objectif principal du projet est de mieux comprendre comment la protéine IL-33 humaine intervient dans la progression tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre d’une part, de préciser le rôle de l’IL-33 dans la réponse tumorale chez des souris humanisées qui miment le profil d’expression observé chez l’homme. D’autre part, de mettre en évidence une différence potentielle avec le rôle de l’IL-33 murine qui est pour l’instant utilisée comme modèle d’étude. Ce projet permettra donc à court terme d’améliorer nos connaissances sur le rôle de l’IL-33 humaine mais aussi à plus long terme de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques fondées sur la régulation de l’IL-33 humaine afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers.
Procédures
Chaque animal subira une injection de cellules tumorales sous anesthésie de 2 à 3 min, pour un temps d'injection d'environ 30 à 40 secondes. Les souris sous anesthésie générale subiront un prélèvement sanguin. Le prélèvement ne dépasse pas 2 min.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut induire du stress et une douleur au réveil au niveau du site d'injection. Le développement tumoral peut causer des douleurs et une dégradation de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…).
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements de tumeurs ou d’organes.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas à ce jour être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, ce projet nécessite de mener des expériences chez l’animal, car nous devons travailler dans des conditions intégrées permettant l’interaction de plusieurs systèmes cellulaires complexes dont le système immunitaire et le microenvironnement tumoral. De plus, l’IL-33 est présente uniquement chez les mammifères et ces études ne peuvent donc pas être conduites dans un organisme modèle autre. L’espèce animale choisie est la souris car notre étude nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques et les outils nécessaires à notre étude sont disponibles uniquement chez la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir d'études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 15 animaux maximums pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences significatives statistiquement. Le projet est conçu avec plusieurs étapes afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du projet en fonction des résultats obtenus. De plus une méthode de randomisation sera mise en place afin de diminuer les biais et de ce fait le nombre de souris à utiliser.
Raffinement
Les modèles tumoraux utilisés sont bien maitrisés. Afin de minimiser le stress de la souris, les pesées auront lieu sous anesthésie ou sur un système de pesée dynamique qui limite à quelques secondes le temps de manipulation de la souris. Les méthodes d’expérimentation et d’hébergement sont optimisées pour réduire au maximum le stress et la douleur causée par les procédures. Les injections ont été optimisées pour réduire au maximum le temps de contention et le stress des animaux. Enfin, les procédures font l’objet d’une réflexion continue sur de potentielles modifications pour réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle le plus couramment utilisé dans la littérature scientifique pour étudier la biologie de l’IL-33 et son implication dans le développement de tumeurs. De plus, l’IL-33 est présente uniquement chez les mammifères et ces études ne peuvent donc pas être conduites dans un organisme modèle autre. Pour toutes les procédures, des souris âgées de 6 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature nécessaire à la compréhension du rôle de l’IL-33.
Conséquences à long terme d’un stress de social défaite juvénile sur les réseaux neuronaux noradrénergiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposées dès 21 jours à une souris agressive trois minutes par jour pendant six jours, 1 947 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 803 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Certaines subissent ensuite une ou deux chirurgies cérébrales pour l'implantation de fibres optiques, ainsi que des prélèvements de sang. L'objectif est de comprendre pourquoi certains individus résistent au stress subi dans l'enfance, présenté comme un modèle de la maltraitance infantile. Le porteur annonce six paradigmes comportementaux mesurant l'anxiété et la cognition, sans préciser lesquels.
Objectifs
La dépression est une maladie fréquente et invalidante, souvent déclenchée par des expériences de vie difficiles, en particulier la maltraitance durant l’enfance. Pourtant, toutes les personnes exposées à un stress précoce ne développent pas de troubles : certaines parviennent à s’adapter et à éviter les effets délétères du stress précoce, un phénomène appelé résilience. Comprendre pourquoi certains individus sont résilients est essentiel pour développer de meilleures stratégies de prévention et de traitement. Ce projet vise à étudier les mécanismes biologiques qui favorisent la résilience face au stress vécu pendant l’enfance. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez la souris reproduisant une exposition précoce à un stress social. Les animaux seront ensuite évalués à l’adolescence et à l’âge adulte à l’aide de tests mesurant les comportements anxio-dépressifs et les capacités cognitives afin d’identifier des profils de résilience au stress. Nous analyserons ensuite les différences biologiques entre ces groupes afin de mieux comprendre comment le stress précoce influence le développement et le comportement à long terme. L’objectif final est d’identifier des facteurs de protection associés à la résilience, qui pourraient inspirer de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou limiter les conséquences durables du stress vécu durant l’enfance.
Bénéfices attendus
L’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de coût et d’efficacité. Ce projet a un intérêt majeur puisqu'il permettra d'améliorer la compréhension de la neurobiologie de la dépression et de la résilience afin de concevoir de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces pour ces patients.
Procédures
- Procédure de stress de défaite sociale juvénile (à partir de 21 jours): 3 minutes d’interaction physique quotidienne pendant 6 jours (616 souris) - Paradigmes comportementaux : les souris seront testées dans 6 paradigmes comportementaux cognitifs et anxio-depressif sur une période de 3 semaines (1150 souris). - Prélèvements sanguin : les souris auront 3 prélèvements de sang de 1 minutes chacun (100 µl chacun) sur une période de 3 heures (1150 souris). - 2 procédures chirurgicales: une première procédure sera réalisée (654 souris) qui pourra être suivie d’une deuxième procédure d'implantation de fibres optique (510 souris). Chaque procédure chirurgicale aura lieu sous anesthésie pour une durée de 1 ou 2 heures chacune.
Impact sur les animaux
Ces expériences induiront une perte de plaisire (anhédonie), un état d'anxiété et une indifférence générale (apathie). Lors de la procédure de stress juvénile de défaite sociale, les animaux sont mis en contact avec une souris agressives 3 minutes par jour pendant 6 jours. Des blessures ou lésions induites par les agressions physiques lors de cette procédure pourront être observées. Suite à la chirurgie on pourrait constater : - Un stress au réveil de l’anesthésie pendant quelques minutes - Une hypothermie du au réveil de l’animale - Une difficulté à se déplacer, se nourrir ou s’abreuver pendant les 2 premières heures suivant le réveil
Devenir
A l'issue des 4 procédures, les animaux seront mis à mort et les cerveaux utilisés pour des analyses d'histologie ou de biologie moléculaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet de recherche étant d’étudier l’émergence de troubles psychiatriques en réponse au stress, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre projet nécessite l’emploi de plusieurs techniques expérimentales. Compte tenu de la littérature et de notre expérience, nous utiliserons les tests statistiques pour analyser nos données. Ces tests nécessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativité en fonction des expériences réalisées (anatomie n=15 ; comportement n=25 ; Imagerie n=15 ; biochimie n=10). D’après notre expèrience, une grande variabilitée individuelle peut être observée lors des enregistrements en imagerie calcique en fonction de l'expression virale et du site d'implantation. Basé sur la littérature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté. C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles en considérant ici le sexe comme une variable d’analyse supplémentaire. Seuls les mâles aggressifs sélectionnés pourront être réutilisés.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton). Les souris isolées auront des enrichissements supplémentaires et seront hébergées dans des cages ouvertes, stabulées dans des armoires ventilées permettant d’avoir des stimulis auditifis et oflactifs des congénéres Pour limiter l’angoisse des animaux, ceux-ci seront habitués à l’expérimentateur, au dispositif et à la pièce d’expérimentation pour éviter un stress supplémentaire. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et des protocoles analgésiques seront mis en place pour limiter la douleur des animaux. Des points limites ont été établis pour chaque procédure afin de permettre l'arret prématuré des procédures. Nous incluons ici une procédure pilote sur un petit nombre d’animaux, pouvant donner lieu à un arrêt total des expériences. Cette phase du projet combinant le stress et deux chirurgies sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux conditions sans les chirurgies.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude de la fonction des circuits cérébraux dans le cerveau des mammifères : i) l’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine ; ii) L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau de la souris sont bien caractérisées ; iii) Il existe une vaste littérature sur le comportement de la souris, l'apprentissage et la mémoire. Par ailleurs, il est possible d'utiliser des souris génétiquement modifiées. L’objectif du projet étant d’étudier les conséquences comportementales et neurobiologiques du stress précoce tel que la maltraitance infantile, le stress juvénile d’agression sociale sera réalisé entre P21 et P26. Les tests comportementaux et analyses neurobiologiques seront réalisés au cours du développement : à l’adolescence (P27), l’âge adulte (P70) et au cours du vieillissement (P120).
Impact de la pollution sur l’immunité et caractérisation des mécanismes impliqués
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à vingt-cinq injections, vingt-cinq gavages et quinze instillations dans le nez par animal: 500 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le protocole comprend aussi des prélèvements de sang et d'urine, l'objectif étant d'étudier l'effet de la pollution respiratoire sur le système immunitaire. Le porteur reconnaît que ces contentions et actes répétés sont source de stress, d'angoisse, voire de douleur. Le choix de la souris repose sur sa proximité physiologique déclarée avec l'humain.
Objectifs
Notre projet vise à améliorer la compréhension d'impact de la pollution sur le système immunitaire et les mécanimes impliqués, dans un modèle de souris exposées à la pollution par voie nasale.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques responsables de l’initiation et de la progression des maladies auto-immunes, c'est à dire les maladies dans lesquelles le système immunitaire s'attaque à notre propre organisme. Ces connaissances fondamentales pourraient ouvrir la voie au développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées et personnalisées, visant à limiter l’impact de la pollution atmosphérique sur le système immunitaire.
Procédures
15 à 25 injections sur animaux vigiles d’une durée approximative de 30 secondes par injection ; 25 gavages sur animaux vigiles (1 seul groupe), d’une durée approximative de 30 secondes; 15 instillations intranasales (30 secondes) ; 2 prélèvements sanguins sur animaux vigiles, d’une durée approximative de 30 secondes par prélèvement ; 5 prélèvements d’urine, obtenus à partir de mictions spontanées lors d’une contention manuelle, d’une durée d’environ 20 secondes par prélèvement. Lorsque des prélèvements sanguins et urinaires seront réalisés le même jour, ils seront effectués de manière concomitante afin de limiter la manipulation des animaux. 1 prélèvement sanguin terminal, réalisé après euthanasie, d’une durée approximative de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les manipulations peuvent être source de stress, d'angoisse, voire de douleurs pour les souris, en raison des multiples contentions ( 30 sec à 1 min par contentions) auxquelles s'ajoutent les actions d'injections (30 sec par injection), de prélèvements d'urine et de sang (30 sec par prélèvements de sang et urine) et les instillations intra-nasales (30 sec par acte).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse de tissus et de sang/urine
Remplacement
Le modèle de souirs permet une étude sur l'être vivant et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. La souris est adaptée à notre étude car sa proximité avec l’être humain se traduit par la présence chez cette espèce d’homologies physiologiques très étroites avec notre espèce, notamment en ce qui concerne le système immunitaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables et robustes. Le nombre d’animaux a également été fixé qu'à partir des données de la littérature et de notre expérience.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Les animaux feront l’objet d’une surveillance 3 fois par semaine (comportement, apparence générale, signes cliniques) par les personnes en charge de l’expérimentation. Toute apparition de signes de douleur ou de souffrance, tels que la prostration, le dos voûté, l’isolement ou le poil hérissé, entraînera l’ouverture d’une fiche de score comportant des points limites clairement définis, pouvant conduire, le cas échéant, à l’euthanasie de l’animal. Une attention particulière sera portée au site d’injection abdominale (recherche de rougeur ou de signes inflammatoires) ainsi qu’au suivi du poids.
Choix des espèces
Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. Les souris seront âgées de 12 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).
Maturation In Vivo des anticorps par édition génétique des lymphocytes B et implémentation d’un gène suicide dans des souris immunodéprimées MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des 672 souris de ce projet est totalement dépourvue de système immunitaire, pour accueillir des cellules humaines sans rejet. Elles vont toutes être tuées à l'issue, dont 504 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le protocole combine injections de cellules, immunisations répétées sur douze semaines, une irradiation corporelle totale et, en cas de réaction du greffon, un gavage quotidien. Ces travaux visent à améliorer une thérapie par lymphocytes B modifiés, les organes étant prélevés après la mise à mort.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de développer des thérapies utilisant des cellules immunitaires. Cela consiste à modifier les cellules immunitaires, appelées lymphocytes T, provenant d'un patient, pour les reprogrammer afin qu'elles reconnaissent spécifiquement un marqueur à la surface de cellules cibles, telles que les cellules cancéreuses. Ces lymphocytes T modifiés sont ensuite réinjectés au patient et, grâce à leur affinité accrue pour, par exemple, une protéine présente sur les cellules cancéreuses, ils vont pouvoir les détruire. Ce type de thérapie a déjà fait ses preuves dans le traitement de cancers comme les leucémies et les mélanomes. Le but est de développer ces stratégies pour d'autres cellules immunitaires, en particulier les lymphocytes B. Ces cellules produisent des anticorps et sont également responsables de la mémoire immunitaire, ce qui permet une réponse plus rapide et efficace lors d’une seconde infection. Modifier ces cellules présente un intérêt, car les lymphocytes B mémoires pourraient exercer une action durable même après une seule administration de cellules modifiées. Actuellement, nous modifions déjà l’ADN des lymphocytes B en utilisant un outil qui agit comme des ciseaux pour altérer l’ADN. Les cellules sont modifiées afin d’exprimer des anticorps spécifiques (anticorps à chaîne unique) capables de reconnaître une cible que nous choisissons. L’objectif de ce projet est de démontrer l’efficacité de ces thérapies dans un organisme vivant complexe, ainsi que d'améliorer la modification des cellules pour les rendre plus efficaces et plus sûres en tant que traitement. Pour cela, nous testerons des cellules, afin que, dans le cas où elles auraient des effets secondaires, elles puissent être éliminées.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient nous permettre d'obtenir un anticorps mutant avec une affinité améliorée, qui pourra être utilisé dans la suite de nos projets pour le développement de thérapies cellulaires à partir de lymphocytes B. D’autres cellules immunitaires pourraient également être utilisées. La fonctionnalité du gène suicide devrait également être démontrée. Finalement, nous allons évaluer la production et l'efficacité de notre anticorps contre des cellules cancéreuses.
Procédures
MODIFICATION Selon l'expérimentation, les différents lots de souris recevront des traitements spécifiques. Une injection unique de cellules (codant pour un anticorps, tumorales ou primaires humaines) sera réalisée par animal pendant environ une minute. Pour l'induction immunitaire, les souris recevront un antigène par voie intrapéritonéale une fois par semaine pendant 12 semaines (6 injections au total), chaque procédure durant quelques secondes. Le suivi du développement tumoral et les traitements médicamenteux seront effectués de manière hebdomadaire par injection et manipulation pendant 5 minutes, sur une période maximale de 20 semaines. L'état de santé général des animaux sera évalué par des prélèvements sanguins bimensuels durant moins d'une minute. Certains groupes subiront également une séance d'irradiation unique de 30 minutes maximum, avec un apport supplémentaire d'oxygène pour réduire le stress. Enfin, en cas de développement d'une GvH, les animaux recevront un traitement quotidien pendant une minute sur une période de 7 jours (pouvant être prolongée jusqu'à 9 jours). Ce traitement sera administré par voie orale (gavage ou eau de boisson) ou par injection.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances et d’effets indésirables sont attendus après l’injection de cellules. Une légère sensation d’inconfort pourra être ressentie en raison des lésions causées par les piqûres. Le développement tumoral peut entraîner un affaiblissement de l’animal. Les autres nuisances attendues proviendront de l’irradiation corporelle totale, qui provoque une immunodépression complèt, qui peut entraîner un affaiblissement notable de l'animal. L’immunisation répétée pourra provoquer une réaction immunitaire et un stress supplémentaire. Les injections répétées, qu'elles soient sous-cutanées ou intrapéritonéales, peuvent entraîner douleur et inconfort localisés, ainsi que de l'inflammation ou une irritation au site d'injection. Il est essentiel de minimiser ces effets en variant les sites d’injection et en respectant les bonnes pratiques d’administration. Les injections seront réduites au minimum lorsque cela sera possible, et des antalgiques seront administrés en cas de signes de douleur. Des prélèvements sanguins répétés, peuvent causer des gênes supplémentaires chez les animaux, principalement sous forme d'inconfort au site de prélèvement et de stress lié à la manipulation fréquente. Le risque de formation d'hématomes ou d'inflammation locale existe, notamment lorsque les prélèvements sont effectués sur des sites souvent sollicités. MODIFICATION Le gavage répeté peut induire des lésions œsophagiennes et du stress. L’isolement social peut générer de l'anxiété, mais permet une auto-administration sans douleur.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt qui seront rigoureusement exploités et analysés afin de recueillir un maximum d'informations.
Remplacement
De nombreuses études in vitro ont validé la fonctionnalité de notre anticorps ainsi que l'édition des lymphocytes B pour qu'ils expriment cet anticorps. Cependant, le système de mutation intra-cellulaire, qui améliore les anticorps dans les cellules et permet la sélection des clones in vivo, est un mécanisme très complexe dont l'efficacité ne peut être reproduite in vitro. L'efficacité du gène d'autodestruction a également été démontrée in vitro, mais doit être confirmée dans un organisme vivant complexe. Étant donné que ce projet vise à développer une thérapie, l'efficacité finale de la stratégie ne peut être évaluée que dans un organisme entier. En raison de ces contraintes, il n'est actuellement pas possible de remplacer complètement les études in vivo par des modèles in vitro. Toutefois, nous avons maximisé l'utilisation des modèles cellulaires et des approches in vitro afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés. Les études in vivo restent essentielles pour valider les résultats et évaluer les effets dans un contexte biologique complet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été conçues de manière à utiliser le moins de souris possible tout en collectant le maximum d’informations. Pour ce faire, plusieurs organes (moelle osseuse, ganglions, rate et sang) seront prélevés et analysés sur un même animal, permettant ainsi de réaliser diverses analyses sans augmenter le nombre de souris. De plus, nous allons tester simultanément l’induction du gène d'autodestruction et l’efficacité de notre anticorp, ce qui permettra de réduire le nombre de lots nécessaires pour ces expériences. Cette approche combinée nous permettra d'obtenir des données robustes tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Des analyses statistiques ont été employées pour définir la taille des lots, afin de garantir que le nombre d'animaux utilisés soit le plus petit possible tout en assurant la fiabilité et la significativité des résultats obtenus. Cela nous permet d'optimiser le design expérimental et de réduire l'utilisation d'animaux au strict minimum nécessaire.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions optimales : locaux confinés, portoirs ventilés, environnement contrôlé (température, humidité, pression) avec alternance jour/nuit de 12 heures, accès à la nourriture ad libitum et à l'eau, et un maximum de 5 animaux par cage (aucun animal seul). Les cages sont changées une fois par semaine. Pour réduire le stress, les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental (coton, "maisons" en carton, boîtes à œufs). Les animaux recevront une anesthésie et/ou analgésie adaptée à chaque procédure. Des points limites sont établis pour détecter rapidement les signes de souffrance. Une évaluation régulière du score de grimace, du poids et du comportement permet un contrôle continu de leur état de santé. Les techniques d'imagerie in vivo non invasives (bioluminescence) permettront une détection précoce sans douleur d'un éventuel envahissement tumoral.
Choix des espèces
Pour la première partie du projet, qui consiste à améliorer l'affinité de nos anticorps, nous souhaitons utiliser un modèle de souris déjà publié. Ce modèle utilise des souris avec un système immunitaire complet, incluant toutes les niches cellulaires nécessaires pour accueillir les cellules modifiées ainsi que tous les mécanismes fonctionnels pour l'amélioration des anticorps. Les souris immunodéprimées, choisies pour la suite du projet, sont totalement dépourvues de la plupart de leurs cellules immunitaires. L'utilisation de souris sans système immunitaire permet d'éviter le rejet de la greffe réalisée avec des cellules humaines, qui seraient autrement reconnues comme étrangères par le système immunitaire de la souris. Ces souris permettent la croissance de nombreuses cellules humaines et l'utilisation d'effecteurs d'origine humaine. L'emploi de cellules humaines chez ces souris nous permet de développer et tester une thérapie qui pourra être facilement transposée à l'homme, puisque les techniques de traitement et d'édition seront identiques. Cela nous permet également de valider leur fonctionnalité une fois greffées dans un hôte. Bien que l'utilisation de ces animaux immunodéprimés expose à un risque accru d'infections, ce risque sera maîtrisé par des précautions sanitaires adaptées, notamment en les hébergeant dans un environnement protégé. Ce phénotype défavorable ne s'exprimera donc pas dans les conditions appliquées à ce projet. Les souris utilisées dans ces études auront entre 7 et 9 semaines, conformément à la majorité des travaux scientifiques, afin d'obtenir des résultats comparables. De plus, à cet âge, les souris ont un système immunitaire complètement développé.
Comment le métabolisme et le système immunitaire interagissent dans les maladies inflammatoires : vers de nouvelles pistes de traitement.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
8 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le protocole impose des régimes alimentaires particuliers ou des traitements pendant quatorze semaines, avec injections, gavages et prélèvements de sang répétés, pour étudier le lien entre métabolisme et inflammation. Une partie porte une inflammation chronique qui réduit leur survie à environ six mois, avec troubles cardiaques et respiratoires. Le porteur affirme que les cultures de cellules ne permettent pas d'étudier la communication entre organes, ce qui justifie selon lui le modèle animal.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre le lien entre les problèmes de métabolisme et l’inflammation dans certaines maladies comme les maladies auto-immunes. Pour cela, nous utiliserons des souris qui ont des troubles similaires à ceux observés chez certaines personnes malades. Nous avons déjà pu observer que ces souris produisent des lipides qui accentuent l’inflammation provoquée par la maladie . Nous voulons maintenant savoir si agir sur l’inflammation et le métabolisme en même temps pourrait aider à mieux traiter ces maladies.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait aider à mieux comprendre certaines maladies inflammatoires de type maladie auto-immunes et à trouver de nouvelles façons de les traiter en agissant à la fois sur les défenses naturelles du corps et sur son métabolisme.
Procédures
Certains animaux recevront des régimes alimentaires spécifiques supplémentés en certains acides gras ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront testés pour voir comment leur corps réagit au sucre (glucose) ou à l’insuline, et comment leur foie régule le taux de sucre dans le sang. Ces tests seront espacés d’au moins 14 jours. Pour cela, il faudra prélever environ 7 petites gouttes de sang sur une période de 2 heures. Ces tests seront réalisés sur des animaux vigiles mais manipulés avec précaution. -Injection 1 fois/2 semaines (x3) ; Prélèvement goutte sang 6 fois/2 semaines (x3) D’autres animaux recevront ces mêmes régimes alimentaires spécifiques ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront prélevés au niveau sanguin toutes les 4 semaines pour suivre des marqueurs sanguins inflammatoires. -Administration traitement 2 fois/semaine (x14) ; Prélèvement sang 1 fois/4 semaines (x4) ; Prise de température environ 1min/2 semaines (x7) Des animaux modèles de maladies inflammatoires chroniques recevront des traitements pharmacologiques pendant 3 semaines via une administration par voie aériennes. Des animaux, dont on aura induit l’inflammation seront traités par voie aérienne ou par injection. -Injection 1 fois ; Administration traitement voie aérienne 40 secondes/jour (x21) Ou 30 secondes/jour (x21)
Impact sur les animaux
Dans ce projet, certains animaux utilisés présentent une inflammation chronique importante, ce qui réduit fortement leur espérance de vie, avec une survie moyenne d’environ 6 mois. Ces animaux peuvent développer des problèmes cardiaques, respirer difficilement ou avoir une peau pâle au niveau des oreilles et des pattes, signes d’un cœur fatigué. D’autres animaux peuvent aussi montrer une faiblesse du système immunitaire, des inflammations des poumons et un poids plus faible que les animaux sains. À noter que certains animaux porteurs d’une seule copie du gène concerné ne développent aucun signe de maladie et vivent normalement.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement des organes d’intérêt (foie, cœur, poumons...)
Remplacement
Ce projet a besoin d'utiliser des modèles animaux, car les méthodes alternatives comme les tests en laboratoire sur des cellules ne permettent pas d’étudier comment les organes communiquent entre eux, ni comment un changement d’alimentation peut influencer tout le corps, notamment le métabolisme et les réactions inflammatoires.
Réduction
Nous adapterons le nombre d’animaux utilisés en fonction des besoins réels de l’étude. Tous les animaux nés seront inclus dans les expériences. Des groupes de référence seront utilisés pour chaque groupe étudié. Par ailleurs, nos expériences précédentes et une analyse préalable nous indiquent qu’un groupe de 10 animaux est suffisant pour obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique.
Raffinement
Des signes d’alerte spécifiques ont été définis pour repérer rapidement tout problème lié à leur état de santé. Si un animal montre l’un de ces signes, il sera immédiatement pris en charge et euthanasié si nécessaire. Leurs besoins sociaux et biologiques sont bien connus, ce qui permet de réduire au maximum toute douleur ou souffrance. Les animaux vivront par petits groupes de cinq, dans des cages enrichies avec une maisonnette et du coton pour leur confort. Lors des expériences, un anti-douleur sera appliqué sur leur queue pour limiter toute gêne.
Choix des espèces
Les souris adultes ( à partir de 6 semaines) sont les animaux les plus utilisés pour étudier le fonctionnement du système immunitaire et du métabolisme, notamment pour comprendre comment certains régimes alimentaires influencent ces mécanismes. Grâce à de nombreux modèles génétiquement modifiés disponibles, nous pouvons obtenir des résultats fiables et les comparer facilement avec ceux d'autres études.
Impact d’une exposition directe ou intergénérationnelle à des composés per et poly-fluoroalkylées (PFAS) sur le système hormonal thyroïdien et le système immunitaire de la truite arc en ciel
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
4 248 truites arc-en-ciel sont exposées à des polluants PFAS puis, pour une partie, infectées par deux virus, dans des procédures dont 2 400 classées en souffrance sévère. L'exposition couvre deux générations et tous les stades de vie, de l'œuf à l'adulte reproducteur. Le porteur annonce peu d'effets indésirables visibles, tout en décrivant pour les épreuves infectieuses une nage erratique, une perte d'équilibre, une exophtalmie et une mortalité dès cinq à sept jours. Tous les poissons sont mis à mort en fin de projet, au nom de la biosécurité.
Objectifs
Au cours des vingt dernières années, les scientifiques et les pouvoirs publics se sont intéressés de plus en plus aux perturbateurs endocriniens (PE), notamment en raison de leur utilisation de plus en plus importante et des preuves croissantes de leurs effets nocifs sur l'homme et l'environnement. Récemment, la perturbation du système des hormones thyroïdiennes par les PE a suscité plus d'attention en raison de son impact sur de nombreux systèmes physiologiques clés dont le développement du système immunitaire. Parmi les PE, les substances per et poly-fluoroalkylées (PFAS) sont ubiquistes et persistantes dans l’environnement comme dans les organismes entrainant de nombreuses perturbations biologiques. Dans ce projet, une première étape de screening sera réalisée pour évaluer la toxicité et les pouvoirs PE de plusieurs PFAS à différentes concentrations d’exposition sur plusieurs modèles biologiques (xenope, poisson zèbre et truite arc-en ciel (TAC)). Puis, la relation entre le système thyroidien, l'immunité, le développement et la reproduction sera étudiée chez 2 générations de TAC exposées soit directement, soit via leurs parents à une sélection de deux PFAS d’intérêt. L'approche méthodologique utilisera différents stades de vie (embryons, larves, juvéniles et adultes matures), à travers des expositions chroniques intergénérationnelles et des analyses effectuées au niveau moléculaire, cellulaire/tissulaire, morphologique, physiologique, comportemental, résistance aux pathogènes et populationnel
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir des connaissances sur les liens entre le système hormonal thyroïdien et la santé globale des poissons après exposition aux PFAS. Le potentiel de succès de ce projet repose sur les approches ambitieuses et innovantes sélectionnées, qui sont (1) une comparaison entre les différents PFAS, modèles et environnementaux (PFOS, PFOA, PFHxS, PFBA, TFA) pour mettre en évidence l'impact potentiel de ces substances à des concentrations proches de celles auxquelles les poissons sont exposés dans leur environnement ; (2) la réalisation de co-expositions (chimiques et pathogènes), pour créer une approche réaliste des conditions de l'environnement naturel ; (3) l'évaluation des effets directs et indirects des expositions intergénérationnelles, pour mettre en évidence les impacts parentaux ; (4) une intégration des différentes étapes de vie, afin de mieux comprendre les fenêtres de sensibilité ; (5) l'utilisation de multiples biomarqueurs classiques (morphologiques, physiologiques et comportementaux) et omiques pour décrire la relation entre différents niveaux d'organisation biologique.
Procédures
Prélèvements de sang (moins de 10% du volume total disponible, d'une durée de moins de 30 secondes) sur animaux vigiles au cours de l''exposition aux PFAS. Prélèvements de sang et d'organes cibles (rate, rein, foie, branchies, thymus) sur animaux mis à mort à la fin des temps d'exposition chimique ou après l'infection virale.
Impact sur les animaux
1) Induction possible d’un léger stress des animaux du fait des conditions expérimentales. 2) Peu d’effets indésirables visibles attendus sur les animaux qui seront exposés à des concentrations sub-létales de PFAS. 3) Comportements et symptômes caractéristiques de l’infection virale au virus de la nécrose hématopoietique infectieuse (NHI) et au virus de la nécrose pancréatique infectieuse (NPI) lors des épreuves infectieuses (assombrissement de la couleur de la peau, nage erratique, perte d’équilibre, exophtalmie...), avec une mortalité débutant en moyenne à 5-7 jours post-infection.
Devenir
Pour des raisons de biosécurité, tous les poissons ayant intégré la plateforme expérimentale seront mis à mort à la fin du projet.
Remplacement
L’étude du système hormonal nécessite la mise en place de systèmes biologiques représentatifs de la complexité du fonctionnement d’un organisme. Ceci est encore plus vrai dans le cas de l’étude d’interactions possibles entre différents systèmes biologiques, ici le système hormonal thyroidien et le système immunitaire. Cela ne peut pas être substitué, notamment pour l’étude des effets sur différents systèmes et des interactions entre ceux-ci, par des méthodes alternatives (tests in vitro ou embryo larvaires).
Réduction
Le nombre de poissons et de bassins par condition a été réduit à son minimum en intégrant les temps et nombre de prélèvements prévus, la variabilité inter-bassins fréquemment observée, les mortalités pouvant survenir sur les stades plus précoces et plus sensibles et de façon à assurer une robustesse statistique des résultats. Le nombre maximum de poissons a été estimé à 4248.
Raffinement
Les mesures de raffinement viseront à: - Assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux afin de s’assurer de leur bien-être i.e une biomasse (nombre d’animaux par bassin) contrôlée permettant l'expression des comportements alimentaires et natatoires attendus de l'espèce étudiée, un volume d'eau adapté et renouvelé en continu, une saturation en oxygène suffisante, un rythme jour/nuit naturel, et une alimentation adaptée à leur stade de développement et la biomasse. - Evaluer quotidiennement l’état de santé général des poissons et leur comportement natatoire et alimentaire, en suivant une grille de points limites adaptée. - Mettre à mort de façon compassionnelle des animaux dont les points limites sont atteints e.g comportement de nage anormal et/ou aspects physiques déterioré, etc...
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce idéale : (1) elle est d'un grand intérêt économique et représente un modèle environnemental pertinent proche des espèces endémiques (c.à.d, Salmo trutta fario) des eaux européennes, (2) les caractéristiques spécifiques de cette espèce, notamment la présence d'unités fonctionnel de la glande thyroidenne dans le rein, en font un organisme très intéressant pour les études fonctionnelles, 3) c'est une espèce facile à élever en laboratoire, avec un cycle de développement plus long que le poisson-zèbre, ce qui permet des expositions chroniques aux stades embryonnaires, larvaires et juvéniles et (4) son génome, entièrement séquencé, est disponible, facilitant ainsi les analyses génétiques. Les animaux sont utilisés à différents stades de développement, depuis l’œuf, larves, alevins, juvéniles jusqu’à l’adulte reproducteur pour couvrir tout le cycle de vie.
Rôle des lymphocytes T non conventionnels dans le diabète de type 1 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
3 080 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections et neuf gavages, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent des prélèvements de sang, une incision de la queue et, pour certaines, une infection virale destinée à déclencher un diabète de type 1. L'étude cherche à comprendre le rôle de cellules immunitaires et l'effet d'un régime enrichi en fibres et acides gras sur la maladie. Le porteur affirme que ce projet est associé à des travaux visant à réduire le recours à l'expérimentation animale, sans le détailler.
Objectifs
Le diabète de type 1 est une maladie dans laquelle les cellules du pancréas, qui produisent de l’insuline, sont détruites par le système immunitaire. Sans insuline, le corps ne peut plus réguler correctement la glycémie (concentration du sucre dans le sang). L’objectif du projet est d’identifier des facteurs responsables de cette destruction et d’étudier les anomalies observées sur les cellules immunitaires. En effet, des facteurs environnementaux comme une infection virale et le changement de microbiote intestinal influencent le système immunitaire et favorisent la maladie. De plus, certaines études montrent les effets bénéfiques de certains régimes alimentaires. C’est pourquoi, le projet portera aussi sur l’impact d’une modification de l’alimentation, notamment dans la diminution du risque ou la sévérité de la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre les mécanismes d'action des cellules immunitaires qui participent à l'apparition du diabète de type 1 chez la souris et plus généralement aux complications causées par une infection virale ou par un microbiote modifié. Enfin l’impact d’un régime enrichi en fibres et en acides gras sera évalué sur le développement du diabète. Comprendre l’action de ces cellules immunitaires dans différents contextes permettra d’envisager de nouveaux traitements thérapeutiques contre le diabète de type 1.
Procédures
Les animaux peuvent recevoir entre 0 et 12 injections (durée 10 secondes par injection). Les animaux peuvent recevoir entre 0 et 9 gavages (durée 1 minute par gavage). Les animaux peuvent être anesthésiés 1 fois pour un prélèvement sanguin (30 secondes). Certains animaux auront une petite incision à la queue pour une micro-goutte de sang (durée 5 secondes)
Impact sur les animaux
Les souris utilisées peuvent développer une hyperglycémie. Le prélèvement d'urine peut induire un stress de courte durée. Les injections et les gavages peuvent générer un stress modéré et de courte durée. La petite incision de l'extrémité de la queue peut induire une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent générer un stress modéré de courte durée. L'infection virale peut induire un état fébrile modéré et transitoire. Les différents traitements peuvent induire une perte de poids légère.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour les analyses des tissus.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable car les cellules immunitaires étudiées sont localisées essentiellement dans les muqueuses et le pancréas. Néanmoins ce projet est associé à des études visant à remplacer le maximum d'expérimentation animale possible.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour valider les données est calculé sur la base d'un plan expérimental élaboré et maîtrisé permettant d'obtenir une puissance statistique nécessaire à l'obtention de conclusions biologiquement pertinentes. La stratégie mise en place vise à obtenir le maximum de résultats significatifs en utilisant différents tests statistiques pour assurer la pertinence des résultats de manière à utiliser le moins d’animaux possibles. En amont des expériences, des analyses en laboratoire sur cellules seront effectuées afin d’optimiser la sélection des échantillons de microbiote à tester ultérieurement chez l’animal.
Raffinement
Le bien-être des animaux est surveillé par le personnel compétent ainsi que les responsables du projet. De l’enrichissement est ajouté dans leurs cages de façon systématique et les animaux sont regroupés en groupes sociaux. Les gestes techniques sont maîtrisés par les porteurs de projet ce qui limite le stress et l’inconfort des animaux. Toute souris diagnostiquée prédiabétique a une attention plus poussée. Une échelle avec les points limites adaptés est mise en place pendant les manipulations expérimentales. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge selon le score de points limites.
Choix des espèces
Le modèle de souris est adapté à l’étude immunitaire de cette pathologie : - Il permet d’avoir accès à de multiples modèles génétiquement modifiés pour permettre d’isoler des paramètres biologiques importants dans le développement de la pathologie. -Le système immunitaire de la souris est très proche de celui de l’Homme, ce qui est important pour l’étude d’une pathologie auto-immune et également facile à étudier par diverses techniques cellulaires ou biochimiques. Les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines d’âge (jeunes adultes), stade duquel sont observées les premières anomalies du système immunitaire chez la souris.
Le rôle de la thrombine, acteur clé de la coagulation, dans le développement des anévrismes dans les vaisseaux du cerveau 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumises à trois interventions chirurgicales pour provoquer des anévrismes cérébraux et implanter une pompe, 768 souris vont toutes être tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. À ces opérations s'ajoutent des prélèvements sanguins par voie rétro-orbitaire et des séances d'IRM sous anesthésie, l'objectif étant de tester si des anticoagulants déjà utilisés chez l'humain freinent la rupture. Le porteur indique qu'environ une souris sur dix ne survit pas à chacune des deux premières chirurgies. Les bénéfices annoncés pour les patients restent au conditionnel, tandis que les cerveaux sont prélevés après la mise à mort.
Objectifs
Un anévrisme intracrânien, c’est comme une petite « bulle fragile » qui se forme dans un vaisseau sanguin du cerveau. Cela concerne environ 1 personne sur 25, surtout les femmes. Tant que cette bulle ne se rompt pas, elle passe inaperçue, mais si elle éclate, cela provoque une hémorragie cérébrale très grave, souvent fatale ou entraînant des séquelles irréversibles. Aujourd’hui, le seul moyen de traiter ces anévrismes est une intervention chirurgicale délicate, qui vise à isoler la zone fragilisée du reste de la circulation. Il n’existe donc pas encore de traitement médicamenteux capable de prévenir leur rupture. Nos recherches, qui se déroulent dans 2 établissement de recherche, s’intéressent à un processus central du sang : la coagulation. Normalement, ce mécanisme permet de réparer un vaisseau abîmé en formant un caillot. Mais dans les anévrismes, ce processus pourrait au contraire fragiliser la paroi et favoriser leur rupture. Nous étudions plus particulièrement une molécule clé appelée thrombine, qui déclenche la coagulation, et son « frein naturel », qui limite son action. Grâce à des modèles expérimentaux innovants en laboratoire, nous cherchons à comprendre si ce duo joue un rôle dans la rupture des anévrismes. À terme, nous espérons découvrir de nouvelles pistes pour prévenir leur rupture et protéger les patients à risque.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à trouver de nouveaux traitements contre l’anévrisme du cerveau, une maladie qui peut avoir des conséquences dramatiques, parfois mortelles. Aujourd’hui, la seule option est une opération chirurgicale lourde, qui comporte des risques importants comme des séquelles neurologiques, des hémorragies ou même le coma. Nous explorons la piste de médicaments déjà utilisés chez l’être humain pour fluidifier le sang ou limiter l’activation des plaquettes en travaillant sur le rôle du sang et des molécules qui le composent dans cette maladie. Si ces approches se révèlent efficaces dans nos modèles expérimentaux, elles pourraient être adaptées rapidement aux patients atteints d’anévrisme. À long terme, l’objectif est d’offrir de nouvelles alternatives médicamenteuses, afin de mieux protéger les patients et de réduire le recours à la chirurgie.
Procédures
À l’exception de la mesure de la pression artérielle , l’ensemble des gestes techniques est réalisé chez des souris anesthésiées par anesthésie gazeuse afin d’éviter toute douleur. Tous les animaux inclus dans ce projet suivent une procédure expérimentale visant à induire la formation d’anévrismes cérébraux, correspondant à une dilatation anormale de certains vaisseaux sanguins du cerveau. Cette procédure repose sur deux interventions chirurgicales (d’une durée approximative de 40 minutes puis 50 minutes) destinées à modifier la circulation sanguine et la pression dans les vaisseaux. Lors de ces chirurgies, les animaux reçoivent systématiquement un traitement antidouleur adapté. Une troisième intervention chirurgicale est réalisée afin d’implanter une pompe sous la peau, permettant l’administration continue d’un traitement pendant plusieurs semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume sont réalisés chez les animaux anesthésiés par voie rétro-orbitaire (au niveau de l’œil), à trois temps distincts au cours du projet, afin d’étudier l’évolution des paramètres sanguins. Chaque prélèvement dure environ une minute. La pression artérielle est mesurée chez les animaux éveillés, à des temps définis au cours de la procédure, lors de séances d’environ 30 minutes. Afin de limiter le stress, les souris sont habituées à la manipulation avant les mesures. Le bon déroulement des chirurgies et l’évolution de la maladie sont suivis grâce à des examens d’imagerie par résonance magnétique (IRM) réalisés chez des animaux anesthésiés. Deux séances d’IRM, espacées de 7 jours, sont effectuées, chacune d’une durée d’environ 30 minutes. Enfin, certains animaux reçoivent un traitement administré par l’alimentation, intégré directement dans les croquettes, afin d’évaluer son effet sur l’évolution de la pathologie. L'ensemble des interventions décrites dans ce projet auront lieu dans le laboratoire de rattachement à l'exception des séances d'IRM qui auront lieu sur le site de la plateforme technique d'imagerie située à 5 minutes à pieds du laboratoire de où les recherches se dérouleront.
Impact sur les animaux
Lors des interventions chirurgicales, certaines souris peuvent malheureusement ne pas survivre : environ 1 sur 10 après la première chirurgie, et une proportion similaire après la deuxième. Les souris qui restent en vie peuvent présenter des effets temporaires, généralement légers à modérés : - Douleur ou gêne pendant environ 1 jour après l’opération - Perte de poids temporaire - Difficultés de déplacement liées aux interventions ou à des troubles neurologiques - Stress lors des mesures de tension artérielle, qui nécessitent une manipulation - Irritation ou inflammation locale au niveau des sutures chirurgicales - Atteinte oculaire rare suite aux prélèvements sanguins rétro-orbitaux En cas de rupture d’anévrisme, des troubles plus sérieux peuvent apparaître, comme une perte de poids importante ou des difficultés motrices. Dans toutes ces situations, l’expérience est immédiatement arrêtée pour l’animal, afin de prévenir toute souffrance inutile.
Devenir
À la fin de l’expérience ou si l'anévrymse se rompt, les souris sont euthanasiées, afin d'étudier leur cerveau.
Remplacement
Pour comprendre comment les anévrismes du cerveau apparaissent et évoluent, nous devons utiliser des souris. C’est le seul moyen, car seul un organisme vivant complet peut vraiment développer cette maladie, un peu comme chez les humains. C 'est en observant ce qui se passe dans leurs vaisseaux sanguins — par exemple l’inflammation, les changements de la paroi des vaisseaux ou la façon dont le sang circule — que nous pouvons mieux comprendre comment l’anévrisme se développe et devient dangereux.
Réduction
Pour notre expérience, nous avons besoin d’un certain nombre de souris pour être sûrs que nos résultats soient fiables. Ce nombre a été calculé grace à des test statistiques. Nous allons utiliser plusieurs types de souris, certaines modifiées génétiquement nous permettant de comprendre el rôle de certains acteurs qui nous interessent dnas la maladies et d’autres souris normales, pour comparer les différences. Certaines souris recevront un médicament spécial pour voir comment il agit sur la maladie.
Raffinement
Après les opérations, les souris peuvent ressentir un peu de douleur ou être fatiguées. Pour limiter leur inconfort, elles reçoivent des médicaments contre la douleur et sont gardées au chaud sur un petit tapis chauffant. Les souris sont observées tous les jours pour vérifier qu’elles se déplacent, mangent et se comportent normalement. Des contrôles cliniques plus détaillés sont réalisés chaque jour à l’aide d’une grille de critères incluant la posture, la mobilité, l’alimentation et le comportement social. Ces observations permettent de détecter rapidement tout problème et de décider des actions à prendre : par exemple, donner un complément de médicaments contre la douleur, placer de la nourriture facile à attraper au sol si elles ont du mal à bouger, ou arrêter l’expérience et euthanasier l’animal si la douleur ou la perte de poids dépasse les points limites définis. Avant de mesurer leur tension artérielle, les souris sont habituees à la manipulation pour réduire le stress. Dans leurs cages, elles disposent de coton pour nidifier et de tunnels ou roues pour se cacher ou se déplacer librement, ce qui améliore leur confort et leur bien-être.
Choix des espèces
Les souris sont très utiles parce que leur corps fonctionne un peu comme celui des humains : leur cœur, leur sang et leurs défenses naturelles sont très semblables. Cela permet de mieux comprendre les maladies et de tester des traitements avant de passer aux humains. En plus, nous pouvons créer des souris « sur mesure » en modifiant certains gènes pour étudier exactement certaines protéines ou parties du corps. Pour ce projet, nous travaillons sur des souris adultes, car nous voulons étudier une maladie qui touche surtout les adultes. Nous nous intéressons particulièrement à une substance dans le sang appelée thrombine et à la façon dont le corps la contrôle, pour mieux comprendre comment se forment et évoluent les anévrismes dans le cerveau.