Recherche fondamentale

Soumis à un contrôle de l'eau pouvant durer des mois voire des années et à des chirurgies cérébrales allant jusqu'à huit heures, 6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils sont déplacés entre quatre établissements pour des séances d'imagerie sous anesthésie, puis maintenus en chaise de contention environ trois heures par jour, cinq jours par semaine. L'objectif est de comprendre les circuits cérébraux de l'apprentissage social chez deux singes en interaction. Le classement en souffrance modérée contraste avec la lourdeur du protocole et sa durée.

Objectifs

Ce projet est multisite et se déroulera dans 4 établissements utilisateurs. L'apprentissage social permet d'apprendre les conséquences d'un comportement sans expérience directe, mais par l'observation d’autrui. Des situations dangereuses peuvent être évitées et les bénéfices de comportements futurs maximisés. Mon projet de recherche vise à comprendre les circuits neuronaux sous-jacents à l'apprentissage social. Pour cela, il faut comprendre les règles qui le régissent, i.e. l'algorithme derrière ce comportement, et ses bases neurales, i.e. les régions cérébrales et les codes neuronaux permettant l'émergence de ce comportement. L'apprentissage social pourrait être soutenu par un renforcement vicariant, i.e. la valeur du comportement des autres serait mise à jour en fonction du résultat de ce comportement. La différence entre le résultat attendu et le résultat réel d’un comportement de choix permettrait le calcul d’une erreur de prédiction de la récompense observée et la mise à jour la valeur de chaque option comportementale. Cela nécessite deux composantes : représenter le comportement d’autrui et établir une association entre action-résultat de l’action. Les meilleurs candidats pour ces processus sont respectivement le mur médian du cortex préfrontal et le striatum antérieur. Alors que deux singes interagissent dans une tâche comportementale conçue pour étudier l'apprentissage social, je vais 1) enregistrer simultanément l'activité neuronale des structures préfrontales et striatales pour suivre la représentation dynamique des variables d'apprentissage social dans les boucles corticostriatales et 2) manipuler la dopamine, une molécule présente dans le cerveau et impliquée dans l'apprentissage individuel, et évaluer (ou non) son recrutement pendant l'apprentissage social. Ma prédiction est que les structures représentant la valeur des actions observées interagiront avec le circuit d'apprentissage individuel, sous l'influence de la dopamine, et permettront d'apprendre par observation.

Bénéfices attendus

Ce projet portera des bénéfices à différentes échelles. A court et moyen terme, il permettra l’élargissement des connaissances sur les réseaux cortico-striataux impliqués dans les comportements d’apprentissage individuel et social. Le jeu de données récolté sera d’une précision spatiale et temporelle inédite. Les aires corticales et sous-corticales sont généralement étudiées séparemment chez le primate alors que leur communication en boucles récurrentes semble être la clé de l’integration neuronale. L'implication de la dopamine dans l'apprentissage social, qui reste une question centrale dans ce domaine de recherche, sera adressée directement. Les bénéfices succeptibles de découler de ce projet sont de : (i) Caractériser la représentation des variables d’apprentissage social dans le striatum anterieur et le cortex préfrontal médian et de comprendre les dynamiques des réseaux cérébraux. (ii) Comprendre le rôle de la dopamine, une molécule importante dans la communication entre les neurones de ce circuit, dans ces deux types d’apprentissage grâce à l'inactivation de son influence sur le striatum. (iii) Fournir ces jeux de données à la communauté scientifiques pour contraindre/valider/étendre les modèles existants de ces apprentissages. A long terme, et de manière plus globale, ce projet permet (iv) de comprendre les mécanismes neuronaux de comportements qui sont dérégulés dans certaines pathologies touchant la cognition sociale, telles que le trouble du spectre autistique, la schizophrénie ou le trouble déficit de l'attention avec ou sans hyperactivité. La compréhension de ces mécanismes permettra, in fine, (v) d'améliorer et d'adapter des méthodes pédagogiques et d'éducation, prévenant potentiellement l'exclusion sociale. (iv)Cela permettra également une meilleure prise en charge thérapeutique des patients, avec un traitement et un soutien plus fin et efficace.

Procédures

Ce projet est multisite et se déroulera dans 4 établissements utilisateurs (EU). Chaque animal sera soumis aux interventions suivantes : - Déplacement au centre IRM pour acquisition d'images IRM, sous anesthésie pour une durée totale d'environ 2h + 2x10min de trajet (EU1/4). Déplacement dans l'EU2/4 pour acquisition d'images par rayons X, sous anesthésie pour une durée totale d'environ 20min + 2x10min de trajet. - Délacement vers l'EU3/4 pour acquisition d'images, sous anesthésie, 1 fois pour une durée d'envirion 2h + 2x3h30 de trajet. - Chirurgie d'implantation du plot de tête et injection intracérébrales pour une durée d'environ 8h. Si les injections s'allongent dans le temps, l'animal subira une chirurgie séparée pour la mise en place du plot de tête (EU1/4). - Chirurgie d'implantation de chambre d'enregistrement, sous anesthésie, pour une durée d'environ 6h (EU1/4). - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements électrophysiologiques, environ 3h, 5 jours par semaine, ainsi que le contrôle hydrique de quelques mois à plusieurs années (EU1/4).

Impact sur les animaux

Ce projet utilisera des macaques fascicularis. La plupart des étapes de la procédure utilisée sera susceptible de créer une nuisance aux animaux. i) Les premières fois où les animaux seront mis en chaise pour leur venu dans le laboratoire pourront causer du stress lié à la prise de l’animal à l’aide d’une canne et à son déplacement depuis sa cage d’hébergement jusqu’à la chaise primate. Cela durera d’une à deux semaines bien qu’une habituation des animaux à la canne soit préalablement réalisée. ii) La restriction des mouvements de la tête des animaux à l’aide d’un plot de tête sera également source de stress, principalement lors des premières mises en contention. iii) Le contrôle hydrique partiel lié au besoin expérimental pourra engendrer un stress, une déshydratation, une perte d'appétit et en conséquence une perte de poids durant la durée de l’expérience. iv) L’anesthésie et l’intubation de l’animal, nécessaires aux procédures d'acquisitions d'images et de chirurgie d’implantation du plot de tête, la réalisation d’injections intracérébrales et de chambre d’enregistrement pourront créer de la douleur post-opératoire à l’animal durant plusieurs jours, des hémorragies et des infections. v) En post-opératoire, l’animal pourrait ressentir de la douleur et développer une infection liée aux actes chirurgicaux. vi) L'isolement post-opératoire de l'animal (une semaine sans contact physique de ses congénères) pourrait créer du stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. L'objectif de la mise à mort est de prélever le cerveau de l'animal en fin de projet afin de préciser par une analyse post-mortem la localisation, la spécificité et l'état de préservation des zones cérébrales étudiées.

Remplacement

Le projet implique l'utilisation d'animaux car à ce jour, il n'existe pas d'alternatives expérimentales permettant de répondre aux objectifs. Aucune simulation informatique ou culture cellulaire ne peut remplacer le modèle animal vivant pour l'étude des substrats neuronaux de comportements complexes tel que l’apprentissage social. Les techniques électrophysiologiques utilisées dans le projet, permettant une mesure de l'activité de neurones unitaires, bien qu'utilisées en milieu clinique, restent trop invasives pour être utilisées chez l'homme pour des approches expérimentales.

Réduction

Les procédures chirurgicales prévues comportent un certain risque. Nous prévoyons d'inclure un maximum de six animaux dans cette étude afin de maximiser le nombre de paires d’animaux qui travailleront ensemble dans le box expérimental. Cependant les objectifs de l’étude sont atteignables avec quatre animaux. Si nous obtenons suffisamment de données (neurophysiologiques et séances comportementales) pour une analyse statistique satisfaisante chez quatre animaux, nous n'en utiliserons pas d’autres. Pour chaque animal, l’enregistrement avec plusieurs microélectrodes multi-contacts permettra de mesurer l’activité de populations neuronales dans plusieurs structures corticales et sous-corticales. La richesse des enregistrements multi-électrodes offre la possibilité de réaliser de très nombreux types d’analyses portant sur les potentiels d’actions de neurones isolés (modulation de fréquence de décharges ou de synchronisation entre neurones dans différentes périodes de la tâche ou dans différentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l’activité, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d’actions. La répétition des séances d’enregistrement sur plusieurs mois a pour objectif d’augmenter le nombre de neurones différents enregistrés dans chaque structure. Cette augmentation permet d’augmenter la puissance statistique de nos analyses. La durée totale des enregistrements pour un animal est étroitement dépendante de la quantité de neurones enregistrés quotidiennement. De fait, elle ne peut être définie à priori. De même, la qualité et le temps d’expression des DREADDs, même si renseigné dans la littérature comme durant plusieurs mois voire année, ne peut pas être définie à priori.

Raffinement

La cage et volière de l’animal est enrichi de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires de l'animal et aussi le retour à une activité normale en période post-chirurgicale. Après un délai minimal d'une semaine et selon l'état de récupération, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est familière. Les méthodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilisées afin de réduire le stress des sujets. L'IRM anatomique et le CT-SCAN pre-chirurgicaux permettent de mieux planifier l’implantation de la chambre d'enregistrement, pour bien atteindre les aires corticales et sous-corticales ciblées. L'IRM anatomique, le CT-SCAN et le PET-SCAN seront réalisés sous anesthésie générale afin de s'assurer de l'inconscience de l'animal, réduisant de fait le stress de l'animal lors de la réalisation de la procédure. Lors d'interventions chirurgicales, en plus de l'anesthésie, un analgésique sera administré et prolongé en période post-opératoire. Des points limites précoces et adaptés seront appliqués.

Choix des espèces

Le primate non humain (PNH) sera utilisé pour la proximité anatomo-fonctionnelle des boucles cortico-striatales qu'il partage avec l'humain, notamment les boucles préfronto-striatales qui sont majoritairement représentés chez le PNH par rapport à d'autres mammifères. L’organisation des differentes couches corticales pour la computation intra-aires et les connectivités inter-aires sont particulièrement similaires entre le PNH et l’humain. Les animaux seront préférentiellement utilisés au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du développement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilisés. Cela permet un contrôle plus précis des protocoles expérimentaux, que ce soit en termes de volume des récompenses utilisées pour l'apprentissage par renforcement, de contrôle du régime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures cérébrales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux étant encore jeunes, ils présentent une meilleure tolérance aux procédures expérimentales et une meilleure récupération suite aux procédures nécessitant une anesthésie. Des animaux plus jeunes mais ayant déjà atteints leur maturité sexuelle pourraient être utilisés pour les premières phases d'habituation et être ainsi jeunes adultes lors du commencement des parties ultérieures de la procédure.

3 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 1 728 recevront une injection directement dans le cerveau et 192 une double chirurgie. Elles sont soumises à un régime gras, à un gavage de tamoxifène et à un suivi en cage individuelle, puis tuées pour extraction du cerveau. L'étude porte sur les filets qui entourent certains neurones de la satiété et sur leur rôle dans l'obésité. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies contre l'obésité, sont renvoyées au long terme.

Objectifs

L’obésité touche aujourd’hui plus de 13 % de la population mondiale et augmente le risque de maladies graves comme le diabète ou les troubles cardiovasculaires. Pour mieux prévenir ou traiter cette maladie, il est essentiel de comprendre comment notre corps régule la faim et la sensation de satiété. Dans le cerveau, une zone appelée l’hypothalamus joue un rôle central. Elle contient des neurones spécifiques, appelés neurones POMC, qui envoient le signal de satiété (on n’a plus faim), et d'autres neurones qui provoquent l’envie de manger. Des recherches récentes montrent que les neurones POMC ne sont pas tous identiques. Certains réagissent moins bien aux signaux hormonaux et seraient plus sensibles à une alimentation trop riche en graisses, ce qui pourrait contribuer à l’installation de l’obésité. Par ailleurs, environ 30 % de ces neurones sont entourés d’une sorte de « filet » protecteur, appelé matrice extracellulaire ou filets périneuronaux (PNN). Ces structures influencent le fonctionnement des neurones et leur capacité à s’adapter. Chez les souris obèses, ces filets semblent profondément modifiés. Nous cherchons à comprendre comment les neurones POMC réagissent aux changements alimentaires (jeûne, réalimentation) et quel rôle joue leur environnement extracellulaire dans cette réponse. Nous allons : Observer ces neurones chez des souris en jeûne, après réalimentation, ou nourries avec un régime gras. Analyser l'activité des neurones et la composition de leur environnement avec des outils d’imagerie et d’électrophysiologie. Modifier directement la matrice autour des neurones pour voir si cela influence leur fonctionnement. Activer ou inhiber artificiellement ces neurones pour étudier l’effet combiné avec les changements de leur environnement. Nous pensons que les modifications de l’environnement des neurones POMC jouent un rôle important dans la dérégulation de la sensation de satiété en cas d’obésité. Mieux comprendre cette interaction entre neurones et matrice extracellulaire pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour lutter contre l’obésité.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’un milliard le nombre de personnes obèses dans le monde, faisant de l’obésité un enjeu majeur de santé publique. Malgré les efforts thérapeutiques, les traitements disponibles restent globalement peu efficaces à long terme, à l’exception de techniques invasives telles que la chirurgie bariatrique, dont les résultats ne sont pas systématiquement garantis. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l’apparition et à la persistance de cette pathologie, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, nous étudions un élément encore peu connu du contrôle de la faim : la matrice extracellulaire, et en particulier les filets périneuronaux (PNN). Ces structures entourent certains neurones du cerveau, notamment les neurones POMC, qui nous aident à ressentir la satiété. Nous pensons que ces filets pourraient réduire la souplesse des neurones, en limitant leur capacité à s’adapter aux changements liés à l’alimentation, surtout en cas d’obésité. Cela pourrait empêcher le cerveau de bien réguler l’appétit lorsque l’environnement nutritionnel change. À court terme, nous voulons comprendre comment ces filets réagissent à une alimentation trop riche ou à des changements rapides de régime, et comment cela influence les neurones qui contrôlent la faim. À plus long terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour aider le cerveau à retrouver sa flexibilité, et ainsi améliorer la régulation de l’appétit chez les personnes obèses.

Procédures

4 prélèvements sera effectués au total pour le suivi de la glycémie. Lors de l'habituation au "fasting" : 24 heures après le jeûne puis 1h30 après la réintroduction à la nourriture. Lors de la phase expérimentale : 24 heures après le jeûne puis 1h30 après la réintroduction à la nourriture. A chaque prélèvement, une goutte de sang sera récoltée, soit 50 µL environ. Cela concerne toutes les souris de toutes les procédures, soit 3456 souris. Des procédures chirurgicales sont prévues. 1728 souris auront une injection intra-cérébrale dans le noyau arqué de l'hypothalamus. 192 souris subiront une double chirurgie, soit une injection de virus permettant de contrôler une sous population de neurones, puis une injection d'enzyme permettant de dégrader la matrice extracellulaire.

Impact sur les animaux

Certaines souris de l’étude recevront une administration orale de tamoxifène, connu pour induire une perte temporaire de tissu adipeux, entraînant une perte de poids transitoire. Le gavage, bien qu’indolore, implique une contention totale, source probable de stress. Des douleurs post-opératoires modérées peuvent survenir à la suite des injections stéréotaxiques bilatérales de vecteurs viraux. Ces douleurs seront prises en charge par un traitement analgésique systématique. Lorsque deux interventions seront nécessaires, un délai suffisant sera respecté entre chaque chirurgie afin de maximiser la récupération. Certaines procédures expérimentales peuvent générer un stress transitoire ou des effets physiologiques réversibles (régime hypercalorique). Ces effets ont été anticipés, et des mesures seront mises en place pour en limiter l’impact (enrichissement augmenté). Le passage en cage individuelle, requis pour un suivi précis de la prise alimentaire, pourra induire un stress lié à l’isolement. Toutefois, les cages resteront proches afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre congénères, réduisant les effets d’isolement social. L’analyse de la composition corporelle par EchoMRI nécessite une brève contention (moins de cinq minutes) dans un tube transparent. Ce stress aigu sera donc de faible intensité et de courte durée. L’administration prolongée d’un régime hypercalorique (HFD) entraînera une prise de poids progressive, ne dépassant pas 200 % du poids initial selon nos données antérieures. Un suivi rigoureux sera mis en place afin de prévenir toute dérive pathologique. Les protocoles de jeûne induiront une perte de poids modérée (inférieure à 10 % du poids initial), totalement réversible à la reprise de l’alimentation. Les chirurgies stéréotaxiques nécessaires aux injections intracérébrales provoqueront une douleur modérée liée à l’incision du scalp et du périoste. Un traitement analgésique sera systématiquement administré, avec une reprise attendue de l’activité normale et du poids en 2 à 3 jours. Enfin, certains tests comportementaux seront réalisés pour évaluer les effets fonctionnels des manipulations. Ils dureront moins d’une heure et nécessiteront une petite goutte de sang pour mesurer la glycémie avec précision.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort, les cerveaux seront alors extraits et des analyses d'imagerie, d'électrophysiologie, ou de "Single Particle Tracking" pourront être effectués ex vivo (le cas échéant).

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier la relation entre l’activité des sous-populations de neurones à POMC et les modifications de leur environnement extracellulaire, en particulier les filets péri-neuronaux (PNN), en réponse à la consommation d’un régime obésogène. Dans ce contexte, les neurones étudiés ne fonctionnent pas de manière isolée : ils interagissent avec d’autres structures cérébrales mais également avec des signaux périphériques d’origine hormonale ou nutritionnelle. La matrice extracellulaire pourrait jouer un rôle clé dans cette interface en modulant la plasticité et la réactivité neuronale. Les effets que nous cherchons à comprendre sont donc le fruit d’interactions complexes entre réseaux neuronaux et signaux métaboliques périphériques. Une telle dynamique ne peut être reproduite in vitro, car elle nécessite un système intégratif capable de refléter fidèlement les adaptations comportementales, telles que la prise alimentaire. De même, aucun modèle informatique ne permettrait aujourd’hui de simuler avec une précision suffisante les interactions entre la matrice extracellulaire, l’activité neuronale, et les réponses métaboliques de l’organisme. Seul un modèle in vivo permet de capturer l’ensemble de ces processus.

Réduction

Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux utilisant des tests statistiques. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront à l’âge de 6 semaines et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages sera ainsi : carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. Nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée de solution saline stérile. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 5) Certains animaux de cette DAP auront un suivi chronique de leur poids, leur prise alimentaire et leur composition corporelle ainsi que le suivi de la prise alimentaire suite à certaines procédures chirurgicales (enzyme dégradant la matrice ou virus permettant le désassemblage de la matrice) nécessitera que les animaux soient placés en cage individuelle. ¬6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été́ définis : l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris. La souris représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Il est admis qu’à 8 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales. Afin de permettre le suivi individuel du poids et de la prise alimentaire, uniquement quand cela sera nécessaire, les souris seront placées en cage individuelle. Ces cages vont être rapprocher le plus possible pour permettre au mieux à l’animal d’avoir une interaction visuelle, auditive et olfactive.

Pour mettre au point des microscopes miniaturisés destinés à imager l'activité des neurones chez la souris éveillée, 640 souris vont être utilisées, réparties en 32 lots, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux chirurgies intracrâniennes et une restriction alimentaire entraînant une perte de 5 à 10 % du poids, puis des séances d'enregistrement de deux à quatre heures. Le projet se présente comme un raffinement réduisant le stress de l'animal, puisqu'il évite de fixer la tête. Cet argument de moindre stress cohabite avec l'ouverture du crâne et l'implantation de dispositifs chez 640 souris.

Objectifs

Un objectif de longue date du domaine des neurosciences est d’élucider comment la perception, la formation de la mémoire et les comportements sont encodés dans le cerveau, à l’échelle des réseaux de neurones. Les méthodes optiques peuvent être très utiles pour atteindre cet objectif, car elles permettent d'enregistrer et de modifier l'activité des neurones dans des régions spécifiques du cerveau, avec une précision cellulaire et de manière répétée au fil des apprentissages. Aujourd’hui, une grande partie de ces expériences sont effectuées en fixant la tête de l’animal sous un microscope. Pourtant, il est fortement intéressant de s’affranchir de la contrainte de la fixation de la tête, de façon à limiter le stress éprouvé par l’animal, à se placer dans des conditions expérimentales les plus physiologiques possible, et à accéder à une palette très diversifiée de comportements. Néanmoins, effectuer des enregistrements optiques de l’activité neuronale chez le rongeur non contraint reste difficile aujourd’hui, en raison des contraintes importantes liées à la miniaturisation des dispositifs embarqués. L’objectif de ce projet est d’améliorer de façon significative les performances des techniques existantes. Deux systèmes seront ainsi développés : 1- Un microscope fibré permettant l’imagerie et la modulation de l’activité neuronale à l’échelle cellulaire avec une très grande précision temporelle, 10 fois supérieure à l’état de l’art. Ce microscope permettra notamment d’imager pour la première fois directement l’activité électrique des neurones individuels chez la souris non-contrainte. La cadence d’acquisition très élevée permettra en outre d’étudier des dynamiques neuronales avec une précision inégalée. 2- Un nouvel endoscope permettant d’accéder à des régions profondes du cerveau de souris non contraintes en réduisant fortement les dommages réalisés par rapport aux microscopes existants (volume de la sonde implantée 6 fois plus faible). Cela permettra un raffinement significatif des méthodes d’endoscopie.

Bénéfices attendus

Les méthodes optiques sont des outils très avantageux pour étudier comment différents mécanismes neuronaux (comportement, perception, mémoire…) sont encodés dans le cerveau, à l’échelle des réseaux de neurones. Néanmoins, la plupart des expériences sont effectuées chez des animaux dont la tête est fixée à un microscope, de façon à tirer partie de méthodes optiques très performantes. Ce projet permettra de développer des méthodes dont les performances sont comparables à celles de ces microscopes, tout en étant adaptées à des souris non-contraintes. Cela aura des bénéfices à la fois pour l’animal, dont le stress sera diminué, et aussi pour la pertinence scientifique des résultats, puisque l’animal sera placé dans de conditions expérimentales les plus physiologiques possible. De plus, cela permettra d’ouvrir l’éventail de comportements étudiés, et donc l’éventail des questions explorées. Enfin, l’une des méthodes développées permettra de diminuer significativement les dommages effectués dans le cerveau lors de l’imagerie de régions profondes. Cela engendrera ainsi un raffinement significatif des méthodes d’endoscopie disponibles pour la communauté des neuroscientifiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux chirurgies intracrâniennes sous anesthésie générale et analgésie : une injection de vecteur viraux (durée de la chirurgie : environ 45 minutes) et de fixation de dispositif implantable (durée de la chirurgie : environ 1h30). Ensuite une partie des animaux (un quart environ) suivra un protocole d’apprentissage d’une tâche de navigation spatiale simple (durée : 30 min à 1h tous les jours pendant 5 à 10 jours), pour laquelle les animaux seront placés en légère restriction alimentaire permettant d’améliorer l’apprentissage. Ensuite, les animaux suivront des sessions d’enregistrement (au maximum 6 sessions au total, espacées de 1 à 7 jours) de durée environ 2-4h. Enfin, une euthanasie par une méthode règlementaire sous anesthésie et analgésie sera effectuée.

Impact sur les animaux

L’animal pourra ressentir un stress dû aux manipulations par les expérimentateurs, ainsi que durant l’induction de l’anesthésie générale, et lors de la fixation de la tête pour les expériences tête-fixée. Il pourra également ressentir de la douleur et un inconfort induit par la chirurgie (craniectomie et ouverture de la peau peuvent entrainer une douleur et les points de suture peuvent entrainer une démangeaison). Il y a de plus un risque d’hypothermie transitoire lors du réveil post-chirurgical. Il existe également un risque de désunion de cicatrice. L’animal pourra également ressentir de la faim, induite par la restriction alimentaire visant à une perte de masse de 5 à 10 pourcents et permettant une motivation à trouver la récompense alimentaire pendant la tache de comportement. Enfin, il existe un risque d’hémorragie et d’irritation / lésion locale lors des injections de marqueurs fluorescent.

Devenir

Tous les animaux seront donc euthanasiés par une méthode réglementaire pour prélèvement afin de répondre à une question scientifique.

Remplacement

Des études préalables in vitro (sur des échantillons non issus d’animaux) sont réalisées pour caractériser et optimiser les performances des microscopes en cours de développement et pour limiter grandement le nombre d’expérimentations in vivo. En particulier, pour caractériser l’endoscope qui permettra d’accéder à des régions très profondes du cerveau, nous avons mis au point un échantillon basé sur des billes fluorescentes qui reproduit le mieux possible le cerveau d’une souris in vivo. Chaque bille mime un neurone, et est éclairée avec un faisceau lumineux dont l’évolution de l’intensité au cours du temps est contrôlée de façon indépendante des faisceaux qui éclairent les autres billes. Ainsi, on peut reproduire des neurones actifs avec des motifs d’activités réalistes, tirés d’expériences publiées dans la littérature. De plus, les billes sont disposées sous une couche de milieu diffusant, dont les caractéristiques s’approchent de celles du cerveau. Nous pourrons également ajouter des mouvements de ces billes pour reproduire les mouvements du champ de vue enregistrés pendant une expérience in vivo (ces mouvements sont liés au fait que le cerveau bouge par rapport à la boite crânienne sur laquelle est fixée le microscope). Néanmoins, comme les méthodes optiques développées sont destinées à l’étude de souris in vivo, non contraintes, la validation et la caractérisation finale des microscopes doit obligatoirement se faire dans ces conditions finales d’utilisation.

Réduction

Comme indiqué ci-dessus, un maximum de tests seront réalisés in vitro sur des échantillons non issus d’animaux. Les tests in vivo ne démarreront que lorsque les performances des techniques seront optimales et satisfaisantes. S’il s’avère que certaines difficultés émergent dans les premières expériences in vivo liées à des caractéristiques qui n’avaient pas été mimées dans le modèle in vitro, nous raffinerons l’échantillon in vitro de manière à mimer encore mieux ces caractéristiques, puis nous effectuerons des expériences in vitro supplémentaires sur ces nouveaux échantillons. Dans ce projet, nous souhaitons valider en tout 32 conditions expérimentales différentes, correspondants aux 2 microscopes mis au point et à toutes leurs applications. Pour chacune de ces 32 conditions expérimentales, nous utiliserons un lot de 20 souris : - 10 souris permettant de mettre au point le protocole, en optimisant les paramètres critiques de notre expérience. Nous nous efforcerons de diminuer ce nombre de souris en développant des modèles prédictifs des résultats obtenus dans chaque nouveau protocole en fonction de l’ensemble des résultats obtenus jusque-là; - 5 souris permettant de valider le protocole optimisé, montrer la reproductibilité des résultats, et permettra la publication de la méthode (5 souris est le minimum requis pour une publication dans le domaine de l’instrumentation optique pour les neurosciences); - le taux de succès de ces deux chirurgies successives étant de 75 pourcents, chaque lot contiendra donc 20 souris. Ainsi, le nombre total de souris utilisées sera de 640 souris, réparties en 32 lots (chaque lot correspondant à une condition expérimentale) de 20 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. La température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées, le cycle jour nuit est automatique. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à l’eau et la nourriture. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères. Un isolement temporaire des animaux sera limité au maximum et ne sera mis en œuvre que dans des cas très exceptionnels. Le milieu est enrichi (nidification, rongement). Une période d'acclimatation de 7 jours sera systématiquement pour les animaux provenant du fournisseur agrée défini ou pour les animaux provenant de notre animalerie centrale et transférés dans la pièce de stabulation. Toute chirurgie sera précédée d’une analgésie et anesthésie adéquat. Le maintien de la température est assuré. Un suivi post opératoire est effectué quotidiennement et toutes les mesures sont prises pour veiller au bien-être animal. Des points limites ont été défini et seront appliqués afin de garantir la minimisation de risque de souffrance des souris les atteignant. La mise en place systématique d’une période de manipulation préalable à l’expérimentation ainsi qu’une habituation progressive du dispositif expérimentale permet de réduire le stress de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle idéal pour les études auxquelles seront appliqués les microscopes développés, à savoir l’exploration des bases neuronales de la perception, de la formation de la mémoire et des comportements. En effet, il s’agit d’un mammifère, ayant donc des mécanismes cérébraux généralisables dans une grande mesure à l'homme. De plus, l’expression des outils optogénétiques dans ce modèle est bien caractérisée. Par ailleurs, la souris a une appétence certaine pour les tâches de navigation. Des animaux adultes seront utilisés, de façon à ce que la taille du cerveau et de la boite crânienne n’évolue plus ; de plus, c’est chez l’adulte que seront effectuées les études sur les bases neuronales de la perception, de la formation de la mémoire et des comportements. Leur âge sera supérieur ou égal à 7 semaines au moment de l’injection virale. Les animaux sont identifiés par poinçon auriculaire réalisé sous anesthésie générale, pendant l’injection stéréotaxique.

Équipées par deux chirurgies sous anesthésie générale d'implants de télémétrie mesurant les contractions de l'utérus, 8 brebis vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. À l'issue, elles ne sont pas tuées mais remises en élevage, où elles pourront servir à d'autres protocoles. L'objectif déclaré est de valider la brebis comme modèle pour tester des contraceptifs humains, et accessoirement d'améliorer l'insémination des brebis laitières. Le porteur présente ce travail comme une étape vers un modèle artificiel remplaçant l'animal, tout en équipant des brebis par chirurgie pour y parvenir.

Objectifs

Le développement de méthodes de contraception non hormonale chez la femme pour s’affranchir des risques associés aux traitements hormonaux est un sujet central de la recherche reproductive actuelle. L’évaluation de potentiels contraceptifs s’appuie sur des tests pré-cliniques sur modèles animaux de laboratoire de type rongeur. Toutefois le modèle rongeur ne permet pas de réaliser toutes les analyses nécessaires. Des modèles animaux de plus grande taille, comme la brebis, permettent par exemple de quantifier la distribution des spermatozoïdes dans le tractus génital femelle par une méthode d’imagerie endoscopique. Un contraceptif de type gel vaginal, qui bloque le passage des spermatozoïdes au niveau du col de l’utérus, a été validé chez la brebis par cette méthode d’imagerie en 2023. Les grands animaux peuvent également être équipés d’implants de télémétrie permettant des mesures d’activité physiologique en continu et sans intervention humaine. Afin de valider le modèle brebis comme modèle animal de test de contraceptif, nous devons caractériser un élément important de la reproduction : la physiologie de l’utérus et plus précisément les contractions utérines. En effet, si les spermatozoïdes se déplacent dans le tractus génital par leur mobilité propre, ce sont les contractions utérines qui sont en grande partie responsables de leur remontée vers l’ovaire. Il existe désormais des implants sous cutanés télémétriques qui permettent de mesurer une activité myoélectrique d’un tissu. Des études récentes ont initié la caractérisation par télémétrie de l’activité utérine chez la brebis et la truie. Dans notre projet, nous souhaitons équiper des brebis avec des implants de télémétrie pour quantifier les contractions utérines (fréquence et intensité des contractions) dans diverses conditions physiologiques (stade du cycle) et comparer les résultats aux données existant chez l’humain. Une fois équipées, ces brebis pourront ensuite permettre le test de contraceptifs potentiels à visée utérine. LA MODIFICATION DEMANDEE VISE A PROFITER DE LA CHIRURGIE DE RETRAIT DES IMPLANTS POUR MESURER IN VIVO SOUS ANESTHESIE GENERALE LE DEPLACEMENT DE SPERMATOZOIDES MARQUES DANS LE TRACTUS ET ENREGISTRER EN SIMULTANE LES CONTRACTIONS UTERINES PAR LES IMPLANTS.

Bénéfices attendus

1. Biologie fondamentale : Données non biaisées : la télémétrie va permettre d’obtenir des données non biaisées de caractérisation de l’activité utérine chez la brebis car il est attendu que l’interaction de l’animal avec l’humain peut perturber l’activité utérine. Relation statut hormonal / activité utérine : Les mesures d’activité seront réalisées au cours du cycle oestral et permettront de relier le statut hormonal (oestrogènes / progestérone) et l’activité utérine. Nous pourrons également mesurer pour la première fois l’activité de chaque corne utérine en simultané et étudier d’éventuels mécanismes de synchronisation / désynchronisation des cornes utérines. Modèle alternatif à l’éxpérimentation animale : A terme, nous souhaitons concevoir un tractus génital de brebis artificiel pour étudier le transport des spermatozoïdes in vitro. Nous disposons déjà d’informations sur la structure fine du cervix et de l’utérus de brebis qui nous permettent dès maintenant d’imprimer en 3D un tractus génital réaliste. Mais il manque une dimension importante : les contractions utérines. Les informations obtenues avec ce projet permettront d’implémenter le modèle artificiel avec un système de contraction artificiel (comme c’est déjà le cas avec des modèles digestifs). Ce modèle brebis pourra ensuite servir de base de travail pour un modèle humain artificiel. 2. Biologie appliquée : Etude pré-clinique de contraceptifs humains non hormonaux : Dans le cadre d’un large projet de recherche international, des contraceptifs non hormonaux sont recherchés. Le contrôle des contractions utérines par un dispositif non hormonal comme moyen de contraception est une méthode envisagée et pourra s’appuyer sur notre modèle. Amélioration de la fertilité après insémination : La production de fromages de brebis s’appuie presque essentiellement sur l’utilisation de l’insémination animale après synchronisation de l’oestrus. Cette insémination nécessite la manipulation des brebis qui peut altérer l’activité utérine et limiter l’efficacité de l’insémination. Une étude de 2002 a déjà montré que la contention, même limitée, perturbe les contractions utérines et donc potentiellement le transport des spermatozoïdes, facteur clé de la réussite de fécondation. Ce projet pourrait permettre d’améliorer les pratiques d’élevage et l’efficacité de l’insémination.

Procédures

Chaque brebis subira DEUX interventionS chirurgicaleS sous anesthésie générale d’une durée d’une heure, DEUX injectionS par voie intraveineuse pour l’induction de l’anesthésie (30 secondes avec contention), et 6 injections par voie intramusculaire pour les traitements post-opératoires (2 injections par jour pendant 3 jours, 1 minute à chaque fois avec contention). Les animaux vivront quelques moments de stress de 5 à 10 minutes lors des déplacements, manipulations et contentions.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une chirurgie qui peut entrainer des douleurs post opératoires. La mise en place des implants va perturber de manière transitoire l’activité utérine. Les animaux pourront subir un stress dû à la contention pour l’induction de l’anesthésie, puis l’administration des traitements post-opératoires et des synchronisations de l'oestrus. Ces injections par voie intra veineuse et intra musculaire peuvent induire une douleur ainsi qu’un hématome.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont replacés en élevage et pourront être utilisés pour d’autres protocoles expérimentaux ou des phases d'élevage.

Remplacement

La mesure de l’activité utérine de la brebis nécessite la réalisation de mesures chez l’animal vivant. Il n’existe pas à ce jour d’alternative non animale. A terme, nous souhaitons concevoir un tractus génital de brebis artificiel pour étudier le transport des spermatozoïdes in vitro. Nous disposons déjà d’informations sur la structure fine du cervix et de l’utérus de brebis qui nous permettent dès maintenant d’imprimer en 3D un tractus génital réaliste. Mais il manque une dimension importante : les contractions utérines. Les informations obtenues avec ce projet permettront d’implémenter le modèle artificiel avec un système de contraction artificielle (comme c’est déjà le cas avec des modèles digestifs). Ce modèle brebis pourra ensuite servir de base de travail pour un modèle humain artificiel.

Réduction

Le projet vise à obtenir des informations provenant de deux types d’implants donc deux lots d’animaux sont nécessaires. Le nombre de 4 animaux par lot a été calculé pour avoir un nombre minimal de 3 animaux par lot en tenant compte d’un éventuel défaut expérimental (chirurgie ou équipement de télémétrie) pour 1 animal sur 4. Les animaux seront analysés pendant plusieurs mois, ce qui permettra d’obtenir des réplicats biologiques sur chaque animal. Les tests statistiques réalisés seront des tests non paramétriques en données répétées car chaque animal sera son propre témoin. Par exemple, au cours du cycle oestral, les paramètres de contraction utérine seront comparés, pour plusieurs cycles successifs, entre le moment de l’oestrus et la phase lutéale au sein de chaque cycle oestral de chaque animal.

Raffinement

Les brebis sont logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée, en groupe social stable. Les brebis proviennent d’un EU fournisseur très proche de notre plateforme ce qui limitera le stress du déplacement. Pour un transit digestif optimal, du foin de qualité sera distribué matin et soir. La douleur est traitée préventivement avant l'acte chirurgical dès induction de l'anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu'à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l'état normal est estimé à 3 à 4 jours post-opératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. De plus, les implants utérins permettront de mesurer en continu la température interne et l’activité locomotrice. Une éventuelle augmentation de la température, signe d’une infection, pourra être détectée et conduire à un traitement antibiotique adapté. L’activité locomotrice sera mesurée comme paramètre de bien être animal. Deux caméras vidéo, présentes dans le logement et couplées aux implants par télémétrie, permettront de suivre les animaux en temps réel dans leur logement et de détecter tout signe de douleur ou mal être. La douleur est également prévenue par l’administration de sérum physiologique stérile et tiédi dans la cavité abdominale : ce geste prévient la formation des adhérences qui peuvent être très douloureuses. Du fait des visites régulières, les animaux seront socialisés et familiarisés à l’humain. Des récompenses après les contentions et manipulations renforceront cette socialisation. Un animal anorexique, prostré, en décubitus latéral prolongé recevra l'administration d'analgésique. Sans réponse physiologique satisfaisante rapide, il sera fait appel au vétérinaire agréé. La décision d’euthanasie par voie médicamenteuse et sous anesthésie sera prise en concertation avec les différents acteurs du projet.

Choix des espèces

Le modèle brebis a été choisi comme modèle expérimental par ses points communs avec l’anatomie humaine concernant la morphologie du tractus génital femelle et la physiologie utérine. Chez ces deux espèces, les contractions utérines sont sous contrôle nerveux et hormonal (l’oestrogène stimule et la progestérone inhibe les contractions utérines). Les brebis seront des femelles multipares et cycliques pour exprimer une activité utérine d’un adulte capable de reproduction.

Soumises à une ligature de l'artère fémorale destinée à provoquer une ischémie de la patte, 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi un prélèvement sanguin et des mesures répétées de perfusion sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses histologiques et moléculaires. Le projet vise à évaluer le rôle d'une voie de signalisation, l'AHR, dans la revascularisation et la régénération du muscle après l'ischémie. Le porteur affirme que les modèles in vitro seraient insuffisants et que seule la souris rend compte des interactions au sein d'un tissu entier.

Objectifs

L?isch?mie chronique des membres inf?rieurs (ICMI), forme la plus s?v?re de la maladie art?rielle p?riph?rique, se caract?rise par un arr?t ou une insuffisance de la circulation sanguine dans les muscles squelettiques entrainant une faiblesse et des douleurs musculaires. Dans des conditions physiologiques, le muscle squelettique poss?de une capacit? remarquable de r?g?n?ration gr?ce ? des cellules souches musculaires. Chez l?adulte, les cellules satellites se situent ? proximit? imm?diate des capillaires sanguins compos?s de cellules endoth?liales et interagissent de mani?re bidirectionnelle pour assurer la r?paration du muscle squelettique. Par ailleurs, l?endoth?lium joue un r?le essentiel dans le maintien de l?int?grit? vasculaire, notamment en r?gulant le tonus vasculaire et les ph?nom?nes de formation de caillots sanguins. De nombreuses voies de signalisation peuvent affecter les cellules endoth?liales et moduler leur capacit? ? former de nouveaux vaisseaux sanguins ce qui peut contribuer au d?veloppement de la pathologie. Des ?tudes se sont int?ress?es plus particuli?rement ? la voie de signalisation du r?cepteur aux hydrocarbures aromatiques (AHR) et ont d?montr? que l?activation de la voie AHR pouvait moduler les capacit?s angiog?niques des cellules endoth?liales, ce qui pourrait perturber la revascularisation post-l?sionnelle et ainsi, la r?g?n?ration musculaire. Dans ce contexte, le but de ce projet est d??valuer l?impact de l?activation de la voie AHR dans les cellules endoth?liales sur la revascularisation et la r?g?n?ration des membres isch?mi?s in vivo.

Bénéfices attendus

Ce travail offrira une meilleure compr?hension des m?canismes responsables des l?sions musculaires post-isch?miques et en particulier l?implication de la voie AHR et des cellules endoth?liales.

Procédures

Les proc?dures invasives sur animal anesth?si? sont au nombre de deux : 1. Mod?le de l?sion musculaire par ligature de l?art?re f?morale (mod?le ICMI) sur animal anesth?si? (1 fois, dur?e : 20 min) 2. Pr?l?vement sanguin sur animal anesth?si? (1 fois, dur?e : 2 min). Les proc?dures non ou peu invasives sur animal anesth?si? ou vigile sont au nombre de un : 1. Mesure de la perfusion sanguine sur animal anesth?si? (2 ? 9 fois / souris en fonction des points de cin?tique d?finis dans la proc?dure, dur?e : 20 min)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets ind?sirables sont ceux li?s ? la contention/manipulation des animaux pouvant engendrer du stress ou ceux li?s ? la r?cup?ration ou post-chirurgie; pouvant conduire ? une perte de poids dans les 24 premi?res heures (10%), une alt?ration de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ?bouriff?, paupi?re ferm?e, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilit? r?duite). Par exp?rience, les signes de souffrance interviennent dans les 24h suivant l?induction des l?sions musculaires, mais ne perdurent g?n?ralement pas au-del?. Dans ce mod?le d?ICMI, il est rarement observ? de n?crose ou de perte du membre inf?rieur (

Devenir

Tous les animaux seront mis ? mort ? la fin de la proc?dure afin de permettre les analyses histologiques et mol?culaires n?cessaires pour r?pondre ? nos questions biologiques.

Remplacement

Afin d??valuer les effets de l?activation de la voie AHR endoth?liale sur la revascularisation et la r?g?n?ration post-isch?mie, le recours ? des mod?les in vitro appara?t insuffisant. En effet, ces approches ne rendent pas compte des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d?un organisme ou d?un tissu entier. De plus, l?utilisation de mod?le in vitro ne pourraient pas rendre compte de la dynamique temporelle des processus de revascularisation et de r?g?n?ration, qui est essentielle dans le contexte d?une isch?mie des membres inf?rieurs. Ainsi, l'utilisation de mod?les animaux reste essentielle pour mieux comprendre les m?canismes physiopathologiques impliqu?s dans l?ICMI. Enfin, la souris est le mod?le de choix en raison des similitudes des syst?mes de r?paration du muscle squelettique humain. Ainsi, le mod?le de ligature de l?art?re f?morale que nous maitrisons au laboratoire permet de reproduire les l?sions isch?miques retrouv?es chez les patients atteints d?ICMI.

Réduction

Nous allons r?duire le nombre d'animaux par l'utilisation des m?thodes non invasives (v?locim?trie laser-doppler) permettant de r?p?ter les analyses sur le m?me animal au cours de la r?g?n?ration, mais aussi gr?ce ? l'utilisation de tests statistiques appropri?s et au fait d?utilisation de la patte controlat?rale comme contr?le sans l?sion. D?apr?s les simulations effectu?es avec l'outil propos? par l'EDA (Experimental Design Assistant) du NC3R, il faut n=10 animaux par groupe exp?rimental pour les analyses histologiques et mol?culaires compte tenu de la variabilit? inter-individuelle dans notre mod?le chirurgical de r?g?n?ration musculaire.

Raffinement

Les animaux import?s resteront une semaine en quarantaine pour acclimatation avant toute manipulation. La souffrance des souris sera r?duite en utilisant des s?datifs et analg?siques. Pour le mod?le d?ICMI, les souris seront anesth?si?es et des injections d?antidouleurs seront faites en pr?- et post-op?ratoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examin?s de fa?on biquotidienne pendant les 3 premiers jours suivant la l?sion musculaire afin de v?rifier leur ?tat g?n?ral de sant?. En cas de signes de souffrance, des mesures gradu?es et adapt?es (analg?sie, mise ? mort compassionnelle, ...) seront prises. La qualit? de l'?levage est am?lior?e en enrichissant les cages exp?rimentales avec des b?tons ? ronger, des ?l?ments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu?un acc?s illimit? ? la nourriture et ? l?eau de boisson.

Choix des espèces

La souris est un mod?le de choix car la physiologie et la r?paration post-l?sionnelle du muscle squelettique est proche de celle de l?Homme. Elle a ?galement l?avantage ind?niable de permettre l?utilisation des souris g?n?tiquement modifi?es. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes de 7 ? 10 semaines. A ce stade, les muscles sont parfaitement form?s.

96 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à trois campagnes de tests à 6, 12 et 18 mois. Les animaux subissent des prises de sang, une suspension à un câble à 45 cm de hauteur, un test de force, un labyrinthe et une course forcée sur tapis avec chocs électriques légers. Le projet évalue un anticorps anti-GDF15 censé freiner le déclin fonctionnel du vieillissement. Les bénéfices annoncés pour la "vitalité" et la "qualité de vie" à un âge avancé restent hypothétiques, les souris étant mises à mort pour nécropsie.

Objectifs

Le vieillissement est un processus complexe et h?t?rog?ne, se manifestant par diff?rentes trajectoires de d?clin fonctionnel et m?tabolique. GDF15 est l?une des prot?ines les plus corr?l?es ? l??ge avec des niveaux qui augmentent progressivement tout au long de la vie. Elle a un effet protecteur ? court terme, mais son ?l?vation chronique est associ?e au d?clin li? ? l??ge. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d'?valuer de mani?re approfondie l'impact d'un traitement par anticorps anti-GDF15 sur ces trajectoires. L'?tude vise ? mettre en ?vidence comment ce traitement influence la pr?servation d'un ensemble de capacit?s intrins?ques (aptitudes physiques et cognitives non li?es ? un apprentissage ou un entrainement) et l'am?lioration des marqueurs cl?s du m?tabolisme comme le taux de cholest?rol et de glucose dans le sang, et la d?pense ?nerg?tique par exemple. En identifiant les effets pr?cis du traitement, ce projet contribuera ? une meilleure compr?hension des m?canismes physiologiques impliqu?s dans le vieillissement, ouvrant ainsi la voie ? de nouvelles strat?gies th?rapeutiques pour favoriser la vitalit? et la qualit? de vie ? un ?ge avanc?. Le projet pourra se d?rouler dans deux ?tablissements Utilisateurs si n?cessaire.

Bénéfices attendus

Gr?ce ? cette ?tude, nous serons en mesure de mieux comprendre le r?le de la GDF-15 dans les processus de vieillissement ainsi que son lien avec le d?clin fonctionnel, et d'envisager de nouvelles approches th?rapeutique pour favoriser la vitalit? et la qualit? de vie ? un ?ge avanc?.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis ? une s?rie d'?valuations comportementales, motrices, et m?taboliques, r?parties sur 3 semaines, le tout ? 3 reprises, soit ? l??ge de 6, 12 et 18 mois : - Les pr?l?vements de sang : faible volume et sous anesth?sie gazeuse pour la Biochimie du sang et l'h?matologie. - L?analyse de la composition corporelle : les animaux seront plac?s dans une cellule de contention, type tube, lui-m?me plac? dans une chambre RMN durant moins de 3 minutes au total. - Evaluation de la coordination motrice : Les animaux seront suspendus ? un c?ble m?tallique ? une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes et le temps de chute (sur une surface ?paisse et molle pour amortir le choc) sera mesur? ? trois reprises, chaque mesure ?tant espac?e d?une heure. - ?valuation de la m?moire spatiale ? court terme : Les animaux seront soumis ? un test d'exploration dans un labyrinthe, d'une dur?e d'environ 8 minutes par souris. - ?valuation de la force de pr?hension : La force motrice des membres sera mesur?e par trois prises espac?es d'une heure pour une dur?e totale d'environ 5 minutes par mesure. - ?valuation de l'activit? motrice et de l'anxi?t? : Les animaux seront observ?s pendant 10 minutes dans une ar?ne lumineuse. - ?valuation de l'endurance physique : Les animaux seront soumis ? un exercice forc? sur tapis roulant. La dur?e de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles. Des stimulations ?lectriques de faible intensit? encouragent le mouvement. - La mesure des ?changes gazeux : les animaux sont temporairement individualis?s (48h) pour permettre la mesure des gaz consomm?s et produits de chaque individu. Afin de limiter la fatigue et l'interf?rence entre les mesures, les tests seront r?partis sur 3 semaines (Pr?l?vements de sang et Analyse de la composition corporelle en semaine 1, tests comportementaux en semaine 2, mesure des ?changes gazeux en semaine 3). L?ensemble du projet jusqu?? ce stade sera r?alis? dans le premier Etablissement Utilisateur. En fin de proc?dure, les animaux seront mis ? je?n durant 2 heures, anesth?si?s pour un pr?l?vement de sang terminal puis mis ? mort pour n?cropsie dans le premier ou le second Etablissement Utilisateur.

Impact sur les animaux

Les tests exp?rimentaux utilis?s pour cette ?tude g?n?rent un faible niveau de stress : - Les pr?l?vements de sang g?n?rent un stress et une douleurs l?gers. Ces pr?l?vements n'auront lieu que tous les 6 mois, soit 3 fois au cours du protocole. - L?analyse de la composition corporelle implique le placement des animaux dans une cellule de confinement exig?e, ce qui g?n?re un stress l?ger et court (moins de 3 minutes au total). - La pr?hension de une ? cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement g?n?re un stress l?ger. - L'?valuation de la coordination motrice g?n?re un stress physique l?ger. Les animaux seront suspendus ? un c?ble m?tallique ? une hauteur de 45 cm pendant maximum 4 minutes. - L'?valuation de la m?moire spatiale ? court terme g?n?re un stress l?ger et court (environ 8 minutes) li? ? un environnement nouveau et non familier. - L'?valuation de la force de pr?hension gen?re un stress lors de la pr?hension mais ?galement un stress physique court lors de l?exp?rience (5 minutes par mesure). - L'?valuation de l'activit? motrice et de l'anxi?t? g?n?re un stress l?ger et court (10 minutes) car l?environnement est nouveau, lumineux et non s?curisant (absence d?enrichissement). - L'?valuation de l'endurance physique g?n?re un stress mod?r? et un inconfort physique dus ? l'exercice forc? (la dur?e de cette intervention est variable en fonction des performances individuelles). Les stimulations ?lectriques sur la grille arri?re sont utilis?es uniquement pour inciter l'animal ? courir et sont calibr?es au niveau minimal efficace (choc aversif l?ger) pour motiver le mouvement par inconfort et non par douleur. - La mesure des ?changes gazeux g?n?re un stress mod?r? li? ? l?individualisation temporaire (48h) des animaux. Les fonds de cage de calorim?trie sont les m?mes que les fonds de cages d?h?bergement habituel, ils sont transparents et les animaux peuvent se voir d?une cage ? l?autre durant l?enregistrement. - Le transport ?ventuel en fin de protocole pour la mise ? mort dans le second Etablissement Utilisateur, entrainera un stress l?ger li? au mouvement des cages durant quelques minutes (300m ? parcourir).

Devenir

Tous les animaux seront mis ? mort en fin de proc?dure afin de proc?der ? des n?cropsies (analyses en biochimie et en expression g?nique sur diff?rents organes d'int?r?t).

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons analyser comment un traitement anti-GDF15 influence l'?volution des capacit?s intrins?ques et des fonctions m?taboliques d'individus d'?ge avanc?. L'?valuation de ces processus exige l'utilisation d'organismes vivants (humains ou mod?les animaux), car les tests comportementaux essentiels ne peuvent ?tre reproduits par des approches in vitro ou ex vivo. Compte tenu de son esp?rance de vie plus courte et de ses processus physiologiques similaires ? ceux de l'Homme, la souris appara?t comme le mod?le de choix le plus pertinent pour cette ?tude.

Réduction

Le nombre d?animaux a ?t? r?duit au maximum en se basant sur les donn?es de la litt?rature et ce nombre a ?t? corrig? par un calcul de puissance statistique. L'utilisation d'un analyseur de composition corporelle pour ?valuer les masses grasses et maigre constitue ?galement un ?l?ment de r?duction du nombre d'animaux utilis?, en ceci que 60 secondes dans une cellule de contention remplacent l'utilisation d'animaux suppl?mentaires : avant l'utilisation de cet automate, il ?tait n?cessaire de pr?voir un groupe d'animaux d?di? ? la composition corporelle, ?valu?e par pr?l?vement et pes?e des tissus lors d'une n?cropsie.

Raffinement

Les tests exp?rimentaux utilis?s pour cette ?tude g?n?rent peu de stress (pr?hension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectu?e avant chaque lot de tests pendant 5 minutes par souris pendant 3 jours avant le d?but des tests pour limiter le stress g?n?r? par l?exp?rimentateur. Les animaux seront ?galement acclimat?s ? la salle d?exp?rimentation pendant la phase d?habituation. Les pr?l?vements de sang seront r?alis?s sous anesth?sie gazeuse afin de limiter le stress et la douleur, ce geste sera effectu? par une personne ayant une longue ex?rience de ce geste technique. Des ?l?ments d?enrichissement seront mis en place dans la cage d?h?bergement afin d?assurer leur bien-?tre et r?duire le stress : animaux plac?s en groupe dans les cages, mise en place de tunnels en cartons, du papier pour faire un nid. A partir de l??ge de 12 mois, les souris seront plac?es dans des portoirs connect?s DVC (Cage Digitales Ventil?es) permettant d?identifier pr?coc?ment toute perte d?activit? et de prostration. Enfin, si la mise ? mort a lieu dans le second Etablissement Utilisateur, les animaux seront transport?s entre les deux ?tablissements suivant une proc?dure de transport d?clar?e lors de l?agr?ment du second Etablissement Utilisateur (cheminement et conditions de transport valid?s par signature d?une charte de transport). Les animaux sont transport?s dans leur cage d'origine et les cages seront prot?g?es du froid ou de la chaleur dans un container souple occultant et isotherme afin de minimiser le stress, pour un transport d'une dur?e de moins de 10 minutes. Le choix de la mise ? mort dans le premier Etablissement Utilisateur sera privil?gi? si l?organisation des laboratoires et des ?quipements au moment de la mise ? mort le permet.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous cherchons ? ?tudier l??volution des capacit?s intrins?ques (aptitudes physiques et cognitives non li?es ? un apprentissage ou un entrainement) d?un individu d??ge avanc? et ses fonctions m?taboliques en fonction d?un traitement anti-GDF15. Cela n?cessite de l??tudier sur des organismes vivants, humains ou mod?les animaux. La souris semble un choix plus appropri? pour cette ?tude gr?ce ? l?esp?rance de vie plus courte et des processus physiologiques similaires ? l?Homme. Pour ?tudier les diff?rentes trajectoires de vieillissement, une ?valuation des capacit?s et des fonctions m?taboliques sera r?alis?e ? trois ?ges diff?rents : 6, 12 et 18 mois. L?objectif est d?identifier le r?le pr?coce de GDF-15 et de l?action du traitement test? ? long terme.

846 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque animal reçoit une greffe de moelle, une irradiation aux rayons X sur animal vigile, jusqu'à quarante injections de médicaments et des prélèvements de moelle osseuse. Certaines développent une leucémie induite, avec augmentation de la rate et perte de poids, avant le déclenchement de points limites biologiques. Le porteur juge le modèle murin "incontournable" et "indispensable" pour étudier une leucémie liée à la protéine p53, faute de prélèvements de patients en nombre suffisant.

Objectifs

Dans les cancers du sang, les mutations de p53 sont peu fr?quentes except? dans certaines cat?gories comme les leuc?mies aigu?s my?lo?des (LAM) secondaires aux n?oplasmes my?loprolif?ratifs (NMP). Les NMP sont des maladies chroniques caract?ris?es par une augmentation des cellules matures du sang (globules rouges, globules blancs, plaquettes). Ils peuvent se transformer en LAM, de tr?s mauvais pronostic avec, dans plus de la moiti? des cas, une implication de la voie p53. Les mutations de TP53 retrouv?es dans les cancers inactivent les fonctions de p53 (qui emp?che normalement la prolif?ration cellulaire en cas d?anomalie survenant dans la cellule), ce qui entra?ne une prolif?ration et une survie cellulaire non contr?l?es. Il a ?t? montr? que ces mutations pouvaient ?galement conf?rer de nouvelles fonctions ? p53 mut?e. Dans ce projet, nous souhaitons identifier les m?canismes reposant sur des anomalies de p53 responsables du d?veloppement de la leuc?mie. Nous avons d?j? d?velopp? des mod?les murins nous permettant d??tudier la maladie, et montr? que des diff?rences existaient entre les mod?les d?l?t?s ou mut?s pour p53. Objectif (1) : Continuer la caract?risation les mod?les murins. Nous ?tudions la coop?ration des alt?rations de p53 avec celles de g?nes retrouv?s mut?s. Nous ?tudierons quelles populations de cellules prog?nitrices (populations encore peu diff?renci?es qui vont donner naissance apr?s plusieurs divisions aux cellules matures) sont amplifi?es dans la moelle osseuse, lieu de fabrication des cellules sanguines. Nous d?terminerons ?galement si les mutations de p53 conf?rent un avantage s?lectif par rapport ? sa d?l?tion. Objectif (2) : Identification des m?canismes impliqu?s. Nous ?tudierons quels m?canismes sont impliqu?s, en particulier quelles diff?rences sont observ?es sur la prolif?ration cellulaire et la mort cellulaire en pr?sence des alt?rations de p53 dans la moelle osseuse. Nous d?terminerons comment les anomalies de p53 modifient l?expression de g?nes et l?ADN. Nous d?terminerons ?galement le niveau d?instabilit? g?n?tique dans nos mod?les. Objectif (3) : Effet de nouveaux traitements. Nous testerons l?effet de mol?cules pharmacologiques ciblant les voies identifi?es comme importantes dans le d?veloppement de la LAM, dans les mod?les d?velopp?s pour les objectifs 1 et 2 et dans des mod?les de greffes de cellules humaines de patients atteints de LAM post NMP dans des souris immunod?ficientes.

Bénéfices attendus

Notre ?tude permettra de mieux comprendre les ?tapes conduisant au d?veloppement de la maladie chez les patients. Si nous identifions un g?ne ou une voie importante, nous pourrons d?velopper de nouveaux traitements que nous testerons dans les mod?les pr?cliniques d?velopp?s dans le cadre de ce projet. A long terme, nous esp?rons ainsi proposer de nouvelles th?rapies dans ces leuc?mies de mauvais pronostic et am?liorer la survie des patients. Nos r?sultats pourraient aussi ?tre applicables ? d?autres types de cancers avec des mutations de p53, qui repr?sentent plus de la moiti? des cancers solides.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : greffe de cellules murines provenant de souris donneuses portant les g?nes d?int?r?t dans des souris receveuses : une injection, dur?e 1 minute, sous anesth?sie g?n?rale. Irradiation vigile (rayons X), dur?e maximale 15 minutes. Injections de m?dicaments, au maximum 40 sur 3 mois, sous anesth?sie locale, dur?e 30 secondes. Pr?l?vements de sang toutes les 2 semaines sous anesth?sie g?n?rale, n=12 maximum, dur?e 2 minutes. Pour certains animaux, pr?l?vement de moelle osseuse sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie, dur?e 1 minute, nombre maximal: 10.

Impact sur les animaux

Certains des mod?les murins d?veloppent une leuc?mie, ce qui peut conduire ? une spl?nom?galie et une perte de poids. Notre exp?rience pass?e nous a permis de mieux ma?triser le d?veloppement de la maladie chez les souris, en ?tablissant des points limites biologiques pr?coces, avant d?gradation de l??tat g?n?ral des souris, bas?s sur la d?tection de cellules leuc?miques dans le sang. Concernant l?administration de nouveaux traitements, nous ne connaissons pas toujours l??ventuelle toxicit? des mol?cules administr?es. Le traitement peut conduire ? une perte de poids et ? des effets ind?sirables encore inconnus mais nous nous r?aliserons des exp?riences pilotes afin de d?celer une ?ventuelle toxicit?.

Devenir

Les animaux seront euthanasi?s pour analyses et ?tudes sur organes et tissus post-mortem.

Remplacement

Les leuc?mies aig?es my?lo?des post n?oplasmes my?loprolif?ratifs sont des maladies complexes, et l'?tude de ces cancers repose sur la mise en ?uvre en conditions physiologiques d'interactions complexes entre diff?rentes cellules (dont des cellules immunitaires) et m?diateurs (cytokines, etc..). Etant donn? l?implication de la voie p53 dans les leuc?mie post n?oplasmes my?olprolif?ratifs (retrouv?e dans plus de la moiti? des cas), un mod?le in vivo porteur des alt?rations g?n?tiques retrouv?es dans ces maladies est incontournable. De plus, comme le nombre de pr?l?vements de patients est limit? du fait de la raret? de cette maladie, il est indispensable de d?velopper des mod?les murins. Ils nous permettront de valider et consolider les r?sultats obtenus chez l?Homme. Par ailleurs, le processus de leuc?mogen?se requiert l?environnement m?dullaire impossible ? reproduire in vitro. Enfin, la prolif?ration in vitro de cellules tumorales est limit?e et ne refl?te pas ce qui se passe in vivo chez l?homme. Notre mod?le pourra ?ventuellement par la suite servir ?galement de mod?le pr?clinique si nous identifions de nouvelles cibles th?rapeutiques.

Réduction

Afin de r?duire le nombre d?animaux nous r?alisons au maximum des transplantations primaires (c?est-?-dire que nous r?coltons les cellules de moelle osseuse d?une souris que nous greffons dans plusieurs souris receveuses (5)), pour limiter les couples en ?levage et le nombre de port?es (car les souris donneuses sont des souris en ?levage). Lorsque nous voulons ?tudier plusieurs g?notypes, nous ?tudions le maximum de groupes en m?me temps afin de n?avoir qu?un seul groupe contr?le. Si nous d?terminons que les mutants de TP53 se comportent de la m?me mani?re, nous focaliserons la suite de notre ?tude sur un seul des mutants. Dans le cas de tests de nouvelles drogues, nous r?aliserons au pr?alable des ?tudes pilotes pour identifier d??ventuelles toxicit?s. Le nombre n?cessaire d?animaux a ?t? estim? afin d?avoir un pouvoir statistique suffisant, en accord avec les ?tudes publi?es.

Raffinement

Les conditions d?h?bergement veilleront ? limiter le stress des animaux (enrichissement : sizzlenests, tunnels, domes). Dans les mod?les leuc?miques ou lors des traitements, la surveillance des animaux sera accrue : observation quotidienne et pes?e minimum 3 fois par semaine, prise de sang toutes les 1-2 semaines, et les points limites pr?coces seront strictement appliqu?s. Des variations de certains param?tres biologiques ? la prise de sang ont ?t? identifi?es comme fortement pr?dictives du d?veloppement d?une leuc?mie, avant que les souris ne pr?sentent de signes de souffrance. Toute intervention sera accompagn? d?anesth?sie locale ou g?n?rale, avec analg?sique en cas d?acte douloureux. En cas de nouveaux traitements, nous r?aliserons des exp?riences pilotes afin de d?celer une ?ventuelle toxicit?.

Choix des espèces

Les mod?les murins sont ad?quats pour notre ?tude, car ils nous permettent d?explorer les diff?rentes ?tapes de la leuc?mogen?se, dans un mod?le mammif?re qui refl?te en g?n?ral ce qui se passe chez l?homme. Par ailleurs, nous pourrons obtenir dans un temps assez court un nombre satisfaisant d?animaux pr?t ? ?tre exp?riment?. Les exp?rimentations seront men?es sur des dur?es d?un an maximum. Les souris porteuses de mutations de d'int?ret pr?sentent des mutations retrouv?es chez les patients atteints leuc?mie post cancer my?lo?de, et reproduiront donc le plus fid?lement possible les conditions de d?veloppement de la maladie. L?invalidation/expression de ces g?nes d?pendent de l?expression d?une enzyme que nous pouvons induire. Etant donn? que nous souhaitons mod?liser la maladie qui survient chez l?homme ? l??ge adulte, nous induirons les d?l?tions/ expressions de ces g?nes chez les souris autour de 2 mois et ?tudierons les souris ? partir de 5 semaines apr?s induction, soit ? partir de l??ge de 3 mois (?ge adulte).

Greffées avec des cellules leucémiques humaines puis suivies par imagerie, 1 290 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque animal reçoit des injections répétées, jusqu'à sept séances de chimiothérapie, des prises de sang mensuelles et des ponctions de moelle osseuse au genou. Le projet étudie la distribution de cellules d'une leucémie de mauvais pronostic et la résistance aux traitements. Le porteur retient des souris immunodéprimées, qui acceptent la greffe de cellules humaines sans rejet, et écarte le poisson zèbre jugé trop éloigné du système sanguin des mammifères.

Objectifs

Sur la base de donn?es cliniques obtenues au laboratoire ? partir de patients atteints d?un cancer du sang d?un sous-type particulier de mauvais pronostic, les objectifs de notre projet de recherche sont de d?terminer l?implication, dans le processus de d?veloppement et de la r?sistance aux traitements de cette leuc?mie, de deux prot?ines retrouv?es dans les cellules malades de ces patients. Pour cela, nous d?velopperons un mod?le de greffe chez la souris de cellules de patients, qui expriment une prot?ine qui ?met de la lumi?re, et o? la pr?sence de ces deux prot?ines sera ?ventuellement modifi?e. Nous pourrons ainsi suivre la distribution des cellules leuc?miques dans la souris greff?e gr?ce ? des m?thodes d?imagerie du petit animal. Ce mod?le, s?il mime cette h?mopathie humaine, nous permettra de mieux comprendre les m?canismes responsables de la r?sistance aux traitements de ce type de leuc?mie chez l?Homme. Ces connaissances nous ouvriront de nouvelles pistes pour d?velopper des th?rapies adapt?es ? ce sous-type particulier de leuc?mie lymphoblastique qui ?chappe aux th?rapies conventionnelles.

Bénéfices attendus

Ce projet s?int?gre dans un projet de recherche translationnelle, ? partir d?observations cliniques, qui ont permis de mettre en ?vidence l?expression massive de deux prot?ines pour un sous-groupe particulier de patients atteints de cancer du sang de mauvais pronostic. Une meilleure compr?hension des m?canismes de d?veloppement de la maladie et de sa r?sistance aux traitements permettra d?identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques. Des mod?les murins nous permettront d?une part, de contr?ler l?expression des deux prot?ines et d??tudier les cons?quences de leur expression sur la distribution des cellules canc?reuse dans la moelle osseuse. Une meilleure connaissance des processus de diss?mination des cellules leuc?miques est n?cessaire pour d?velopper de nouvelles strat?gies th?rapeutiques. Le projet d?crit ici est int?gr? dans un projet plus vaste qui inclut plusieurs groupes de recherche et, entre autres, le criblage de mol?cules sur des lign?es cellulaires de patients de ce sous-groupe de leuc?mie pour identifier de nouveaux m?dicaments qui permettraient de cibler ces cellules leuc?miques particuli?res, et de gu?rir les patients.

Procédures

MODIFICATION : Les animaux seront soumis ? deux injections sur animal vigile. Pour les animaux trait?s par chimioth?rapie, 7 injections de produits de chimioth?rapies seront r?alis?es sur animal vigile au cours de la proc?dure par semaine (traitement sur 4 semaines). Pour suivre l??volution de l?h?mopathie attendue, 2 ? 12 prises de sang, ? raison d?une prise par mois ou au maximum deux pr?l?vements de moelle osseuse (r?alis?s sur animal anesth?si?, avec au minimum 2 mois entre les deux pr?l?vements), pourront ?tre r?alis?s sur la souris. Les souris seront anesth?si?es pour suivre la distribution des cellules qui ?mettent de la lumi?re dans un appareil d?di? apr?s une injection d'un produit de d?tection (3 injections / semaine). La dur?e des chaque geste ne d?passe pas 10 minutes.

Impact sur les animaux

Suite ? l?injection de cellules leuc?miques, les souris sont susceptibles de d?velopper une leuc?mie. La majorit? des effets d?l?t?res sera d?e ? l??mergence de cette maladie : l??tat de sant? des souris greff?es peut se d?grader rapidement, n?cessitant un suivi tr?s r?gulier. Les leuc?mies entrainent une forte perturbation de la formule sanguine : en cons?quence, elles perdent du poids et, dans les stades avanc?s, pr?sentent des signes de dyspn?e, d?an?mie, parfois des masses sous la peau, deviennent inactives et prostr?es, avec un pelage non entretenu. L?imagerie de bioluminescence n?cessite l?injection de luciferine sur animal vigile et une anesth?sie des souris ce qui peut constituer une nuisance temporaire g?n?ralement bien support?e. La ponction de moelle osseuse ?tant r?alis?e au niveau du genou, la souris peut avoir des l?sions au niveau du cartilage qui peuvent provoquer des douleurs et perturber temporairement ses d?placements. Enfin, il existe toujours un risque d?infection ou d?inflammation au niveau des points de ponction ou d?injection.

Devenir

Les animaux seront mis ? mort ? la fin des proc?dures pour pr?l?vements et analyses ult?rieures sur les tissus pr?lev?s. Ils ne pourront donc pas servir pour d'autres exp?rimentations.

Remplacement

L?impact des modifications d?expression de CDX2 et/ou UBTF-ATXN7L3 sur la canc?rog?n?se et la distribution dans le corps de la souris des cellules leuc?miques avant et apr?s traitement chimioth?rapeutique sera ?tabli in vivo dans les mod?les murins de greffes. Ce mod?le permet le suivi de cellules leuc?miques dans leur environnement m?dullaire qui est un environnement complexe difficilement mod?lisable in vitro ou ex vivo, et dans un environnement extra-m?dullaire. Cette ?tude de la biodistribution des cellules leuc?miques n?cessite donc l?utilisation d?animaux vivants. Les ?tudes m?canistiques associ?es, non d?crites ici, seront r?alis?es ? partir de mod?les de cultures ex vivo de cellules de moelle osseuse issues de ces souris et/ou de lign?es cellulaires en culture mais ne peuvent pas r?pondre aux questions abord?es par un mod?le murin in vivo dans lequel la distribution m?dullaire et extra-m?dullaire peut ?tre suivie et o? l?interaction avec les cellules de la niche est essentielle. L?utilisation d?un autre mod?le animal, par exemple le poisson z?bre, ne permettrait pas non plus de r?capituler la complexit? du syst?me h?matopo??tique des mammif?res.

Réduction

Les chiffres indiqu?s dans le dossier correspondent au nombre estim? maximal d?animaux utilis?s pour les exp?riences envisag?es. Le nombre d?animaux minimum et suffisant a ?t? d?termin? avec un outil math?matique ? 10 animaux par groupe au minimum pour obtenir des r?sultats robustes et fiables statistiquement. La possibilit? d?imager les animaux, d?analyser la num?ration sanguine des animaux par prise de sang et d?immunoph?notyper les cellules de moelle osseuse ponctionn?es au niveau du genou permet une ?tude longitudinale et ainsi, de diminuer le nombre des animaux utilis?s.

Raffinement

Les animaux seront h?berg?s en groupes dans des conditions sanitaires contr?l?es et permettant un bien-?tre optimal dans des portoirs ventil?s (igloo, tubes de cellulose pour la fabrication des nids, balan?oires, liti?re d?poussi?r?e). Ils seront acclimat?s au moins deux semaines apr?s leur arriv?e ? l?animalerie et avant le d?but de toute proc?dure. Les proc?dures ont ?t? ?tablies afin de r?duire au maximum le stress et la souffrance des animaux soumis aux exp?rimentations. Une anesth?sie sera pratiqu?e pour certain protocole pour limiter le stress et la douleur. Les animaux seront surveill?s quotidiennement durant les proc?dures. En cas de signes d?infection, la plaie sera trait?e avec un antiseptique local. En cas de signes de douleur, les animaux recevront un traitement analg?sique. Des points limites pr?coces ont ?t? d?finis afin d?interrompre les proc?dures et limiter la souffrance animale et garantir le bien-?tre animal.

Choix des espèces

L'esp?ce utilis?e est la souris (Mus musculus) qui repr?sente l?esp?ce animal la plus propice pour ce type d??tude pour les raisons suivantes : ?nombreux protocoles bien ?tablis pour cette esp?ce ?possibilit? d'avoir acc?s ? des animaux g?n?tiquement modifi?s, notamment permettant les greffes de cellules humaines sans rejet (animaux immunod?prim?s) ?mod?les mimant tr?s bien les cancers h?matologiques et qui ont d?j? fait l?objet de nombreuses applications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilis?s car les potentielles applications th?rapeutiques s'adresseront ? une population humaine adulte.

Espèce en danger critique d'extinction, l'Apron du Rhône fait ici l'objet d'une étude où 160 individus issus d'élevage vont être utilisés, tous mis à mort, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque poisson est marqué, soumis à une restriction alimentaire, à un test de tolérance à la chaleur poussé jusqu'à la perte d'équilibre et à des mesures d'effort de nage. Le porteur inscrit le projet dans un Plan National d'Action et annonce vouloir améliorer les connaissances utiles à la conservation. L'étude vise donc à protéger une espèce menacée en mettant à mort 160 de ses représentants élevés pour l'occasion, leurs organes prélevés pour analyse.

Objectifs

Ce projet vise ? identifier les m?canismes responsables du d?clin des populations d?Apron du Rh?ne, une esp?ce end?mique du bassin du Rh?ne aujourd?hui class?e en danger critique d?extinction et faisant l?objet d?un Plan National d?Action. De nombreuses ?tudes ont ?t? men?es afin de conna?tre les causes ?cologiques de ce d?clin mais tr?s peu se sont int?ress?es aux m?canismes physiologiques pouvant expliquer la difficult? de cette esp?ce ? maintenir des populations stables. Dans le contexte des changements climatiques et du r?chauffement des rivi?res, il avait ?t? sugg?r? que cette esp?ce pr?sentait une faible capacit? d?acclimatation aux hausses de la temp?rature environnementale. Cependant, lors d?une ?tude r?cente, une ?quipe a montr? que cette esp?ce tol?rait facilement une vague de chaleur. Comme l?augmentation de la temp?rature du milieu s?accompagne chez les poissons (dont la temp?rature corporelle d?pend de l?eau), d?une augmentation de la d?pense d??nergie, une autre hypoth?se attenante serait que l?Apron du Rh?ne ne pourrait tol?rer les variations de temp?rature qu?avec assez de nourriture pour faire face ? cette d?pense d??nergie. Afin de tester cette hypoth?se, des Aprons issus d?une reproduction artificielle seront soumis ? deux temp?ratures diff?rentes et/ou ? une diminution de la quantit? de nourriture pendant 4 semaines au minimum. Puis des mesures de tol?rance thermique, de performances de nage et des d?penses d??nergie de l?animal et fonctionnement ?nerg?tique de ses tissus seront r?alis?es pour d?crire, ? la fois sur l?animal et sur ses tissus, les cons?quences de ces deux contraintes isol?es ou combin?es sur le fonctionnement de cette esp?ce prot?g?e, afin d?am?liorer les connaissances visant ? sa conservation.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d?am?liorer les connaissances sur le fonctionnement et les besoins de l?Apron du Rh?ne, une esp?ce menac?e. Il permettra notamment de mieux comprendre comment les variations de temp?rature de l?eau et la disponibilit? de nourriture peuvent influencer la capacit? de ces poissons ? vivre, ? se d?placer et ? faire face ? des conditions difficiles. Ces r?sultats aideront ? mieux prendre en compte ces facteurs dans les actions de conservation.

Procédures

Les poissons seront soumis ? plusieurs interventions au cours du projet. Toutes les interventions ne concerneront pas n?cessairement chaque individu, car les essais seront organis?s par lots et par s?quences. ? Marquage individuel pour le suivi : 1 fois, dur?e d?environ 5 ? 10 minutes par poisson. ? Manipulations de routine (capture, transfert, pes?e et mesure) : plusieurs fois au cours du suivi (environ 3 ? 6 fois selon les s?quences), dur?e de quelques minutes par poisson ? chaque fois. ? Une restriction alimentaire pour certains groupes : alimentation r?duite ? 50% de la ration ?normale?, pendant la p?riode de conditionnement (jusqu?? ~8 semaines pour le groupe exp?rimental ? restriction alimentaire ?). ? Une mise ? jeun avant certaines mesures afin d??viter l?effet de la digestion sur le m?tabolisme : je?ne standardis? d?environ 24h, avec une dur?e totale strictement inf?rieure ? 48h, r?p?t? avant chaque test m?tabolique (au maximum 2 fois selon la s?quence exp?rimentale). ? Test de tol?rance ? la chaleur (exposition ? une augmentation progressive de la temp?rature jusqu?? un point limite) : au maximum 1 fois par poisson, dur?e totale d?environ 90 minutes. ? Mesures en dispositif de nage : au maximum 1 fois par poisson. Les poissons sont plac?s la veille (vers 16h-18h) dans un tunnel de nage pour une phase d?acclimatation d?environ 12h et le matin (8h-9h) l?enregistrement de performance de nage commence pour maximum 6 heures. ? Mesure de temp?rature pr?f?r?e dans un dispositif d?di? (pr?f?rence thermique) : au maximum 1 fois par poisson, dur?e d?environ 24 heures. ? Fin de proc?dure : euthanasie sur un sous-?chantillons de poissons en fin de protocole, suivie de pr?l?vements d?organes r?alis?s imm?diatement apr?s (quelques minutes) pour des analyses en laboratoire.

Impact sur les animaux

Les effets ind?sirables attendus sont principalement li?s au stress physiologique induit par : - Le changement d?environnement (transport entre les deux animaleries), - Les manipulations exp?rimentales (tunnels de nage, chambre de respirom?trie, ?chauffement thermique, restriction calorique). Ce stress peut favoriser des troubles immunitaires et l?apparition d?infections opportunistes, notamment chez des individus d?j? fragilis?s. Ce risque sera r?duit par des phases de r?cup?ration post-manipulation, une surveillance rigoureuse de l??tat des animaux et une stabulation adapt?e (eau filtr?e, oxyg?n?e, cachettes, densit? contr?l?e). Les autres effets ind?sirables incluent : - Le je?ne alimentaire impos? avant les mesures m?taboliques (~24h, strictement

Devenir

Les poissons seront mis ? mort ? la fin de la proc?dure selon la r?glementation en vigueur, afin de pouvoir pr?lever les organes et r?aliser les mesures de fonctionnement ?nerg?tique des cellules (capacit? des tissus ? produire de l??nergie).

Remplacement

A ce jour, seule l?exp?rimentation sur animaux permet de r?aliser une ?tude int?grative qui prend en compte l?ensemble de l?organisme et ses r?ponses physiologiques, surtout lorsqu?il s?agit d?animaux issus de la faune sauvage, ou non mod?les. Cela permet notamment de caract?riser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour ?tudier de fa?on compl?te, les r?ponses m?taboliques de l?animal face ? son environnement. Afin de ne pas impacter les populations naturelles (tr?s faibles dans le cas de l?Apron du Rh?ne), notre ?tude utilise des poissons uniquement issus d?un ?levage.

Réduction

Compte tenu de la variabilit? interindividuelle attendue (taille, masse, r?ponses physiologiques), le nombre d?animaux a ?t? r?duit au strict n?cessaire tout en garantissant la pertinence scientifique et statistique. Le marquage individuel permet un suivi longitudinal et l?utilisation de mod?les ? mesures r?p?t?es dans lesquels l?individu est l?unit? statistique et peut ?tre int?gr? comme effet al?atoire, ce qui optimise l?information obtenue par poisson et limite le besoin d?augmenter les effectifs. Le projet pr?voit jusqu?? 160 poissons. Le nombre d?animaux n?cessaire pour r?pondre aux objectifs scientifiques est de 136 poissons (r?partis entre les groupes temp?rature ? alimentation). Une r?serve de 24 poissons (?15%) est pr?vue uniquement pour compenser d??ventuelles pertes li?es au transport, ? l?acclimatation ou au retrait pr?coce d?un individu pour raison de bien-?tre. Cette r?serve n?augmente pas le nombre d?animaux effectivement utilis?s si elle n?est pas mobilis?e. Le plan exp?rimental vise ? maximiser l?information recueillie par individu (mesures standardis?es et comparables) afin de limiter le recours ? des animaux suppl?mentaires. Dans notre cas, les effets attendus incluent non seulement l?impact d?une restriction calorique, mais aussi l?interaction crois?e temp?rature ? restriction calorique, pour laquelle les r?ponses peuvent se chevaucher entre groupes et g?n?rer des tailles d?effet plus modestes. Un effectif de 16 individus par groupe nous permet donc de conserver une puissance statistique suffisante pour d?tecter ces effets tout en restant dans un cadre de r?duction.

Raffinement

Le transport (du site d??levage ? l?animalerie) est r?alis? dans des contenants adapt?s (bacs de transport calorifug?s), avec eau bull?e en continu, contr?le de la temp?rature, densit? limit?e et dur?e r?duite (< 5 heures). ? l?arriv?e, les poissons sont plac?s en aquariums pr?par?s ? l?avance et font l?objet d?une surveillance rapproch?e (3 rondes journali?res minimum durant la premi?re semaine). Lors des protocoles in vivo, un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesures et changement de milieu ? tunnel, chambre ou nouvel aquarium) sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re, suivi par un temps d?acclimatation de 12h dans le tunnel de nage avant les protocoles de respirom?trie. Apr?s chaque exp?rience, les poissons seront replac?s dans leur aquarium de stabulation et toutes les pr?cautions seront prises pour leur ?viter toutes nuisances visuelles et sonores. Les Aprons seront maintenus dans des aquariums de 50L ou 90L en densit? adapt?e ? leur esp?ce, agr?ment?s de plantes artificielles, de gravier et de cachettes en tube PVC. Quel que soit leur groupe exp?rimental, les poissons seront nourris une fois par jour, avec des larves de chironome et lors du nourrissage, leur comportement sera particuli?rement observ?. Un poisson ne se nourrissant pas ou pr?sentant un comportement anormal sera imm?diatement isol? dans un bac de r?cup?ration o? il b?n?ficiera de conditions environnementales optimis?es (r?duction des stimuli, oxyg?nation renforc?e, diminution du stress par apport de sel, acc?s facilit? ? la nourriture). Une observation biquotidienne sera r?alis?e par le personnel animalier et les exp?rimentateurs afin de veiller au bien-?tre des animaux depuis leur arriv?e ? l?animalerie jusqu?? l?euthanasie. Enfin, les ?tats de sant? et de bien-?tre des animaux seront ainsi ?valu?s quotidiennement en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d??valuation afin de d?finir des points limites adapt?s et pr?coces pour mettre fin ? toute douleur incompatible avec les objectifs du projet dans les plus brefs d?lais : retrait du protocole si un poisson pr?sente durablement une respiration anormale, une perte d??quilibre, une incapacit? ? nager correctement, un refus de s?alimenter, ou des l?sions visibles. L?animal est alors plac? en bac de r?cup?ration ; en l?absence d?am?lioration rapide, une euthanasie est pratiqu?e selon les m?thodes r?glementaires.

Choix des espèces

Comprendre les causes du d?clin de l?Apron du Rh?ne n?cessite l?utilisation de ce poisson en tant que mod?le d??tude. Du fait de l?importance des actions de conservation engag?es pour la sauvegarde de cette esp?ce, il existe une litt?rature cons?quente concernant des approches ?cologiques mais les param?tres physiologiques que l?on souhaite caract?riser dans cette ?tude n?ont que tr?s peu ?t? abord?s. Afin de ne pas impacter les populations naturelles, les poissons utilis?s dans cette ?tude proviennent exclusivement d?un ?levage exp?rimental. Les Aprons seront des jeunes adultes (2ans) afin de (i) limiter la variabilit? li?e au d?veloppement rapide des juv?niles (croissance/ontog?nie), (ii) travailler sur des individus dont les fonctions physiologiques sont stabilis?es (morphologie, capacit?s de nage, tol?rance thermique), et (iii) ?viter des biais potentiels li?s ? la maturation/reproduction (changements hormonaux, allocation d??nergie aux gonades) qui peuvent modifier fortement le m?tabolisme et la r?ponse ? la temp?rature et ? l?alimentation.