Recherche fondamentale

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène puis six séances d'électrostimulation du mollet sous anesthésie générale sur sept jours, pour étudier le rôle d'une protéine dans l'adaptation du muscle à l'exercice. Le porteur qualifie les nuisances de modérées du fait du cumul d'injections, d'électrostimulations et d'anesthésies. Il affirme que le modèle animal est "indispensable", l'électrostimulation étant selon lui impossible à reproduire in vitro et l'analyse ne pouvant se faire que sur "l'organisme entier".

Objectifs

Le maintien de la quantité et de la qualité du tissu musculaire strié squelettique est crucial pour une bonne qualité de vie, et est facilité par la remarquable capacité de ce tissu à s’adapter soit à une augmentation de l’activité musculaire (exercice physique) soit à une diminution de l’activité musculaire (immobilisation, alitement prolongé). Les cellules souches musculaires (les cellules satellites) ont une contribution importante à cette capacité d’adaptation du tissu musculaire grâce à leur capacité de différenciation et de fusion avec les fibres musculaires, processus conduisant à une accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires. Cette accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires dépend des propriétés énérgétiques des cellules souches et de la fibre musculaire. Ainsi, des données obtenues sur des cultures cellulaires montrent qu’une protéine X régulant les processus énergétiques des cellules favorise l’accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires. Il a également été démontré qu’un protocole d’exercice consistant à électrostimuler les muscles du mollet de souris saines se traduit par une augmentation du nombre de noyaux au sein des fibres musculaires. Nous avons donc pour objectif d’utiliser ce protocole d’exercice par électrostimulation afin d’étudier le rôle de la protéine X dans l’accumulation de noyaux générée par l’exercice. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des cellules souches musculaires dans le maintien du bon fonctionnement du muscle strié squelettique et l’influence d’une protéine dont la fonction est de réguler les processus énergétiques cellulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale permet de mieux comprendre le rôle d’une protéine régulant les processus énergétiques des cellules souches dans le fonctionnement du tissu musculaire.

Procédures

Chaque animal recevra une injection par jour de tamoxifène ou d’huile en intra péritonéale pendant 4 jours. Chaque animal sera ensuite soumis à 6 séances d’exercice d’électrostimulation du mollet réparties sur une période de 7 jours (i.e., 3 séances consécutives, 1 jour de repos, 3 séances consécutives). Chaque séance d’exercice d’électrostimulation sera réalisée sous anesthésie générale et durera un maximum de 20 minutes. Afin d’évaluer la progression du cycle cellulaire des cellules souches musculaires, les animaux seront supplémentés à l’aide d’un analogue de la thymidine (0,5 mg/ml repris dans une solution glucosée à 1%) administré dans l’eau de biberon 24h avant la première séance et jusqu’à la fin de la procédure expérimentale (soit pendant 8 jours consécutifs).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, électrostimulation, anesthésies). L’injection de tamoxifène dans les animaux adultes n’induit pas en soi de phénotype dommageable comme montré dans des études précédentes. Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables de l’administration d’EdU dans l’eau de biberon. Il a été démontré que le protocole d’exercice par électrostimulation n’induit aucune altération de la fonction et de la structure musculaire ainsi qu’aucun changement de mobilité, d’activité et de comportement des animaux. Aussi, il a été démontré que les anesthésies répétées à l’isoflurane liées au protocole d’électrostimulation n’induisent pas de troubles anxieux ou de modifications du comportement, de l’activité et de la mobilité des animaux. Les animaux ne présentent aucun signe de prostration ou d’amaigrissement et sont en mesure de se mouvoir, de s’alimenter et de s’hydrater normalement dès leur réveil. Enfin, aucun animal n’a dû être mis à mort du fait de la procédure d’exercice par électrostimulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice d’électrostimulation qui est impossible à reproduire in vitro. Aussi, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe

Réduction

Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’électrostimulation et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous proposons d’établir des banques biologiques informatisées issues des expérimentations qui pourront à terme limiter l'utilisation de nouveaux animaux. Des prélèvements multiples sont réalisés après euthanasie sur le même individu pour des tests parallèles. L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Les analyses statistiques précédentes de l'équipe permettent d'ajuster le nombre d'animaux requis. La taille de l’échantillon (12 animaux par condition) a été déterminée en prévoyant, à l’aide de tests statistiques adaptés, une augmentation de 15% du nombre de noyaux par fibre à l’issue du protocole d’électrostimulation chez les animaux contrôles

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique à l'anesthésie générale profonde lors de l’exercice d’électrostimulation. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage afin d'enrichir l'environnement des souris. Aussi, un suivi quotidien des animaux permet d’éviter toute souffrance inutile et de prendre les mesures adéquates dans le cas d’un éventuel phénotype dommageable

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet d’invalider la protéine X soit dans la fibre musculaire, soit dans la cellule souche afin d’évaluer les impacts fonctionnels, tissulaires et cellulaires sous-jacents. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues dépourvues de microbiote, elles sont inoculées par voie orale avec des souches d'Escherichia coli dont une pathogène, puis tuées 72 heures après pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la souche pathogène peut provoquer faiblesse, diarrhée et déshydratation, les souris atteignant le point limite étant mises à mort par anticipation. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale capable de simuler un organisme constitué de plusieurs organes, comprendre ces mécanismes étant selon lui "indispensable" pour la santé publique.

Objectifs

Les Escherichia coli producteurs de shigatoxines (STEC) sont des bactéries responsables d’infections humaines. Les symptômes vont de la diarrhée bénigne à la colite hémorragique et au syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3 à 5 % et plus d’1/3 des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Compendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La shigatoxine est une protéine formée de 2 sous-unités codées par les gène stxA et B. Ces 2 gènes font partie du génome d’un bactériophage (virus infectant les bactéries), qui infecte spécifiquement E. coli. Le génome du bactériophage peut s’intégrer au chromosome des bactéries infectées. On parle alors de prophage. Le plus étudié des prophages des STEC est le prophage 933W. Expérimentalement, chez la souris, une souche d’E. coli dont le chromosome porte le prophage 933W est pathogène. Á l’inverse, les STEC chez lesquelles le prophage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Les gènes stxA et B sont précédés d’une séquence d’ADN qui contrôle leur expression. Cette séquence est reconnue par la machinerie cellulaire de la souris ou de l’Homme, ce qui amène à faire l’hypothèse que l’infection se déroule ainsi : libération des prophages dans l’intestin sous l’action d’un facteur environnemental qui stresse les bactéries porteuses ; les particules virales libérées traversent la muqueuse intestinale et pénètrent dans les cellules cibles de l’organisme (ex : cellules rénales) ; la séquence d’ADN qui contrôle l’expression des gènes stxA et B est reconnue par la machinerie cellulaire ; ces gènes sont alors exprimés et la shigatoxine est produite. L’objectif du projet est de tester cette hypothèse en comparant des souris inoculées avec l’une des souches d’E. coli suivantes : C600:933W (prophage et sa séquence d’ADN contrôlant les gènes stxA et B, souche pathogène), C600:933W delta-pr1 (prophage sans la séquence de contrôle, souche non pathogène), C600 (pas de prophage, souche non pathogène).

Bénéfices attendus

Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans l’expression des gènes stxA et stxB in vivo. L’utilisation de souris axéniques, c’est-à-dire dépourvues de microbiote intestinal, permettra de s’affranchir de facteurs confondants (transmission possible du prophage à d’autres souches d’E. coli présentes naturellement dans le microbiote intestinal), et de facteurs pouvant affaiblir le pouvoir pathogène de la bactérie modèle étudiée (effet « barrière » possible du microbiote intestinal). Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certaines de leurs manifestations cliniques. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5 %) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique de ces bactéries pathogènes, en particulier lors d’infection par les denrées alimentaires. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant.

Procédures

En début de procédure, les animaux sont soumis à un jeûne hydrique de 4 heures, suivie d'une unique inoculation par voie orale. Puis deux prélèvements de fèces à 24 h d’intervalle après l’inoculation sont réalisés. La procédure s’arrêtera 72 h après l’inoculation. Les animaux recevront une injection sous-cutanée d’un analgésique ayant une action puissante sur les douleurs viscérales. Une heure plus tard, ils seront profondément anesthésiés à l’isoflurane (dose létale). La paroi abdominale sera incisée, une ponction de la veine cave (située dans l’abdomen) sera faite pour prélever du sang, puis une perfusion intra-cardiaque sera faite pour éliminer le sang restant dans le système circulatoire afin de pouvoir prélever des tissus sans trace de sang, condition nécessaire pour des analyses histochimiques de bonne qualité. L'ensemble de cette procédure durera entre 5 et 10 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les groupes recevant la souche C600 ou la souche C600:933W delta-pr1 sont réduites. En effet, la seule intervention invasive sera une inoculation orale avec 150 µL de culture bactérienne. D’une part, ces souches ne sont pas pathogènes. D’autre part, l’inoculation sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les nuisances attendues dans le groupe recevant la souche pathogène C600:933W sont l’expression d’un syndrome infectieux : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures et des points limites seront mis en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition du syndrome infectieux. Fréquence de surveillance accrue aux premiers signes cliniques, et mise à mort anticipée si les symptômes atteignent le point limite indiqué dans la procédure expérimentale. Les souris sont mises à mort au plus tard 3 jours après l’inoculation, ce qui exclut toute nuisance à long terme. Pendant toute la durée de l’expérience, les souris seront maintenues en groupes sociaux de 3 individus, dans un environnement enrichi ; de l’eau stérile, des croquettes de nourriture stérile de formulation standard et de l’aliment gélifié stérile de formulation standard seront mis à leur disposition à volonté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Celle-ci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus dans lesquels seront pratiquées des analyses destinées à étudier l’effet de la production de shigatoxine par la souche d’Escherichia coli introduite dans le tube digestif des souris.Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L'analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative non animale suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.

Réduction

L’expérience de nos partenaires argentins dans le domaine étudié permet de considérer que 6 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 6 souris par groupe dans les deux groupes témoins. Dans le groupe inoculé avec la souche pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si la mise à mort est très anticipée par rapport à la date prévue pour mettre à mort toutes les souris, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 6 souris supplémentaires dans ce groupe, qui seront utilisées si nécessaire. Le protocole comportera donc 3 groupes de 6 souris, plus 6 souris supplémentaires, ce qui aboutit à un total de 24 animaux.

Raffinement

Il n’y a pas de souffrance liée à l’hébergement en isolateur. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 3 individus par cage, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau stériles seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, bûchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement disposé les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard (gel diet) seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue induites par un syndrome infectieux (possible dans le groupe inoculé avec la souche pathogène C600:933W). De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté par voir sous-cutanée aux souris si elles montrent des signes de déshydratation (1 ml par injection, 3 fois par jour). Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite les premiers signes d’un syndrome infectieux et décider d’une mise à mort anticipée si les points limites sont atteints. L’inoculation orale des souris avec les souches bactériennes sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Préalablement à la mise à mort des souris, au cours de laquelle une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque seront réalisées, un analgésique sera administré par voie parentérale (flunixine ; 2,5 mg/kg ; puissante action analgésique sur les douleurs viscérales).

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris (semaine suivant le sevrage). Chez l’Homme, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit dès l'âge de sept à dix jours une amputation d'orteil pour le génotypage, puis plusieurs séries d'injections et, pour une partie, un jeûne de vingt-quatre heures, dans un modèle génétique d'atrophie musculaire. Les souris sont mises à mort après les injections pour prélever les muscles et les organes. Le porteur affirme que l'analyse de la dégradation des protéines musculaires ne peut se faire sur cultures cellulaires et que le modèle souris est "essentiel".

Objectifs

Une fonte musculaire sévère est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme le cancer, les myopathies et le vieillissement. Cette perte de masse musculaire (atrophie) est très délétère pour le patient, affectant sa qualité de vie mais aussi réduisant la réponse aux traitements et la survie. Il n’existe aujourd’hui pas de traitement efficace permettant de freiner cette fonte musculaire. Un nouveau modèle de souris génétiquement a été généré, développant une perte de masse musculaire progressive, induite chez l’animal adulte, et récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les travaux portent sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cette atrophie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. L’ atrophie est induite chez l'animal adulte par des injections intrapéritonéales d'une molécule inductrice. Avant ce traitement inducteur, les animaux ne présentent aucune pathologie. Les premiers résultats expérimentaux sur ce modèle, montrent que la perte de masse musculaire est causée par un déséquilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines musculaires. Pour valider ces résultats, il est nécessaire d'effectuer une exploration fonctionnelle du flux de dégradation des protéines chez l'animal. Une accélération du flux de dégradation des protéines comme un blocage de ce flux sont délétères pour le fonctionnement du muscle, car conduisant respectivement à une dégradation accrue des protéines musculaires et à la persistance de composants cellulaires endommagés. Cette évaluation nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie et la mesure de l’accumulation de protéines marqueurs dans le muscle des animaux. Les souris seront mises à mort 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les muscles seront prélevés et analysés. Cette évaluation sera effectuée sur les animaux en condition normale nourrie et aussi après induction du processus de dégradation des protéines par un jeûne de 24 heures. La durée de 24heures de jeûne est requise pour activer et détecter une augmentation de la dégradation des protéines dans le muscle d'animaux contrôles.

Bénéfices attendus

Ces résultats permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la perte de masse musculaire, essentielle pour le développement de traitements efficaces et qui représentent un réel enjeu clinique. Ces expériences complémentaires permettront de finaliser la caractérisation des altérations musculaires générées par notre mutation, responsable de l’activation d’une signalisation d’atrophie dans le muscle. Ces résultats seront valorisés par une publication scientifique et sont essentiels pour comprendre et anticiper les conséquences de la modulation de cette signalisation sur la physiologie musculaire chez les patients. Cette caractérisation est par ailleurs nécessaire pour tester dans un second temps le bénéfice de la modulation des processus dérégulés sur la limitation de la perte et de la dysfonction musculaire. Ainsi en fonction des résultats obtenus, les données seront essentielles pour déterminer s’il est préférable de développer une approche pour limiter la dégradation des protéines par le processus autophagique dans les muscles de ce modèle ou s’il est préférable de mettre au point des stratégies permettant de restaurer le processus autophagique, afin de prévenir l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés responsables d’une altération de la fonction musculaire, comme c’est observé au cours du vieillissement musculaire.

Procédures

Tous les animaux subiront une phalengectomie entre l’âge de 7 jours et 10 jours, nécessaire à l’identification et au génotypage et justifié d'un point de vue scientifique pour les objectifs du projet. Tous les animaux recevront 4 injections intrapéritonéales consécutives à l’âge de 10 semaines environ, espacées de 24heures. Ensuite, soit 1 semaine soit 4 semaines après ces injections, tous les animaux recevront 3 injections intraperitonéales, espacées de 12 heures. Les souris seront mises à mort après ces injections. Les animaux concernés par la procédure 2 seront soumis à un jeûne de 24 heures en parallèle des dernières injections.

Impact sur les animaux

Suite au traitement inducteur de notre mutation, chez la souris adulte, les animaux développent une perte de masse musculaire progressive récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Il ne présente pas de signe de souffrance avant 7 mois après cette induction. Nos expériences seront réalisées au plus tard 4 semaines après l’induction de l’activation du processus d’atrophie musculaire, à un stade où leur état général n’est pas altéré, aucune modification de leurs déplacements et prise de nourriture n’est observée. L’évaluation du flux de dégradation des protéines nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie. Les souris seront mises à mort maximum 2 jours après les injections de l'inhibiteur. Cette évaluation sera effectuée sur les animaux en condition normale nourrie et aussi après induction du processus de dégradation des protéines par un jeûne de 24 heures. La durée de 24heures de jeûne est requise pour activer et détecter une augmentation de la dégradation des protéines dans le muscle d'animaux contrôles.

Devenir

Les animaux seront mis à mort, les muscles et autres organes seront prélevés pour des analyses expérimentales.

Remplacement

L'analyse du flux de dégradation des protéines dans le muscle de notre modèle animal ne peut être effectuée sur des cultures de celllules. Le modèle murin est essentiel pour étudier fonctionnellement le muscle et également étudier l’impact des défauts musculaires sur le reste de l’organisme.

Réduction

Nous utiliserons le nombre d’animal minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le maximum de données pouvant être généré à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Les analyses en condition de jeûne (procédure 2) ne seront pas effectuées si les résultats obtenus en procédure 1 montrent des défauts autophagiques en condition basale nourri et sont suffisants pour conclure. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une consultation approfondie de la littérature permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Des effectifs de 8 animaux par groupe seront privilégiés. Des tests de comparaisons de moyennes (test-t) ou de rang (non-paramétrique) seront utilisés pour comparer deux groupes, des tests ANOVA ou Kruskall-Wallis (non-paramétrique) seront effectués pour les comparaisons multiples (groupes controles/mutants, traités colchicine ou non-traités, nourris/à jeun). Le personnel est formé à ces analyses. Nous souhaitons pouvoir étendre nos groupes à 12 animaux pour prévenir une potentielle hétérogénéité provenant de la réponse à la colchicine. Une adjonction progressive d'animaux supplémentaires sera envisagée jusque 12 animaux par groupes en s'appuyant sur une évaluation statistique.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée. Les animaux seront surveillés quotidiennement, pesés une fois par semaine et ensuite quotidiennement lors des injections d’inhibiteur autophagique et la mise à jeun. Aliment et eau gélifiée seront mis à disposition sur le sol de la cage en cas de diminution de la mobilité observée. La durée du jeûne pourra être ajustée en fonction du comportement, du poids et de l'état des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront mis à mort immédiatement si signes de souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d'animaux génétiquement modifiés grâce à la stratégie cre/lox. La physiologie musculaire des souris est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour que l’on puisse en tirer des données extrapolables. La souris est un modèle très accessible, de maintien aisé et manipulable génétiquement afin de répondre au questionnement scientifique Le projet porte sur la compréhension des mécanismes impliqués dans l'atrophie musculaire induite par l'activation de notre signalisation d'intéret, après la phase de croissance post-natale du muscle, dans le muscle adulte. L’induction de notre transgène par injection de tamoxifène est donc réalisée à la fin de cette croissance post-natale vers 10 semaines environ. Les injections d'inhibiteur de l'autophagie seront effectuées soit 1 semaine après les injections de tamoxifène (animaux de 11 semaines) soit 4 semaines après ajout de tamoxifène (animaux de 15 semaines). L'étude de ces deux stades 1 semaine et 4 semaines après l'induction de l'expression du transgène est motivée par nos résultats expérimentaux préalables suggérant une activation de l'autophagie au début de l'atrophie du muscle et ensuite un blocage qui conduirait à l'accumulation de mitochondries endommagées dans les fibres musculaires.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris hémophile reçoit une injection de thérapie génique, des prélèvements sanguins rétro-orbitaux toutes les quatre semaines, puis un test de temps de saignement où l'extrémité de la queue est sectionnée sur trois millimètres. Le porteur indique que les animaux, encore sous anesthésie et ayant perdu du sang, sont tués par dislocation cervicale sans réveil. Il affirme que les tests in vitro ne reproduisent pas l'ensemble du processus de coagulation.

Objectifs

L'hémophilie A est une maladie hémorragique rare affectant principalement les hommes (1 naissance de garçons sur 5000 environ). Il s'agit d'une maladie génétique et le gène affecté est celui du facteur VIII, une protéine clé de la cascade de la coagulation. Si la maladie n'est pas traitée, l'espérance de vie est en moyenne de 15 ans. Le traitement standard de l'hémophilie A repose sur l'injection intraveineuse régulière (2-3 fois/semaine) de facteur VIII soit recombinant, soit purifié à partir de plasma. Ce traitement est lourd et coûteux. Récemment un anticorps thérapeutique qui peut se substituer au facteur VIII a été développé. Cet anticorps (Emicizumab) a montré une très bonne efficacité chez les patients hémophiles A sévères et est désormais approuvé par les autorités de santé. Il est administrable par voie sous-cutanée 1-2 fois/mois. L’Emicizumab ne normalise pas la coagulation mais transforme une hémophilie sévère en hémophilie mineure. De ce fait, un traitement par Emicizumab n’est pas toujours suffisant et doit parfois être utilisé en combinaison avec d’autres agents procoagulants. L’effet de telles associations est encore très mal connu et lors des essais cliniques sur l’Emicizumab, il y a eu malheureusement des accidents pro-thrombotiques et des cas de décès de patients dus à un emballement du système de coagulation. De plus, son utilisation est coûteuse et de ce fait 70% des patients dans le monde n'ont pas accès à ce type de thérapie. L'objectif de ce projet est de répondre à ces 2 limites, le risque de thrombose par utilisation d'un anticorps thérapeutique mimant le FVIII et le coût élevé d'un traitement par injection d'un anticorps purifié de façon régulière. Pour répondre à cet objectif, le but de notre projet est de tester in vivo un nouvel anticorps thérapeutique développé par une biotech, qui comme l’Emicizumab a montré in vitro qu’il corrigeait l’hémophilie. Cet anticorps a montré dans des tests in vitro que contrairement à l'Emicizumab il évitait les thromboses. Il sera exprimé in vivo par l’utilisation d’un vecteur viral qui permettra en une injection une expression sur plusieurs années de la thérapie. Il s'agira de déterminer si cette nouvelle thérapie est efficace pour corriger les saignements anormaux observés chez un organisme vivant hémophile.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de répondre à plusieurs attentes actuelles concernant les traitements des patients hémophiles : 1) Eviter les effets secondaires des nouveaux traitements notamment les risques de thromboses chez certains patients. 2) Utiliser un système thérapeutique, la thérapie génique, éliminant les injections intraveineuses répétées qui sont douloureuses pour les patients. 3) Réduire le coût des traitements et rendre plus accessible les traitements au 70% de la population mondiale hémophile qui n'a toujours pas accès à une thérapie. L'espérance de vie d'un patient hémophile sévère sans thérapie est de 15 ans.

Procédures

Les souris sont injectées vigiles au niveau de la veine latérale de leur queue avec 200 µl d'un solution d'AAV. Elles sont observées pendant 12 semaines avec un prélèvement rétro-orbitalde sanguin toutes les 4 semaines. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Au terme des 12 semaines de suivi, un test de temps de saignement sera réalisé afin de vérifier l'efficacité fonctionnelle de l'anticorps exprimé. Le test de temps de saignement sera réalisé sur les souris sous anesthésie (l’extrémité de la queue de la souris est sectionnée sur 3 mm à l'aide d'un scalpel stérile). Les animaux sont gardés en vie au maximum 35 minutes lors du test de coupure de l’extrémité de leur queue (5 minutes pour l'anesthésie, suivie de 30 minutes pour le test de saignement).

Impact sur les animaux

Pendant les 12 semaines maximums de suivi de l'expérience, les souris hémophiles à la suite de l'injection de la thérapie génique risquent principalement de développer des hémorragies. Pendant le temps de saignement, l'animal sera sous anesthésie par un mélange Xylazine (10 mg/kg) –Kétamine (100 mg/kg). Si pendant cette période, l’animal présente des signes de réveil, une nouvelle dose d’anesthésiant sera administrée (demi-dose par rapport à la dose initiale).

Devenir

Tous les animaux sont encore sous anesthésie à la fin de la procédure où ils subissent un test de saignement qui dure 30 minutes. Ils auront alors perdu pour certain un volume de sang important. Il est plus éthique de ne pas réveiller les souris utilisées dans la procédure de ce projet et de les euthanasier par dislocation cervicale.

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, autant des molécules procoagulantes que leurs inhibiteurs mais aussi des phospholipides membranaires, des cellules sanguines, les vaisseaux sanguins et les tissus. Actuellement les tests disponibles in vitro, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus. Par conséquent, afin de tester l’efficacité anti-hémorragique du Bi8 via thérapie génique, il est crucial de pouvoir tester son effet dans un modèle animal d'hémophilie A.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à l’ensemble de l’étude a été défini pour chaque procédure de façon à avoir une réponse statiquement analysable sur tous les paramètres mesurés. Les mêmes souris permettront de mesurer différents paramètres : taux d’expression de l'anticorps thérapeutique, efficacité du traitement à restaurer la coagulation, effet du traitement sur le bien-être et sur la survie de l’animal, sur le bilan de cellules sanguines. Nous prévoyons d’utiliser 50 souris déficientes en FVIII pour ce projet.

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec des groupes sociaux stables sans isolement, un accès à volonté à la nourriture et à la boisson. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement du milieu : morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid, en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Les animaux seront suivis individuellement et ils seront obligatoirement euthanasiés aux points limites définis dans la procédure. L’anesthésie générale sera induite dès la sortie du groupe afin d’éviter tout stress. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin d'hémophilie A (souris déficientes en facteur VIII) est bien caractérisé et a été utilisé dans la littérature scientifique comme un modèle préclinique valide d’hémophilie, reproduisant la pathologie humaine et permettant ainsi les tests de nouvelles thérapies anti-hémorragiques notamment la thérapie génique. Les souris seront injectées entre 6-12 semaines lorsqu'elles auront atteint un poids de 18-25 gr. La durée de suivi des expériences de thérapie génique (6-12 semaines) est alors compatible avec une fin de procédure à un âge compris entre 12 et 24 semaines. A ce stade, leur poids est tout à fait compatible avec la réalisation des expériences de saignement pour tester l'efficacité de la thérapie.

1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter dans la veine jugulaire par chirurgie sous anesthésie, puis s'auto-administre de l'héroïne pendant vingt jours en cage opérante, jusqu'à six heures par jour, pour identifier des facteurs de vulnérabilité à l'addiction et à la rechute. Les rats sont ensuite mis à mort pour prélever le sang et le cerveau. Le porteur affirme que les méthodes alternatives sont "impossibles" et présente le rat comme un "modèle de référence" dans le domaine des addictions.

Objectifs

Notre étude se focalise sur l'identification: 1) Des facteurs biologiques de vulnérabilité à développer une addiction à l’héroïne. Pour cela nous identifierons des marqueurs sanguins reflétant des modifications cérébrales, qui pourraient ultérieurement être utilisés comme outils de diagnostic et de pronostic dans les études cliniques; 2) Des facteurs de vulnérabilité à la rechute et des facteurs de variabilité à la réponse thérapeutique afin de pronostiquer l’efficacité des traitements de substitution aux opioïdes. Pour cela nous identifierons des marqueurs sanguins, reflétant des modifications cérébrales, qui pourront là aussi être utilisés comme outils de diagnostic et de pronostic dans les études cliniques. De plus, parallélement à l’identification de facteurs de variabilité et vulnérabilité, grâce à des études morphologiques et de transcriptomique sur les cerveaux des animaux, nous pourrons identifier de nouvelles voies de signalisation cellulaire jouant un rôle critique dans les différentes étapes du processus d’addiction (mise en place du comportement, et rechutes), offrant la possibilité de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. L’ensemble de projet permettra donc d’affiner la prise en charge des personnes dépendantes aux opioïdes, d’assurer un meilleur suivi en abordant la problématique des rechutes qui sont malheureusement très fréquentes en clinique humaine, et d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale a plusieurs bénéfices attendus sur la base de nos objectifs qui sont : L’identification des facteurs biologiques de vulnérabilité à développer une addiction à l’héroïne; L’identification des facteurs de vulnérabilité à la rechute et des facteurs de variabilité à la réponse thérapeutique afin de pronostiquer l’efficacité des traitements de substitution aux opioïdes; l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce rojet nous permettra, grâce à l’identification de marqueurs sanguins reflétant ce qui peut être observé au niveau central, d’affiner la prise en charge des personnes dépendantes aux opioïdes. Ce projet permettra également d’assurer un meilleur suivi de l’efficacité des traitements de substitution, en étudiant la problématique des rechutes, qui sont malheureusement très fréquentes en clinique humaine. Et enfin, l’ensemble des résultats qui seront obtenus au niveau central, permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la prise en charge des patients dépendants aux opioïdes.

Procédures

Tous les animaux du protocole (N= 1344) seront soumis à une anesthésie générale, pour poser un cathéter dans la veine jugulaire. durant cette anesthésie, 0,6 ml de sang seront prélevés via le cathéter pour éviter la souffrance à l'animal. Cette chirurgie dure environ 45 min. Tous les animaux ayant reçu le cathéter (N=1344), seront soumis au protocole d'auto-administration d'héroïne pendant 20 jours. Pour cela, tous les jours, les animaux sont placés en cage opérante pendant 1heure pour la moitié des rats, ou pendant 6 heures, pour l'autre moitié. Le nombre d'injections d'héroïne, directement par le cathéter, est variable en fonction des animaux. En effet l'injection suit l'appui sur un levier qui est une action que le rat exerce librement dans la cage opérante. Immédiatement après les jours d'auto-administration, 1260 rats seront soumis à une nouvelle anesthésie générale pour la pose en sous-cutanée d’une pompe permettant la libération prolongée d’un traitement pharmacologique. Lors de cette nouvelle anesthésie générale, 0,6 ml de sang seront prélevés via le cathéter. Cette chirurgie dure entre 5 et 10 min.

Impact sur les animaux

Les procédures qui seront réalisées le sont déjà dans des projets antérieurs. La pose du cathéter endovasculaire et des pompes osmotiques sera réalisée sous anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur pré-et post-opératoire. Le protocole d’auto-administration d’héroïne pendant 20 jours peut entrainer une prise de poids un peu moins forte des animaux au cours de l’expérience, mais avec des différences qui restent inférieures à 10% par rapport aux contrôles (sauf atteinte d’un point limite). Dès l’arrêt du protocole d’auto-administration, les animaux reprennent une courbe de prise de poids tout à fait identique à celle des rats contrôles. A la fin des 20 jours d’auto-administration, les animaux recevront une pompe osmotique, permettant le mise en place d’un traitement de substitution. Ce traitement permet d’éviter les symptômes de sevrage. Chez les animaux contrôles ces symptômes pourront être observés (mobilité réduite, diminution des toilettages, courbe de reprise de poids un peu plus lente que chez les rats sous substitution). Au bout de 48 - 72 heures ces symptômes disparaissent spontanément.

Devenir

Induction d'une anesthésie profonde, puis mise à mort, pour récupération d'échantillons sanguins et récupération des cerveaux post-mortem. Ces échantillons sont indispensables pour identifier des marqueurs sanguins de vulnérabilité et de variabilité comme décrit dans nos objectifs, et pour les études morphologiques et transcriptomiques des cerveaux qui seront réalisées à la suite.

Remplacement

Ce projet ayant pour but d’étudier des phénomènes psychiatriques associés à des modifications comportementales d’auto-administration de drogue, les méthodes alternatives actuelles (e.g., modélisation, études in vitro) sont impossibles. Ce projet a pour but d’étudier des modifications cérébrales complexes et des modifications comportementales qui s’inscrivent dans le cadre d’une étude intégrée. L'objectif est également de rechercher des biomarqueurs périphériques prédictifs de la réponse aux traitements de substitution, et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient être pertinentes dans la prise en charge des patients dépendants aux opioïdes. Il doit donc être réalisé sur des animaux vivants.

Réduction

Pour réduire au miminum le nombre de rats utilisés, nous avons estimé la taille de échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données obtenues lors de projets précédents. Chaque groupe sera constitué de 14 animaux pour révéler des différences inter-individuelles comportementales.

Raffinement

L’hébergement s’effectuera dans un environnement enrichi (nids végétaux et un tunnel opaque où ils pourront s’isoler). Les rats seront également logés à deux par cage d’habitation permettant un enrichissement social tout en assurant un espace d’hébergement suffisant. Pour réduire au maximum l’angoisse des animaux ils seront habitués à l’expérimentateur par une manipulation quotidienne de 7 jours avant la chirurgie. La chirurgie endovasculaire et l’implantation des pompes osmotiques seront réalisées par une personne compétente ayant suivie la formation réglementaire de chirurgie. Pour éviter la souffrance, les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale Les études expériences comportementales commenceront après récupération totale des animaux, au moins 7 jours après la chirurgie endovasculaire.

Choix des espèces

L’investigation d’une pathologie telle que l’addiction nécessite d’étudier une espèce animale phylogénétiquement voisine de l’homme pour pouvoir reproduire la maladie. Le rat est un modèle de référence dans le domaine des addictions. Il possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. De plus, il est idéal pour les études comportementales. Le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés. Enfin, le rat présente un certain nombre de similitudes de séquences génétiques et de régulations géniques avec l’Homme, ce qui en fait un modèle très intéressant lors de l’étude des régulateurs génétiques. Les animaux testés seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 7 semaines environ et ne sont pas testés avant leur 8ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte pour pouvoir éviter le facteur confondant de l’âge sur les facteurs comportementaux mesurées. En effet, l’âge peut influencer de manière significative l’état émotionnel et le comportement de l’animal, un animal vieux pourra ainsi présenter un déclin cognitif ou une diminution de l’exploration par exemple. De même un rat adolescent pourra présenter un comportement différent de l’adulte (exploration plus importante, une prise de risque et une recherche de la nouveauté plus importantes).

158 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de quatre heures pour poser une prothèse, puis un isolement pouvant durer soixante jours et plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie, pour mesurer le couplage neurovasculaire par TEP et ultrasons en neuropharmacologie. Le porteur indique que la fenêtre crânienne empêche de regrouper ou d'adopter les rats, qui sont donc euthanasiés dès la dernière acquisition. Il juge "indispensable" le recours à des animaux vivants, la modélisation et l'in vitro ne restituant pas ces interactions.

Objectifs

La tomographie par émission de positons (TEP) est une modalité d’imagerie qui permet d’étudier la fixation d’un médicament sur sa cible cérébrale. L’imagerie ultrasonore (US) permet quant à elle d’étudier les variations du débit sanguin cérébral qui sont la conséquence de l’effet des médicaments sur le cerveau (réponse hémodynamique). L’objectif de ce projet est d’associer ces deux modalités de neuro-imagerie innovantes de manière simultanée pour mieux comprendre l’effet des médicaments sur le cerveau. Le phénomène de pharmacorésistance ou la tolérance à certains médicaments pourrait s’expliquer par une réponse hémodynamique atténuée lors de l’interaction du médicament avec sa cible. Cela pourrait s’expliquer par un déficit des mécanismes de couplage entre les cibles neuronales et la réponse hémodynamique, c’est-à-dire le couplage neuro-vasculaire. On pense que la qualité du couplage neuro-vasculaire peut être appréciée in vivo en mesurant les paramètres TEP et US de manière simultanée. L’imagerie hybride TEP/US sera réalisée chez le rats témoins. Certains animaux recevront un médicament testé à dose unique et/ou après un traitement prolongé. L’os du crâne atténue les US. Une « fenêtre » chirurgicale devra donc être mise en place sur chaque animal. Cela consiste à ôter et remplacer une partie de l’os du crâne par une résine dans des conditions d’asepsie et sans générer de douleur. La chirurgie et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Au total, 158 rats seront utilisés sur 5 ans. Cela permettra d’optimiser les conditions expérimentales et de suivre les effets de 4 protocoles de traitements médicamenteux différents. Compte tenu des contraintes techniques liées aux traitements et aux modalités d’imagerie, la taille des groupes a été fixée à 8 rats par groupe. Les traitements étudiés sont des médicaments parfaitement connus, déjà utilisés chez l’animal voire chez l’Homme: ils n’induisent pas de toxicité. Les animaux seront surveillés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine. Ils feront aussi l’objet de mesures de comportement simples et peu génératrices de stress comme la mesure de l’activité locomotrice. Ce protocole ne peut pas être remplacé par des études de pharmacologie in vitro qui permettent seulement de mettre en évidence l’interaction d’une molécule isolée avec une cible ou un système biologique isolé. Seules les expériences in vivo récapitulent la complexité et l’ensemble des effets des médicaments sur le cerveau.

Bénéfices attendus

Actuellement, chacune de ces techniques est utilisée séparément en routine en recherche préclinique. Réalisées en même temps, elles permettront de diviser au moins par 2 le nombre d’animaux nécessaires par rapport à l’utilisation de l’imagerie TEP puis US isolées. Surtout l’approche simultanée TEP-US ne nécessite pas le sacrifice de l’animal, il sera donc possible de réaliser plusieurs sessions d’imagerie chez un même animal pour mesurer l’évolution de l’effet des médicaments au cours du temps. Cela permettra de diminuer encore plus le nombre d’animaux grâce à la puissance des tests statistiques appariés. A terme, ce protocole devrait permettre d’offrir une méthode d’imagerie optimisée pour mieux comprendre l’effet des médicaments sur le cerveau et de mettre en évidence des mécanismes de tolérance ou de résistance.

Procédures

1. Procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie. Temps=4h 2. Isolement à 1 animal par cage afin de préserver l’intégrité de la prothèse, pendant 60 jours maximum avant euthanasie (le temps de réaliser les traitements et les sessions d’imagerie, en prenant en compte un risque d’échec de radiosynthèse du traceur et la reprogrammation des examens). 3. Les animaux utilisés pour la mise au point de l’acquisition US pourront participer à 5 acquisitions US de 90 min maximum, sous anesthésie générale, espacées de 48h au minimum. 4. Maximum 2 acquisitions espacées de 7 jours au minimum en TEP-US sous anesthésie générale incluant injections i.v par cathéter caudal Temps 90 min 5. 1 traitement chronique, quelques minutes quotidiennement, sur animal vigile pendant 15 jours maximum 6. Etude du comportement pendant 15 min, au maximum 2 fois par jour pendant la durée du traitement (15 jours maximum).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale est conduite sous anesthésie générale et des analgésiques sont également utilisés. La récupération post-opératoire inclut un traitement antalgique. Aucune douleur n’est attendue. Les injections nécessaires à l’enregistrement TEP-US se font également sous anesthésie générale à l’isoflurane. Pas de douleur attendue. Les animaux ne peuvent pas s’arracher la prothèse crânienne qui est parfaitement solidaire de l’os et qu’ils ne peuvent pas voir ou sentir. Cependant, afin de les protéger des conflits avec leurs congénères, les animaux opérés sont hébergés individuellement par cage, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’hébergement individuel en cage transparente et ouverte, à côté d’autres cage, permet ainsi un partage de l’odorat et du visuel avec les autres animaux présents dans le cages voisines afin de minimiser l’effet négatif sur le bien-être animal. De plus, un enrichissement supplémentaire tel qu’un deuxième matériel de nidification sera ajouté. Les médicaments testés auront vraisemblablement un effet sur le comportement (apathie, diminution ou augmentation de l’activité locomotrice) mais ne sont aucunement toxiques pour l’animal aux doses testées. Le stress induit par l’administration des médicaments sur animal non anesthésié est limité par une habituation à la manipulation préalable. Pour les injections répétées, les sites d’injection parentérale seront alternés afin de ne pas induite de lésion au point d’injection.

Devenir

La présence d’un volet chirurgical au niveau du crâne empêche le rassemblement avec d’autres rats et une adoption ultérieure : les animaux opérés seront donc euthanasiés dès que possible, soit immédiatement après la dernière acquisition TEP-US.

Remplacement

Ni la modélisation informatique ni l’expérimentation sur cellules in vitro ne permettent encore d’appréhender les processus complexes relevant de mécanismes impliquant des interactions entre neurones, cellules gliales et réseau vasculaire, dans un contexte de régulation circulatoire sanguine. Il est donc indispensable d’utiliser des animaux vivants capables d’exprimer les troubles neurologiques et de valider les biomarqueurs d’imagerie étudiés. Au maximum, toutes les adaptations possibles de l’imagerie US (sensibilité, résolution spatiale, résolution temporelle…) seront mises au point au préalable sur des objets en plastique remplis d’eau ou de gel qui miment les propriétés physiques de la tête et du cerveau. Néanmoins, 30 rats seront tout de même nécessaires pour finaliser la mise au point de cette nouvelle technique d’imagerie : les données collectées sur ces animaux serviront à l’élaboration d’un référentiel (animaux non traités), ce qui permettra au final de réduire le nombre de sujets nécessaires. La réalisation d’une imagerie US sur tout la profondeur du cerveau directement chez l’Homme n’est pas possible à ce jour du fait de l’épaisseur de la boite crânienne.

Réduction

L’utilisation conjointe des deux techniques (imagerie TEP et ultrasonore (US)) permet de diviser par deux le nombre d’animaux actuellement nécessaire à la collecte séparée de données TEP et US indépendamment l’une de l’autre. De plus, ces techniques d’imagerie permettent d’étudier plusieurs régions cérébrales en même temps, dans l’ensemble du cerveau. Pour la mise au point de la méthode : 30 rats serviront à l’apprentissage de la technique chirurgicale et à la mise au point des paramètres physiques de la méthode TEP-US. Ce nombre pourra être revu à la baisse si les objectifs sont atteints avec un nombre inférieur d’animaux. Pour l’étude de l’effet de 4 traitements dont la tolérance chez l’animal voire chez l’Homme est parfaitement connue, le nombre d’animaux nécessaires à cette étude a été calculé grâce à une planification précise afin d’en réduire au maximum le nombre. Il a été estimé à 128 pour les 5 ans à venir. Ce nombre est un minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Avant chirurgie : Les animaux seront acclimatés pendant les 5 jours suivant leur arrivée aux conditions de température et d’humidité de l’animalerie. Ils seront deux par cage (enrichie en tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et papier Kraft). Il y aura une période d’habituation des animaux aux manipulations par les personnes intervenantes sur ce projet avant toute expérimentation. Après chirurgie : Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et en étant vigilant sur les conditions d’asepsie. Une surveillance continue de l’état de l’animal aura lieu de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux seront observés individuellement tous les jours et pesés 3 fois par semaine. Le traitement sera administré en fonction du poids des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats adultes jeunes et matures sexuellement (180-250g au début de l’étude). Ils pourront être étudiés pendant un maximum de 3 mois après la réalisation de la chirurgie. Cet âge a été choisi car les animaux sont suffisamment matures dans leur développement mais leur taille reste compatible avec les outils d’acquisition qui sont réalisés dans un espace restreint.

338 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une irradiation sublétale sur animal vigile suivie d'une greffe de moelle osseuse, d'autres des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie pendant quatre mois, pour étudier le rôle du microenvironnement médullaire dans la leucémie aiguë lymphoblastique B. Le porteur décrit un développement leucémique spontané pouvant entraîner une paralysie de l'arrière-train et des tumeurs ganglionnaires, et toutes les souris sont mises à mort. Il affirme que la coopération des cellules et le rôle du stroma ne peuvent être reproduits in vitro de façon satisfaisante.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques de type B (LAL-B), équivalents pathologiques des lymphocytes B (LB) en développement, sont la cause principale de cancer chez l’enfant, et bien que moins fréquentes, concernent un nombre de cas similaires chez l’adulte. Malgré l’amélioration des traitements de chimiothérapie, le pronostic reste mauvais dès le diagnostic chez l’adulte, et à la rechute chez l’enfant. De nombreuses études montrent que des cellules du microenvironnement de la moelle osseuse sont impliquées dans les mécanismes de résistance aux traitements mais leur identité précise et les mécanismes de protection mis en jeu restent mal connus. Pour ce type d’étude, puisqu’il est actuellement impossible d'obtenir des conclusions fiables in vitro nous ne pouvons pas nous passer des expérimentations conduites sur des animaux pouvant simuler les principales propriétés biologiques des leucémies humaines. Nos études précédentes nous ont permis de montrer que les cellules du microenvironnement qui soutiennent le développement des LB présentes de fortes similitudes entre l’homme et la souris. Peu de données sont par contre disponibles concernant l’influence de ce microenvironnement sur l’acquisition de mutations lors du développement pathologique des LB et sur son rôle de soutien de la leucémogénèse. Dans la présente demande d’autorisation, nous étudierons l’impact d'un facteur - produit par le microenvironnement et impliqué dans la prolifération des LB normaux – sur le développement leucémique.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus auront un impact sur la santé humaine. En effet, la littérature montre clairement l'influence du microenvironnement sur le développement des LAL-B mais ces données restent parcellaires et peu de cibles thérapeutiques ont été identifiées. Nos travaux s'appuie sur la découverte par notre équipe d'une protéine produite dans la moelle osseuse sur la prolifération d'un sous type de LAL-B. L'utilisation du modèle de souris humanisé de développement leucémique nous permettra de comprendre les mécanismes de régulation et l'identification à moyen terme de facteurs représentant des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

Trois types d'intervention seront effectuées sur les animaux. Pour le suivi du développement leucémique, des prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie gazeuse au niveau du sinus rétro orbital ou de la veine faciale afin d’espacer au maximum les prélèvements à un même site et permettre ainsi une parfaite cicatrisation. Ces prélèvements seront espacés de 2-3 semaines sur un maximum de 4 mois et seront effectués sur 248 animaux. Des transplantations de cellules de moelle osseuse seront aussi effectuées sur 108 souris. Le protocole implique tout d'abord une irradiation sublétale sur animaux vigiles suivie le lendemain d'une injection intra veineuse des cellules de moelle au niveau du sinus rétro orbital sous anesthésie gazeuse. Ce geste ne sera effectué qu'une fois pour chaque souris.

Impact sur les animaux

Notre projet implique des souris génétiquement modifiées (expression d'une protéine de fusion identifiée dans des LAL-B humaines) pour lesquelles on observe un développement leucémique spontané. Les symptomes les plus couramment observés sont une paralysie du train arrière ou des tumeurs ganglionnaires visibles. Le développement leucémique peut aussi s'accompagner d'une diminution du taux d'hématocrite. La cinétique de développement leucémique dans ce modèle étant connue, nous effectuerons des prélèvements sanguins de suivi avant l'apparition de ces symptômes pour limiter tant que possible l'inconfort de l'animal. Ces sympômes seront considérés comme points limites et seront de plus complétés par une grille de score tenant compte des éventuels changement de poids corporel, de l'apparence physique, de signes cliniques objectifs, de comportement non provoqué et des réponses comportementales aux stimuli.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des procédures

Remplacement

La régulation de l’hématopoïèse normale et pathologique implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux (extrinsèques) et propres aux cellules hématopoïétiques (intrinsèques). Seuls ces derniers peuvent être appréhendés in vitro. Ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, du contexte cytokinique, sont cruciaux et ne peuvent actuellement pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.

Réduction

Réduction du nombre d'animaux: lorsque possible et utile, un calcul d’effectif pour chaque groupe a été réalisé sur le site BiostaTGV (voir partie 3.4.10, justification du nombre d’animaux). Réduction du stress: présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton), maintien des animaux en groupes de 4-5 afin d’éviter l’isolement et les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris dans la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation.

Raffinement

la détection précoce et encore asymptomatique du développement leucémique se fera à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront suivis quotidiennement. Ainsi, l’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score de douleur spécifique de ces modèles de pathologies hématologiques. Afin de réduire le stress et d’améliorer le cadre de vie des animaux, nous optimiserons les conditions de leur hébergement, par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et/ou coton), et par le maintien des animaux en groupes de 4 à 5 afin de respecter leur instinct grégaire.

Choix des espèces

Le modèle souris est celui utilisé majoritairement par la communauté scientifique pour mimer les altérations génétiques à l’origine des leucémies chez l’homme. Ainsi, dans le modèle de souris que nous utiliserons, il a été démontré que les lymphocytes B qui se développent en cellules leucémiques acquièrent les même mutations que chez l’homme. Par ailleurs, nous avons montré que les cellules qui supportent le développement des lymphocytes B sont similaires entre l’homme et la souris. Ces résultats montrent la relevance du modèle souris pour l’étude de la biologie des LAL-B humaines. Les études proposées nécessiteront l’utilisation d’animaux avant l’apparition de symptômes, c’est à dire entre 4 et 8 semaines et dans la tranche d’âge ou apparaissent les symptômes c’est-à-dire entre 13 et 34 semaines. Nous pourrons également utiliser des cellules issues de ces animaux pour tester des thérapeutiques innovantes en accord avec leurs altérations génétiques. Ces cellules seront issues d'animaux pré-leucémiques (avant 8 semaines) ou leucémiques (après 13 semaines).

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur mammaire greffée, reçoit des injections répétées de luciférine et des séances d'imagerie sous anesthésie pendant deux semaines et demie, pour étudier le rôle de la MMP11 des adipocytes dans la croissance tumorale. Les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale ou au CO2 pour prélever les tumeurs. Le porteur affirme que l'animal est "nécessaire" pour reproduire la croissance tumorale du cancer du sein sur "l'organisme entier".

Objectifs

Dans ce projet, nous allons étudier le rôle de la métalloprotéase matricielle-11 (MMP11) sécrétée par les adipocytes dans la croissance tumorale par imagerie en bioluminescence. Au début du projet, après avoir répété la même expérience 3 fois, il a été montré que la MMP11 sécrétée par les adipocytes accélère de manière significative la croissance tumorale à un stade précoce du développement tumoral. Pour montrer cela, nous avons implanté des cellules cancéreuses mammaires en localisation orthotopique dans la glande mammaire des souris transgéniques déficientes et surexprimant la MMP11 dans le tissu adipeux. Puis, nous avons mesurer le volume des tumeurs mammaires dans ces souris à l'aide d'un pied à coulisse durant 2 semaines et demi. Etant donné que la MMP11 agit à un stade précoce du développement tumoral, nous souhaitons analyser précisément ce qui se passe au stade précoce grâce à une méthode d'imagerie sensible qui détecte les tumeurs à un stade infra clinique. Cette méthode nous permet donc de quantifier précisément les tumeurs de petite taille, de visualiser et de suivre en temps réel et de manière non invasive les cellules cancéreuses bioluminescentes afin de compléter les données obtenues avec le pied à coulisse. Nous pouvons ainsi visualiser de manière beaucoup plus précoce et fonctionnelle, la cinétique de développement des tumeurs à partir des cellules cancéreuses, ainsi que la dissémination locale des cellules tumorales. Nous n'attendons pas de dissémination à distance des tumeurs formées (métastases) car notre expérience se limite au stade précoce du développement tumoral.

Bénéfices attendus

Cette procédure permettra d'avoir une vision beaucoup plus précoce et fonctionnelle des tumeurs obtenues à partir des cellules mammaires cancéreuses, en présence et en absence de la MMP11, dans la quatrième glande mammaire inguinale des souris et ainsi de mettre en évidence la contribution des adipocytes dans la progression des tumeurs mammaires.

Procédures

Lors de ce projet, les souris seront soumises à un total de 3 interventions réalisées par le manipulateur : 1. L'acquisition d'images bioluminescentes par l'imageur nécessite d'endormir les souris grâce à un mélange d'isoflurane et d'oxygène dans une boîte à induction en plexiglas puis de maintenir cette anesthésie durant toute la période d'imagerie (30 minutes maximum). 2. Afin d'imager les souris, pour une souris de 20-25g, 100µL de luciférine est injecté par voie intrapéritonéale afin d'injecter environ 3.3mg de luciférine par souris pour une dose de 150mg/kg. 3. Pour finir, au bout de 2 semaines et demi, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale par une personne habilitée ou par inhalation de CO2, afin de prélever les tumeurs pour réaliser des analyses moléculaires.

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées de luciférine, nous n'attendons pas d'effets indésirables de la luciférine mais du fait de la répétition des injections, par précaution, nous surveillerons les animaux. Notre protocole d'observation des tumeurs est établi sur une courte durée (2 semaines et demi) ce qui permet d'observer les premières étapes de la cancérogénèse, ainsi les tumeurs seront de petite taille durant tout le protocole, et nous ne devrions pas observer d'effets indésirables (nécroses, métastases etc), mais les tumeurs seront tout de même surveillées tout au long du projet.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie pour un suivi de la croissance tumorale durant 2 semaines et demi, puis les souris seront sacrifiées afin de prélever les tumeurs pour réaliser des analyses moléculaires. Aucun animal sera donc maintenu en vie au terme de ce projet.

Remplacement

L'utilisation des animaux est nécessaire pour mimer le plus fidèlement possible la croissance tumorale observée chez les femmes atteintes d'un cancer du sein, notamment du fait de la présence de glandes mammaires différenciées et fonctionnelles présentant du tissu adipeux, mais également du fait que la progression tumorale implique tout l'organisme et que les souris présentent un système immunitaire fonctionnel qu'il est impossible de récapituler in vitro. C'est pourquoi nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de croissance tumorale est semblable à celui de la femme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude.

Réduction

Au début du projet, après avoir répété la même expérience 3 fois, il a été montré que la MMP11 sécrétée par les adipocytes accélère de manière significative la croissance tumorale à un stade très précoce du développement tumoral. Ces résultats solides permettent la mise en place d'une expérience complémentaire sur un nombre limité de souris qui viendront compléter et confirmer les données obtenues. Cela signifie également que les modèles de souris génétiquement modifiées sont déjà disponibles. Les paramètres mesurés nécessitant l'utilisation de tests statistiques sont la taille des tumeurs et le poids de l'animal. Ces paramètres seront mesurés 2 jours par semaine pendant 2 semaines et demi après l'injection des cellules cancéreuses, et les analyses statistiques se feront de manière indépendante pour chacun de ces jours. Vu que nous travaillons seulement avec des groupes de 5 souris, nous utilisons un test non paramétrique (Mann-Whitney) de comparaison entre deux groupes (souris mutantes et souris contrôles appariées) avec le logiciel PRISM qui s'appliquent aux petits échantillons.

Raffinement

Les animaux seront placés dans des cages leur assurant un bien-être avec de la sciure de bois comme litière. Celle-ci est remplacée de manière hebdomadaire pour une hygiène optimale. Le stress est diminué au maximum en hébergeant les souris dans des cages transparentes permettant la visualisation des autres souris et en les habituant à la vue de l'opérateur expérimental qualifié pour les procédures liées à l'expérimentation animale. La taille de l'aiguille permettant l'injection de la luciférine sera adaptée au poids de l'animal afin de réduire le risque de lésion induite par l'aiguille. L'occurence de blessure éventuelle et le risque d'infection au niveau de la zone d'administration de la luciférine seront pris en considération. Pendant l'imagerie, les souris sont anesthésiées afin d'éviter tout stress. De plus, les souris seront placées sur un support chauffant afin d’éviter toute déperdition de chaleur causée par l’anesthésie. Elles seront ensuite suivies dans les heures suivant l'injection. Des visites quotidiennes seront effectuées afin de vérifier le niveau d'inconfort et les signes de douleur des animaux dans la cage (diminution des comportements d'exploration, diminution de la prise de boisson et/ou de nourriture, perte de poids, posture voutée, etc...). Autrement, nous n'attendons pas de signes cliniques péjoratifs lors de la procédure expérimentale, mais nous surveillerons tout de même : la réaction des souris suite à des injections répétées de luciférine, l'aspect des tumeurs, la difficulté des souris à se déplacer à cause d'une gêne occasionnée par la taille et la localisation des tumeurs. En cas de souffrance visible ou de douleur apparente des animaux, un avis vétérinaire sera sollicité pour décider de la continuité ou de l'arrêt de l'expérience.

Choix des espèces

Le modèle de souris a été retenu car c'est le seul pour lequel il est possible de manipuler le niveau d’expression de la MMP11 en employant des souris transgéniques déficientes et surexprimant la MMP11 de manière tissu-spécifique. Ces modèles permettent de répondre directement à notre objectif. A notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle animal plus simple permettant de répondre à la problématique inhérente à ce projet. Les souris utilisées pour ce projet seront âgées de 8 semaines au moment de l’expérimentation de manière à étudier la progression tumorale mammaire dans un organe différencié et fonctionnel.