Recherche fondamentale

Tester si un extrait de larves de vers de farine calme l'anxiété de souris soumises à des changements de gravité, tel est l'objet de ce projet qui utilise 75 souris dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent des gavages ou des injections, trois tests comportementaux, puis une session en manège tournant allant de dix minutes à trois semaines, un stress inspiré de celui des astronautes. Toutes sont mises à mort pour doser des marqueurs d'anxiété dans leurs tissus. Le porteur admet n'attendre que des effets anxiolytiques "légers", ce qui interroge l'ampleur du bénéfice mis en regard de trois semaines d'hypergravité.

Objectifs

Plusieurs extraits de protéines obtenus à partir d’animaux (lait de vache, têtes de saumon, larves de vers de farine) sont intéressants pour diminuer l’anxiété. Ce projet fait suite à une étude précédente qui a permis d’identifier que des protéines issues de larves de vers de farine possède une action de calmant naturel contre l’anxiété. Parmi six extraits différents, l’extrait complet (appelé «Fraction Totale») réduisait le plus efficacement les signes d’anxiété après ingestion chez des souris. La nouvelle étude a pour objectifs principaux d’explorer l’effet préventif et/ou curatif de cet extrait : voir s’il peut aider les souris à mieux gérer le stress soit avant (préventif), soit après (curatif) une exposition à des situations stressantes générées par des changements de gravité. Ces situations de stress sont inspirées de celles que subissent les astronautes.

Bénéfices attendus

Puisque cet extrait réduit l’anxiété, nous souhaitons savoir s’il sera assez puissant pour contrer les effets négatifs provoqué par une simulation de décollage ou de modification de la gravité sur une durée de 3 semaines, deux situations anxiogènes rencontrées par les astronautes. La prise préventive et curative chronique d’extraits anxiolytiques de vers de farine pourrait être une contre-mesure potentielle à cette élévation de l’anxiété.

Procédures

Les animaux subiront, selon le groupe dans lequel ils seront placés : - 2 gavages plus 3 tests comportementaux simples de 5 minutes chacun, ainsi que (1) une session d’accélération puis de décélération en manège tournant d’une durée totale de 10 minutes, ou bien (2) une session de 3 semaines en manège tournant. - Ou 3 injections de calmant plus 3 tests comportementaux simples de 5 minutes chacun ainsi que (1) une session d’accélération puis de décélération en manège tournant d’une durée totale de 10 minutes, ou bien (2) une session de 3 semaines en manège tournant.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress léger de 30 secondes lors des administrations par gavages (2 fois pour certains groupes) ou injections (3 fois pour d’autres groupes). Tous les animaux réaliseront 3 tests comportementaux pouvant induire un léger stress de 5 minutes chacun. Trois groupes d’animaux subiront un stress modéré engendré par une session d’accélération puis de décélération en manège tournant d’une durée totale de 10 minutes. Deux autres groupes d’animaux subiront un stress modéré engendré par une session de 3 semaines en manège tournant. Dans les 2 cas, une augmentation de l’état anxieux des animaux sera attendue.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de procéder à des prélèvements pour des dosages de marqueurs d’anxiété permettant de compléter et de consolider les résultats issus des tests comportementaux.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives permettant de reproduire la complexité des phénomènes générés par un changement de gravité chez un organisme, particulièrement lorsque son système nerveux est sous l’influence d’un mélange complexe de composés actifs issus de la digestion d’un aliment. La multitude de paramètres et de facteurs engagés dans cette étude implique l’utilisation de souris en tant qu’organismes complets, dont les actions comportementales dans les divers tests impliqués seront des réponses globales et donc pertinentes quant aux interprétations des résultats dans la problématique des futurs voyages spatiaux.

Réduction

Sur le plan statistique, nous avons fait des simulations à l’avance grâce à un logiciel spécialisé, sur la base des résultats de nos précédentes études ayant montré un effet fort de l’hypergravité sur le niveau d’anxiété des souris, avec persistance de l’anxiété au moins 2 semaines après la fin du stress. On peut s’attendre à ce que les extraits de vers de farine montrent des effets anxiolytiques légers dans ce type de stress. Ainsi, des effectifs de n=15 souris par groupe expérimental sont requis pour permettre la comparaison statistique.

Raffinement

Les tests comportementaux seront réalisés sur une période limitée à 5 minutes par animal. Les administrations par gavage ou injection seront réalisées par le référent de ces gestes au sein de la structure, validé par notre vétérinaire. Tout au long du déroulement de ce projet, une observation quotidienne des souris sera réalisée et ce, même lorsque les souris seront en hypergravité pour 3 semaines, grâce à des caméras présentes dans le manège tournant. Une roue d’activité sera placée dans les cages afin d’enrichir l’environnement. Ainsi, les animaux seront surveillés plusieurs fois par jour, y compris le week-end. Cette surveillance permettra de repérer à la fois des signes indirects d’anxiété et de mal-être. Des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

Le modèle souris, particulièrement bien connu dans l'étude du comportement animal, est fréquemment utilisé lorsqu'on cherche à caractériser les effets d'un médicament agissant contre l’anxiété. De plus, nos précédents travaux concernant les effets du changement de gravité ont été réalisées avec ce modèle : souris âgées de 8 semaines au moment du premier test comportemental.

Pour mesurer le rôle d'un facteur de transcription dans les lymphocytes T, 131 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélèvement des tumeurs, de la rate et des ganglions. Les animaux reçoivent une greffe de cellules de mélanome ou de cancer du côlon sur le flanc, puis des injections de médicaments et de lymphocytes, la tumeur pouvant provoquer une douleur modérée et parfois nécroser. Les retombées décrites relèvent de l'espoir, le porteur indiquant qu'il "pourrait" mettre en évidence un biomarqueur de réponse aux immunothérapies. Les procédures suivantes ne seront menées que si la première donne des résultats significatifs.

Objectifs

Malgré l’avancée révolutionnaire que constituent les immunothérapies du cancer, seule une partie des patients en bénéficie de façon durable. Notre projet vise à comprendre le rôle d’une protéine exprimée par les cellules immunitaires, dans la progression du cancer et la réponse aux immunothérapies. L’objectif principal est de décrire l’impact et les mécanismes de l’inhibition de cette protéine dans des modèles de mélanome et de cancer du colon chez la souris. Nous testerons aussi l’amélioration de la réponse aux immunothérapies induite par la sur-expression de notre protéine d’intérêt.

Bénéfices attendus

D’un point de vue fondamental, nous pourrions mettre en évidence une protéine régulant l’activité des globules blancs dans la tumeur. Au point de vue translationnel, nous espérons mettre en évidence notre protéine comme un biomarqueur de réponse aux immunothérapies et comme une cible potentielle d’immunothérapie.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc de cellules tumorales, sous anesthésie (1x 2 minute/souris) – Injections intrapéritonéales de médicaments (2 ou 3x 5 secondes/souris) – Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, de lymphocytes (1x 2 minutes/souris)- Pesées (30 secondes, une fois par semaine) – Mesure des volumes tumoraux (30 secondes, 3 fois par semaine)

Impact sur les animaux

L’évaluation des volumes tumoraux et les pesées nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. -La progression des tumeurs sur le flanc des souris peut induire une douleur modérée. Dans de très rares cas, les tumeurs peuvent nécroser.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Nous avons effectué une série d’expériences in vitro et d’analyses in silico pour établir le rôle de notre protéine d’intérêt dans la réponse immunitaire contre la tumeur, et pour dresser des hypothèses de mécanisme. Néanmoins à notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de l’informatique, les interactions entre les cellules tumorales, immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Les procédures 2, 4 et 5 ne seront effectuées que si la procédure 1 donne des résultats significatifs.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le rasage et les injections sous-cutanées et intra-veineuses seront faites sous anesthésie gazeuse. Un anesthésique local sera appliqué avant les injections intra-veineuses. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes, de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle de la molécule d’intérêt dans l’efficacité des immunothérapies. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 10 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. Les animaux seront distribués à 50/50 entre mâles et femelles, sauf dans une procédure où seules des femelles seront utilisées. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

3 824 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous-cutanée de cellules tumorales puis jusqu'à treize injections et deux prélèvements sanguins, pour tester des vaccins peptidiques contre le cholangiocarcinome, un cancer des voies biliaires. Le porteur justifie l'effectif par le regroupement des expériences et le partage des tissus, sans détailler le calcul qui conduit à 3 824 animaux. Il rappelle que la maladie tue plus de quatre patients sur cinq en cinq ans, un constat qui situe le bénéfice espéré loin de l'atteinte immédiate infligée aux souris.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins peptidiques comme nouvelle approche à la fois prophylactique et thérapeutique du cholangiocarcinome, un cancer agressif et encore mal pris en charge qui affecte les voies biliaires. L’objectif est de stimuler le système immunitaire afin, non seulement, de prévenir l’apparition de la tumeur, mais aussi de limiter sa progression et d’améliorer la réponse aux traitements existants.

Bénéfices attendus

Le cholangiocarcinome est le second cancer du foie en fréquence avec une incidence de 1.5 sur 100.000 habitants en Occident. Il présente l’un des pronostics les plus sombres, avec moins d’un patient sur cinq encore en vie après cinq ans, en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour la prévention et le traitement du cholangiocarcinome, non disponible à ce jour en clinique.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une seule injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (moins de 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à des injections sous anesthésie générale (pour un total maximum de 4, moins d’une minute par animal) et une partie des animaux vigiles sera soumise à des injections (pour un maximum total de 9, moins d’une minute par animal). Tous les animaux vigiles seront soumis à un maximum de 2 prélèvements sanguins (durée d’environ 2 minutes). A la fin des expériences, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie) et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. Les traitements de chimiothérapie et immunothérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections et de prélèvements peuvent s’infecter. Les prélèvements sanguins peuvent induire des hématomes. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité prophylactique et/ou thérapeutique de vaccins peptidiques dans un modèle de cholangiocarcinome ectotopique. Ces vaccins peptidiques ont été développés, in vitro, par clonage de 13 antigènes identifiés (ex vivo) par des analyses immunopeptidomiques et immunologiques complémentaires. Cette étude peut être conduite seulement in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de la vaccination et ses mécanismes, notamment immuno-dépendants, vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 3824 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les procédures seront effectuées de manière séquentielle : seulement les traitements qui s’avèrent efficaces lors de la première procédure seront utilisés dans les procédures suivantes; et elles seront effectuées seulement si les procédures précédentes s’avèrent efficaces. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes homogènes de souris pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous utiliserons des tests statistiques pour évaluer et comparer les effets immunologiques dans les divers groupes de traitements. Une veille bibliographique attentive et constante sera effectuée pour s’assurer que les expériences planifiées n’ont pas été déjà rapportées dans la littérature scientifique.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, maisonnettes, …). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général des animaux sera suivi. Le poids sera mesuré 1 fois par semaine. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Des points limites surveillés seront mis en place lors des procédures de croissance tumorale. L’anesthésie gazeuse des animaux sera effectuée (avec tapis chauffants). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats. Si les souris apparaissent affaiblies (prostration) pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques. La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Notre établissement utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Toutes mises à mort à l'issue pour prélèvement des tumeurs et des organes, 288 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules cancéreuses du sein, jusqu'à six injections intraveineuses dans la queue, des mesures d'haleine en cage métabolique et une ponction intracardiaque, pour tester une molécule qui libère à la fois une chimiothérapie et un marqueur volatil détectable dans l'haleine. Les bénéfices annoncés pour les patientes, un suivi en temps réel et moins d'effets secondaires, restent au conditionnel et à long terme. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la diffusion du marqueur dans un "organisme entier" et conclut au caractère "indispensable" de la souris.

Objectifs

Le cancer reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès estimés chaque année selon l’Organisation mondiale de la Santé. Le cancer du sein constitue la première cause de décès par cancer chez les femmes. Certaines formes de cancer du sein sont particulièrement agressives, avec un risque élevé de rechute. Malgré les progrès récents en cancérologie, les traitements disponibles restent limités et le suivi de leur efficacité demeure difficile. Ce projet propose de tester une nouvelle approche qui combine, traitement et suivi de l’efficacité du traitement dans une même molécule. Cette molécule reste inactive dans le sang et ne s’active qu’au contact de certaines substances présentes autour de la tumeur. Une fois activée, elle libère à la fois une chimiothérapie et une petite molécule volatile détectable dans l’haleine ou dans le sang. La chimiothérapie agit directement sur la tumeur, en limitant les effets secondaires sur les tissus sains. La libération de la molécule volatile sur le site tumoral permet de suivre l’efficacité de la chimiothérapie sans recourir à des examens invasifs. Le projet prévoit d’évaluer une molécule issue de cette technologie. Au préalable, nous évaluerons l’efficacité de cette molécule sur des cellules tumorales humaines en boite de culture. Par la suite, le composé sera testé sur un modèle murin. Ce modèle permet de reproduire au plus près la physiologie complexe d’un organisme humain. En effet, à ce jour, aucun modèle biologique, autre que les modèles animaux, ne peut reproduire le fonctionnement du système respiratoire et de la circulation sanguine de manière optimale. À terme, cette approche vise à offrir une nouvelle option thérapeutique pour les cancers du sein agressifs. Cette approche permettra d’améliorer la prise en charge clinique, de réduire les effets secondaires et de faciliter le suivi personnalisé des patientes.

Bénéfices attendus

Dans le domaine de l’oncologie, le développement de nouvelles approches thérapeutiques demeure une priorité majeure, notamment pour les cancers solides tels que le cancer du sein, dont certains sous-types restent difficiles à traiter. Cette approche pourrait apporter plusieurs bénéfices importants dans la lutte contre le cancer du sein. Elle permettrait de suivre l’évolution de la tumeur en temps réel grâce au sous-produit volatil libéré dans l'organisme. Cette approche limite ainsi le recours à des examens lourds ou invasifs nécessaires au suivi de l’efficacité thérapeutique. Ce suivi rapide de l’efficacité des traitements, permettrait de l’ajuster plus précocement en fonction de la réponse de la tumeur. D’autre part, comme cette molécule est activée au niveau de la tumeur, cela réduit les effets secondaires souvent observés avec les chimiothérapies classiques. À terme, cette approche innovante présenterait un intérêt clinique majeur car elle offrirait une nouvelle façon d’évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux tout en améliorant le confort et la qualité de vie des patientes.

Procédures

La totalité des animaux seront soumis à un baguage auriculaire des animaux sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour permettre leur identification. Dans l’étude de toxicité chaque animal subit les actes suivants : 6 injections intraveineuses par voie caudale (2 injections par semaine pendant 3 semaines) 1 injection maximum sur animal vigil, sous anesthésie locale, jusqu’à 5 injections sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. 1 mesure de l’haleine par animal durant 2 heures sur animaux vigiles, en cage métabolique 3 prélèvements sanguins submandibulaires sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec une fréquence : 1 prélèvement avec un intervalle de plus de 7 jours sur 3 animaux . Dans l’étude de libération du sous-produit volatil sur le site tumoral chaque animal subit les actes suivants : 1 injection sous-cutanée de cellules cancéreuses du sein ou PBS/matrigel (selon le lot) sous anesthésie gazeuse. 1 injection intraveineuse par voie caudale sur animal vigile, sous anesthésie locale. 1 mesure sur l’haleine par animal d’une durée comprise entre 30 minutes et 2 heures sur animal vigile, en cage métabolique 1 ponction intracardiaque gazeuse à l’isoflurane avec analgésie à la buprénorphine Certains animaux subiront 1 prélèvement sanguin submandibulaire sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour le groupe 4 heures après l’injection du composé. Dans l’étude d’efficacité antitumorale chaque animal subit les actes suivants : 1 injection sous-cutané injection de cellules cancéreuses du sein sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. 6 injections intraveineuses par voie caudale (2 injections par semaine pendant 3 semaines) : 3 injections maximum sur animal vigile, sous anesthésie locale et 3 injections sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. 3 mesures de l’haleine par animal entre 30 minutes et 2 heures sur animal vigile, en cage métabolique. 3 prélèvements sanguins submandibulaires sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec une fréquence : 1 prélèvement tous les 7 jours à un temps post-injection défini précédemment.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéprimées présentent un phénotype fragile et sensible aux infections. Ce phénotype nécessite des conditions d’hébergement adaptées, telles que celles présentes au sein de notre animalerie. L’utilisation de l’anesthésie gazeuse au cours de ce projet peut provoquer un stress léger et passager lors du réveil des animaux. Cette anesthésie sera utilisée pendant l’implantation des cellules tumorales en sous cutanée, les injections et les prélèvements sanguins ainsi que le marquage auriculaire. La croissance des tumeurs en sous-cutané entraînera une gêne locomotrice proportionnelle à la taille de la protubérance tumorale. Enfin les injections intraveineuses de composé pourront être réalisées chez des animaux vigiles sous anesthésie locale à l’aide de tubes de contention, ce qui induit un stress et l’inconfort pour les animaux.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Des études des tissus, incluant des prélèvements d’organes et de tumeurs, seront réalisées post mortem. Ces études sont absolument fondamentales. Elles permettront de vérifier dans les tumeurs récupérées après la mise à mort, l’efficacité de notre composé sur les tumeurs ainsi que leurs effets potentiels chez des animaux ne portant pas de tumeur. De plus, ces procédures permettront également d’investiguer le mécanisme d’action de notre composé. Nous réaliserons différents marquages immunohistochimiques de protéines cibles couramment étudiées en cancérologie. Nous évaluerons aussi les niveaux d’enzymes dans le tissu intra-tumoraux et péri-tumoraux sur les tissus à l’aide de techniques de chimie analytique.

Remplacement

Les paramètres de distribution de notre composé ne peuvent être obtenus qu’au moyen d’animaux. Ces études précliniques sont indispensables avant toute évaluation en essais cliniques chez l’homme. À l’heure actuelle aucun modèle non biologique ou in vitro ne permet de réaliser ces analyses sans perte d’informations scientifiques essentielles. Le développement de notre composé nécessite le recours à un modèle systémique complexe intégrant les systèmes circulatoire et respiratoire. En effet, l’activation du composé dans l’environnement tumoral entraîne la libération d’un sous-produit volatil. Ce dernier diffuse dans la circulation sanguine, puis est transféré vers le système respiratoire, où il est finalement expiré par les animaux. La détection du sous-produit de notre composé dans l’haleine des animaux constituera un marqueur direct de la libération du composé au sein du microenvironnement tumoral. Elle servira également de marqueur indirect de l’efficacité du composé sur la tumeur. Ce phénomène repose sur des interactions physiologiques dynamiques entre plusieurs organes. Elles sont impossibles à reproduire de manière pertinente à l’aide de modèles in vitro ou in silico. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour reproduire fidèlement la diffusion et l’élimination du sous-produit volatil dans l’organisme.

Réduction

Afin de limiter le nombre de composés à tester chez l’animal, des essais préliminaires in vitro ont été réalisés sur des lignées cancéreuses afin d’évaluer leur efficacité et la libération du sous-produit volatil. Nous avons ainsi pu réduire le nombre d’animaux grâce à ces études. De plus, seul le composé le plus prometteur sera ainsi évalués in vivo. Nous disposons également des connaissances et du savoir-faire technique pour mesurer les produits volatils contenus dans l’haleine chez l’animal. En effet, cette technique a déjà été mise en œuvre avec succès lors de précédentes études in vivo menées par notre équipe. Cette maîtrise de la technique réduit les risques d’échec des mesures. Elle contribue aussi à limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant des essais exploratoires supplémentaires. Les protocoles ont été conçus pour maximiser les informations obtenues tout en minimisant la douleur et la souffrance des animaux. De plus, certaines parties des procédures seront réalisées de manière séquentielle. Nous ajusterons les différents paramètres expérimentaux sans mobiliser l’ensemble des souris dès le départ, conformément au principe de réduction. De plus nous avons prévus de faire des tests pilotes qui seront des étapes conditionnant la poursuite de certaines procédures. Une organisation optimisée des groupes expérimentaux permettra également de réduire le nombre d’animaux sans compromettre la fiabilité des résultats. Le nombre d’animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique a priori permettant de déterminer le nombre minimal qui donnera des résultats robustes. Les données utilisées pour le calcul se basent sur des données issues de la littérature décrivant des modèles murins comparables. Le calcul conduit à un effectif de 12 souris par groupe permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en respectant le principe de réduction des animaux. Ces procédures d’expérimentation animale sont nécessaires pour progresser dans la mise au point de nouvelles thérapies anti-tumorales et de procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de réaliser de manière fiable des études biologiques aussi complexes. De plus, la collecte post-mortem des organes et des tumeurs permettra de compléter nos procédures à posteriori.

Raffinement

Des mesures de raffinement ont été mises en place afin de réduire la douleur, la souffrance, le stress et l’anxiété des animaux tout au long du protocole. À leur arrivée, les souris immunodéprimées présentent un statut sanitaire contrôlé garantissant l’absence d’agents infectieux connus. Elles seront hébergées dans des armoires ventilées en pression positive qui sont adaptées au maintien de leur statut sanitaire et permettent de limiter l’expression de leur phénotype immunodéficient. Les animaux seront maintenus en groupes dans un environnement enrichi, grâce à la présence de tunnels, et des modules en bois, favorisant leurs comportements naturels et leurs interactions sociales. Les conditions d’hébergement seront strictement contrôlées, et une période d’acclimatation de 10 jours. Au cours cette période, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations grâce à la distribution de récompenses alimentaires stérilisées, afin de réduire le stress. Les interventions susceptibles de provoquer de la douleur, telles que l’implantation tumorale, le baguage auriculaire et les prélèvements sanguins, seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, avec maintien de la température corporelle. Lorsque cela est compatible avec le protocole expérimental, les injections seront également réalisées sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane afin de réduire la douleur. Dans les cas où l’anesthésie gazeuse n’est pas possible, une anesthésie locale (lidocaïne gel) sera utilisée pour garantir le confort des animaux tout en préservant l’intégrité des mesures. Pour anticiper toute douleur, une analgésie adaptée sera systématiquement mise en place, incluant des injections et l’ajout de buprénorphine dans l’eau de boisson. Toutes les manipulations seront effectuées avec du matériel stérile à usage unique afin de minimiser le risque de contamination. L’état clinique et le comportement de chaque animal seront évalués quotidiennement à l’aide d’une grille d’observation spécifique, permettant de détecter précocement tout signe de souffrance. Des points limites précis et validés seront appliqués pour assurer une prise en charge rapide et appropriée des animaux présentant des signes cliniques anormaux. Si les animaux atteignent les points limites nous effectuons une mise à mort par dislocation cervicales sous anesthésie gazeuse. De plus, toutes les mises à morts seront réalisées après sédation pour limiter le stress des animaux et améliorer la réalisation de l’acte.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées offrent la possibilité de développer des modèles tumoraux humains sans risque de rejet immunitaire. Les techniques employées pour l’induction tumorale sont rapides, reproductibles et bien documentées, ce qui permet de connaître précisément les limites éthiques associées à ce type d’expérimentation. Ces modèles animaux sont essentiels pour le développement de nouvelles thérapies et pour leur évaluation préclinique avant d’être testées chez l’homme. La souris constitue l’espèce la mieux adaptée et la mieux caractérisée pour la réalisation de protocoles de thérapie in vivo. Nous allons avoir recours à des souris ayant 5 semaines. À ce stade de développement, elles sont considérées comme jeunes adultes et présentent une capacité optimale de prise tumorale. Une période d’acclimatation de 10 jours sera mise en place à leur réception, afin de leur permettre de s’habituer à leur nouvel environnement. Les procédures expérimentales débuteront lorsque les souris auront atteint l’âge de 7 semaines.

76 souris mâles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de sang intracardiaque et de tissus. Pendant douze semaines, elles reçoivent des régimes riches en gras et en sucre, des prélèvements sanguins répétés à l'entaille de la queue, des gavages de glucose et de lipides et des injections d'insuline et d'héparine. Le porteur note que les prises de sang répétées sur douze semaines peuvent générer un stress modéré malgré l'espacement des tests. L'étude cherche à mesurer l'effet d'une féverole fermentée sur le métabolisme et le microbiote, et n'inclut que des mâles.

Objectifs

Ce travail s’inscrit dans une démarche globale d’exploration des bénéfices potentiels de la substitution partielle de protéines animales par des protéines végétales fermentées, dans le cadre d'un programme qui promeut le développement et la valorisation des protéines végétales dans l’alimentation humaine. La féverole (FB) (Vicia faba) est une légumineuse cultivée en Europe et reconnue pour sa forte teneur en protéines (25–30 %). Elle représente une piste majeure pour diversifier les sources protéiques et réduire la dépendance aux protéines animales dans un contexte de transition agroécologique. Sur le plan nutritionnel, elle est riche en acides aminés essentiels, en fibres fermentescibles et en composés bioactifs. Toutefois, la présence de facteurs antinutritionnels peut limiter sa digestibilité. La fermentation lactique des concentrats de féverole constitue une approche prometteuse pour améliorer ses qualités nutritionnelles en augmentant la digestibilité, en réduisant les composés antinutritionnels et en modulant favorablement les populations bactériennes intestinales. Dans ce contexte, ce projet vise à déterminer dans quelle mesure la substitution d’une partie des protéines animales par des protéines de (FB) fermentées peut influencer la santé cardio-métabolique et les composition/fonction du microbiote intestinal. L’étude des effets métaboliques d’une consommation de concentrats protéiques fermentés chez la souris après le sevrage, permettra d’évaluer l’impact de différents régimes (protéines animales, FB non fermentée, FB fermentée) sur la croissance, le métabolisme lipidique, la tolérance au glucose, l’inflammation de bas grade ainsi que la santé intestinale et la composition du microbiote. Des approches métabolomiques et transcriptomiques permettront d’identifier les voies biologiques modulées par ces régimes. L’impact de ces régimes sur le microbiote intestinal sera analysé en caractérisant sa composition taxonomique et fonctionnelle. Nous rechercherons si la fermentation des protéines de FB modifie favorablement la structure et les fonctions microbiennes intestinales. Ce projet vise à apporter des connaissances nouvelles sur le rôle d’ingrédients fermentés issus de légumineuses dans la prévention des pathologies métaboliques, sur les mécanismes impliquant le microbiote intestinal, et sur le potentiel de leur intégration dans l’alimentation humaine dans un objectif de santé publique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer des connaissances essentielles sur l’impact de protéines végétales fermentées issues de la féverole (Vicia faba L.) sur la santé cardio-métabolique d’un mammifére et sur son microbiote intestinal. Les résultats attendus présentent un double intérêt, à la fois scientifique et sociétal. Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des effets des protéines végétales fermentées sur la santé cardio-métabolique, en évaluant leur impact sur le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que sur l’inflammation de bas grade. Il contribuera également à identifier des signatures métaboliques et microbiennes associées aux régimes à base de féverole, offrant de nouveaux biomarqueurs pour les recherches futures. Les résultats soutiendront le développement d’aliments plus durables et plus sains, en cohérence avec les objectifs du programme scientifique, et pourraient contribuer à la prévention des pathologies métaboliques chez l’humain.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés les semaine 1, semaine 6, semaine 9, semaine 10, semaine 11 et semaine 12 du protocole sur animal vigile pour effectuer les tests de tolérance au glucose et aux lipides. Aprés administration des solutions (glucose, lipide) par biberonage ou gavage, des préevements sanguins seront effectués pour des dosages. Ils sont effectués par incision superficielle de l’extrémité de la queue, après désinfection et application préalable de lidocaïne et sont réalisés à 1 semaine d’intervalle minimum. Chaque goutte de sang correspond à un volume d’environ 5µL et le recueil ne dépassera pas 70µL par session sauf pour le test de tolérance aux lipides où le volume devra être de 180 µL au total. L’hémostase au niveau de la queue sera assurée par compression locale pendant 60 secondes à chaque prélèvement. Seulement en cas de nécrose de la queue, le prélèvement de sang sera réalisé par ponction de la veine caudale latérale après réchauffement de la queue de la souris sur un pad chauffant, ou bien un prélèvement dans la veine faciale submandibullaire.

Impact sur les animaux

Pour les souris incluses dans ce projet, les nuisances induites par la procédure seront limitées aux manipulations pour l’administration de lipide par gavage, de glucose par gavage ou biberonage, l’injection d’insuline, l’injection d’héparine, les prises de poids, les prélèvements sanguins ainsi que la mise à mort des animaux. Les prélèvements de sang réalisés à l’extrémité de la queue peuvent provoquer une gêne passagère, un stress léger et une douleur brève au moment de l’incision. Le test fonctionnel de tolérance au glucose implique l’administration d’une solution de glucose par biberonnage volontaire des souris ou bien par gavage gastrique, pouvant générer un stress transitoire lié à la contention et à la manipulation, de courte durée. Il en est de même pour le test fonctionnel de tolérance aux lipides qui implique un gavage en contention douce de l’animal, provoquant ainsi un stress transitoire. L’injection intrapéritonéale d’insuline générera un inconfort transitoire lié à la manipulation et à la procédure invasive. L’injection unique d’héparine en fin de protocole est également susceptible d'entraîner une gêne momentanée. L’ensemble de ces effets indésirables est attendu comme léger à modéré, transitoire, et limité par des pratiques de raffinement (contention douce, personnel formé, surveillance des animaux, arrêt anticipé en cas de signe clinique anormal). Cependant les prises de sang répétees sur la durée de 12 semaines d'expérimentation, bien que espacées d'au moins 1 semaine entre 2 tests peut générer un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de permettre la réalisation des analyses biologiques finales sur prélèvements de sang intracardique et de tissus, indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Aucun animal n’est maintenu en vie à la fin du protocole.

Remplacement

Le recours au modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Les interactions entre alimentation, métabolisme, microbiote intestinal et inflammation impliquent des mécanismes physiologiques complexes qui ne peuvent être reproduits ni par des modèles in vitro, ni par des simulations in silico. Les paramètres étudiés (tolérance au glucose, sensibilité à l’insuline, régulation lipidique, réponses inflammatoires systémiques, modifications du microbiote) nécessitent un organisme entier dans lequel les systèmes digestif, immunitaire et métabolique et microbien, interagissent. Aucun modèle alternatif ne permet aujourd’hui de refléter fidèlement cette intégration physiologique. Le recours aux animaux est donc justifié scientifiquement et constitue la seule approche pertinente pour répondre à la question posée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en respectant l’objectif de minimiser l’utilisation d’animaux. Une analyse de puissance satistiques indique qu’un effectif théorique de 12 animaux par groupe serait nécessaire. Nous choisissons d’utiliser 14 animaux par groupe, cet effectif correspond au standard utilisé dans l’unité pour les études nutritionnelles et métaboliques, où il permet régulièrement d’obtenir des résultats robustes malgré la variabilité biologique qui est relativement faible pour des animaux consanguins. Par ailleurs, toutes les mesures physiologiques (poids, prise alimentaire, glycémie, insulinémie, prélèvements sanguins, collectes fécales) sont réalisées longitudinalement sur les mêmes individus, ce qui maximise la quantité de données obtenues par animal et évite la constitution de groupes supplémentaires. Pour tester l'appétit des souris (procédure 1) nous utilisons un effectif minimal (6 animaux) puisque le but est juste de vérifier que les animaux mangent et ne perdent pas de poids. Ainsi, le design expérimental adopté permet de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire, tout en garantissant la validité et la robustesse des résultats. Nous ne testerons les effets des régimes que sur des souris de sexe mâle.

Raffinement

Les procédures ont été conçues pour limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Les manipulations (pesées, collecte fécale, distribution des aliments) sont non invasives et réalisées avec une contention minimale, rapide mais sans brusquerie, par un personnel compétent et entraîné. Le stress généré par la pesée des animaux et des prélèvements sanguins seront limités du fait de leur mise en oeuvre dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et des recommandations relatives aux volumes de sang prélevés. Les tests métaboliques (OGTT, ITT, OFTT) sont effectués par du personnel expérimenté, avec des jeûnes courts (4h à 12h) pour réduire le stress. Les animaux sont hébergés par 2 dans des cages enrichies à l’aide de matériau cellulosique pour le nid et de tunnels et font l’objet d’une surveillance quotidienne. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement et les observations seront recueillies dans un fichier de suivi des souris (Annexe 1). Tout animal présentant une perte de poids supérieure à 20 %, une léthargie marquée, un refus persistant de s’alimenter, une respiration anormale ou un comportement anormalement agressif persistant sera immédiatement retiré du protocole en accord avec le resposnable SBEA. Toute souffrance est anticipée par des points limites stricts (Annexe 2) ce qui conditionnera les éventuelles décisions d’administration d’analgésique sous-cutané dans le cas d’observation de signes attestant d’une souffrance ou si score de point limite supérieur à 22 (Annexe 2) a mise à mort sera proposée par le responsable SBEA et réalisée sous anesthésie générale profonde, garantissant l’absence de douleur.

Choix des espèces

Le modèle murin C57BL/6J est une lignée de souris est largement utilisé en recherche métabolique et nutritionnelle car il développe de manière reproductible une obésité, une altération de la tolérance au glucose, ainsi qu’une résistance à l’insuline lorsqu’il est exposé à un régime riche en sucre et graisse. Par ailleurs, le microbiote intestinal de la souris est l’un des plus étudiés en recherche préclinique, avec des signatures microbiennes bien référencées, ce qui en fait un modèle pertinent pour examiner les interactions nutrition–microbiote. Aucun modèle in vitro, ex vivo ou alternatif ne permet actuellement de reproduire l’ensemble des interactions physiologique entre digestion, microbiote, immunité et métabolisme. Ce choix est donc scientifiquement justifié, cohérent avec les standards internationaux en nutrition/microbiote, et indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Les animaux à leur arrivée à l’animalerie auront 28 jours. À cet âge, les souris sont pleinement autonomes : elles ont achevé la transition alimentaire vers le solide, régulent correctement leur température corporelle et ne dépendent plus des soins maternels. A 35 jours de vie nous leur apporterons les différents régimes alimentaires à tester. A cet âge la croissance somatique des souris est presque stable et leur poids proche du plateau physiologique. Les régimes seront appliqués pendant 12 semaines. Les variations pondérales que nous observerons au cours du protocole reflèteront essentiellement des modifications de la composition corporelle — notamment l’accumulation de masse grasse induite par les différents régimes — et non la croissance physiologique normale des animaux. Ce stade post-sevrage avancé constitue également une période pertinente pour étudier la maturation du microbiote intestinal, qui est suffisamment structuré pour permettre l’analyse des interactions nutrition–microbiote, tout en restant sensible aux modifications alimentaires. Par ailleurs, les tests métaboliques tels que tolérance aux sucres et aux ainsi que les suivis physiologiques (poids, mesures des lipides plasmatiques) présentent à cet âge une fiabilité et une reproductibilité reconnues. L’utilisation d’animaux plus âgés ne permettrait pas d’évaluer l’impact des régimes durant les fenêtres critiques de maturation métabolique, tandis que l’utilisation d’animaux plus jeunes exposerait inutilement à des contraintes supplémentaires et obligerait à prendre en compte la croissance.

Une injection de toxines dans le cerveau pour détruire des neurones, un choc électrique de 0,7 milliampère et une restriction alimentaire : 2 280 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Plusieurs modèles de la maladie de Parkinson sont reproduits, avec pose d'une canule cérébrale et injections répétées sur quatre semaines, suivies de tests comportementaux et d'imagerie. Le protocole prévoit la mise à mort dès qu'un rat atteint des points limites : perte de 20 % du poids, prostration, automutilation ou hémorragie. L'objectif est d'identifier des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur des modèles dont le porteur reconnaît qu'ils ne reproduisent que partiellement la maladie humaine.

Objectifs

Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.

Capturés au filet, anesthésiés, puis équipés par chirurgie d'une balise acoustique et d'un marqueur fluorescent en moins de dix minutes, 30 picarels sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré avant d'être relâchés sur leur lieu de capture. La capture et la manipulation peuvent causer stress et blessures, l'implant étant présenté comme une gêne légère. L'étude suit leurs déplacements vers des zones de reproduction déjà connues pour compter des millions de nids. Le porteur associe à cet objectif de connaissance la production d'un documentaire valorisant ces colonies.

Objectifs

Trois précédents projets ont mis en lumière une biodiversité et une richesse spectaculaires associées à la limite inférieure des herbiers et du substrat meuble. L’intérêt majeur de la zone d'étude nous amène à poursuivre la dynamique d’exploration des colonies de reproduction de picarels (Spicara smaris) en réalisant cette étude complémentaire. Ce projet a pour objectifs de : - Caractériser plus précisément la dynamique de trois arènes de reproduction (dates, paramètres environnementaux, surface, densité de nids) et inventorier les comportements associés. - Décrire ces colonies de reproduction de picarels, ainsi que les espèces présentes dans ces écosystèmes temporaires, et les valoriser à travers la production d’un documentaire.

Bénéfices attendus

Ce projet propose de suivre les déplacements des picarels entre leur site de vie et leur site de nidification et sur leur site de nidification afin de déterminer : (1) la connectivité entre leur habitat préférentiel et la zone de reproduction, (2) le temps de résidence et le comportement au sein de la zone de nidification et (3) s’il existe plusieurs sessions de reproduction (aller-retours). Une connaissance accrue de cette espèce permettra une meilleure protection de la biodiversité dans un habitat fragile..

Procédures

L'ensemble des individus seront soumis à une phase de captures par un filet qui durera quelques minutes, puis anesthésié pendant 6-7 mn avant une phase d'implantation d'une balise acoustique par voie chirurgicale et l'injection sous cutanée d'une marqueur fluorochrome qui durent moins de 3-4 mn.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de la capture sont essentiellement le stress lié à la capture et des blessures éventuelles liées à l’engin de pêche ou à la manipulation entre l’engin et les bacs de confinements. L’implantation d’une balise interne unique engendre une nuisance de gravité légère ne dérangeant pas l’activité normale du poisson par la suite. En ce qui concerne l'injection du fluorochrome, l'anmal peut developper un léger stress lié à l’injection. Le fluorochrome peut aussi entrainer des sensibilités ou retards de croissance mais sur les jeunes stades de vie uniquement, ce qui n’est pas le cas ici puisque seuls des adultes seront marqués. Peuvent s’ajouter une modification temporaire du comportement (nage, alimentation) après marquage.

Devenir

Tous les animaux seront relachés vivant dans le milieu naturel sur leur lieu de capture.

Remplacement

L'intérêt du projet étant d’étudier le comportement spatial de ces espèces dans leur milieu naturel, il n’est pas possible de les remplacer.

Réduction

Il est difficile en écologie spatiale de déterminer le nombre d’individus nécessaire pour capturer la variabilité de l’utilisation de l’espace pour une population et son comportement. Ce nombre est variable en fonction des objectifs, des caractéristiques écologiques de l’espèce concernée et des modèles utilisés. Le projet cherchant à déterminer les differents comportements pour cette espèce, il est nécessaire d’etudier un nombre d’individus suffisamment grand pour capter cette variabilité dans l’utilisation et les comportements de migration au site de reproduction. Afin de minimiser le nombre d’individus dans cette étude, il est envisagé de marquer 30 individus de picarel répartis autour d’une zone de nidification connue afin de pouvoir documenter leur migration au site de reproduction. La plupart des études de ce type montrent qu’une trentaine d’individus permet de capter cette diversité de comportements. Le nombre de 30 individus de cette espèce de petite taille reste toutefois est minimal compte tenu de leur nombre et densité en milieu naturel (plusieurs millions de nids observés sur une même aire géographique).

Raffinement

L’ensemble des étapes du projet est mis en œuvre de sorte à limiter les nuisances : la capture est réalisée à l’aide de filet non maillant (formant des poches) en plongée ou posé par des professionnels, le transfert à bord et entre les bacs est réalisé à l’aide d’épuisettes en silicon limitant l’abrasion du poisson. Le marquage est réalisé sous anesthésie générale, un bullage dans le bac de réveil permet une bonne récupération du poisson avant d’être relâché en douceur sans exondation. L'ensemble du protocole de l'endormissement au réveil dure moins de 10 mn.

Choix des espèces

Le picarel (Spicara smaris) est un petit poisson vivant sur le fond qui forme des colonies de reproduction massives, pouvant couvrir plus de 130 hectares (ha) au sein d'une zone de 700 ha, une seule colonie couvrant de 2 à 30 ha entre 40 et 50 mètres de profondeur. Avec une densité de plus de 2,5 nids par m², on estime à plus de 18 millions le nombre de nids dans la colonie. Chaque nid est gardé par un mâle. Les femelles nagent en groupe au-dessus des nids et y déposent parfois des œufs. L’objectif du projet est de documenter leur comportement reproductif. Ces arènes de reproduction forment aussi un écosystème temporaire important puisqu’elles attirent de nombreux prédateurs ainsi que des pêcheurs. Il s’agit de marquer des individus dans leur habitat préférentiel (les herbiers alentours) afin de documenter leur migration vers ces sites de nidification et au sein de la colonie de reproduction afin de mieux comprendre la provenance des poissons et leur résidence sur le site ainsi que de déterminer les facteurs qui déclenchent leurs déplacements vers ces sites de reproduction. Ceci permettra de déterminer si ces phénomènes sont prédictibles et ainsi de pouvoir mieux protéger la biodiversité associée.

Pour vérifier in vivo une hypothèse sur le rôle de la protéine NLRP3 dans l'immunité anti-tumorale, 260 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les poumons. Des tumeurs sont provoquées dans les poumons par injection dans une veine de la queue, suivies de chimiothérapies par voie intrapéritonéale. Le porteur affirme que ces foyers, maintenus à moins de cent nodules d'un millimètre, n'affectent pas la vie des animaux, en s'appuyant sur plus de dix ans de pratique du modèle. L'objectif reste d'apporter des connaissances sur NLRP3 et d'évaluer si elle pourrait un jour servir de cible, retombée présentée comme incertaine.

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues d’autres globules blancs appelés lymphocytes, isolés de souris montrent que NLRP3 est présent dans ces cellules. En l’absence de NLRP3 ces globules blancs ont une activité anti-tumorale marquée contre différents types de tumeurs. L’absence de NLRP3 dans ces globules blancs semble impacter le recrutement de ces cellules au site tumoral. Grâce à des cellules isolées des tumeurs de souris déficientes pour NLRP3 nous avons pu observer une différence dans l’expression de certains récepteurs membranaires suspecter d’être impliqué dans le recrutement des globules blancs déficients pour NLRP3. Le récepteur appelé CXCR3 interagit avec 3 molécules ayant des effets différents. Différentes lignées tumorales sont capables de les produire. Nous avons validé in vitro la différence de recrutement. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui valider ces observations in vivo. En effet, la complexité de la réponse immunitaire anti-tumorale est telle que les résultats obtenus in vitro ne sont pas suffisants pour affirmer que les mécanismes de recrutement des globules blancs identifiés in vitro sont transposables à un organisme entier et qu’ils pourraient servir de cible thérapeutique. Pour confirmer nos hypothèses in vivo, nous utiliserons des souris contrôles ou déficientes pour NLRP3 comme donneurs de globules blancs. Ces globules blancs seront injectés à des souris ayant de tumeurs au niveau pulmonaire. Ainsi, nous pourrons comparer le recrutement des globules blancs contrôles ou déficients pour NLRP3 dans des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - apporter des connaissances nouvelles concernant NLRP3. - évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie

Procédures

Les injections de cellules seront réalisées en intra veineux sur souris vigiles (2 par souris, chaque injection dure quelques secondes). Les traitements par chimiothérapies seront réalisés en intra péritonéal sur souris vigiles (4 par souris, chaque injection dure quelques secondes). La mise à mort sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites dans les poumons suite à une injection intra veineuse dans la veine caudale. Les traitements par chimiothérapie par injection intra péritonéales. Ces actes peuvent engendrer du stress chez l’animal car il doit être maintenu dans un système de contention. L’injection induit une douleur de faible intensité au site de l’injection. Les foyers tumoraux au niveau des poumons permettent d’obtenir des résultats plus clairs et de meilleure qualité. Les animaux seront mis à mort à J11 ou J17 post-injection des cellules tumorales. A ce stade, il y a moins de 100 foyers tumoraux sur les poumons (d’environ 1mm de diamètre) et cela n’impacte pas la vie des animaux (nous avons plus de 10 ans d’expérience sur ces modèles).

Devenir

Les 260 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les poumons

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et des phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires.

Réduction

Dans un souci de réduction et étant donné que nous voulons confirmer des résultats obtenus in vitro, les expériences ne seront réalisées que 2 fois avec 5 souris par groupes et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience sera accompagnée d’une analyse complète de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences (1 lobe pour l’analyse de l’infiltrat et 1 lobe pour les marquages). Enfin, un « go-no go » est appliqué à la fin de chaque phase du projet..

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.