Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Caractérisation des fibroblastes infiltrant les tumeurs pulmonaires dans le modèle transgénique Kras/Tp53.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Vingt souris de réforme servent, sous anesthésie et sans réveil, à entraîner un geste technique au niveau du larynx, tandis que 88 souris porteuses de tumeurs pulmonaires, dans des procédures de souffrance sévère, sont suivies par imagerie sous anesthésie pour étudier les fibroblastes qui isolent la tumeur des lymphocytes. Le porteur indique surveiller poids et respiration, avec une mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour isoler et caractériser ces fibroblastes.
Objectifs
Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par la chirurgie et la radiothérapie conduisent à des rémissions mais les stades métastatiques ont une faible survie. Les nouvelles approches par immunothérapie permettent de détruire les cellules cancéreuses en stimulant le système de défense immunitaire du patient (lymphocytes T). Ces nouvelles approches ont conduit à des résultats spectaculaires de rémission durable de tumeurs solides (mélanome et cancer du poumon principalement). Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (30% environ), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Une caractéristique fréquemment observée chez les patients ne répondant pas aux immunothérapies est l’exclusion des lymphocytes T des ilots de cellules tumorales. Maintenus à distance les lymphocytes T sont inaptes à détruire les cellules tumorales. Les fibroblastes associés aux tumeurs (CAF) semblent en partie responsables de cette exclusion en formant une barrière autour des ilots tumoraux. L’objectif de ce projet est de caractériser in vivo dans un modèle transgénique de tumeur pulmonaire chez la souris, les différentes populations de CAF et d’étudier leurs interactions avec les lymphocytes T infiltrant les tumeurs. Pour cela nous avons choisi un modèle transgénique murin inductible de tumeurs pulmonaires qui permet d’étudier les interactions entre les cellules tumorales pulmonaires et le microenvironnement fibroblastique et immunitaire. Cette recherche fondamentale pourrait déboucher sur des applications cliniques en proposant des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.
Bénéfices attendus
Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et libérer les lymphocytes T afin qu’ils infiltrent les îlots tumoraux permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie.
Procédures
Tous les gestes techniques de ce projet sont réalisés sous anesthésie : - Induction de l’expression du transgène par administration à l’entrée de la trachée- réalisée sous anesthésie générale des souris transgéniques 108 souris sont concernées. Le geste n’est pas douloureux mais l’anesthésie générale est obligatoire pour garantir une immobilité de l’animal et l’accès au larynx. Durée de l'anesthésie : 20 minutes. - Une anesthésie gazeuse des souris est réalisée pour le suivi longitudinal des tumeurs pulmonaires par imagerie. Celle-ci est réalisée tous les 15 jours à partir de 8 semaines post induction : 3 imageries maximum pour le temps précoce 10-12 semaines (44 souris concernées) et 8 imageries maximum pour le temps tardif 20-24 semaines(44 souris concernées). Durée de l'anesthésie : 10 min - Une anesthésie gazeuse des souris est réalisée pour l’administration intra-veineuse de lymphocytes T La cornée est protégée par un onguent durant l’anesthésie générale. Durée de l'anesthésie : moins de 5 minutes
Impact sur les animaux
Les souris inductibles élevées n’ont pas de phénotype dommageable car le transgène ne s’exprime qu’après une étape d’induction. Cette induction dans les cellules épithéliales pulmonaires conduit au développement de tumeurs pulmonaires chez 100% des animaux en 3 mois. Les dommages sont causés par le développement des tumeurs pulmonaires qui induisent à long terme une perte de poids importante et une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces permet d’éviter la survenue de douleur en suivant la croissance des tumeurs par imagerie et par suivi du poids des animaux.
Devenir
Mise à mort pour les 20 souris de réforme utilisées dans la procédure sans réveil d’apprentissage de la technique d’administration au niveau du larynx afin de vérifier la qualité du geste technique. Euthanasie des 88 souris induites porteuses de tumeurs pulmonaires pour prélèvement post mortel des poumons et analyse
Remplacement
Ce projet est fondé sur ces observations préliminaires réalisées sur des tumeurs humaines. L’établissement d’un modèle de tumeur pulmonaire murine est indispensable afin d’isoler et de caractériser la fonction de ces CAF. Il sera complété par des approches alternatives ex vivo Seul un modèle in vivo permet de modéliser toutes les interactions cellulaires et d’apprécier l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet sera de 108 souris pour 5 ans. L'imagerie des animaux permet des analyses et un recueil de données longitudinales et donc contribue à la réduction du nombre d'animaux Les analyses cellulaires des CAF seront réalisées sur N=6 souris par temps (10-12 sem et 20-24 sem post induction) . Une caractérisation des CAF sera réalisée et une corrélation avec une exclusion des lymphocytes T des ilots tumoraux sera recherchée (test de correlation de Pearson) Le nombre de souris par groupe a été défini à minima tout en permettant une analyse fiable. Afin d’apprécier la reproductibilité des résultats obtenus l’expérience sera répétée une fois avec le même nombre d’animaux par groupe. 10 souris transgéniques porteuses de tumeurs pulmonaires seront nécessaires à chacun des temps afin d’obtenir suffisamment de CAF pour les analyses de single cell RNA
Raffinement
La bonne connaissance du modèle tumoral, un suivi adapté des points limites (suivi des tumeurs par imagerie et pesées des animaux) et la manipulation des animaux sans stress, sous anesthésie si besoin, par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum le stress et la douleur des souris. Les tumeurs seront mesurées par imagerie. Les animaux sont pesés 1 fois/sem. La grille de score jointe est appliquée pour confirmer le bon état général de l’animal. Les points limites plus spécifiques pour ce modèle sont une perte de poids>20% du poids à l’induction, une dypsnée..
Choix des espèces
Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées qui reproduisent la physiopathologie des tumeurs humaines. Le modèle transgénique choisi ici reproduit la pathologie de certains cancers pulmonaires humains. De plus, de nombreux outils sont disponibles (anticorps, cytokines, souris transgéniques possédant des lymphocytes T spécifiques de tumeurs) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Les souris transgéniques seront induites à l’âge de 3 à 4 mois pour l’expression du transgène et utilisées dans les procédures, 10 à 12 semaines ou 20 à 24 semaines post induction donc âgées de 6 mois à 12 mois. Souris adultes avec un système immunitaire mature
Effets rénaux de la protéine Claudine 14 (Cldn14)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumises deux semaines à un régime riche en calcium, elles sont ensuite anesthésiées pour un prélèvement de sang et l'ablation des reins, qui entraîne leur mort, afin d'étudier le rôle d'une protéine rénale. Le porteur indique que le régime, jugé moins appétent, peut réduire la prise de nourriture et faire perdre du poids, avec des points limites de surveillance. Il affirme qu'un modèle cellulaire in vitro ne peut pas restituer la complexité des transports ioniques d'un épithélium rénal.
Objectifs
L’adaptation de l’organisme aux variations des apports de calcium pourrait impliquer la protéine Cldn14 exprimée dans la branche ascendante large de l’anse de Henle (BLAH). L’expression de Cldn14 augmente en régime riche en calcium et, dans des modèles cellulaires de cellules épithéliales, la protéine Cldn14 peut interagir avec la protéine Cldn16. On ne sait ni si ces interactions protéiques existent dans le tissu natif, ni si elles sont nécessaires à l’adaptation de la BLAH, ni s’il est pertinent de chercher des anomalies de la protéine Cldn14 chez les patients ayant une perte rénale de calcium. Objectif: déterminer si l’adaptation du transport de calcium dans la BLAH native, en réponse à une augmentation des apports calciques, implique la protéine Cldn14.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de déterminer l'implication (ou l'absence d'implication) de la protéine Claudine 14 dans l'adaptation du rein à un régime riche en calcium. Plus généralement, cette étude apportera des éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes d'adaptation des mammifères aux variations de leur environnement, en particulier alimentaire. En effet les apports de calcium peuvent varier considérablement et rapidement en fonction du type de nourriture consommée : une adaptation rapide à ces changements est nécessaire dans le but de maintenir l ‘homéostasie.
Procédures
Les animaux sont soumis successivement - à un régime alimentaire riche en calcium pendant 2 semaines - à une anesthésie terminale au cours de laquelle un prélèvement sanguin puis une exérèse des reins sont pratiqués, entrainant la mort de l'animal
Impact sur les animaux
Le régime riche en calcium peut avoir un gout perçu comme moins agréable que la nourriture standard par certains animaux : dans ce cas, les animaux concernés peuvent diminuer leur prise de nourriture et perdre du poids. L'évolution du poids et la quantité de nourriture consommée font l'objet d'une surveillance et, le cas échéant, des points limites s'appliquent.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure : en effet, des tests fonctionnels rénaux doivent être réalisés à la fin de la procédure, nécessitant le prélèvement des reins sous anesthésie générale et donc l'euthanasie.
Remplacement
Le projet explore les mécanismes de l'adaptation rénale à un régime riche en calcium et permet la mesure directe de transport ionique à travers un épithélium spécialisé intact. La complexité des déterminants des transports ioniques transépithéliaux est telle qu'un modèle cellulaire in vitro ne peut pas la restituer
Réduction
Les méthodes choisies testent directement l’hypothèse énoncée en utilisant la microperfusion in vitro, méthode de référence dans le domaine : cette approche maximise la probabilité d’obtenir des réponses non ambiguës à la question posée. Les données seront comparées par un test de Student pour variables non appariées. Nous utiliserons 20 souris par groupe (10WT et 10KO pour le transport de calcium, 10WT et 10KO pour le transport de sodium) du fait de notre expérience des différences quantitatives attendues et des tests statistiques utilisés. Les manipulations des animaux sont réduites au minimum et la seule contrainte imposée est l’alimentation avec un régime riche en calcium pendant 2 semaines.
Raffinement
Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Les animaux bénéficient d’un environnement enrichi et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Les manipulations des animaux sont réduites au minimum et la seule contrainte imposée est l’alimentation avec un régime riche en calcium pendant 2 semaines. Des points limites ont été définis et les animaux sont l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande
Choix des espèces
Le modèle d'inactivation constitutionnelle du gène Cldn14, codant pour la proteine Cldn14, a été développé chez la souris Les animaux sont nourris avec le régime riche en calcium à partir de l'âge de 2 mois. Les animaux ont alors terminé leur phase de croissance rapide et sont considérés comme matures ; la taille de leur rein permet la dissection d'une branche large ascendante de longueur suffisante pour pouvoir mesurer le transport transépithélial de calcium et celui de sodium
Modèles d’étude pour les pathologies infectieuses humaines : souris humanisées pour le système immunitaire et/ou le foie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines, elles subissent une irradiation sublétale, des prélèvements de sang, des chirurgies puis une infection par des virus comme le VIH ou les hépatites B et C, pour étudier ces infections et tester des traitements. Le porteur indique que certaines souris présentent un poids réduit lié à une déficience hépatique et peuvent développer une dermatite, avec mise à mort si le score de souffrance atteint le point limite. Il présente ce modèle comme le "seul" permettant ces infections et comme une alternative au recours aux primates non-humains.
Objectifs
Ce projet utilise le seul modèle murin expérimental qui permet de suivre la progression in vivo des infections par des virus à tropisme restreint aux humains et aux primates non-humains. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la physiopathologie induite par l’infection des virus de l’immunodéficience humaine (VIH), d’Epstein-Barr (EBV), de l’hépatite B (VHB), et de l’hépatite C (VHC) en suivant les réponses immunitaires, et évaluer l’impact des nouvelles approches antivirales ou vaccinales. Ce type d’expérimentation ne peut pas être mené chez l’hôte naturel de ces virus pathogènes (l’homme) et s’avère de plus en plus difficile à mettre en place chez des primates non-humains. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces virus, des modèles de souris humanisés pour le système immunitaire (souris HIS), ou pour le foie avec l'ajout d'hépatocytes humains (souris HUHEP), ont été développés au cours des deux dernières décennies. Comme premier modèle, nous avons généré des souris immunodéficientes (BRGS), par l’invalidation fonctionnelle des gènes codant pour certaines protéines. Les principaux mécanismes de rejet de greffe sont absents chez ces souris ce qui permet l’établissement d’une xénogreffe hématopoïétique humaine après injection de cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC). Des études précédentes ont montré que les souris HIS étaient susceptibles aux infections par les virus HIV ou EBV, et modélisaient les réponses immunitaires humaines. Un second modèle murin immunodéficient porte en plus un gène urokinase plasminogen activateur (uPA) qui est toxique pour les hépatocytes dans le foie, ce qui induit une déficience hépatique. Ces souris sont greffées avec des hépatocytes humains adultes sains qui participent à la régénération du foie et constituent le modèle HUHEP. Des études précédentes ont montré que les hépatocytes humains pouvaient être infectées par les virus VHB et VHC ainsi que par le parasite de la malaria (Plasmodium falciparum) chez ces souris HUHEP. La combinaison des deux modèles ci-dessus, dite HIS-HUHEP permet une étude approfondie des interactions entre le système immunitaire et le foie dans le cadre d’infections hépatiques (VHB, VHC, P. falciparum). Celui-ci permet de décortiquer les mécanismes d’infection et de mieux comprendre la pathogénèse complexe induite par ces microbes invasifs.
Bénéfices attendus
Ces modèles animaux permettront de mieux caractériser les mécanismes d'infection et de réplication des virus (VIH, EBV, VHB, VHC), le rôle du système immunitaire dans l'évolution des pathologies, ainsi que de tester des nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. Bien que des traitements thérapeutiques existent pour les patients atteints de VIH, un vaccin thérapeutique permettrait de contrôler les infections de manière pérenne. Il n’existe pas de vaccin préventif pour le VIH et le VHC, ainsi des millions de nouvelles infections surviennent par an, ne permettant pas d’éliminer ces virus de la population globale. Bien qu’un vaccin sûr et efficace existe pour le VHB, plus de 260 millions de personnes sont actuellement infectées et seul 1% de ces patients ont accès aux traitement thérapeutiques, le VHB induit des hépatocarcinomes à mauvais pronostique. Ces traitements, comme celui pour le VIH, doivent être pris à vie, induisant un coût élevé pour la société et un risque de survenu d’échappement virologique. Ainsi, les recherches se poursuivent pour développer des vaccins, ou des traitements curatifs, pour ces pathologies. L’interaction entre la réponse immunitaire et le virus est essentiel dans la progression de la pathologie, comprendre ces mécanismes d’action est une clé de voute pour développer des nouveaux concepts de traitements à visé thérapeutiques, ou des vaccins. Or, les modèles animaux qui permettent d’étudier ces interactions sont rares étant donné que ces virus n’infectent que des cellules humaines ou de chimpanzés. Afin de modéliser ces questions, nous avons développé des modèles de souris greffées avec des cellules humaines qui sont susceptibles à ces virus, permettant d’étudier les réponses immunitaires antivirales humaines. L’ensemble de ces études participe à comprendre la physiopathologie induite par ces virus chez l’humain, et à développer des nouveaux traitements thérapeutiques et des stratégies vaccinales afin d’éliminer ces maladies.
Procédures
Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes : irradiation avec des doses sous-létales (une fois par vie, 1-3 minutes), prélèvements sanguins en retro-mandibulaire (chaque prélèvement dure quelques secondes et est réalisé tous les 15 jours au maximum), anesthésie et procédures chirurgicales (une fois par vie, environ une heure et demi par animal), infection par des virus (une fois par vie, chaque infection dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Le degré de gravité des procédures est considéré comme léger (injections et prélèvements) ou modéré (conséquences potentielles à long terme de l’irradiation sous létale ou chirurgie). Les animaux portant le transgène uPA ont un poids réduit (autour de 10% en dessous du poids normal) du à leur déficience hépatique qui entraîne des défauts métaboliques. Ce poids diminué n’affecte pas le comportement des animaux, n’entraîne pas de souffrances, ni de stress, d’après nos observations sur plusieurs années d’expérimentation. Les animaux humanisés pour le système immunitaire et exprimant le transgène TSLP peuvent développer une dermatite. Afin de soulager la dermatite, les animaux seront traités avec une solution antiseptique (bétadine) avec un anesthésiant locale (lidocaine) et ils pourront être hébergés sur une litière de cellulose plus adaptée aux peaux sensibles. Leur phénotype est suivi toutes les semaines selon les critères et les points limites suivants : 1. Apparence global de l’animal score 0 : normal score 1: poils ébouriffés, rougeur de peau ou perte de poils sur moins de 50% du corps, expression faciale modérée, animal en mouvement score 2: dos voûté, perte de poils sur plus de 50% du corps, expression faciale sévère, absence de mouvement, prostration. 2. Conditions corporelles (cachexie) score 0: BCS (Body Condition Scoring) 3: L’animal est bien conditionné. La colonne vertébrale est continue. Vertèbres palpables seulement avec une pression ferme. score 1: BCS 2: L’animal est sous-conditionné. Segmentation de la colonne vertébrale évidente. Les os du bassin dorsal sont facilement palpables. score 2: BCS 1 : L’animal est amaigri. Structure squelettique extrêmement visible et peu ou pas couverte par la chair. Vertèbres distinctement segmentées 3. Poids score 1: perte de plus de 10% du poids score 2: perte de plus de 20% du poids Le point limite est défini par la détection d’un score =2 Si un score > 0 est observé, les animaux auront une surveillance renforcée. Si un score = 2 est observé, les animaux seront mis à mort.
Devenir
A l’issu de la procédure expérimentale #1 les animaux seront mises en expériences suivant les procédures expérimentales # 2, 3, 4 et 6. A la fin de ces procédures expérimentales les animaux seront mis à mort pour être analysés afin de caractériser la physiopathologie et la réponse immunitaire induite par les virus VIH, VHB, VHC, EBV. A l’issu de la procédure expérimentale #5 les animaux seront mis en accouplement.
Remplacement
Ce projet nécessite un modèle expérimental soutenant l’ensemble des mécanismes de la physiopathologie induite par une/des infection(s) virale(s). Or, de nombreux exemples démontrent que les tests d’efficacité de thérapies antivirales in vitro ne se confirment pas systématiquement in vivo en phase clinique chez l’Homme du fait des dynamiques complexes mises en jeu dans l’organisme (cinétique de l’infection; distributions cellulaires ; bio-distribution des composés; réponse immunitaire). Historiquement, les modèles infectieux de choix restent le macaque pour le VIH (avec le virus simien apparenté VIS ou l’hybride SHIV) et le chimpanzé pour le VHC et le VHB. En proposant comme modèle alternatif la souris humanisée pour le système immunitaire et/ou le foie, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains, avec l’avantage supplémentaire d’utiliser un modèle expérimental directement adapté au pathogène humain natif. A ce titre, les souris HIS et HIS-HUHEP sont le seul modèle expérimental correspondant à ces critères (mis à part l’Homme lui-même, chez lequel il est éthiquement inacceptable de tester directement de nouvelles stratégies préventives ou thérapeutiques).
Réduction
Le plan d’étude bénéficie de nos connaissances antérieures obtenues avec des souris humanisées sur l’infection par le VIH et le VHB. De plus, nous utilisons un modèle de souris HIS qui est à la pointe du domaine, ce modèle est sans cesse optimisé pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux requis par expérience. Il sera essentiel de compter un minimum de 10 animaux par groupe, du fait de cette variabilité intrinsèque, et d’inclure l’ensemble des groupes contrôles pour valider les conclusions de chaque étude. La planification des expériences en amont et la concertation entre les membres de l’équipe seront des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux.
Raffinement
Les cages d’hébergement sont enrichies avec un coton dentaire permettant une nidification, et avec des refuges en forme de dômes en cellulose dans les cages de croisements. Par ailleurs, le stress des animaux est largement diminué par l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité des procédures. L’isoflurane par voie respiratoire présente l’avantage d’être un anesthésiant permettant des séquences d’endormissement courtes et répétées. Les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, et une alimentation hydratante (DietGel) sont inclus dans nos protocoles expérimentaux.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale soutenant une infection productive par le VIH. La souris HUHEP greffée avec des hépatocytes humains est permissive aux infections hepatotropiques (VHB, VHC, P. falciparum). Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire (HIS) sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans des souriceaux nouveau-nés (
Etablissement d’un modèle de glioblastomes (GBM) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
808 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souriceaux d'un jour sont anesthésiés, reçoivent une injection d'ADN dans un ventricule cérébral puis des chocs électriques d'électroporation, pour induire et étudier les premières étapes d'un glioblastome. Le porteur indique que l'électroporation peut provoquer stress de séparation, refroidissement et douleur modérée, et prévoit d'arrêter l'expérience quand les tumeurs atteignent 15 % du volume du cerveau. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle cellulaire capable de récapituler ces niches de cellules souches.
Objectifs
Les glioblastomes (GBM) représentent la forme la plus fréquente et aussi la plus agressive des tumeurs primaires du cerveau avec un pronostic de survie post-diagnostique très bas. L’objectif du projet est d’établir dans notre laboratoire un modèle murin de GBM qui permettra d’étudier les étapes précoces de progression de ces tumeurs. Récemment les cellules souches neurales localisées autour des ventricules latéraux du cerveau ont été identifiées comme les cellules qui sont à l’origine des GBM. En effet lorsque certains gènes sont mutés dans ces cellules souches, celles-ci sont en capacité de se transformer en cellules tumorales. Sur la base d’études publiées dans d’autres laboratoires, nous souhaitons effectuer des expériences pilotes pour mettre au point un modèle d’induction de GBM basé sur l’introduction de mutations dans ces cellules souches neurales. Grâce à une méthode d’électroporation mise au point au laboratoire, nous pouvons cibler spécifiquement ces cellules souches et y introduire des modifications génétiques. L’analyse de ces cellules ainsi modifiées sera effectuée à différents temps après l’induction des mutations et permettra de caractériser les évènements cellulaires et moléculaires qui interviennent pendant la période d’induction et de développement précoce des GBM.
Bénéfices attendus
Grâce à l'électroporation nous avons le moyen unique de pouvoir cibler les cellules qui sont à l’origine de la formation de GBM. La mise au point d’un nouveau modèle de glioblastome basé uniquement sur l’électroporation ouvre la possibilité d’étudier les étapes précoces du développement des GBM dans un contexte physiologique avec un niveau de résolution cellulaire et moléculaire qui n’existe pas à l’heure actuelle. Ainsi de nouveaux processus cellulaires et moléculaires intervenant au commencement de la tumorigenèse pourront être découverts.
Procédures
Nombre total d'animaux= 808. Tous les animaux de ce projet seront traités avec le même protocole. Pour l'étape d'électroporation, les souriceaux âgés de 1 jour seront anesthésiés, des solutions d'ADN seront injectés dans un ventricule latéral du cerveau grâce un capillaire très fin, puis des électrodes placées de part et d'autre de la tête de l'animal délivreront des chocs électriques. L’ensemble de ces actes ne dure que 30 secondes. Ils seront réveillés progressivement en les ramenant à une température de 37°C et replacés auprès de leur mère. Avant leur mise à mort, les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’EdU ou de BrdU, composés qui permettent de suivre la prolifération des cellules, qui ne provoquent aucune douleur et qui ne sont pas délétères à l’animal. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l'électroporation. La mise à mort se fera après injection d'une surdose d'anesthésique.
Impact sur les animaux
Dans la procédure d'électroporation, certaines étapes peuvent potentiellement générer du stress lié à la séparation d’avec leur mère, au refroidissement utilisé pour l’anesthésie et à la douleur modéré de l’électroporation. Cependant avec le recul de plusieurs années d’utilisation et de maitrise des procédures d’électroporation, nous avons pu constater que les souriceaux ne présentent pas de signes de douleur ni d’anxiété au réveil et sont allaités par la mère très rapidement après leur retour dans la cage. Les autres effets indésirables attendus sont le développement de tumeurs qui sera évalué au cours du temps. Comme le but de notre étude est concentré sur les étapes précoces de l’établissement des tumeurs, nous ne souhaitons pas atteindre le stade où les tumeurs deviennent délétères pour l’animal. C’est pourquoi, nous suivrons un lot d’animaux pour déterminer le temps nécessaire à la survenue de tumeurs en analysant par histologie les cerveaux prélevés toutes les deux semaines jusqu'à un maximum de 16 semaines après l'électroporation. L’expérimentation sera arrêtée lorsque les tumeurs atteindront 15% du volume du cerveau. Ce stade de développement des tumeurs est suffisant pour notre étude et n’entraine pas de perte de poids chez l’animal ni de comportement anormal.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser le devenir des cellules souches modifiées génétiquement et afin d’ évaluer si et comment des tumeurs se développent.
Remplacement
Le but de notre projet est d’étudier les mécanismes celluaires et moléculaires intervenant dans les phases précoces de développement des GBM dans le contexte écologique de l’avènement des tumeurs en ciblant les cellules souches neurales situées dans le cerveau antérieur et qui sont à l’origine de ces GBM. Malheureusement il n’existe pas de modèles cellulaires capables de récapituler ces niches cellulaires.
Réduction
Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. - Les animaux test et témoin seront issus d’une même portée - des méthodes statistiques adaptées aux petits échantillons seront utilisés pour pouvoir obtenir des données statistiques fiables tout en utilisant un nombre restreint d’animaux par expérience. - Le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire et génétique des animaux limitera la variabilité des résultats expérimentaux. - Des expériences pilotes seront effectuées en début de protocole sur un nombre très réduit d’animaux pour établir la chronologie des évènements conduisant à des GBM et permettront ainsi de réduire ainsi la fenêtre d’étude aux étapes précoces de développement des tumeurs avant que celles-ci ne deviennent délétères.
Raffinement
- L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. - Les cages sont enrichies avec des carrés de coton, des cylindres de carton et des dômes de nidification. - Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. - Pour limiter l’anxiété lors des procédures expérimentales d’électroporation, les souriceaux sont maintenus au maximum en portée avec leur mère. - Une prémédication d’anti-douleur sera administrée en sous cutanée 30 minutes avant la mise à mort pour éviter toute souffrance ; les animaux seront euthanasiés après avoir reçu une surdose d’anesthésique. Pour limiter les effets trop délétères liés au développement de tumeurs cérébrales, une analyse histologique des cerveaux au cours du temps permettra de déterminer le stade de progression des tumeurs qui soit suffisant pour l'étude mais qui ne provoque pas de perte de poids ni de comportement anormal.
Choix des espèces
De façon générale, la souris est le modèle Mammifère le plus utilisé par la communauté scientifique pour établir des modèles de cancers in vivo permettant l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires des phases précoces de développement de cancer. Un modèle d'induction de GBM similaire au nôtre a déjà été décrit chez la souris et mime différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires de la genèse et du développement des glioblastomes. Ce modèle est donc réalisable et pertinent. De plus, grâce à l'adaptation de notre protocole basée uniquement sur l’électroporation, nous pourrons, dans le futur, étudier les étapes d’induction et de développement précoce des GBM dans des contextes génétiques mutants existant uniquement chez la souris. Tous les animaux seront électroporés au stade nouveau-nés car c’est le stade où les cellules souches neurales qui bordent les ventricules latéraux, peuvent être modifiées génétiquement grâce à l’électroporation de plasmides. Des animaux seront euthanasiés à différents temps, à partir d’une semaine jusqu’à un maximum de 16 semaines après l’électroporation pour suivre l’évolution des cellules électroporées.
L’inflammation pour stimuler la régénération rétinienne dans un modèle de dégénérescence spontanée lente chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une dégénérescence rétinienne, elles reçoivent sous anesthésie des injections dans l'œil de molécules inflammatoires et des injections dans l'abdomen, pour tester si l'inflammation réveille les capacités de régénération de la rétine. Le porteur qualifie les atteintes de légères et limitées à la rétine, et compare l'injection intraoculaire à une pratique clinique courante chez l'humain. Il indique valider d'abord ses hypothèses sur des explants de rétine puis affirme le recours à l'animal "nécessaire", l'œil étant un organe complexe.
Objectifs
La rétine est soumise à des pathologies dégénératives dont la plupart restent non traitables jusqu'à ce jour. La stimulation de la capacité de régénération des cellules souches de la rétine des mammifères, qui est naturellement limitée, pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante. Les cellules souches de la rétine, les cellules gliales de Müller, possèdent un potentiel de régénération extraordinaire chez les amphibiens et les téléostéens, mais celui-ci est très limité chez les mammifères. Cependant, elles ne sont pas dépourvues de propriétés régénératives puisque l’on peut les forcer à se reprogrammer et à générer de nouveaux neurones. L'une des différences entre les deux espèces est la réponse inflammatoire aux dommages. Dans le système nerveux central des mammifères (cerveau et rétine), il est considéré que l'inflammation empêche la régénération du tissu. Dans la rétine du poisson, les médiateurs de l’inflammation favorisent la reprogrammation et la prolifération des cellules gliales de Müller après une blessure. En ce sens, il a été montré que les cellules immunes de la rétine (les microglies) favorisent la régénération chez le poisson, bien qu'elles deviennent préjudiciables si l’inflammation se prolonge. Chez les mammifères, l'inflammation favorise la gliose, la fibrose et la cicatrisation, mais pas la régénération. Ceci suggère une interaction microglie-Müller différente selon l’espèce. L’ensemble de ces résultats indiquent que chez la souris, des propriétés régénératives existent mais sont restreintes soit par des mécanismes intrinsèques aux cellules de Müller, soit par leur environnement (par exemple environnement pro- ou anti-inflammatoire défavorable). Dans ce contexte, nous souhaitons chez la souris moduler l’inflammation via l’injection intraoculaire de molécules pro- ou anti-inflammatoires, et étudier les conséquences sur le réveil régénératif des cellules de Müller.
Bénéfices attendus
A ce jour, les différences d'efficacité de régénération observées entre espèces restent inexpliquées. La régénération rétinienne très efficace des espèces telle que les poissons nécessite une régulation fine de l'inflammation. Notre projet vise à reproduire des conditions inflammatoires favorisant la régénération chez la souris. Notre ambition est de réussir à débloquer les propriétés régénératives latentes des cellules souches de la rétine en modulant l'inflammation. Si le projet abouti, cela ouvrirait la voie vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soigner les patients atteints de dégénérescence rétinienne.
Procédures
Les animaux du présent projet seront soumis à quatre actes expérimentaux : (i) Anesthésie : une fois pendant la procédure juste avant l'injection intraoculaire afin d'éviter la douleur qui aurait été générée par l'injection. La durée de l'anesthésie est d'environ 20 minutes. (ii) Injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en cinq minutes maximum en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal anesthésié pour réaliser l'injection. (iii) Injection intrapéritonéale : selon l'expérience, chaque animal recevra selon la procédure entre une et quatre injections intrapéritonéales d’un analogue de nucléotide permettant de révéler la prolifération cellulaire. (iv) Alimentation formulée : de 15 à 18 jours.
Impact sur les animaux
Les conséquences sur les animaux des procédures utilisées dans nos expériences sont restreintes à la rétine. Le modèle de souris que nous utilisons présente une dégénérescence rétinienne lente non préjudiciable pour l’animal (Annexe I). Les différentes procédures ont un niveau de sévérité de classe légère (i.e. « entraînant une douleur, une souffrance ou une angoisse légère de courte durée sans incidence significative sur le bien-être ou l'état général des animaux »), et sont couramment utilisées dans le domaine de la recherche ophtalmologique. La technique d’injection intraoculaire est utilisée couramment en clinique chez l’homme dans le cadre du traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et n’a pas de conséquence néfaste.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront gardés en vie (4h, 24h, 48h, 72h) selon l'expérience puis euthanasiés pour réaliser des expériences d'analyses phénotypiques.
Remplacement
Préalablement aux expériences in vivo nous validerons nos hypothèses grâce à la technique de culture d’explants rétiniens issus de souris euthanasiées n’ayant subi aucune procédure préalable. Les explants rétiniens cultivés ex vivo dégénèrent progressivement. Ils sont un excellent modèle pour tester l’effet de molécules anti- ou pro-inflammatoires, ou à potentiel régénératif. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que l’œil est un organe complexe composés de différents tissus en communication permanente les uns avec les autres ainsi qu’avec la circulation sanguine systémique et le cerveau via le nerf optique. Ces interactions sont cruciales pour l’obtention d’un signal visuel correct et participent à tous les processus cellulaires y compris la réparation et la régénération. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales sans utilisation d'animaux vivants n’apportent pas la même pertinence d'information.
Réduction
Nous avons estimé à 12 souris le nombre minimum d’animaux par groupe. Ce nombre correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des effets biologiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides et prenant en compte les aléas techniques. A noter également que dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses en même temps, de sorte que les deux rétines de chaque individu seront utilisées.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Nous aurons recours aux procédures anesthésiques appropriées. Les points limites de nos expériences sont déterminés grâce au suivi de l’état des yeux suite à l’injection, et en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Les doses d’agents inflammatoires injectés seront réajustées à la suite de la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Nous nous baserons sur les doses définies précédemment dans la littérature. Chacune des injections intraoculaires sera effectuée sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Le modèle de souris que nous avons choisi développe spontanément et progressivement une dégénérescence des photorécepteurs. Nos expériences visent à tester la capacité de l’inflammation à réveiller les propriétés régénératives des cellules gliales de Müller dans différents contextes dégénératifs. Pour déterminer le stade auquel nos expériences seront réalisées, il nous faut prendre en compte les contraintes liées au développement de la rétine et du système immunitaire chez la souris, ainsi que les contraintes techniques. Des souris de six semaines ayant une rétine totalement mature seront utilisées pour les expériences nécessitant l'utilisation d'une alimentation contenant une molécule qui inhibe les cellules immunitaires rétiniennes. Il faut un minimum d'une dizaine de jours d’alimentation pour obtenir une inhibition suffisante. Les injections intraoculaires d'agents pro- inflammatoires seront donc réalisées à 8 semaines.
Importance physiologique de la modulation nutritionnelle dans le traitement des désordres métaboliques du foie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries seize semaines avec un régime riche en gras et en sucre, elles subissent des jeûnes, des gavages ou injections et des prélèvements de sang à la queue lors de tests de tolérance, avant une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. Le porteur affirme que ce régime n'engendre ni douleur ni anxiété d'après l'observation du comportement, et classe en modéré la souffrance liée au jeûne, au gavage et aux prélèvements. Il affirme que l'usage d'animaux est "essentiel", une enzyme clé n'étant pas exprimée par les lignées cellulaires.
Objectifs
Les points de contact entre les mitochondries et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MAMs pour Mitochondria-Associated Membranes, ont un rôle crucial dans le contrôle de l'homéostasie glucido-lipidique de l’hépatocyte. Ces plateformes dynamiques peuvent être régulées par différents facteurs, notamment les nutriments. Des données récentes montrent que les MAMs sont altérées dans le foie de modèles murins d'obésité, de résistance à l’insuline et de stéatose hépatique, faisant des MAMs une cible thérapeutique privilégiée pour la prévention ou le traitement des désordres métaboliques hépatiques associés à l’obésité. Ces derniers sont étroitement associés à une diminution de la concentration plasmatique en certains acides aminés comme l'arginine, la glycine et la bétaine. Par ailleurs, des travaux in vitro ont démontré que les acides aminés arginine, citrulline, glycine et bétaine sont capables de réguler les MAMs par des voies de signalisation que l'on peut cibler par des molécules pharmacologiques comme la tetrahydrobioptérine (pour arginine et citrulline) et la S-adenosyl-méthionine (pour la glycine et la bétaine). L'objectif de ce projet consistera à 1) valider l'intérêt d'une supplémentation en acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques (résistance à l'insuline, stéatose) associés à l'obésité, 2) démontrer que les bénéfices santé sont associés à une restauration de d'intégrité des MAMs dans le foie des souris traitées et 3) valider in vivo les voies de signalisation impliquées par l'utilisation de molécules pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Le projet présenté vise à apporter des preuves de concept, d'une part sur l'intérêt de certains acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité, d'autre de l'intérêt des MAMs comme cible thérapeutique pour la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité chez l'Homme. Le projet apportera des connaissances mécanistiques solides pour soutenir une approche très originale et porteuse de potentiel d'innovation pour la santé humaine pour le futur proche.
Procédures
L'intervention principale sur les animaux consistera en de petits prélèvements sanguins au niveau de la queue lors de tests de tolérance au glucose et au pyruvate qui seront réalisés sur animal vigil, à jeun depuis 6h (tolérance au glucose) ou 10h (tolérance au pyruvate), respectivement. Après anesthésie locale (crème lidocaïne) et incision au scalpel à l'extrémité de la queue, des ponctions de 4-5 µL de sang seront réalisées à la veine caudale avant et 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après gavage oral (pour la moitié des souris) ou injection intrapériotonéale (pour l'autre moitié des souris) de glucose (2mg/g) ou injection intrapériotonéale (pour toutes les souris) de pyruvate (1.5 mg/g) pour suivre la glycémie à l'aide d'un glucomètre. Après le premier prélèvement, les suivants seront réalisés par simple grattage du caillot sanguin. La durée du jeune avant chaque test a été optimisée afin de limiter la nuisance infligée à l'animal tout en garantissant l'obtention d'un résultat métabolique fiable et reproductible, donc interprétable. Les protocoles se termineront par un jeune de 10h avant la mise à mort des animaux. Cette durée de jeune est indispensable pour garantir la qualité des mesures réalisées sur le foie de animaux.
Impact sur les animaux
D’après les premiers protocoles réalisés, 16 semaines de régime riche en gras et en sucre n’engendrent pas de douleur ou d’anxiété comme évalué par l’observation régulière du comportement des animaux, et n'empêchent pas les animaux de bouger dans la cage, notamment pour se nourrir et boire. Par ailleurs, selon les connaissances actuelles, il est peu probable que les interventions nutritionnelles testées aient des effets indésirables sur la santé et le bien-être des animaux. Lors de la mise à mort, l’utilisation de la dislocation cervicale sur animal anesthésié est une méthode rapide qui respecte les réglementations en vigueur pour les petits rongeurs. La douleur associée à la mise à jeun, au gavage ou aux injections intrapéritonéales, et aux prélèvements sanguins à la queue sont des contraintes dont le degré de sévérité est évalué de classe modérée.
Devenir
Les protocoles se termineront après anesthésie des animaux (kétamine/xylazine: 100/20 mg/kg soit 220µL de mélange pour une souris pesant 20g) et mise à mort par dislocation cervicale pour pouvoir récupérer différents tissus et organes. La nécessité de faire des anlayses histologiques et biochimiques justifie la mise à mort pour récupérer les tissus et organes.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse des effets de régimes sur un organisme complexe, et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées, qui n'expriment pas une enzyme clé impliquée dans nos mécanismes, la GNMT.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles.
Raffinement
Nous aurons pour objectif d'optimiser les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et les stress subis par les animaux. En particulier, nous n'utilisons pas de procédures susceptibles d'induire un dépassement de point limite de souffrance. Le raffinement sera appliqué tout au long de la vie des animaux. Pour cela, nous planifierons les protocoles de façon à éviter les perturbations susceptibles de procurer le stress de l'animal. Les protocoles ont été prévus de façon à obtenir le plus d'informations possibles par animal en imposant en même temps, un "moindre coût" en terme de mal-être de l'animal. Nous utiliserons une procédure d'analgésie pour les prises de sang, et une procédure d'anesthésie et de mise à mort par dislocation cervicale. Enfin, nos procédures de raffinement nous permettront de générer des résultats de meilleure qualité et d'exploiter au mieux les résultats obtenus.
Choix des espèces
Le travail avec des animaux est indispensable pour mimer au plus près la réalité de la surnutrition, de l'obésité et des désordres métaboliques comme dans l’espèce humaine. Le travail en épidémiologie sur l’Homme permet, en effet, de faire des corrélations entre la surnutrition et l'apparition de l’obésité et des désordres métaboliques. Le travail sur l’animal nous permet de montrer un effet causal, des manipulations nutritionnelles sur les paramètres biologiques ciblés et leurs bénéfices métaboliques à l'échelle de l'organe et du corps entier.
Rôle des macrophages dans le cancer du foie et la réponse aux immunothérapies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections induisant des tumeurs du foie et un suivi par échographie sous anesthésie, pour étudier le rôle des macrophages dans le cancer hépatique et la réponse aux immunothérapies. Le porteur indique qu'un quart des animaux peut développer une encéphalopathie foudroyante deux à quatre semaines après l'invalidation d'un gène. Il affirme que les lignées cellulaires ne permettent pas d'appréhender le foie dans sa globalité et présente le recours à Crispr comme une réduction du nombre d'animaux.
Objectifs
Notre objectif est d’étudier comment les macrophages du foie sont impliqués dans le développement du cancer du foie dépendant de la beta-caténine et modifient la réponse aux traitements d’immunothérapie dans des modèles murins de CHC (carcinome hépatocellulaire) relevants. Ce projet est divisé en 3 grands axes: 1) déterminer de manière cinétique au cours du processus tumoral comment une activation oncogénique de la beta-caténine dans les hépatocytes remodele le paysage immunitaire à son voisinage et notamment les macrophages embryonnaires. 2) comprendre comment les macrophages embryonnaires sont progressivement perdus au cours du processus tumoral pour être remplacés par des macrophages dérivés des monocytes et comment des événements oncogéniques associés à l'activation de la beta-caténine modifient ce remodelage macrophagique et 3) déterminer comment la réponse aux immunothérapies de ces cancers est modifié selon le remodelage des macrophages.
Bénéfices attendus
En aidant à la compréhension des mécanismes de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie en s'intéressant à une population immunitaire qui fut longtemps peu étudiée et dont la diversité des sous-populations a récemment été mise en lumière grâce à l'utilisation du single RNAseq (scRNAseq), ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeants ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre.
Procédures
1) Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles durant 10 secondes, 2) Injection intraveineuse sous anesthésie durant 30secondes 3) échographie hépatique sous anesthésie durant 10minutes si l'animal ne présente pas de tumeurs jusqu'à 25minutes si les tumeurs sont nombreuses 4) prélèvement sanguin sous anesthésie durant 30secondes
Impact sur les animaux
Les modèles de CHC décrits dans ce projet sont des modèles créés au laboratoire et que nous utilisons depuis plusieurs années. Entre la 2ème et la 4ème semaine après invalidation d’Apc un phénotype délétère lié à une encéphalopathie foudroyante peut être observé chez 25% des animaux, sans perte de poids. Ce phénomène est aussi observé dans le modèle de déletion de l'exon 3 de la beta-catenine par Crispr/Cas9 mais un mois et demi à deux mois après édition du gène du fait du temps de latence plus long pour que la machinerie Crispr soit pleinement efficace. Les autres traitements sont sans nuisances sur les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet seront euthanasiés pour analyse de leurs tissus hépatiques et leurs tumeurs afin de comprendre les événements génétiques et immunitaires à l'origine du développement de ces tumeurs et si nos traitements ont pu modifier leurs caractéristiques (invasion, prolifération)
Remplacement
Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire (cellules immunitaires, cellules endothéliales...). L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité, d’autant plus que les CHC mutés pour la beta-caténine sont peu proliférants et donc difficiles à maintenir en culture. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous optons pour la technique des ciseaux moléculaires ou crispr/cas9. 1290 animaux sur les 2650 nécessaires au projet suivent ce protocole, le quadruple ayant été nécessaire sans l’utilisation de cette stratégie. Nous suivrons le développement des tumeurs par suivi échographique, un appareil ayant été acquis récemment au sein de l'animalerie, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral évitant d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à nos expériences précédentes et à un calcul de puissance pour obtenir des résultats robustes : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Nous suivrons le développement des tumeurs par échographie, ce qui permet un suivi longitudinal depuis les phases précoces du développement tumoral évitant la souffrance des animaux liée à un développement tumoral trop important. Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée - les animaux étant euthanasiés si le score de souffrance est trop élevé. Les injections stressantes et les échographies seront réalisées sous anesthésie et les animaux mis sur tapis chauffant pour limiter l’hypothermie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum.
Choix des espèces
Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèle murin. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les CHC humains. Pour toutes les procédures, des souris mâles âgées de deux mois seront utilisées pour induire les délétions géniques d'intérêt (par Cre/lox ou Crispr/cas9) afin de réaliser un suivi longitudinal de l’initiation et du développement tumoral chez la souris adulte jeune et de les traiter avec les immunothérapies
Evaluation de la survie de souris présentant une pneumonie à Pseudomonas aeruginosa avec ou sans prophylaxie à Porphyromonas
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par voie nasale, sous anesthésie, une bactérie responsable de pneumonie grave, puis leur survie est suivie pendant sept jours pour tester l'effet protecteur d'un probiotique. Le porteur indique que les souris infectées sans protection peuvent perdre du poids et présenter douleurs, mobilité réduite voire inactivité, une analgésie étant administrée en cas de douleur effective. Il affirme ne pas pouvoir répondre à la question par des cultures cellulaires et conserve donc le modèle animal.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer la survie à l’infection, en complément des diminutions de charge bactérienne, avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart sous anesthésie gazeuse, La durée de chaque instillation dure moins d'une minute. A la suite de quoi, une courbe de survie sera réalisée sur 7 jours.
Impact sur les animaux
L’installation intranasale de bactérie peut induire un stress chez les animaux. L’utilisation d’anesthésie gazeuse lors de l’instillation permet de diminuer significativement le stress chez les animaux, par ailleurs un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec un score validé par une publication et l’administration d’un antalgique en cas de dégradation de l’état des animaux permettent également une diminution de ces effets. Lors de la réalisation de la courbe de survie, le groupe témoin recevant seulement PA peut être sujet à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec le score choisi, induisant une antalgie en cas de douleur effective. Pour les groupes essais et témoin PC recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.
Devenir
A l'issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin d'analyser les différents groupes, réaliser les courbes de survie et procéder aux tests statistiques permettant de démontrer le bénéfice thérapeutique d'une proxylaxie par Porphyromonas lors d'une infection à Pseudomonas aeruginosa.
Remplacement
Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer sa persistance dans le poumon après instillation. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
L’analyse de la survie sera réalisée par comparaison du pourcentage de survie au 7eme jour. Dans l’hypothèse d’une mortalité de 100% dans le groupe des souris infectées par Pseudomonas aeruginosa (souche PA01) et d’une mortalité de 60% dans le groupe des souris ayant reçu une administration prophylactique de Porphyromonas cationae clinique (PC 103) et infectées par PA01 (Groupe PC 103+PA 01) ; le nombre de souris nécessaire par groupe est de 20 souris (risque alpha=0.05, puissance du test 1-béta=90%) Afin de réduire le nombre d’animaux, nous choisissons de limiter le groupe contrôle (Sérum physiologique) à 10 souris car nous n’attendons pas de mortalités Le nombre total de souris sera donc de (3*20) + (1*10) soit 70 souris. Par ailleurs, nous nous limitons à une seule souche de Porphyromonas (P. catoniae ou PC) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon. La souche PC103 utilisée lors de ce projet a été préalablement sélectionnée parmi les 7 autres souches cliniques isolées lors d’une précédente étude menée au laboratoire. PC103 a été sélectionnée sur sa capacité à réduire in vitro la croissance de PAO1, sa production d’acides gras à chaines courtes, et son action sur des macrophages, également in vitro.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés (isoflurane gazeux), une analgésie est mise en place en cas de dépassement du score M-CASS 11 (de la buprénorphine pour réduire la douleur). Une mise à mort par CO2 sera pratiquée en cas de besoin au cours du suivi ou à la fin du protocole pour les animaux ayant survécus. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats. Les animaux seront utilisés après 1 semaine d’acclimatation à l’animalerie.
Impact d’une pollution lumineuse nocturne sur le métabolisme et la fertilité féminine chez un modèle animal diurne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Ovariectomie avec implant d'œstradiol, pose d'un capteur de glycémie ou d'un cathéter permanent lors de chirurgies de deux heures, frottis vaginaux quotidiens et prélèvements de sang par incision de la queue : 312 femelles d'un rongeur diurne, Arvicanthis ansorgei, subissent ces actes dans un projet sur les effets de la lumière nocturne sur le métabolisme et la fertilité. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tuées à l'issue pour l'étude de leurs gènes, hormones et organes. Pour 16 d'entre elles, 150 microlitres de sang sont prélevés toutes les trois heures pendant vingt-quatre heures par le cathéter. Le porteur reconnaît que ces rongeurs sont sociaux et prévoit d'en garder une partie en cage individuelle pendant toute l'expérimentation.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à déterminer les mécanismes biologiques, à ce jour très mal connus, impliqués dans les effets néfastes de la pollution lumineuse et de la désynchronisation circadienne (= désynchronisation des rythmes biologiques proche de 24 heures). Les résultats permettront de répondre aux enjeux de santé publique visant à améliorer la santé du personnel exposé aux conditions de travail posté et des populations exposées à la lumière nocturne (professionnels navigants sur plusieurs fuseaux-horaires, travaillant très tôt ou très tard, enfants et adolescents s’exposant à la lumière d’écrans la nuit). Les mécanismes impliqués dans les effets sanitaires néfastes de la pollution lumineuse et des horaires décalés sont difficiles à établir chez les sujets humains, et nécessitent l'utilisation d’un modèle animal proche de l’homme. Les modèles classiques (rats, souris) ont un phénotype nocturne (vivent la nuit) qui est inadapté aux applications biomédicales. Nombre de leurs rythmes journaliers (cycles veille-sommeil, prise alimentaire-jeune) sont inversés par rapport à l’Homme (phénotype diurne, de jour). La majorité des études expérimentales sont réalisées chez des individus mâles, ignorant l’effet sexe de ces analyses. Les études ne distinguent pas l’impact direct de la pollution lumineuse nocturne de l’effet indirect de la désynchronisation circadienne sur la physiologie. Nous proposons une approche originale pour mieux comprendre les effets de la pollution lumineuse et des décalages horaires sur le métabolisme et la fertilité féminine. L’objectif de ce projet est de fournir de nouvelles connaissances pour mieux comprendre les effets délétères de la pollution lumineuse sur l'homéostasie métabolique et la fertilité. Le choix d’un modèle diurne, le rongeur Arvicanthis Ansorgei, permettra la production de résultats rapidement exploitables dans le domaine de la santé humaine. La majorité des études dans cette thématique étant menées chez les individus masculins, notre choix de sujets féminins permettra d’évaluer les points critiques et, de gérer les risques sanitaires de la pollution lumineuse sur l'ensemble de la population générale. La réalisation de ce projet aidera à développer des approches préventives.
Bénéfices attendus
Ce projet va aider à mieux comprendre les mécanismes néfastes de la pollution lumineuse nocturne sur la santé métabolique et la fertilité. Les résultats obtenus chez un modèle animal diurne ( = vivant de jour) féminin permettront de mieux appréhender les risques sanitaires de la pollution lumineuse pour le personnel exposé aux conditions de travail en horaires décalés ainsi que pour toutes les autres catégories populationnelles exposées à de la lumière nocturne (par exemple, personnel navigant sur plusieurs fuseaux-horaires, personnes de toutes classes d’âge s’exposant à la lumière d’écrans pendant la nuit). La réalisation de ce projet conduira ensuite à développer des approches préventives sous forme de mesures interventionnelles ou de recommandations de bonnes pratiques et de gestion des risques professionnels.
Procédures
108 animaux vigiles seront soumis à une injection d’une solution sucrée ((2 g de D-glucose / kg masse corporelle) à l’aide d’une seringue d'un mL afin de réaliser un test de tolérance au glucose (durée 3H). Ce test sera effectué avant le début de l'expérience, puis à la fin de chaque mois, l’expérimentation durant entre 1 et 3 mois selon les résultats obtenus. Des micro-volumes de sang (5 μl) seront prélevés à 5 reprises sur une durée totale de 3 h à l’aide d’une micro-incision de la queue. Un anti-douleur sera administré sur la queue à la fin du protocole. 16 animaux seront soumis à une chirurgie permettant la pause d’un capteur donnant la glycémie 24/24h (durée 2H). Cette opération s’effectuera sous anesthésie générale et un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. 32 animaux seront soumis à une cathétérisation permanente (durée de la chirurgie 2H). Cette chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale et un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. Pour 16 des animaux, un volume de 150 μl sera prélevé toutes les 3 heures avec réinjection des éléments sanguins (durée 24H). Pour les 16 animaux restants ce volume sera de 50 μl (prélèvement répété sur plusieurs jours) avec réinjection des éléments sanguins. 48 animaux seront soumis à une ovariectomie et à un implant estradiol sous anesthésie générale puis un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. Ces animaux seront soumis à un unique frottis vaginal. Les frottis seront réalisés sur animaux éveillés maintenu à l’aide d’un tissu englobant le corps (pour réduire le stress) pendant une durée d’environ une minute. Les cellules sont recueillies avec 10 microL de sérum physiologique inséré dans le vagin à l’aide d’une micropipette. 108 individus seront soumis à des frottis vaginaux quotidiens (décrit précédemment) et des micro-prélèvements sanguins réguliers (jour déterminé par frottis). Les micro-volumes de sang (4 μL) seront prélevés à 4 reprises sur une durée totale de 8h par une micro-incision de la queue. Un anti-douleur sera administré sur la queue à la fin du protocole.
Impact sur les animaux
L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse (douleur modérée) et inflammatoire. Toute intervention chirurgicale sera donc effectuée sous anesthésie générale, anti-douleur locale et avec apport d’anti-inflammatoires pour réduire toute souffrance et éviter toute inflammation post-opératoire. Les procédures chirurgicales peuvent entraîner une perte de poids de 15%. Au-delà de ce seuil,l'expérience sera interrompu. Le poids sera surveillé à J+1, J+3 et J+5 après tout prélèvement sanguin ou toute intervention chirurgicale. Bien que les rongeurs soient des espèces « dit » social, il faudra garder certains individus en cage individuelle après intervention chirurgicale pour éviter que ses congénères ouvrent la plaie et empêchent la cicatrisation. De plus, certaines analyses s’effectueront dans des cages particulières n’étant pas prévu pour l’analyse de 2 individus simultanément. Une partie des animaux sera donc placés en cages individuelles pendant toute l’expérimentation. Les cages seront enrichies au mieux (bâton à ronger). Dans une telle étude, l’animal devra être habitué à être manipulé. Pour l’habituation de la présence humaine tout sera fait de façon la plus neutre possible (même blouse, absence de parfum).
Devenir
L’euthanasie des animaux est nécessaire puisqu'elle permettra d’étudier les gènes, hormones et organes afin de comprendre le mécansime biologique d’action de la lumière sur le métabolisme et la reproduction.
Remplacement
En termes de remplacement, la régulation du métabolisme et des cycles reproducteurs impliquant plusieurs organes (notamment, cerveau, foie, pancréas, muscles, hypophyse, ovaires), l’investigation des interactions nécessite l’utilisation d’organismes entiers, et non pas d’organes ou de cellules isolées.
Réduction
En termes de Réduction, le nombre d’animaux propose est basé sur un nombre minimal qui prend en compte les moyennes des données comportementales recueillies dans des études précédentes. Ici nous privilégions l’utilisation des mêmes animaux pour les expérimentations calorimétrie, tolérance au glucose, actimétrie.
Raffinement
En termes de Raffinement, les cages seront systématiquement enrichies d’un morceau de bois à ronger. L’ajout de matériel de nidification n’est pas utile chez les Arvicanthis en stabulation car ni les mâles, ni les femelles hors reproduction ne construisent de nid avec ce matériau. Par ailleurs, bien que ce projet nécessite des procédures invasives, le maximum sera fait pour réduire la douleur et le stress des animaux tout au long de l’expérience (environnement enrichi, anesthésie et analgésie profondes, suivi du score de douleur). De plus, l’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement. Des points limites prédictifs ont été établis permettant d’interrompre les procédures et soustraire ainsi l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le rongeur diurne Arvicanthis ansorgei a été choisi car son système circadien fonctionne d’une manière similaire à celui des Hommes, contrairement aux rongeurs classiques de laboratoire (rats et souris qui ont une activité nocturne). Le modèle Arvicanthis présente donc des atouts novateurs indéniables pour les applications biomédicales visant à étudier les effets de la pollution lumineuse sur la santé humaine. Nous avons choisi d’étudier l’effet de la pollution lumineuse sur un modèle de rongeur de sexe féminin pour trois raisons majeures : 1) le genre féminin est rarement étudié dans les investigations scientifiques à ce jour, 2) il existe des différences spécifiques liées a la reproduction féminine qui implique les rythmes biologique de 24 h dans la création des cycles reproducteurs ; 3) un nombre croissant de femmes travaille en horaires décalés alors que leurs systèmes reproducteur et métabolique sont particulièrement sensibles à la pollution lumineuse. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier des fonctions matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier les fonctions physiologiques matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature et non-sénescentes.
Etude du rôle d’Arhgef18 dans la biologie endothéliale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Certaines reçoivent dès la naissance trois injections dans l'estomac ou l'abdomen en trois jours, d'autres, adultes, dix injections abdominales de tamoxifène en deux semaines. Une partie subit ensuite une prise de sang derrière l'œil et des mesures de pression artérielle par brassard sur la queue, après deux semaines d'accoutumance. Le projet doit établir le rôle d'une protéine des vaisseaux, ARHGEF18, et renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre l'anévrisme intracrânien. Des souriceaux sont tués à six et à quatorze jours de vie pour l'analyse de leur rétine.
Objectifs
La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.
Procédures
Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.
Devenir
Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4 Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.
Remplacement
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Réduction
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.
Raffinement
Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).
Décryptage de l’activité neuronale et astrocytaire induite par l’ocytocine dans l’amygdale centrale – AstrOT
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil, et celles soumises au conditionnement de peur reçoivent chacune deux à quatre chocs électriques de 0,4 à 0,6 milliampère, associés à un son. Une chirurgie d'une heure leur implante des canules dans le cerveau pour y injecter des molécules qui agissent sur le récepteur de l'ocytocine, et toutes sont tuées pour l'étude de tranches de leur cerveau. Le projet doit comprendre comment la peur s'acquiert et s'éteint, ce qui permettrait selon le porteur d'"ouvrir des voies thérapeutiques" contre le stress post-traumatique. Il décrit lui-même une douleur, une peur et "une angoisse liée à la répétition du choc en l'absence d'échappatoire", qu'il dit inévitable car elle est "l'essence même du conditionnement de peur".
Objectifs
"Les troubles du stress post-traumatique (TSPT) sont des troubles psychiatriques qui surviennent après un événement traumatisant. Ils se traduisent par une souffrance morale et des complications physiques qui altèrent profondément la vie personnelle, sociale et professionnelle". Parmi ces troubles, on trouve une dérégulation du système de stress et une résurgence importante des souvenirs traumatisants, rendant la personne anxieuse face à des situations normalement non anxiogènes. Au sein du cerveau, la peur nait de l'interaction de plusieurs régions, parmi lesquelles l'amygdale joue un rôle prépondérant. De plus, cette structure est à la base des réponses autonomes, comportementales et émotionnelles de la peur, faisant de ce noyau une structure de choix pour l’étude des TSPT. Dans l'amygdale, l’ocytocine (OT) a été récemment identifiée comme étant un candidat pour le traitement de la peur pathologique. Ainsi, l’OT est un candidat de choix pour agir sur la modulation des réponses émotionnelles face à la peur ou son souvenir. Par ailleurs, un intérêt croissant émerge sur l'implication des cellules non neuronales tels que les astrocytes dans la régulation des circuits neuronaux. De plus, il a été récemment démontré que l'OT pouvait agir sur les astrocytes de l'amygdale via son récepteur présent sur ces cellules. Ce projet vise à élucider l’effet de l’activation des récepteurs à l’ocytocine (OTR) de l’amygdale via l’application de molécules modifiant l'activité de ce récepteur. Lors des études ex vivo, nous évaluerons l'activité des neurones et des cellules gliales sur des tranches de cerveau comportant l'amygdale centrale. Elles apporteront de nouvelles connaissances quant aux mécanismes d’action des TSPT, en observant particulièrement si une interaction neurone-glie est requise. Les études in vivo se feront à l’aide d’un modèle de TSPT et les observations seront menées sur l'expression de la peur conditionnée.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes cérébraux mis en place au cours de l'acquisition et de l'extinction de la peur ce qui permettrait d'ouvrir des voies thérapeutiques permettant de réduire les symptômes de personnes traumatisées ou excessivement anxieuses.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 principales interventions: A. Une biopsie du cerveau suivant une anesthésie dissociative. B. L'implantation de canules intracérébrales permettant d'administrer des agents pharmacologiques dans les structures cérébrales étudiées. Nos nous limiteront à 1 chirurgie (1h) et 1 injection intracérébrale (5 minutes) par animal. C. Le conditionnement de peur se dérouleras sur 3 jours. Elle dureras 20 minutes le premier jour puis 60 minutes les deux jours suivants.
Impact sur les animaux
Pour les expériences ex vivo (point A), la nuisance se limite à l'insertion d'une aiguille pour injecter l'anesthésique. La procédure étant sans réveil, aucune autre nuisance n'est attendue. L'implantation de canules intracérébrales (point B) peuvent entrainer des démangeaisons et une légère douleur au site d'incision sont attendues après l'opération. Pour limiter au maximum ces effets indésirables, nous prendrons des dispositions pré-opératoires (injection d'analgésiques locaux ansi que d'anti-inflammatoires), pendant l'opération (gel hydrolique pour empêcher la déshydratation des yeux, couverture chauffante pour l'hypothermie) et en post-opératoire (suivi du poids et de l'apparence des souris, anti-inflammatoire dans l'eau de boisson). Enfin, pour le protocole de conditionnement de peur, le concept de cette expérience est de créer une peur à un son en associant ce dernier à un choc électrique ; la nuisance liée au choc ne peut donc pas être évitée. Celle ci comprend une douleur, une réaction de peur (liée au caractère aversif et imprédictible de l'apparition du choc) ainsi qu'une angoisse liée à la répétition du choc en l'absence d'échappatoire. Dans ce protocole, même si nous comptons réduire au maximum cette angoisse, elle ne peut être évitée car elle est l'essence même du conditionnement de peur. Les souris recevront 2 à 4 chocs d'une intensité de 0,4 à 0,6mA sur une session de 20 minutes. Ces valeurs seront déterminées lors d'expériences préliminaires visant à estimer quels sont les paramètres minimums permettant l'installation d'une peur conditionnée.
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort afin de réaliser une biopsie du cerveau et analyse ex vivo. Ainsi, les animaux sont toujours utilisés pour une procédure "sans réveil" à la fin des expériences.
Remplacement
Notre étude porte sur l’analyse de l’activité complexe de réseaux neuronaux qui ne peuvent être pour le moment reproduits in vitro ou in silico. Il n’est donc pas possible, à ce jour, de remplacer l’usage d’animaux vivants. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Dans l'objectif de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous comptons réaliser les expériences ex vivo (électrophysiologie et imagerie calcique) sur les animaux utilisés lors du fear conditionning. Ces expériences ex vivo étant "sans réveil", cela n'apportera d'inconforts surnuméraires aux individus utilisés. Pour toutes les expériences, la normalité des données sera évaluée puis une ANOVA (ou son équivalent non paramétrique) et des tests post hoc seront effectués. Toutes les comparaisons seront faites à une seuil de significativité de 5%. L'effectif a été évalué en se basant sur les travaux réalisés précédemment dans l'équipe. Ce chiffre est une estimation du nombre d'animaux nécessaires pour obtenir 10 à 20 enregistrements, représentant une unité statistique robuste. L'utilisation d'un nombre d'animaux plus faible pourrait induire un biais et ainsi affaiblir les conclusions. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef.
Raffinement
Pour répondre aux besoins comportementaux des animaux, ils seront hébergés en cages collectives avec de l'enrichissement. Cet enrichissement comportera de la frisure et du coton pour qu'elles se fassent des nids de toute splendeur. Des bâtons à ronger seront aussi mis à disposition dans les cages d'hébergement. De plus, nous ajouterons des tunnels afin de rendre le change de cages moins stressant. Enfin, les souris étant des animaux sociaux, elles seront hébergées par cage de 2 à 5. Au cours des chirurgies, nous nous assurerons de la présence d'une couverture anesthésique et analgésique. Nous utiliserons aussi des tapis chauffant afin d'éviter la diminution de la température corporelle due à l'anesthésie. De l'ocrygel sera aussi placé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Après la chirurgie, du Gel Diet seras placé dans la cage afin de faciliter l'hydratation et la prise de nourriture. Des points limites spécifiques aux procédures ont été établis ce qui permettra d'interrompre les procédures à tout moment et donc soustraire l'animal à la souffrance. Pour le conditionnement de peur, nous comptons réaliser des tests préalables sur : 1) le nombre de choc et 2) la l'intensité de ces derniers. Nous comptons essayer d'appliquer peu de choc (2) de faible intensité (0,4mA) et tester si cela suffit à produire un robuste conditionnement de peur. Si ce protocole s'avère être trop faible, nous augmenterons le nombre de choc jusqu'à un maximum de 4 et si cela n'est toujours pas suffisant, nous augmenterons l'intensité des chocs, le tout sans jamais dépasser 0,6mA, correspondant aux valeurs hautes observées dans la bibliographie du domaine.
Choix des espèces
Le modèle expérimental chez la souris est un standard pour ce type d'expérience et comporte une série de symptômes superposables avec la pathologie humaine. La grande majorité des expériences réalisées à ce jour concernant l'action de l'ocytocine au sein de l'amygdale ont été effectuées chez la souris. Ainsi, il nous pourrons aisément comparer et interpréter les résultats et pour la qualité des mesures effectuées, il est préférable de travailler chez cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 5 semaines. En effet, nous nous intéressons ici à un mecanisme qui n'est pas développemental et pour cette raison nous souhaitons utiliser des animaux matures. Sachant que l'encéphale se développe encore jusqu'à la cinquième semaine, nous avons donc choisi d'utiliser des animaux à partir de 5 semaines.
Caractérisation cellulaire de l’horloge circadienne chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les 96 souris de ce projet appartiennent à des lignées génétiquement modifiées, conçues pour que l'équipe puisse éteindre l'activité électrique ou l'horloge moléculaire de cellules précises de leur cerveau. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une injection dans la profondeur du cerveau sous anesthésie générale, puis un hébergement en cage individuelle équipée d'une roue, pour mesurer leur rythme d'activité sous alternance de jour et de nuit, puis dans l'obscurité constante. L'effet recherché est une perte ou un décalage de leur rythme circadien, qui peut provoquer selon le porteur une fatigue liée à des troubles du sommeil. Toutes sont tuées en fin de procédure pour vérifier au microscope l'emplacement de l'injection, et une souris qui perdrait 15 % de son poids serait tuée avant, par dislocation cervicale.
Objectifs
En France, environ 15% de la population active est concernée par le travail de nuit. Ce mode d'organisation du travail augmente les risques de troubles du sommeil et du métabolisme, de cancer ou de problèmes cardiovasculaires et psychiques. Pour répondre à cet enjeu de santé publique, il convient de mieux connaitre l'horloge interne qui régule nos rythmes biologiques en adéquation avec le cycle jour-nuit de 24 heures. Cette horloge circadienne (= "autour du jour") est localisée dans une petite structure du cerveau profond, appelée les noyaux suprachiasmatiques (NSC). Les NSC contiennent environ 10000 cellules nerveuses, douées d'une rythmicité circadienne autonome reposant sur un petit ensemble de gènes, appelés gènes de l'horloge. Alors que les interactions entre ces gènes de l'horloge sont maintenant bien connues et définissent les rouages moléculaires de l'horloge, le rôle des différentes cellules des NSC reste mal connu. Pour répondre à cette question, notre approche expérimentale vise à éteindre l'activité électrique ou à inactiver le mécanisme de l'horloge moléculaire dans des populations cellulaires spécifiques des NSC chez des souris génétiquement modifiées. Notre objectif sera de cibler une dizaine de populations cellulaires différentes et d'identifier lesquelles participent au rythme de locomotion circadienne, mesurée à l'aide d'une roue d'activité dans la cage des animaux.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra d'identifier les cellules régulant les rythmes circadiens, et selon quelle modalité (phase, amplitude, période?). Cette dissection cellulaire de l'horloge circadienne des Mammifères est une étape essentielle pour comprendre le fonctionnement physiologique de l'horloge et son dérèglement pathologique dans le cadre de notre société moderne, active 7 jours sur 7, 24 heures sur 24. A terme, les cellules ainsi identifiées pourraient constituer la cible de traitements adaptés pour accompagner les travailleurs de nuit et les voyageurs souffrant de jetlag. Un autre bénéfice attendu consiste dans l'obtention de nouvelles données sur le rôle du canal NALCN que nous ciblerons pour éteindre l'activité électrique des cellules des NSC. Ce canal ionique est associé à des maladies génétiques rares. Les enfants touchés par ces maladies développent très souvent des troubles du rythme veille-sommeil. Comprendre le rôle précis de NALCN dans l'horloge circadienne serait une avancée majeure pour alléger les conditions de vie de ces jeunes patients et de leur famille, déjà confrontés à des situations très sévères.
Procédures
Injection intra-cérébrale sous anesthésie générale. Hébergement en cage individuelle (avec contact visuel avec des congénères) pour mesure du rythme de lcomotion volontaire dans une roue d'activité.
Impact sur les animaux
L'effet attendu des manipulations réalisées est une perturbation de l'horloge circadienne : diminution ou perte totale de la rythmicité circadienne, ou déphasage entre le rythme interne et le cycle jour-nuit extérieur. La perte de rythme n'est a priori pas dommageable sur la durée du protocole. Le déphasage peut provoquer une fatigue liée à des troubles du sommeil. Sur le long terme, le développement d'un syndrome métabolique (diabète, obésité) ou au contraire un amaigrissement est possible, ainsi qu'un risque accru de cancer est possible. Cependant, ces effets extrêmes ne sont pas envisageables en quelques semaines. La nuisance potentiellement causée par la procédure chirurgicale d'injection stéréotaxique sera traitée par anesthésie/analgésie et surveillance des animaux
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour réaliser une vérification histologique du site d'injection.
Remplacement
Le fonctionnement moléculaire de l'horloge a déjà été largement étudié in vitro. Mais comprendre l'impact de ce mécanisme dans des cellules spécifiques au sein d'un organisme nécessite le recours aux modèles animaux. Ici, nous regarderons comment une manipulation cellulaire dans le cerveau profond modifie le rythme repos-activité chez la souris. Les résultats expérimentaux que nous obtiendrons révéleront la complexité fonctionnelle de l'horloge circadienne. Ces données pourront servir de base pour une modélisation réaliste de ce système.
Réduction
Pour chaque groupe expérimental, la quantité totale d'activé sera mesurée en condition d'éclairage jour-nuit, puis d'obscurité constante. Les paramètres du rythme d'activité locomotrice, directement liés à l'horloge, seront évalués sous ces conditions d'obscurité constante (= conditions de libre cours) : 1. Analyse qualitative : le rythme circadien d'activité est-il préservé ou aboli? 2. Analyse quantitative : si une rythmicité est préservée, la période du rythme en conditions de libre cours sera le paramètre limitant. Nous avons réalisé une étude statistique (programme G-Power) pour estimer la taille nécessaire de nos groupes expérimentaux.
Raffinement
L'injection stéréotaxique de petits volumes (1 µl) dans les NSC est largement documentée, et maitrisée dans notre équipe. Cette opération est conduite sous anesthésie générale de l'animal, et est suivie d'une observation accrue pendant la phase de réveil, avec utilisation d'analgésiques et per- et post-opératoire. La mesure de l'activité locomotrice implique l'hébergement en cage individuelle, équipée d'une roue d'activité. Pour limiter l'isolement social, les animaux garderons un contact visuel avec leurs congénères. D'autre part, l'accès à la roue constitue un enrichissement des conditions d'hébergement très apprécié. Les animaux seront observés visuellement de façon quotidienne. En plus des signes de souffrance couramment recherchés (prostration, poil hérissé, amaigrissement), nous utiliserons la mesure d'activité locomotrice comme point limite spécifique à la procédure mise en œuvre : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par des souris contrôles sera pesée et observée plus en détail. En fonction des signes cliniques observés, la souris aura accès à une nourriture hydratée et/ou un analgésique adapté. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% au poids avant l'opération, alors elle sera euthanasiée par dislocation cervicale.
Choix des espèces
La souris est un modèle mammifère de choix, donnant accès à un grand nombre de lignées génétiquement modifiées. Ici les lignées Bmal1-flox et Nalcn-flox sont uniques et particulièrement adaptée pour répondre à la question posée. D'autre part, la mesure de l'activité locomotrice volontaire dans des cages à roue est un outil très largement utilisé en chronobiologie pour évaluer le fonctionnement de l'horloge circadienne des rongeurs. Souris jeunes adultes (7-8 semaines), lorsque la croissance est terminée pour des coordonnées stéréotaxiques fiables.