Recherche fondamentale

Le crâne ouvert sous anesthésie pour environ six heures afin d'y implanter une chambre d'enregistrement, cinq macaques rhésus sont soumis à des enregistrements électrophysiologiques quotidiens, dans des procédures classées de souffrance modérée. Chaque animal est installé chaque jour en chaise de contention, avec un contrôle de sa consommation d'eau, cinq jours par semaine pendant six à vingt-quatre mois. Le porteur met en avant que tous les animaux sont gardés vivants à l'issue. Après une chirurgie de désimplantation, les électrodes sont pourtant laissées dans le lobe temporal, trois macaques pouvant être réutilisés et deux replacés en élevage.

Objectifs

La voix humaine est l?un de nos signaux sociaux les plus puissants. En une fraction de seconde, nous reconnaissons qui parle, percevons son ?motion et devinons son intention. Cette aptitude remarquable n?est pas propre ? l??tre humain : les macaques, les ouistitis et d?autres primates extraient eux aussi des informations sur l?identit? et l??tat affectif ? partir des vocalisations, afin de s?orienter dans leurs environnements sociaux complexes. Les ?tudes de neuroimagerie ont mis en ?vidence des ? patchs vocaux? (? voice patches ?) chez l?humain?, et plus r?cemment chez le macaque et le ouistiti, sugg?rant l?existence d?une architecture neuronale conserv?e pour le d?codage des voix, fa?onn?e par des millions d?ann?es d??volution des primates. Cependant, nous ne disposons toujours pas d?un mod?le au niveau neuronal expliquant comment les voix sont repr?sent?es dans le cerveau. L?IRM fonctionnelle permet de localiser les r?gions du cerveau sensibles ? la voix, mais ces cartes ne permettent pas d?expliquer comment les populations de neurones encodent les voix. Ce projet vise ? combler ce foss? en passant des cartes corticales aux neurones individuels chez le macaque. Le projet cartographiera les neurones s?lectifs aux voix chez n=5 macaques ? l?aide d?enregistrements des neurones ? haute densit? guid?s par IRM fonctionnelle. Il mod?lisera comment les neurones respondent aux voix ? partir de descripteurs acoustiques et de r?seaux neuronaux profonds, afin de r?v?ler les strat?gies de repr?sentation vocale chez le macaque.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compr?hension unique de l?information vocale contenue dans l?activit? de populations de neurones individuels du cortex auditif secondaire. Ceci contribuera ? notre connaissance des m?canismes neuronaux de la communication, avec un impact potentiel sur le d?veloppement des nouvelles g?n?rations d?implants corticaux pour restaurer/augmenter l?audition.

Procédures

Chaque animal sera soumis aux interventions suivantes : - D?placement au centre IRM pour acquisition d'images IRM, sous anesth?sie pour une dur?e totale d'environ 3h ; - Chirurgie d'implantation de chambre d'enregistrement, sous anesth?sie, pour une dur?e d'environ 6h ; - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements ?lectrophysiologiques, environ 2h, 5 jours par semaine, ainsi que le contr?le hydrique . Un maximum de 5 sessions d?imagerie par animal sera effectu? pour la localisation des aires sensibles ? la voix (limit?es ? 1 ou 2 en cas de r?sultats concluants). L?entrainement ? la t?che et l?enregistrement pendant la t?che seront effectu?s 5j/semaine pendant la dur?e de l'exp?rience, qui n'est pas d?finissable a priori. Une estimation vraisemblable serait entre 6 et 24 mois (entrainement 3- 6 mois / enregistrement 3-18 mois) selon l'avancement de l'entra?nement des animaux et la qualit? des enregistrements. Dans le cas d'un protocole d'enregistrement plus long, une prolongation serait demand?e ? la SBEA.

Impact sur les animaux

Stress li? ? la capture en cage de contention: Douleur li?e ? la piq?re pour les anesth?sies; Risques li?s ? l'anesth?sie pour l?IRMf et la chirurgie d?implantation; Irritation de la trach?e li?e ? l?intubation pour l?anesth?sie gazeuse; Douleur post-op?ratoire pour l'implantation; Possibles infections au niveau des implants.

Devenir

Tous les animaux sont gard?s en vie ? l'issue de la proc?dure. Une fois les enregistrements termin?s, les animaux subissent une chirurgie de d?-implantation du connecteur (les ?lectrodes subdurales sont laiss?es en place pour ?viter une nouvelle craniotomie). Apr?s cicatrisation et r?cup?ration, ils peuvent soit ?tre r?utilis?s dans es projets pour lesquels la pr?sence d??lectrodes dans le lobe temporal n?est pas g?nante (potentiellement 3/5), ou replac?s dans des groupes reproducteurs dans des ?levages (potentiellement n=2).

Remplacement

Le but du projet est de comprendre comment les neurones dans les aires s?lectives ? la voix du cortex auditif traitent l?information vocale. Les enregistrement de neurones isol?s dans les aires de la voix sont inexistants chez l?humain, il est donc n?cessaire d?avoir recours ? des animaux pour cette recherche.

Réduction

R?duction du nombre d?animaux au minimum (n=5) pour obtenir des r?sultats chez au moins deux (voire trois singes) sur chacune des exp?riences pr?vues sur 5 ans, ?tant donn?e la complexit? de la chirurgie qui implique un certain risque, et la possibilit? que des matrices cessent de donner du signal exploitable apr?s quelques mois. Si nous obtenons suffisamment de donn?es neurophysiologiques pour une analyse statistique satisfaisante chez trois animaux, nous n'en utiliserons pas d?autres. Pour chaque animal, l?enregistrement avec plusieurs micro?lectrodes multi-contacts permettra de mesurer l?activit? de populations neuronales dans plusieurs structures corticales et sous-corticales. La richesse des enregistrements multi-?lectrodes offre la possibilit? de r?aliser de tr?s nombreux types d?analyses portant sur les potentiels d?actions de neurones isol?s (modulation de fr?quence de d?charges ou de synchronisation entre neurones dans diff?rentes p?riodes de la t?che ou dans diff?rentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l?activit?, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d?actions. La r?p?tition des s?ances d?enregistrement sur plusieurs mois a pour objectif d?augmenter le nombre de neurones diff?rents enregistr?s dans chaque structure. Cette augmentation permet d?augmenter la puissance statistique de nos analyses La dur?e totale des enregistrements pour un animal est ?troitement d?pendante de la quantit? de neurones enregistr?s quotidiennement. De fait, elle ne peut ?tre d?finie ? priori.

Raffinement

Les animaux sont h?berg?s en paires dans des cages et voli?re enrichis de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires et aussi le retour ? une activit? normale en p?riode post-chirurgicale. Apr?s un d?lai minimal d'une semaine et selon l'?tat de r?cup?ration apr?s l?implantation, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est famili?re. Les m?thodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilis?es afin de r?duire le stress des sujets. L'IRM anatomique et fonctionnelle seront r?alis?s sous anesth?sie g?n?rale afin de s'assurer de l'inconscience de l'animal, r?duisant de fait le stress de l'animal lors de la r?alisation de la proc?dure. Lors d'interventions chirurgicales, en plus de l'anesth?sie, un analg?sique sera administr? et prolong? en p?riode post-op?ratoire. Des points limites pr?coces et adapt?s seront appliqu?s.

Choix des espèces

Les raisons justifiant le choix des macaques comme esp?ce de comparaison sont les suivantes : - Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylog?n?tique de sorte que les r?sultats nous renseigneront sur l'histoire de l'?volution relativement r?cente ; - Ils utilisent des vocalisations complexes et vari?es, bien caract?ris?es acoustiquement; - Il s'agit d?un mod?le neuroscientifique largement ?tudi?, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les r?sultats obtenus seront interpr?tables en relation avec une grande quantit? de donn?es compl?mentaires; - Enfin, ils peuvent ?tre scann?s en IRMf sur le m?me scanner que les humains, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la litt?rature ?lectrophysiologique sur les singes. Les animaux seront pr?f?rentiellement utilis?s au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du d?veloppement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilis?s. Cela permet un contr?le plus pr?cis des protocoles exp?rimentaux, que ce soit en termes de volume des r?compenses utilis?es pour l'apprentissage par renforcement, de contr?le du r?gime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures c?r?brales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux ?tant encore jeunes, ils pr?sentent une meilleure tol?rance aux proc?dures exp?rimentales et une meilleure r?cup?ration suite aux proc?dures n?cessitant une anesth?sie. Des animaux plus jeunes mais ayant d?j? atteints leur maturit? sexuelle pourraient ?tre utilis?s pour les premi?res phases d'habituation (entrainement ? la t?che auditive) et ?tre ainsi jeunes adultes lors du commencement des parties ult?rieures de la proc?dure (implantation, ?lectrophysiologie).

688 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant traitement antibiotique, gavages répétés, inoculations rectales sous anesthésie et tests de tolérance au glucose. Certaines reçoivent en plus l'implantation d'une pompe osmotique sous la peau pendant six semaines et des instillations nasales d'acariens pour induire un asthme. Le projet étudie un métabolite du microbiote intestinal dans l'obésité, le diabète et l'asthme, avec des applications probiotiques adossées à un brevet. Le porteur affirme qu'il reste "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, la complexité des interactions entre organes étant difficile à reproduire in vitro.

Objectifs

Ce projet vise ? mieux comprendre comment les bact?ries pr?sentes dans l?intestin influencent certaines maladies chroniques fr?quentes, comme l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme. Ces maladies sont souvent li?es entre elles et partagent des m?canismes communs, notamment une inflammation persistante de l?organisme et un d?s?quilibre du microbiote intestinal (ensemble des bact?ries vivant dans l?intestin). Certaines bact?ries intestinales produisent naturellement des substances appel?es m?tabolites, qui peuvent avoir des effets b?n?fiques sur la sant?. L?un de ces m?tabolite, est produit uniquement par la flore intestinale, mais son r?le exact dans ces maladies reste encore mal connu. L?objectif de ce projet est d??tudier comment ce m?tabolite d'int?r?t et les bact?ries le produisant, influence le m?tabolisme du glucose et des lipides, ainsi que l?inflammation des voies respiratoires. Pour cela, nous utiliserons des mod?les de souris pr?sentant des caract?ristiques proches de celles observ?es chez l?Homme dans l?ob?sit?, le diab?te et l?asthme. Les effets de ce m?tabolite seront ?tudi?s sur le contr?le de la glyc?mie, la prise de poids, l?accumulation des graisses au niveau du foie et l?inflammation des poumons. Ce projet, men? sur cinq ans, respectera strictement les r?gles ?thiques et le bien-?tre animal. Les r?sultats attendus pourraient contribuer au d?veloppement de nouvelles approches pr?ventives ou th?rapeutiques bas?es sur le microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche ouvre des perspectives prometteuses pour le d?veloppement de nouvelles strat?gies th?rapeutiques chez l?Homme fond?es sur des produits probiotiques. L?enrichissement cibl? en bact?ries productrices de m?tabolites b?n?fiques, comme le 4-cr?sol, pourrait non seulement am?liorer l?hom?ostasie glucidique et lipidique, mais aussi att?nuer l?inflammation syst?mique impliqu?e dans l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme allergique. Le brevet sur lequel ce projet se fonde (Compounds for the prevention and treatment of glucose intolerance related conditions and obesity. Patent Ref. EP 17306326.4 -1466, filed 4 October 2017), et les essais cliniques en cours pour ?valuer l?efficacit? de produits probiotiques, en particulier pour le traitement de la maladie de Crohn, illustrent l?importance des applications th?rapeutiques potentielles des r?sultats des proc?dures exp?rimentales. Les m?canismes sous-jacents, impliquant des interactions complexes entre le microbiote, l'h?te et son environnement, font l'objet de recherches intensives. Bien que des d?fis persistent concernant la s?lection des souches, le dosage ou la variabilit? interindividuelle, ce projet pourrait contribuer ? l??mergence de th?rapies probiotiques de nouvelle g?n?ration en compl?ment ou en alternative aux traitements actuels.

Procédures

Proc?dure 1 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales, r?alis?es chez des animaux vigiles ou sous anesth?sie l?g?re. Ils re?oivent un traitement antibiotique dans l?eau de boisson pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par inoculation de bact?ries non pathog?nes, comprenant un gavage oral trois fois par semaine chez l?animal vigile (contention < 30 s) et une inoculation rectale une fois par semaine sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Le poids et la glyc?mie sont mesur?s une fois/semaine ? partir d?une goutte de sang pr?lev?e ? la queue. Un premier test de tol?rance au glucose par voie intrap?riton?ale (IPGTT, dur?e ? 2 h) est r?alis? ? J15, avec 6 pr?l?vements glyc?miques (< 3 ?l) aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes, et 4 pr?l?vements sanguins suppl?mentaires (10?15 ?l) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes pour le dosage de l?insuline. Un second IPGTT est r?alis? deux mois apr?s le d?but des inoculations. Un test de tol?rance au pyruvate (PTT, ? 2 h) est r?alis? ? J30 avec 7 pr?l?vements glyc?miques (0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min). Un test de tol?rance ? l?insuline (ITT, ? 2 h) est r?alis? ? J45 avec 7 pr?l?vements glyc?miques selon le m?me sch?ma temporel. Proc?dure 2 Les animaux subissent une proc?dure chirurgicale unique correspondant ? l?implantation sous-cutan?e dorsale d?une minipompe osmotique, r?alis?e sous anesth?sie ? l?isoflurane et analg?sie pr?ventive. Cette intervention de courte dur?e (? 10 min) permet une perfusion continue de solution saline ou de 4-cr?sol pendant 6 semaines. Deux semaines apr?s l?implantation, les animaux sont soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), r?alis?es chez des animaux vigiles et de tr?s courte dur?e (< 1 min). Proc?dure 3 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales. Ils re?oivent un traitement antibiotique pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par gavage oral r?p?t? trois fois par semaine chez l?animal vigile et une inoculation rectale hebdomadaire sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Un suivi clinique hebdomadaire (poids, glyc?mie) est r?alis?. Les animaux sont ?galement soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), chacune de courte dur?e et sans proc?dure chirurgicale.

Impact sur les animaux

Compte tenu de notre exp?rience dans les proc?dures mises en ?uvre dans ce projet, toutes optimis?es et publi?es, nous ne pr?voyons pas de nuisances ou d?effets ind?sirables conduisant ? une mise ? mort anticip?e. Induction de l?ob?sit? et du diab?te par r?gime HFD (Proc?dure?1) : l?ob?sit? induite reste mod?r?e et n?entrave ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture ; les troubles associ?s correspondent ? une nuisance l?g?re. Enrichissement de la flore par des bact?ries productrices de 4?cr?sol (Proc?dures?1&3) : l?inoculation par gavage, n?cessitant une contention br?ve (10?% avec diarrh?e, une injection sous-cutan?e de s?rum physiologique est r?alis?e. Tests de tol?rance au glucose et ? l?insuline (Proc?dure?1) : les volumes sanguins pr?lev?s sont minimes et espac?s d?une semaine. La micro-coupure distale de la queue induit une douleur mod?r?e ? cicatrisation rapide (nuisance mod?r?e). Administration chronique de 4?cr?sol par minipompes osmotiques (Proc?dure?2) : l?implantation sous?cutan?e dorsale est r?alis?e sous analg?sie par bupr?norphine (0,03?mg/ml, vol. = poids ??6, i.p.) et 30 min plus tard sous isoflurane 3,5?% induction, 1,5?% maintien. Cette proc?dure induit une nuisance mod?r?e avec douleur postop?ratoire transitoire, soulag?e par m?loxicam (5 mg/kg). Les minipompes implant?es pendant 6?semaines sont bien tol?r?es, sans rejet ni infection, et n?entravent ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture (Brial et al., Cell Reports?2020 ; Gut?2021). Induction de l?asthme par administration intranasale d?extrait d?acariens (HDM) (Proc?dures?2&3) : l?administration intranasale est peu invasive et induit une nuisance l?g?re et transitoire. Les administrations aux jours 0, 11, 12 et 13 (Wypych et al., Nature Immunology, 2021) conduisent ? l?installation progressive d?un mod?le d?asthme allergique exp?rimental avec inflammation des voies a?riennes, sans crise aigu? imm?diate, correspondant ? une nuisance mod?r?e. Les animaux peuvent pr?senter une respiration l?g?rement plus rapide ou superficielle mais conservent activit? normale et acc?s ? nourriture et eau. Une surveillance quotidienne (respiration, activit?, poids) est r?alis?e, et toute aggravation s?v?re, notamment perte de poids >15?%, entra?nera une mise ? mort anticip?e.

Devenir

Les 688 animaux de la proc?dure seront euthanasi?s ? la fin de la proc?dure.

Remplacement

Le contr?le du m?tabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins ?nerg?tiques et contr?ler les flux ?nerg?tiques en fonction des besoins. Il est tr?s difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des mod?les animaux vivants est encore n?cessaire.

Réduction

Pour r?duire le nombre d'animaux, nous avons effectu? un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bact?ries, non virulentes et qui peuvent cro?tre dans des conditions compatibles ? la souris, gr?ce ? des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette s?lection, effectu?e en partenariat avec l'?quipe de microbiologie, a abouti ? ne retenir que les bact?ries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront test?es in vivo, r?duisant ainsi le nombre d'animaux n?cessaires ? l'?tude. Les ?chantillons pr?lev?s chez chaque animal permettront de g?n?rer un grand nombre d?informations sur des marqueurs mol?culaires. De plus, nous avons estim? la taille des ?chantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace gr?ce aux donn?es de la litt?rature.

Raffinement

Les animaux feront l?objet d?une observation quotidienne durant les phases d?induction exp?rimentale, notamment lors de l?induction de l?asthme allergique. Un suivi du poids corporel sera ensuite r?alis? trois fois par semaine afin de d?tecter pr?cocement tout signe de mal-?tre ou de d?tresse respiratoire. Toute souris atteignant un point limite pr?d?fini, notamment une perte de poids sup?rieure ? 15 % ou des signes respiratoires s?v?res, sera imm?diatement euthanasi?e conform?ment aux proc?dures en vigueur. Afin de r?duire le stress et l?inconfort, l?enrichissement de la flore intestinale par voie rectale sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re apr?s induction ? l?isoflurane. Les sondes utilis?es seront souples et de diam?tre adapt? ? la taille de l?animal afin d??viter toute l?sion. L?inoculation par voie orale sera r?alis?e chez l?animal vigile, cette m?thode ?tant mieux tol?r?e et ne n?cessitant qu?une contention de courte dur?e. Lors des tests de tol?rance au glucose, le volume de sang pr?lev? sera strictement limit? au minimum n?cessaire au dosage de l?insuline (5 ?l de plasma), afin de r?duire la contrainte li?e aux pr?l?vements r?p?t?s. Apr?s l?implantation des minipompes osmotiques, les animaux seront surveill?s attentivement et une analg?sie appropri?e (m?loxicam (5 mg/kg)) toutes les 12h pendant 2 jours sera syst?matiquement mise en place pour pr?venir la douleur postop?ratoire. Enfin, les animaux seront pr?alablement habitu?s ? la contention et au gavage avant le d?but des inoculations, afin de limiter le stress li? aux manipulations r?p?t?es.

Choix des espèces

Les mod?les murins pr?sentent de fortes homologies physiologiques et immunologiques avec l?Homme et constituent des outils indispensables pour ?tudier les m?canismes de r?gulation de l?hom?ostasie ?nerg?tique, incluant les m?tabolismes glucidique, lipidique et inflammatoire. La majorit? des lign?es isog?niques de souris d?veloppent une prise de poids, une hyperglyc?mie et une st?atose h?patique en r?ponse ? un r?gime riche en graisses, reproduisant des caract?ristiques cl?s de l?ob?sit? et du diab?te de type 2 humains. Les voies mol?culaires impliqu?es dans ces pathologies sont largement conserv?es entre la souris et l?Homme. La souris est ?galement le mod?le de r?f?rence pour l??tude de l?asthme allergique. L?exposition intranasale ? des allerg?nes tels que les extraits d?acariens permet de reproduire les principales caract?ristiques de l?asthme humain, notamment l?inflammation des voies a?riennes, le recrutement de cellules immunitaires et les r?ponses de type 2. Les m?canismes immunopathologiques sous-jacents sont fortement conserv?s, justifiant l?utilisation de ce mod?le. Nous utiliserons des souris C57BL/6J ?g?es de 2 ? 6 mois. Cet ?ge a ?t? choisi pour plusieurs raisons. Tout d'abord, ? cet ?ge, le microbiote intestinal est relativement stable, ce qui permet de minimiser les variations interindividuelles et de mieux contr?ler les effets de la manipulation exp?rimentale. De plus, les souris ont atteint leur maturit? physiologique, ce qui est essentiel pour ?tudier les m?canismes sous-jacents ? la question scientifique. Enfin, cet ?ge a ?t? largement utilis? au laboratoire dans des ?tudes pr?c?dentes sur le m?me mod?le, en particulier dans des protocoles de perfusion de 4-cresol avec des minipompes osmotiques (Brial et al. Cell Reports 2021), ce qui peut r?duire le nombre de souris en retirant le besoin d?exp?riences exploratoires, et facilite la comparaison de nos r?sultats avec la litt?rature existante.

Deux heures par jour, cinq jours sur sept, pendant un à trois mois d'exposition à la fumée de cigarette: 1 100 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une instillation d'élastase dans la trachée, l'implantation d'une pompe sous la peau et un cathétérisme cardiaque. Le projet vise à comprendre la perte musculaire associée à la bronchopneumopathie chronique obstructive et à explorer des pistes thérapeutiques. Le porteur retire les éléments de nidification des cages pendant les deux heures d'exposition quotidienne et met à mort tout animal atteignant un score de dégradation trop élevé, les organes étant ensuite prélevés.

Objectifs

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est l’une des maladies respiratoires les plus fréquentes dans le monde et constitue une cause majeure de décès. Elle provoque une dégradation progressive des poumons, rendant la respiration de plus en plus difficile. Le tabagisme en est la principale cause, mais d’autres facteurs, comme la pollution de l’air, des infections respiratoires répétées durant l’enfance ou certaines prédispositions héréditaires, peuvent également favoriser son développement. Cette maladie s’accompagne souvent d’une diminution de la masse et de la force musculaires, appelée sarcopénie, ce qui altère la qualité de vie des personnes atteintes. Chez l’adulte, les muscles possèdent normalement une grande capacité d’adaptation et de réparation, leur permettant de se renouveler efficacement. Cette capacité repose sur des cellules souches présentes dans les muscles, généralement au repos, mais capables de s’activer en cas de besoin pour assurer leur entretien et leur régénération. Avec l’âge, ces mécanismes deviennent toutefois moins performants : les muscles se réparent moins bien, ce qui entraîne une diminution progressive de leur masse et de leur force, comme observé dans certaines situations de fragilité musculaire. Par ailleurs, certaines protéines présentes dans l’organisme jouent un rôle clé dans ces processus et pourraient constituer des pistes prometteuses pour de futurs traitements, afin de limiter les atteintes pulmonaires et de préserver la fonction musculaire. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de la perte musculaire associée à cette maladie et d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la santé et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce travail devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la sarcopénie associée à la BPCO et fournir un cadre de traitement potentiel.

Procédures

Exposition à la fumée de cigarette : 2h/ jour, 5 jours/7 pendant 1, 2 ou 3 mois. Administration intratrachéale d'élastase sous anesthésie : 15min, 1 fois. Implantation sous-cutanée de pompe osmotique : 10-15min. Test d'agrippement : 5 min, entre 2 et 4 fois par procédures. Test de course : 16 min, entre 2 et 4 fois par procédures. Évaluation de la fonction cardiaque et de la pression artérielle par cathétérisme : 25-30min, 1 fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement dues au stress lié : - à la contention et aux manipulations sur animal vigile (test d’agrippement, test de course). - à l’exposition à la cigarette incluant l’odeur et le bruit généré par la machine. Remarque : en cas d’agressivité ou de mortalité, les animaux pourraient être isolés (seul dans une cage) afin de les garder dans l’étude.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.

Remplacement

Afin de tester l’impact direct de l’hypoxie intermittente sur la biologie des cellules satellites, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier. L'utilisation de modèles animaux, dont les systèmes musculosquelettique et pulmonaire sont similaires à l’Homme, reste essentielle afin d’étudier les effets délétères de la BPCO sur le muscle squelettique et la biologie des cellules satellites. Par ailleurs, la variabilité des caractéristiques des patients comme leur âge, leur consommation de tabac, ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d'animaux en utilisant des méthodes non invasives (test d’agrippement, test de course sur tapis roulant) qui permettent de répéter les analyses sur le même animal mais aussi en utilisant des tests statistiques appropriés. Des expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=11 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans nos modèles de BPCO.

Raffinement

Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des anesthésiques et analgésiques. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, des perturbations de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. Une surveillance accrue sera mise en place pendant les 24h suivant l’instillation d’élastase. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson. Remarque : Afin de facilité l'exposition à la fumée de cigarettes, les éléments de nidification seront retirés des cages pendant les 2h d'exposition.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car les systèmes physiologiques pulmonaire et musculosquelettique sont proches de ceux de l’Homme. Par ailleurs, la souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées afin de faciliter les analyses nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude. Enfin, nous utilisons des outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et des cellules satellites in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes de 8 semaines. A ce stade, l’appareil respiratoire est totalement développé et les muscles squelettiques sont parfaitement formés avec les cellules souches musculaires résidant en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos.

Pour cartographier les circuits nerveux de la sensibilité de la langue, 220 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des injections dans la langue, l'application de molécules et jusqu'à deux chirurgies d'une heure sous anesthésie. Le porteur rattache ce travail au syndrome de la bouche qui brûle, une douleur orale touchant surtout les femmes ménopausées, et évoque un rôle des hormones. Les perspectives thérapeutiques annoncées restent renvoyées au long terme, les souris étant tuées pour le prélèvement de tissus.

Objectifs

La langue est un organe essentiel au bon déroulement de nombreuses fonctions orales (mastication, gustation, phonation etc.). Sa sensibilité conditionne le bon déroulement de ses fonctions. Certaines conditions médicales ou environnementales altèrent la bonne exécution de ces fonctions, dégradent la santé et altèrent la qualité de vie. Par exemple, le syndrome de la langue qui brûle correspond à une pathologie douloureuse encore mal comprise. Cliniquement, ce syndrome se manifeste par une sensation persistante de brûlure au niveau de la pointe de la langue, caractérisée par une douleur modérée à sévère sans lésion apparente. Avec son impact significatif sur la qualité de vie, elle représente un véritable enjeu de santé publique ainsi qu’un enjeu socio-économique majeur. Les traitements actuellement disponibles ne traitent pas les causes de la pathologie et ne soulagent que trop peu la douleur. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués pour permettre une meilleure prise en charge de la pathologie. Il faut noter que le syndrôme de la bouche qui brûle affecte 7 femmes pour 1 homme, et atteint principalement les femmes au moment de la ménopause. Ceci suggère un rôle des hormones dans cette pathologie. Ici, l’objectif du projet est de caractériser les circuits nerveux impliqués dans la sensibilité de la langue et d’évaluer l’effet des changements hormonaux sur cette sensibilité dans des modèles murins reproduisant la carence hormonale associée à la ménopause, et leur contrôle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra une meilleure caractérisation des circuits nerveux du syndrôme de la bouche qui brûle, inconnus à ce jour. Plus largement, il permettra également d’évaluer les effets des modifications hormonales survenant à la ménopause, qui restent très peu étudiées du point de vue de la sensibilité (douleur, tact, goût, sensation de bouche sèche etc.). A plus long terme, l’identification des mécanismes sous-tendant ce syndrome et les circuits nerveux de modulation de la sensibilité ouvrira des perspectives thérapeutiques ciblées pour les patients.

Procédures

Injection (2x, 20 secondes, sous anesthésie), application de molécule (1x, 10 minutes, sous anesthésie), injection (jusqu’à 3x, 20 secondes, animal vigile), chirurgie (jusqu’à 2x, 1 heure, sous anesthésie).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engender une douleur post-opératoire transitoire et légère de quelques heures à quelques jours. Les procédures d’injection de molécules peuvent également induire une douleur transitoire de quelques heures à quelques jours, notamment localement au niveau des sites d’injection.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de procéder à des prélèvements de tissus pour des études immunohistochimiques.

Remplacement

L’innervation précise des neurones sensitifs innervant la langue, et les projections descendantes pouvant médier l’apparition des douleurs spécifiques à la langue n’est pas connue à ce jour. Cela nécessite donc une caractérisation chez l’animal vivant par traçage neuronal. En effet, il n’existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico permettant de modéliser des voies nerveuses qui n’auraient été caractérisées sur modèle vivant au préalable.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Le bien-être des animaux sera garanti grâce à l’utilisation d’anesthésie générale et grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout au long des procédures, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort ont été définis.

Choix des espèces

Le travail sera effectué sur la souris car il s’agit d’un excellent modèle pour étudier le système nerveux et les pathologies pouvant affecter la sensibilité. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et humain, permettant l’extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout majeur dans l’analyse et l’interprétation des résultats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car les circuits neuronaux sont développés et matures.

Relâchés en milieu naturel après l'expérience, 28 hamsters communs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dans un projet de conservation de l'espèce. Chacun subit deux chirurgies sous anesthésie, l'implantation puis le retrait d'un enregistreur miniature dans l'abdomen, à six mois d'intervalle, avec des risques de douleur, d'inflammation et d'infection. L'objectif est de valider ce dispositif de suivi avant son déploiement sur les populations sauvages en déclin. Le porteur indique pratiquer ces implantations depuis quinze ans sans complication observée, les animaux n'étant lâchés qu'après cicatrisation complète.

Objectifs

Cette demande d’autorisation concerne une phase de test préalable à une utilisation en conditions naturelles. Le projet a deux objectifs principaux. Le premier objectif est de tester un nouvel appareil de suivi miniaturisé (appelé « logger ») sur 14 hamsters communs mâles adultes, placés dans un enclos d’un hectare. Le second objectif est de vérifier que ce dispositif n’a pas d’effet négatif sur la reproduction des femelles (14 individus) et d’analyser précisément le comportement des animaux en reliant les observations directes aux données enregistrées par l’appareil. Ce nouveau logger permet de localiser les animaux grâce à un signal radio, mais aussi de mesurer leur température corporelle et leur niveau d’activité. Les informations transmises à une antenne réceptrice serviront à mieux comprendre la survie des hamsters, leur période d’hibernation, leur reproduction et leur utilisation de l’habitat, en lien avec les conditions environnementales. Cette étude préliminaire permettra d’améliorer et d’ajuster un protocole de suivi à long terme, qui sera ensuite appliqué de manière standardisée dans la nature au cours des années suivantes. Les données obtenues viendront compléter les méthodes de suivi actuellement utilisées, comme le comptage des terriers, les pièges photographiques ou les opérations de capture, marquage et recapture, qui donnent une vision plus globale mais moins précise du comportement des animaux.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de valider le fonctionnement et l’innocuité d’un logger avant son déploiement en milieu naturel. Le logger permettra ensuite un suivi long-terme en milieu naturel des paramètres démographiques du hamster commun en fonction des conditions environnementales et de la santé de l’écosystème en fonction des pratiques agricoles. Les méthodes développées pourront être transposées au suivi in natura d’autres espèces cryptiques (peu visibles) et de petite taille, dans l’objectif d’une mise en place adaptée de mesures de protection des espèces.

Procédures

Implantation/désimplantation intrapéritonéale d’un logger sous anesthésie générale, 14 femelles et 14 mâles, par animal : 1 chirurgie d’implantation (environ 12 min) et 1 de désimplantation (environ 12 min) 6 mois plus tard.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à la chirurgie (pendant la convalescence post-chirurgie) : douleur, inflammation, infection potentielle, perte de poids.

Devenir

Lâcher en milieu naturel

Remplacement

Cette étude concerne la préservation du hamster commun en plaine d’Alsace et ne peut être réalisée sur une autre espèce, ni par des études de modélisation.

Réduction

Cette étude est réalisée préalablement sur un petit effectif pour tester l’effet du logger sur la gestation des femelles et raffiner le protocole avant sa mise en œuvre in natura. Nous prévoyons d’implanter 14 femelles adultes dont le suivi sera réalisé pendant la période de reproduction en conditions contrôlées de laboratoire. Le succès reproducteur étant de 50% chaque année, nous nous attendons donc à suivre les portées de 7 femelles. En parallèle, nous suivrons 7 mâles implantés avec le logger et 7 mâles implantés avec un émetteur classique en enclos pour vérifier l’acquisition des données par le logger et éventuellement reprogrammer certains paramètres avant son déploiement in natura. Selon des modèles mathématiques, 7 individus par groupe est le nombre minimum pour qu'une différence éventuelle entre les différents groupes puisse être statistiquement décelée. Les résultats seront soumis à des tests non paramétriques du fait du faible effectif des groupes.

Raffinement

En animalerie : Les animaux sont élevés en cages individuelles, car le hamster commun n’est pas une espèce sociale et fait preuve d’agressivité envers ses congénères. Des objets visant à enrichir le milieu (tubes) et des éléments permettant le comportement de construction de nid sont placés dans les cages. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie gazeuse et la douleur sera traitée par administration d’un analgésique en pré- et post-opératoire. L’état des animaux sera suivi par des mesures quotidiennes de la masse, et une observation visuelle du poil, de la posture et de la locomotion. Les animaux dépassant les point limites établis seront mis à mort pour limiter leur souffrance. Les hamsters seront lâchés en enclos uniquement après complète cicatrisation et s’ils n’ont pas perdu de poids suite à la chirurgie. A noter que nous réalisons ces procédures d’implantation intra-péritonéale d’enregistreurs de température et d’émetteurs chez cette espèce depuis 15 ans, sans qu’aucune complication post-opératoire n’ait été observée. En enclos : Les hamsters seront transportés à l’enclos à 10 min (voiture) de l’animalerie dans des boîtes adaptées avec du papier absorbant. Les lâchés seront réalisés en soirée au moment du pic d’activité de l’espèce. Nous serons très vigilants au bien-être des animaux dans l’enclos en réalisant des observations régulières (pièges photos et captures à l’aide de pièges non létaux 1 à 2 fois par semaine). Les pièges seront contrôlés toutes les heures. Un suivi de la masse corporelle par pesée et de l’aspect général permettra d’évaluer leur état nutritionnel et sanitaire et d’agir en conséquence : supplémenter leurs apports alimentaires dans l’enclos ou ramener l’animal au laboratoire pour le soigner ou l’euthanasier en fonction du niveau d’atteinte de points limites. L’enclos est conçu de façon à empêcher toute évasion de hamster et toute intrusion de prédateur.

Choix des espèces

Ce programme de recherche s’intéresse spécifiquement à la préservation du hamster commun. Les populations sauvages sont en déclin en raison notamment des pratiques agricoles intensives. Notre objectif est de réaliser un suivi précis des paramètres démographiques de l’espèce en fonction des conditions environnementales, afin d’améliorer les pratiques agricoles et les protocoles de renforcement et de restaurer ainsi durablement l’état des populations sauvages. Nous utiliserons des adultes mâtures sexuellement (1 an) pour l’étude de l’effet sur la reproduction et dont la masse corporelle est supérieure à 200 g (soit largement plus de 95% de la masse du logger)

Pour étudier le dialogue entre cellules leucémiques et moelle osseuse humanisée, 688 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules humaines après irradiation, elles reçoivent des injections répétées de chimiothérapie et, pour une partie, une ponction de moelle osseuse au fémur décrite comme le geste le plus douloureux et invasif. L'expansion leucémique provoque à terme une perte de poids et une grosse rate, avant la mise à mort pour prélever les organes hématopoïétiques. Le porteur reconnaît qu'un modèle d'organoïde de moelle osseuse existe déjà mais le juge non stabilisé, donc encore insuffisant pour remplacer la souris.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) sont des cancers du sang dont le pronostic diffère fortement entre les patients jeunes et âgés. L’intensification de la chimiothérapie a amélioré la survie des patients (supérieure à 85% pour les enfants ; seulement 50% chez les adultes). L’une des explications possibles résiderait dans l’influence des facteurs physiologiques sur la résistance des cellules leucémiques aux traitements. Bien que ces cellules se propagent dans de nombreux organes du patient, le tissu d’expansion privilégié reste la moelle osseuse (MO), située dans les cavités osseuses. Or, la MO évolue avec l’âge : pauvre en adipocytes (cellules graisseuses) à la naissance, elle s’enrichit avec le vieillissement, la chimiothérapie et/ou l’obésité. Chez la souris, on retrouve une MO riche en adipocytes dès la naissance au sein des vertèbres de la queue. L’injection de cellules de patients LAL à des souris immunodéficientes (ID), qui ne rejettent pas la greffe de cellules humaines, a montré que les cellules leucémiques deviennent « dormantes » et résistantes à la chimiothérapie dans les os riches en adipocytes. Ce modèle a permis d’identifier de nombreux mécanismes de développement et de chimiorésistance des LAL, mais il souffre d’une limite majeure : les molécules produites dans la MO de la souris ne sont pas parfaitement identiques à celles produites chez l’homme. Pour dépasser cette limite, des chercheurs ont créé un modèle d’os humanisés qui permet de recréer une MO majoritairement composée de cellules humaines. Notre projet vise plusieurs objectifs : 1) Mettre en place une MO « humanisée » chez la souris ID avec une composition cellulaire la plus proche possible de celle retrouvée chez les individus humains sains. 2) Explorer les signaux du microenvironnement médullaire qui influence la croissance ou la résistance aux traitements des cellules leucémiques humaines. 3) Reproduire le vieillissement de la MO afin de comprendre les mécanismes à l’origine des rechutes plus fréquentes chez les individus âgés en comparaison aux enfants. 4) Développer, un modèle pré-clinique pertinent pour l’étude des échantillons de patients qui ne greffent pas en souris ID dépourvues de cet environnement osseux humanisé. Ce modèle d’os « humanisée » constituera un atout majeur pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques et améliorer les chances de guérison des patients atteints de LAL.

Bénéfices attendus

La rechute des leucémies aiguës lymphoblastiques est souvent fatale. Comprendre les mécanismes impliqués dans les mécanismes de résistance menant à la rechute est un enjeu majeur en vue d’améliorer la prise en charge de ces patients. Cette meilleure compréhension passe immanquablement par l’utilisation de modèle d’étude de plus en plus pertinents. On compte parmi ces modèles, les cultures in vitro de cellules leucémiques et les modèles animaux (principalement des souris). Les modèles in vitro permettent de répondre à des questions simples, souvent pour confirmer des résultats observés dans des modèles plus complexes (modèles animaux). Seuls les modèles animaux permettent d’étudier l’interaction des cellules leucémiques avec les composants cellulaires et moléculaires retrouvés dans l’os autrement appelé moelle osseuse (MO). L’utilisation de ce modèle humanisé permet d’avoir un environnement humanisé dans lequel se développe les cellules leucémiques du patient. Il s’agit d’une avancée majeure permettant de mieux comprendre le dialogue qui existe entre les cellules leucémiques et celles de leur environnement de la MO. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et a pour but d’identifier des nouvelles pistes thérapeutiques basées sur l’addiction des cellules leucémiques pour des facteurs produits par les cellules de la MO. Il est important de proposer des thérapies innovantes. Actuellement, les traitements proposés sont majoritairement développés pour cibler les cellules cancéreuses. Mais l’ensemble des connaissances démontre que les cellules cancéreuses communiquent avec leur environnement cellulaire et qu’aujourd’hui, une thérapie innovante doit intégrer cette vision d’ensemble. C’est exactement l’objectif de notre étude.

Procédures

En fonction des questions posées, les animaux seront soumis au maximum à : 1- Une injection de cellules stromales/souches mésenchymateuses humaines sous la peau de la souris. Cet acte est rapide (quelques secondes) et est réalisé sous sédation (532 animaux). Cette injection est un acte unique dans toutes les procédures. 2- Injection d’une hormone en sous-cutanée en vigile (5 secondes), pour 532 animaux, à raison de 5 jours/semaine, pendant un mois. Cette hormone permet de faire maturer les os « humanisés ». 3- Une injection de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques humaines (hCSPH) pour 520 animaux. Cet acte, qui ne dure que quelques secondes, est effectué sous sédation. Toutefois, ce geste nécessite que les souris soient irradiées au préalable pour permettre la reconstitution des cellules sanguines humaines. Acte qui dure 1 à 2 minutes. 4- Une injection de cellules leucémiques de patients pour 365 animaux. Cet acte, qui ne dure que quelques secondes, est effectué sous sédation. 5- Afin de mimer une MO d’un patient âgé ou obèse, les croquettes classiquement utilisées seront remplacées par des croquettes complémentées d’une molécule connue pour induire la différenciation adipocytaire pendant 13 semaines pour 98 animaux.6- Selon la question posée, certaines souris subiront une injection de molécules utilisées en chimiothérapie conventionnelle selon le même protocole que pour l’injection de cellules hématopoïétiques et leucémiques. Cet acte, de quelques secondes, est effectué sous sédation 48 animaux. 7- Ces mêmes souris recevront d’autres molécules utilisées en chimiothérapie conventionnelle. Les injections seront réalisées sur des souris non-anesthésiées après avoir appliqué un analgésique local. 1 injection tous les jours pendant 5 jours. Le geste d’injection dure quelque secondes (48 animaux). 8- Selon la question posée, un seul prélèvement de moelle osseuse sera effectué dans le fémur des souris sous anesthésie générale et analgésie. Ce geste dure moins de 5 minutes. Avant le réveil un prélèvement sanguin sera également effectué au niveau du site sous-mandibulaire (durée du geste : 2 secondes). Ce double prélèvement sera effectué sur 364 animaux. Le prélèvement sanguin pourra être renouvelé 4 fois à raison d’un prélèvement toutes les 3 semaines pour 48 animaux. Ce prélèvement sanguin s’effectue avec des souris non-endormies.

Impact sur les animaux

Notre expérience dans la réalisation de ces protocoles dans le modèle murin, nous permet d’anticiper des nuisances modérées sur les animaux utilisés dans ce projet. Plusieurs points sont à retenir : - L’Implantation de ce modèle humanisés sous la peau des souris peut engendrer une gêne dans leur déplacement. - La mise en place d’une hématopoïèse humaine chez la souris peut engendrer à long terme une anémie de l’animal liée à une chasse de l’hématopoïèse murine. - L’expansion leucémique des cellules de patients dans le modèle murin provoque à long terme une perte de poids de l’animal ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. En point ultime d’expérience, nous notons parfois une prostration/manque de mobilité de l’animal. - La chimiothérapie utilisée provoque également une perte de poids liée à l’ensemble des effets adverses des agents utilisés. - L’induction d’une MO âgée ou d’un patient obèse peut entrainer des effets liés à la prise de poids rapide des souris. Le prélèvement de moelle osseuse, effectué au niveau des fémurs, est le geste le plus invasif effectué dans nos procédures. au niveau des fémursCe geste est douloureux. - La manipulation des souris peut aussi causer stress et angoisse entrainant un affaiblissement.

Devenir

Dans l’ensemble des procédures, l’euthanasie des animaux aura lieu soit à l’issue de 12 semaines de mise en place de l’hématopoïèse humaine, soit au cours de l’expansion leucémique, soit 1 semaine après la chimiothérapie. Nous euthanasierons les souris afin de suivre et mesurer le développement de la leucémie. Les tissus/organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, colonne vertébrale, mini-os) seront prélevés et les cellules qui y sont contenues seront caractérisées. Cela permettra de comparer les différents groupes de souris afin de pouvoir tirer les conclusions suite à nos observations.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude des leucémies, l’expérimentation sur des modèles animaux, comme les souris, est essentielle pour comprendre comment la maladie se développe chez un patient. Les méthodes de cultures in vitro ne permettent pas de mimer un environnement osseux. Le système de culture in vitro le plus complexe que nous pouvons mettre en place consiste à cultiver ensemble des cellules leucémiques avec des cellules hématopoïétiques saines sur des cellules stromales (cellules adhérentes extraites des MO humaines, cf paragraphe 5.5.2). Malgré la complexité de ce système, il reste encore très éloigné des modèles animaux. En effet, de nombreuses autres cellules seront encore absentes. Très récemment, des systèmes d’organoïdes de moelle osseuse en bioréacteur ont été développés. Ce modèle, bien que pertinent, n’est pas stabilisé à long terme. Il ne permet pas d’établir une hématopoïèse humaine stable. Il est donc impossible d’utiliser ce système d’un point de vue exploratoire comme nous souhaitons le faire avec le modèle de mini-os in vivo. En revanche, ce modèle d’organoïde pourra être mis au point au laboratoire pour valider des hypothèses révélées par le projet ici présenté. Une fois mis en place, il pourra remplacer/compléter le modèle murin pour répondre à des questions simples.

Réduction

Afin de développer le modèle préclinique le plus pertinent possible, nous tiendrons compte de la diversité de la maladie retrouvée chez les patients et nous utiliserons plusieurs patients représentatifs, sélectionnés parmi les centaines d’échantillons disponibles au laboratoire. Les résultats obtenus à partir de notre étude devraient ainsi être transposables à un nombre important de patients. Ce choix méticuleux réduira par conséquent l’utilisation des souris. Par ailleurs, chaque expérience sera répétée afin de garantir la fiabilité et la robustesse scientifique des résultats. Enfin, la comparaison de plusieurs conditions biologiques et groupes expérimentaux nécessite l’utilisation de plusieurs animaux. L’ensemble de ces faits expliquent le nombre important de souris nécessaires au projet de recherche que nous développons. De plus, lorsque nous devons tester plusieurs conditions en suivant la même procédure, nous réaliserons les expériences en même temps pour comparer tous les groupes avec un seul groupe témoin. Enfin l’analyse séparée des 2 mini-os par souris (un sur chaque flanc) permettra de réduire considérablement le nombre de souris utilisées pour atteindre la puissance statistique.

Raffinement

Dans l’ensemble des procédures associées à cette demande, les animaux sont hébergés en groupe. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront régulièrement surveillées par l’équipe, le personnel animalier et un vétérinaire afin de repérer tout changement de comportement et éviter toute douleur, souffrance ou stress inutile. L’apparition de ces critères, notés selon une grille remplie par les animaliers ainsi que les expérimentateurs, permettra une prise de décision rapide quant à la mise en place de la stratégie à adopter pour arrêter la souffrance. Afin d’améliorer le bien-être des souris vis-à-vis des potentielles souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies recevront un complément hydrique et alimentaire sous forme d’hydrogel et de nourriture humidifiée déposée directement dans la cage en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons pour plus de confort. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale. Enfin, pour diminuer le stress de la contention, nous transférons les animaux de leur cage vers la cage de sédation, par l’intermédiaire d’un tube de transfert dans lequel viennent se loger les animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris immunodéficientes pour leur incapacité à rejeter la greffe de cellules d’une espèce étrangère, ici de cellules humaines. Outre l’absence de rejet, ce modèle est pertinent pour l’étude des cancers du sang puisqu’il est capable de récapituler l’expansion leucémique de patients dans un modèle vivant. Les cellules de patients interagissent alors avec l’ensemble des constituants cellulaires et moléculaires de l’animal au même titre qu’une cellule leucémique interagit avec son environnement chez le patient. La mise en place d’un modèle humanisé permettra d’obtenir un environnement le plus fidèle possible de celui rencontré par les cellules leucémiques chez les patients. Il outrepassera les limites liées aux barrières d’espèces. Cette amélioration significative du modèle permettra d’aborder plus spécifiquement les dialogues inter-cellulaires. Cela conduira vers de nouvelles pistes thérapeutiques pertinentes pour les patients. En outre, il représente une avancée majeure pour les cellules de patients difficiles à amplifier en souris immunodéficientes qui nécessitent probablement un environnement humain. Le modèle de mini-os deviendra, à minima pour ces patients, le modèle préclinique de référence permettant de tester des cibles thérapeutiques impossible à tester in vivo jusqu’à lors. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, qui, selon les recherches de notre laboratoire, montrent une excellente capacité à accepter des greffes après injection, que ce soit pour des cellules normales ou malades.